Выделенная нуклеиновая кислота, плазмида, реплицируемый вектор экспрессии, трансформированная линия клеток мыши 127, полипептид, способ получения предшественника полипептида, обладающего активностью scce, фармацевтическая композиция для лечения нарушений, связанных с кератинизацией

Выделенная нуклеиновая кислота, плазмида, реплицируемый вектор экспрессии, трансформированная линия клеток мыши 127, полипептид, способ получения предшественника полипептида, обладающего активностью scce, фармацевтическая композиция для лечения нарушений, связанных с кератинизацией

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для получения рекомбинантного химотрипсинового энзима роговичного слоя (SCCE). Рекомбинантный полипептид, обладающий активностью SCCE, получают путем культивирования мышиных клеток С127, трансформированных вектором экспрессии, содержащим нуклеотидную последовательность (SEQ IDN1), кодирующую указанный полипептид. В фармацевтическую композицию для лечения нарушений, связанных с кератинизацией, включают 0,00l - 25% нативного или рекомбинантного SССЕ. Изобретение позволяет получить энзим, активный в отношении роговичного слоя кожи, и использовать его в составе фармацевтических и косметических композиций. 7 с.п. ф-лы, 23 ил., 5 табл.

Изобретение относится к рекомбинантному полипептиду и к нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, к системе экспрессии, способной экспрессировать этот полипептид, а также к фармацевтическим и косметическим композициям, содержащим этот полипептид, и к использованию полипептида для различных косметических или терапевтических целей.

Краткое описание изобретения Кожа, как орган, представляет интерес с биологической, медицинской и косметической точек зрения. Существует множество кожных заболеваний, которые являются либо органоспецифическими, как например, псориаз и экземы, либо проявлениями таких общих заболеваний, как общие аллергические реакции. Тот факт, что существуют кожеспецифические заболевания, можно рассматривать как доказательство существования молекулярных механизмов, которые уникальны для кожи. Аналогично, исследования кожеспецифических молекулярных процессов имеют важное значение для понимания и лечения кожных заболеваний. По-видимому, разумно предположить, что некоторые из этих процессов, так или иначе, связаны с наиболее специализированными функциями кожи, то есть, с созданием физико-химического барьера между организмом и внешним окружением. Физико-химический кожный барьер локализован в самом верхнем слое кожи, роговичном слое (Stratum corneum).

Роговичный слой является наиболее специализированной структурой кожи. Он является конечным продуктом процессов дифференциации эпидермиса, то есть, расслоенным чешуйчатым эпителием, который представляет самую верхнюю часть кожи. Большинство клеток эпидермиса состоит из кератиноцитов в различных стадиях дифференциации. Наиболее глубоко расположенные кератиноциты, базальные клетки, находятся на базальной мембране в контакте с дермой /собственно кожей/, которая представляет соединительную ткань кожи, и являются единственными кератиноцитами, обладающими способностью к делению. Часть базальных клеток непрерывно покидает базальную мембрану и претерпевает процесс дифференциации, в результате которого клетки становятся строительными блоками роговичного слоя. В этом процессе кератиноциты претерпевают ряд адаптационных изменений. Происходит увеличение содержания цитоскелета, состоящего из эпидермис-специфических цитокератинов. Промежуточные нити соприкасающихся клеток соединены с функциональными фрагментами за счет возрастающего количества десмосом. Наиболее резкие изменения происходят при переходе от самого верхнего слоя живых клеток, stratum granulosum, к мертвому роговичному слою, stratum corneum, в процессе, который обычно носит название кератинизация. Ковалентно связанные протеины расположены близко к внутренней части плазменной мембраны, образуя очень устойчивую клеточную оболочку. Кроме того, богатое липидами вещество, образующееся в органеллах кератиноцит-специфических клеток, секретируется во внеклеточное пространство, и, образуя липидные пластинки, которые окружают клетки роговичного слоя, составляет барьер, проницаемый для гидрофильных веществ. И наконец, все межклеточные структуры, за исключением плотно упакованных цитокератиновых нитей, исчезают.

