Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью

Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью

Реферат

 

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего противовоспалительной активностью. Надземную часть панцерии шерстистой экстрагируют 50 - 55% этиловым спиртом в соотношении сырье : экстрагент 1 : 14 - 16 с учетом коэффициента водопоглощения при 55 - 65^oC. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при 1-ом, 2-ом и 3-ем контактах фаз 60 мин. Извлечения фильтруют, объединяют, упаривают и очищают сепарированием. Очищенный экстракт высушивают в вакуумной сушилке и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта составляет 28,9 0,5% от исходной массы растительного сырья. Изобретение позволяет повысить содержание активных веществ в продукте. 10 табл.

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего противовоспалительной активностью.

В настоящее время уделяется большое внимание изучению, разработке и внедрению в практику лекарственных препаратов для лечения и профилактики воспалительных заболеваний, поскольку воспалительные заболевания широко распространены, страдают ими лица различного возраста, нередко они сопровождаются тяжелыми клиническими проявлениями и являются причиной частичной или полной утраты трудоспособности больших контингентов населения.

Несмотря на то, что современный арсенал противовоспалительных лекарственных препаратов насчитывает значительное число, проблема изыскания новых высокоэффективных противовоспалительных средств, не оказывающих побочного действия, остается весьма актуальной. Это связано с тем, что нет "идеальных" лекарств, не все препараты противовоспалительного действия отвечают высоким требованиям эффективности и безопасности. Объект исследования - экстракт панцерии шерстистой готовится из местного растительного сырья и потому является более доступным и дешевым. Известен способ получения настоя из панцерии шерстистой, которая используется при гепатитах и интоксикациях (прототип) /Крылов Г.В. Травы жизни и их искатели. - Томск, - 1992. - 217 с. // Минаева В. Г. Лекарственные растения Сибири. - 5-е изд., перераб. и дополненное. - Новосибирск: Наука. - 1991. - 431 с. / Однако фармакотерапевтическая эффективность его не обеспечивает желаемого результата. Это связано с тем, что при использовании в качестве экстрагента воды 40 - 50% биологически активных веществ остается в шроте / Муравьев И.А. Технология лекарств. - М., - 1971, - 751 с./. Кроме того, недостатком данного способа получения лекарственного средства является меньшее содержание флавоноидов - основных действующих веществ.

Задачей настоящего изобретения является повышение противовоспалительной активности средства за счет увеличения в нем содержания действующих веществ.

Для достижения указанной задачи растительной материал измельчают до размера частиц не более 5 мм, экстрагируют 50 - 55% этиловым спиртом в соотношении сырье : экстрагент 1 : 14 - 16 в течение 60 мин при температуре 60 2,5^oC и постоянном перемешивании. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при 1-ом, 2-ом и 3-ем контактах фаз - 60 минут. Объединенные извлечения фильтруют через серошинельное сукно, упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенное извлечение концентрируют доупаркой до 1/5 первоначального объема, затем высушивают в вакуум-сушильном аппарате и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход сухого продукта составляет 28,90,5%.

Предложенный способ позволяет получить конечный продукт, представляющий собой порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом с содержанием влаги не более 5%.

Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1.

1 кг травы панцерии шерстистой измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 0,5 мм (сито N 50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстрационный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 13 л 50% этилового спирта в соотношении сырье : экстрагент 1 : 14 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре 60^oC и постоянном перемешивании в течение 60 минут. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Заливают 50% этиловым спиртом в количестве, равном слитому, и вновь экстрагируют 60 минут. Аналогично проводят и третью экстракцию в течение 60 минут. Первый слив - 10,5 л, второй слив - 9 л, третий - 9 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/5 первоначального объема, затем сушат в вакуумной сушилке при температуре 60^oC в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0,287 кг готового продукта, что составляет 28,7% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги - 5%.

Острая токсичность сухого экстракта определялась на белых беспородных мышах-самцах с исходной массой 20,01,0 г при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введениях растворенного в воде экстракта. Каждую дозу экстракта испытывали на 10 животных. Наблюдение за животными вели в течении 14 дней. Регистрировали наблюдаемые признаки интоксикации, проводили вскрытие и осмотр погибших животных. Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении больших доз сухого экстракта панцерии шерстистой белым мышам наблюдаются признаки интоксикации, выражающиеся в замедлении ориентировочной реакции, резких движениях, появлением тонических, а затем тоникоклонических судорог. Животные погибали при явлениях остановки дыхания преимущественно в течении первых суток с начала введения экстракта. LD50 по Керберу при внутрибрюшинном введении сухого экстракта панцерии шерстистой соответствовала 4625,0390,0 мг/кг. При внутрижелудочном введении данного экстракта в максимально возможной дозе гибели животных не наступало и не наблюдали явных признаков иноксикации. Это данные позволяют отнести испытуемый сухой экстракт к группе малотоксичных веществ по классификации Сидорова / Сидорова К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах ведения // Токсикология новых промышленных химических веществ. - М. - 1973. - Вып. 13. - С. 47-51./.