Клетки Stratum corneum, корнеоциты, являются, таким образом, мертвыми клетками. Это означает, что регуляция различных процессов в роговичном слое должна быть результатом "программирования" на той стадии, когда кератиноциты все еще являются живыми клетками. Превращения эпидермиса, которые обычно протекают в течение примерно четырех недель, причем клетки являются частью роговичного слоя примерно в течение двух недель, завершаются отпадением клеток с поверхности кожи в процессе шелушения /десквамации/. Этот процесс является примером "программирования" роговичного слоя. Необходимым условием для функционирования роговичного слоя в качестве физико-химического барьера является требование того, чтобы отдельные его клетки удерживались вместе за счет механически устойчивых структур, то есть десмосом. Деградация десмосом, которая необходима для десквамации, должна регулироваться таким образом, чтобы обеспечить такое шелушение с поверхности кожи, которое уравновешивалось бы образованием нового роговичного слоя, без нарушения барьерных функций ткани.

Нарушение кератинизации В основе большого числа патологических состояний кожи различной степени тяжести лежит нарушение процесса кератинизации. При псориазе наблюдается, помимо типичного хронического воспаления, избыточное продуцирование незрелых клеток роговичного слоя, что приводит к типичному для этого заболевания шелушению. Существует группа врожденных заболеваний кожи, которые характеризуются утолщением роговичного слоя, что приводит к образованию "рыбьей чешуи" так называемого ихтиоза. У некоторых индивидуумов, страдающих ихтиозом, наблюдается пониженная скорость десквамации. Хотя и менее серьезное нежели ихтиноз, заболевание "сухая кожа" /ксеродерма/ также характеризуется роговичным слоем, с которого отшелушиваются корнеоциты, не так, как в обычных условиях, в виде отдельных клеток или мелких агрегатов клеток, но в виде крупных, макроскопических чешуек; это заболевание весьма обычно для старческого возраста, а также среди атопических индивидуумов с пониженной устойчивостью к кожным поражениям и склонностью к развитию характерных форм эндогенной экземы. В случае акне заболеваний наблюдается нарушенная кератинизация в протоках сальных желез, что приводит к образованию комедонов в закупорке желез. Образование комедонов прогрессирует и, как считают, приводит к образованию воспалительных угревых язвочек. Протеолитические энзимы участвуют в кератинизации.

Существует несколько стадий в процессе кератинизации и во время превращений роговичного слоя, где протеолитические энзимы, по-видимому, играют важную роль. Естественно, исчезновение всех внутриклеточных структур, за исключением цитокератиновых нитей, наблюдающееся в процессе перехода от живых до ороговевших эпидермальных слоев, должно включать протеолиз. Превращение профилаггрина в филаггрин, протеин, который, как считают, функционирует в специальном типе аггрегаций нитей цитокератина в процессе кератинизации, может катализироваться специфической протеиназой. В роговичном слое филаггрин далее разлагается до низкомолекулярных компонентов, которые, вероятно, важны как "природные увлажнители". Кроме того, существуют протеолитические модификации цитокератиновых полипептидов в процессе кератинизации. И наконец, протеолитические акты, по-видимому, играют решающую роль в деградации межклеточных когезивных структур в роговичном слое в процессах, которые обычно приводят к десквамации.

Когезия и десквамация клеток роговичного слоя /Stratum corneum/ Роль десмосом Межклеточная когезия в роговичном слое, так же как и в живых частях эпидермиса, в значительной степени осуществляется за счет десмосом. Десмосома состоит из двух симметричных половинок, каждая из которых образована двумя соприкасающимися клетками. Каждая половинка десмосомы имеет одну внутриклеточную часть, связанную с нитями цитокератина, и одну часть, состоящую из гликопротеинов, закрепленных внутриклеточно и с трансмембранной и внеклеточной частями. Внеклеточные части этих протеинов, десмоглеины, представляют собой адгезивные молекулы, и за счет их взаимодействия друг с другом во внеклеточном пространстве образуется когезивная структура. Деградация десмосом, по-видимому, протекает несколько другими путями в роговичном слое ладоней и подошв /стоп/ по сравнению с роговичным слоем, не относящимся к ладоням-подошвам. В последних тканях около 85% десмосом исчезает вскоре после того, как клетки становятся полностью ороговевшими. Оставшиеся десмосомы, которые расположены, предпочтительно, на ворсинчатых краях чрезвычайно уплощенных клеток, по-видимому, остаются интактными вплоть до того уровня, где происходит десквамация. В роговичном слое, который не относится к ладоням и подошвам, корнеоциты гораздо менее уплощены, и не происходит деградации десмосом в более глубоких слоях ткани. В обоих типах тканей десквамация связана с деградацией десмосом. В случае ихтиозной кожи, так же как и в случае "сухой кожи", число десмосом в поверхностных слоях роговичного слоя, как было показано, повышается.

Межклеточные липиды роговичного слоя Различия в деградации десмосом, относящихся к ладоням и подошвам роговичных слоев и не относящихся к ним, могут быть связаны с различными количествами внеклеточных липидов в этих двух типах тканей. Содержание липидов значительно выше в роговичных слоях, не относящихся к ладоням-подошвам. В результате эффективность этой ткани в качестве барьера, проницаемого для воды и других гидрофильных веществ, гораздо выше проницаемости роговичного слоя ладоней и стоп. Так как десмосомы занимают значительный объем и так как интактные десмосомы предотвращают расширение межклеточного пространства, именно деградация десмосом может быть тем механизмом, за счет которого большее внеклеточное пространство становится доступным для липидов. Внеклеточные липиды роговичного слоя связаны с десквамацией также и некоторыми другими путями. Так как они составляют основную часть внеклеточного пространства, можно ожидать, что они оказывают значительное влияние на активность энзимов, которые действуют в этом месте, например, энзимов, ответственных за деградацию десмосом. Действительно, различные нарушения метаболизма липидов, как было показано, по-видимому, вызывают некоторые типы ихтиоза. По-видимому, также, сами липиды в некоторой степени вносят вклад в клеточную когезию роговичного слоя. Более того, секреция липидов в межклеточное пространство роговичного слоя, по-видимому, связана с секрецией также и ряда энзимов. Предшественники липидов хранятся в верхних живых кератиноцитах в специфических органеллах. Эти так называемые ламелларные /пластинчатые/ тела, как было показано, содержат ряд гидролитических энзимов. Таким образом предполагается, что энзим, ответственный за деградацию десмосом в роговичном слое, синтезируется, возможно в неактивной про-форме, кератиноцитами, хранится в ламелларных телах и секретируется в межклеточное пространство роговичного слоя в процессе кератинизации, где он может быть активирован, и его активность далее регулируется, наряду с другими факторами, составом внеклеточных липидов.

Нарушений клеточной когезии в жизнеспособном эпидермисе Существует ряд кожных заболеваний, при которых нарушается когезия между кератиноцитами в неороговевших жизнеспособных эпидермальных слоях. Эти заболевания характеризуются феноменом, именуемым акантолизом, то есть разрушением десмосомных контактов между кератиноцитами, которые в остальных проявлениях кажутся нормальными. Этот процесс, по-видимому, осуществляется за счет протеиназ, которые до сих пор не были идентифицированы. Аквантолиз, в своих острых формах, приводит к образованию волдырей и является характеристикой автоиммунных заболеваний pemphigus vulgaris и pemphigus foliaceus наследственного доброкачественного familiar pemphigus /болезнь Hayley-Hayley's/ и наследственного dyskeratosis follicularis /болезнь Darier's/.

Эпидермис принимает активное участие в иммунологических и воспалительных реакциях В дополнение к своим функциям в качестве создания физико-химического барьера между внутренностями организма и внешней средой, эпидермис также функционирует в качестве активного иммунологического барьера. Кератиноциты обладают способностью продуцировать, а также регулировать на большое число цитокинов и других медиаторов воспалений, за счет которых они коммутируют и взаимодействуют с клетками иммунологической и воспалительной систем. Это имеет огромное значение при защите хозяина от микробной инфекции и в заживлении ран. Современные исследования показали также, что кератиноциты, по-видимому, принимают активное участие во многих воспалительных кожных заболеваниях, таких, как псориаз и экземы.

Эпидермальные протеиназы могут играть важную роль в воспалительных процессах Одним из цитокинов, продуцируемых кератиноцитами, является интерлейкин 1 /Il-1/. Il-1 существует в двух формах, Il-1 и Il-1 , причем обе они присутствуют в эпидермисе. Если Il-1 после синтеза является полностью активным, Il-1 синтезируется в виде неактивной 31 кД про-формы. Про- Il-1 превращается в активную 17 кД форму за счет специфической протеиназы, присутствующей, например, в моноцитах, но до сих пор не обнаруженной в нормальном эпидермисе. Ряд сериновых протеиназ со специфичностью к химотрипсин-подобному субстрату /химотрипсин поджелудочной железы и катепсин G нейтрофильных гранулоцитов/ может, однако, служить в качестве активаторов про- Il-1 .

Как предложил Норрис /Norris 1990/, протеолитические энзимы, присутствующие в межклеточном пространстве роговичного слоя, могут в определенных условиях оказаться способными превращать неактивные формы цитокинов в активные формы. Особый интерес в этом контексте представляет биологически неактивный про-интерлейкин-1 , который, как было показано, продуцируется кератиноцитами /Migutani et at., 1991/. До сих пор не было обнаружено энзимов со способностью превращать про-интерлейкин-1 в активный интерлейкин-1 . Однако, так как химотрипсин и катепсин G /химотрипсиноподобный энзим/ обладают способностью катализировать превращение неактивного 31 кД рекомбинантного про-интерлейкина 1 в полностью активную 17 кД форму, возможно, что и эпидермальные химотрипсин-подобные энзимы могут катализировать это превращение.

Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к энзиму, который был назван химотрипсиновым энзимом strarum corneum /роговичного слоя// SCCE/, который рассматривается как энзим, ответственный за деградацию десмосом в роговичном слое. Доказательство, представленное в примере 1, демонстрирует, что отшелушивание клеток с поверхности ороговевших поверхностных слоев кожи включает деградацию протеинов десмосом, и что ответственным за это энзимом, по-видимому, является химотрипсино-подобная сериновая протеиназа, которую можно ингибировать ионами цинка.

В примере 2 описывается открытие химотрипсинового энзима Stratum corneum /SCCE/, протеиназы, которая удовлетворяет критериям ответственности за деградацию внутриклеточных когезивных структур в роговичном слое ин витро и, возможно, также ин виво. Пример 3 описывает частичную характеризацию активности химотрипсинового энзима stratum corneum /SCCE/ с помощью хромогенных субстратов.

Полученные результаты демонстрируют, что SCCE отличается энзимологически от остальных химотрипсиновых протеиназ. Характер ингибирования и способность разлагать два различных субстрата трипсиноподобных энзимов существенно отличается для SCCE по сравнению с бычьим химотрипсином и катепсином G человека. По-видимому, SCCE также отличается от химазы тучных клеток человека. Последний энзим катализирует деградацию Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa эффективно /см. Schwartg et al., 1987, и Schelter et al., 1989/ - чего не делает SCCE- и не ингибируется апротинином SBTJ /Shelter et al., 1983 и Wintroub et al. 1986/, тогда как SCCE ингибируется.

В примере 4 описана частичная очистка SCCE из KCl экстрактов корнеоцитов с помощью афинной хроматографии на несолюбилизированном ингибиторе трипсина сои /SBTJ/ и определение N-терминальной аминокислотной последовательности SCCE. Для невосстановленных образцов были получены хорошие выходы на стадиях 1-6, но снизились до 0 на стадиях 7 и 9, и выходы на последующих стадиях были заметно снижены. Для восстановленных образцов на стадиях 7 и 9 не детектировались производные аминокислот, но на последующих стадиях, на которых детектировались производные, сильного падения выходов не наблюдалось. Эти результаты дают возможность предположить, что в положениях 7 и 9 существуют цистены. Однако, не представилось возможности определить карбоксиметилированный цистеин на стадиях 7 и 9 после восстановительной обработки иодоуксусной кислотой /100 мМ/. Полученная последовательность /фиг. 13, послед. ID N 3/ была идентична как для восстановленного, так и для невосстановленного образцов.

Пример 5 описывает получение SCCE-специфических моноклональных антител и поликлональных SCCE-специфических антител цыпленка и кролика, а также иммуногистохимические исследования с моноклональными антителами.

Пример 6 описывает клонирование и секвенирование кДНК, кодирующей SCCE человека. Вначале, кДНК библиотеку, полученную на мРНК, полученной из эпидермльных кератиноцитов взрослого человека, скринируют анти-SCCE кроличьими поликлональными антителами. Одно из этих антител дает высокий фоновый сигнал, и его исключают из интенсивных исследований за счет скринирования на ранней стадии. Используя другое поликлональное антитело /Д-5/, ряд иммунореактивных бляшек обогащают как превосхищающие истинно положительные бляшки. Не наблюдалось реакционноспособности с моноклональными антителами мoAb 4 и мoAb 9 ни для одной бляшки. Интенсивная характеристика рестрикционных энзимов и характеризация PCR одиннадцати выделенных бляшек не выявила никакого сходства между различными бляшками. На основании невозможно получить "отпечатки пальцев" вероятной кДНК последовательности SCCE, стратегию пришлось модифицировать.

Несмотря на предпочтительное детектирование SCCE иммунореактивного материала в супрабазальных кератиноцитах, для скринирования кДНК SCCE использовали кДНК библиотеку, полученную из культивируемых кератиноцитов человека. Можно ожидать, что такая библиотека должна содержать кДНК только из базальных кератиноцитов. Эта попытка была основана на наблюдении слабого, но, вероятно, значительного иммуноокрашивания с использованием SCCE моноклональных антител также из базальных кератиноцитов.

Бляшки были скринированы с использованием синтетического 17-мерного олигонуклеотидного зонда, сконструированного на основании наиболее надежной части аминокислотной последовательности, Ile-Ile-Asp-Gly-Ala-Pro /последовательность ID N 10 aa 1-aa 6/ экспериментально определенной аминотерминальной последовательности нативного SCCE энзима, как описано в примере 4. Из-за неопределенности внутри экспериментально определенной аминокислотной последовательности, этот гексапептид, как считают, представляет одну из наиболее надежных частей. Кроме того, возможные кодоны, кодирующие этот гексапептид, приводят к наименьшей из возможных дегенерации ДНК зонда. Более длинная экспериментально определенная последовательность Gln-Val-Ala-Leu-Leu-Ser-Gly-Asn-Gln-Leu /последовательность ID N 3, aa 15-aa 24/ была исключена из-за высокой степени дегенерации последовательности, кодирующей эту пептидную последовательность. Четырнадцать позитивных бляшек были идентифицированы при первичном скринировании. Эти позитивные бляшки были снова скринированы с использованием тех же зонда и метода, которые были описаны ранее. После процедуры повторного скринирования были идентифицированы две позитивные бляшки. Эти две отобранные бляшки были еще раз очищены, а размер вставок был определен с помощью PCR с использованием SYМ 1600 и SYM 1601, которые оказались комплементарны двум плечам фага, в качестве праймеров, и выделенных фагов в качестве матриц. Этот клонированный фрагмент был подвергнут частичному анализу последовательности.

Трансляция полученной ДНК последовательности привела к аминокислотной последовательности, которая была гомологична экспериментально определенной протеиновой последовательности. Однако, в этой последовательности не было трансляционного стартового кодона. Для выделения полной длины кДНК, полученный ДНК фрагмент выделили на агарозном геле и использовали в качестве зонда, обеспечив гибридизацию в жестких условиях. Для получения полной длины кДНК, библиотеку кДНК рескринировали дважды с помощью зонда, используя те же методы, которые были описаны ранее, за исключением того, что гибридизацию вели в жестких условиях при 65^oC. Эти эксперименты привели к идентификации и выделению 45 отдельных позитивных бляшек, которые были вначале скринированы в PCR анализе с использованием SYM 1600 или SYM 1601 в сочетании с SYM 3208 в качестве PCR праймеров для идентификации бляшек, содержащих полную 5' открытую считывающую рамку.

После дальнейшего скринирования и секвенирования полученные PCR амплифицированные фрагменты, полученные из этих фагов, были клонированы, как было подробно описано в примере 6, и полученные результаты указывают, что один из фагов 205.2.1 содержит полной длины вставку. Была определена полная нуклеотидная последовательность кДНК фрагмента. Нуклеотидная последовательность /последовательность ID N 1/ содержит открытую считывающую рамку, достаточную для кодирования полной аминокислотной последовательности протеина SCCE предшественника, состоящего из 253 аминокислот, включая сигнальный пептид и преполипептид /последовательность ID N 2/.

Пример 7 описывает определение в эпидермисе человека двух SCCE мРНК-видов, которые способны гибридизоваться с кДНК зондами, полученными на базе SCCE кДНК последовательности.

Пример 8 описывает экспрессию рекомбинантного SCCE в E.coli. Полученный результат показывает, что представляется возможность продуцировать рекомбинантный SCCE в бактериях.

Пример 9 описывает экспрессию рекомбинантного SCCE человека в клетки млекопитающих. Получают три протеина, которые демонстрируют реакцию со всеми жизнеспособными поликлональными антителами SCCE кролика и цыпленка, так же как и с депонированными моноклональными антителами. Рекомбинантные протеины, которые реакционноспособны по отношению к антителам, выработанным против нативного SCCE, демонстрируют кажущийся молекулярный вес, который примерно на 1 кД больше, чем у нативного очищенного SCCE человека. Рекомбинантный протеин не демонстрирует какой-либо протеолитической активности.

Выделение, активация и дальнейшая характеризация рекомбинантного SCCE описаны в примере 10. Неактивную проформу рекомбинантного SCCE можно активировать протеолитическим расщеплением трипсином или эндопептидазой LYS-C. Предполагается, что ряд других протеаз, которые расщепляют пепетид после основной аминокислоты, таких как эндопротеиназа LYS-C, папаин и плазмин, могут быть способны активировать про- SCCE в активный SCCE. Было обнаружено, что сигнальный пептид состоит из 22 аминокислот и основан на N-терминальной аминокислотной последовательности нативного активного SCCE, пропептида, состоящего из семи аминокислот. Более того, было показано, что полученный рекомбинантный SCCE существует в двух N-гликозилированных формах и одной негликозилированной форме, что аналогично результатам, полученным для активного нативного SCCE.

Под термином "stratum corneum" химотрипсиновый энзим /SCCE/" /химотрипсиновый энзим роговичного слоя/ или "полипептид, обладающий SCCE активностью" в широком смысле подразумевают сериновую протезу или ее проформу, которую можно активировать за счет протеолитического расщепления, причем указанный энзим в его активной форме ингибируется теми же самыми ингибиторами и точно таким же образом, что и спонтанная клеточная диссоциация, которую можно вызвать в модельной системе с образцами ороговевшего слоя кожи, инкубируемыми при нейтральных или близких к нейтральным pH при физиологических температурах.

Более конкретно, термин "полипептид, обладающий SCCE активностью" определяет таким образом полипептид, который отличается от химотрипсина и катепсина G и который в его активной форме способен разлагать MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA /S= 2586/, причем это разложение полипептидом ингибируется апротинином, химостатином и сульфатом цинка практически по способу примеров 3 и 13, что проиллюстрировано на фиг. 9 и в таблице 5.

Еще более конкретно термин "полипептид, обладающий SCCE активностью" включает полипептид, который способен вызвать протеолитическое расщепление протеина десмосом - десмоглеина 1 во время ин витро инкубирования роговичного слоя пяточной части.

Такой полипептид обычно также реагирует с антителами, выработанными против нативного SCCE, который был выделен из экстракта диссоциированных клеток роговичного слоя пяточной поверхности. Примеры таких антител представляют поликлональные антитела, полученные как указано в 5.2, и моноклональные антитела TE4b и TE9b, полученные как указано в примере 5.1. Моноклональные антитела получают за счет гибридом TE4o и TE9o, депонированных в Европейской коллекции клеточных культур животных, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SR 4 OJP, United Kingdom под регистрационными номерами ECACC 93061817 и EC ACC 93061816, соответственно, в соответствии с требованиями Будапештского соглашения.

Клонирование и секвенирование кДНК, кодирующей SCCE человека, описано в примере 6. Нуклеотидная последовательность, содержащая открытую считывающую рамку, достаточную для кодирования полной аминокислотной последовательности протеина предшественника SCCE, состоящая из 253 аминокислот, включая сигнальный пептид и преполипептид, была таким образом найдена. Нуклеотидная последовательность представлена как последовательность ID N 1, а полученная аминокислотная последовательность "химотрипсинового энзима роговичного слоя /SCCE/" представлена как последовательность ID N 2.

Под термином "про- SCCE или его аналог или вариант его" подразумевают полипептид, содержащий аминокислотную последовательность ID N 2 или его аналог или вариант указанной последовательности, который получают, когда нуклеотидная последовательность изобретения экспрессируется в подходящую систему экспрессии, и который после протеолитической активации приводит к образованию сериновой протеиназы, которую можно ингибировать теми же самыми ингибиторами, что и спонтанную клеточную диссоциацию, которую можно вызвать в модельных системах с образцами ороговевшего слоя кожи, инкубируемыми при нейтральных или почти нейтральных pH при физиологических температурах, то есть, около 37^oC. Вообще, протеин будет реагировать с антителами, выработанными против очищенного нативного или рекомбинантного SCCE.

Под термином "SCCE или его аналог или вариант его" подразумевают полипептид, содержащий аминокислотную последовательность ID N 2 или аналог или вариант указанной последовательности, который продуцируется, когда нуклеотидная последовательность настоящего изобретения экспрессируется в подходящую систему экспрессии, и который является сериновой протеиназой, которую можно ингибировать теми же самыми ингибиторами, что и спонтанную диссоциацию клеток, которую можно индуцировать в модельных системах с образцами ороговевших слоев кожи, инкубируемых при нейтральных или почти нейтральных значениях pH при физиологических температурах, т.е. около 37^oC. Вообще, протеин должен реагировать с антителами, вырабатываемыми против нативного или рекомбинантного SCCE.

Под термином "его аналог или вариант" подразумевают полипептид, последовательность которого в точности не соответствует аминокислотной последовательности ID N 2, но которая все еще сохраняет "SCCE активность", как определено ранее. Вообще, такие полипептиды представляют полипептиды, которые отличаются, например, до некоторой степени по составу аминокислот или включают пост-трансляционные модификации, например, гликозилирование или фосфорилирование, по сравнению с SCCE протеином, описанным в примерах.

Термин "аналог" или "вариант" используют в настоящем контексте для того, чтобы обозначить протеин или полипептид с аналогичным составом аминокислот, или последовательностью такой, как характеристическая последовательность аминокислот ID N 2, полученная из SCCE протеина, как указано в примере 6, позволяя небольшие вариации, которые изменяют аминокислотную последовательность, например, делеции, сайт-направленный мутагенез, вставки дополнительных аминокислот, или их сочетания, для создания SCCE протеиновых аналогов. Эти модификации могут привести к инверсным и полезным новым свойствам аналога. Аналоговые полипептиды или протеины можно получить из животных или человека, или они могут быть частично или полностью синтезированы. Аналоги можно также получить за счет использования методик рекомбинантных ДНК.

Таким образом, важный вариант настоящего изобретения относится к полипептиду, в котором, по крайней мере, один аминокислотный остаток замещен другим аминокислотным остатком и/или в котором, по крайней мере, один аминокислотный остаток был исключен или добавлен, так что в результате получен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, отличную от аминокислотной последовательности, представленной в последовательности ID N 2, или субпоследовательность указанной аминокислотной последовательности, как определено далее, но практически обладающей SCCE активностью, как указано ранее.

Интересный вариант изобретения относится к полипептиду, который является аналогом или субпоследовательностью полипептида настоящего изобретения, содержащим от 50 до 250 аминокислот, например, по крайней мере, 70 аминокислот, по крайней мере, 100 аминокислот, по крайней мере, 150 аминокислот или, по крайней мере, 200 аминокислот.

Наиболее важным вариантом изобретения является полипептид, содержащий аминокислотную последовательность -7- 224 в последовательности ID N 2 /про-SCCE/ и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 1-224 в последовательности ID N 2 /SCCE/.

Термин "энзиматически активное вещество" обозначает полипептидную последовательность, которая содержит только часть полипептидной последовательности, представленной в последовательности ID N 2, и которая обладает энзиматической активностью. Сюда входят полипептидные субпоследовательности, которые были аналогизированы за счет модификаций, как здесь указано. Специфический полипептид /или полипептиды/, который обладает энзиматической активностью, считается особенно интересным.

Предсказанная аминокислотная последовательность ID N 2 была сравнена с аминокислотными последовательностями энзимов химотрипсина человека /Joulta et al., 1989/, катепсина G человека /Salvesen et al., 1987/ и химазы тучных клеток человека /Caughey et al., 1991/. Хотя предсказанная аминокислотная последовательность содержит консервативные активные участки сериновых протеаз, степень гомологичности очень низка, около 33-38%. В этом отношении кажется, что SCCE имеет только умеренное сходство с известными ранее сериновыми протеиназами. С другой стороны, SCCE является типичной сериновой протеиназой в отношении гистидинового, аспарагинового и серинового остатков активных сайтов и консервативных участков, расположенных вблизи от этих сайтов. Это справедливо также для большинства цистеиновых остатков и других высоко консервативных участков сериновых протеиназ. В глубине "кармана" /pouch/ первичной специфичности /остаток 189 в химотрипсине/ расположен сериновый остаток химотрипсина человека, химаза тучной клетки и простато-специфический антиген и аланиновый остаток катепсина G человека. В SCCE, с другой стороны, это положение занято аспарагиновым остатком. Это может объяснить тот обнаруженный факт, что хотя SCCE несомненно обладает химотрипсиновой активностью, его относительная активность по отношению к различным хромогенным пептидным субстратам отличается от химотрипсина и катепсина G, так же, как и ингибирующая эффективность химостатина, низкомолекулярного ингибитора химотрипсин-подобных энзимов.

Сравнение последовательностей химотрипсина человека, катепсина G человека и химазы тучных клеток человека с последовательностью SCCE представлено в последующем сравнительном анализе первичных структур этих последовательностей, представленных в конце описания.

Сравнительный анализ первичных структур осуществляют вручную.

Обозначения: HUMCTRP = химотрипсин человека /Jouita et al., BBRC 158:569-575, 1989/ HUMCHTG = катепсин G человека /Salvesen et al., Biochemistry, 26:2289-2293, 1987/ HUMCHYM = химаза тучных клеток человека /Caughey et al., J. Biol. Chem., 226:12956-12963, 1991/ Гомологичность: HUMCTRP/SCCE: 85/224 = 38% HUMCHTG/SCCE: 74/224 = 33% HUMCHYM/SCCE: 74/224 = 33% HUMCHTG/HUMCHYM: 109/226 = 48% Нумерация относится к химотрипсиногену Подчеркнуты: Консервативные участки вблизи активного сайта /Ile 15, His 57 ASP 102, Ser 195 химотрипсина/ и карманы первичной специфичности химотрипсина /Ser 189, Ser 213 - Trp 215, Gly 226 химотрипсина/.

Звездочки: возможные сайты N-гликозилирования в SCCE.

Таким образом, важный вариант настоящего изобретения относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, в которой последовательная нить из 20 аминокислот гомологична, по крайней мере, на 80% нити аминокислот той же самой длины, выбранной из аминокислотной последовательности ID N 2.

Полипептидные последовательности настоящего изобретения, гомологичные, по крайней мере, на 80%, например, на 85%, или, по крайней мере, на 90%, полипептидам, представленным в последовательности ID N 2, составляют важный вариант изобретения. Так как последовательность, представленная как последовательность ID N 2, по-видимому, совершенно уникальна, в объем настоящего изобретения входят полипептиды, для которых степень гомологичности с аналогичной последовательной нитью из 20 аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности ID N 2, может быть не более 55%, хотя предпочтительно, не более 70%. Такие последовательности можно получить из аналогичных протеинов из других видов, например, таких других млекопитающих, как мыши, крысы, кролики, морские свинки, свиньи или коровы. Так как небольшие части последовательности могут демонстрировать существенное сходство с другими сериновыми протеазами, в объем настоящего изобретения включены также пептиды со степенью гомологичности, по крайней мере, 95%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 99% гомологичности с аналогичной последовательной нитью из 20 аминокислот, выбранных из аминокислотной последовательности, представленной в последовательности ID N 2.

Под термином "гомологичность последовательности" подразумевают идентичность в последовательности аминокислот в сегментах двух или более аминокислот в паре по отношению к идентичности и положению аминокислот полипептидов.

Таким образом, термин "гомологичный" использован здесь для иллюстрации степени идентичности аминокислотной последовательности данного полипептида и аминокислотной последовательности, представленной в последовательности ID N 2. Аминокислотную последовательность, подлежащую сравнению с аминокислотной последовательностью, представленной в последовательности ID N 2, можно вывести из нуклеотидной последовательности, такой, как ДНК или РНК последовательность, например, полученные за счет гибридизации, как будет указано далее, или можно получить обычными методами аминокислотного секвенирования. Степень гомологичности предпочтительно определяют на аминокислотной последовательности зрелого полипептида, то есть, без учета какой-либо лидерной последовательности. Обычно используют только кодирующие участки при сравнении нуклеотидных последовательностей для определения их внутренней гомологичности.

В настоящем контексте термин "полипептид, который распознается, по крайней мере, одним из депонированных антител" должен включать аминокислотную последовательность, которая содержит аминокислоты, составляющие практически последовательную нить в линейной или пространственной конформации любой последовательности полипептида, представленного в последовательности ID N 2, которая распознается по крайней мере о