В дальнейшем было исследовано влияние экстракта панцерии шерстистой на основные фазы воспалительного процесса. Опыты по влиянию полученного экстракта на процессы альтерации были проведены на 30 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 160.010.0 г. Повреждение ткани в области спинки крыс вызывалось подкожным введением 0,5 мл 9% уксусной кислоты с одновременным внутрибрюшинным введением 0,4 мл 10% раствора реополиглюкина (300 мг/кг). Планиметрию поврежденной зоны проводили на 7, 14, 21 сутки. Экстракт в дозе 100 мг/кг и пасту в дозе 100 мг/кг (в пересчете на абсолютно сухое сырье) панцерии шерстистой вводили двум группам животных 1 раз в день перорально за час до инъекции уксусной кислоты, а затем ежедневно на протяжении 21 дня. Контрольная группа животных получала дистиллированную воду в соответствующем объеме по аналогичной схеме. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что экстракт панцерии оказывает антиальтеративное действие на всех сроках наблюдения, а фармакотерапевтическая эффективность настоя по данному критерию уступает действию экстракта.

Пример 2.

1 кг надземной части панцерии шерстистой измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 0,5 мм (сито N 50, ГОСТ 214 - 83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 15 л 53% этилового спирта в соотношении сырье : экстрагент 1 : 15 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре 65^oC и постоянном перемешивании в течение 60 минут. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Заливают 50% этиловым спиртом в количестве, равном слитому, и вновь экстрагируют 60 минут. Аналогично проводят и третью экстракцию в течение 60 минут. Первый слив - 11,25 л, второй слив - 9,6 л, третий - 9,5 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/5 первоначального объема, затем сушат в вакуумной сушилке при температуре 60^oC в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0,283 кг готового продукта, что составляет 28,3% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Полученный сухой экстракт представляет собой порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги - 5,93%.

Эксперименты по оценке влияния полученного экстракта на процессы экссудации были проведены на серых мышах линии F1(CBA x C57B1/6) с исходной массой 20,01,0 г. Серым мышам за 2 часа до субплантарной инъекции в правую заднюю конечность вводили 0,2 мл 3% раствора формалина, а затем через 5 часов и 18 часов после этого в желудок животных зондом вводили экстракт панцерии в дозах 100 мг/кг и 300 мг/кг. Другой группе крыс для сравнения в аналогичных условиях вводили настой панцерии в оптимально-терапевтической дозе 100 мг/кг (в пересчете на абсолютно сухое сырье). Контрольной группе вводили дистиллированную воду в равном объеме. Через 24 часа после введения формалина проводили оценку антиэкссудативного действия указанных средств онкометрическим методом. Данные исследований представлены в таблице 2. Из данных, приведенных в таблице 2, следует, что экстракт панцерии в дозе 100 мг/кг оказывает выраженное антиэкссудативное действие. Увеличение дозы данного экстракта не приводит к существенному приросту регистрируемого эффекта.

Пример 3.

1 кг надземной части панцерии шерстистой измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 0,5 мм (сито N 50, ГОСТ 214 - 83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 16 л 50% этилового спирта в соотношении сырье : экстрагент 1 : 16 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре 55^oC и постоянном перемешивании в течение 60 минут. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Заливают 55% этиловым спиртом в количестве, равном слитому, и вновь экстрагируют 60 минут. Аналогично проводят и третью экстракцию в течение 60 минут. Первый слив - 12 л, второй слив - 10,28 л, третий - 10,15 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/5 первоначального объема, затем сушат в вакуумной сушилке при температуре 60^oC в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0,281 кг готового продукта, что составляет 28,1% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги 5%.

Опыты по влиянию экстракта панцерии на процессы пролиферации были проведены на 30 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 200,010,0 г с подкожной имплантацией стерильных ватных тампонов по рекомендации Тринуса с соавторами / Тринус Ф.П., Мохорт Н.А., Клебанов В.Н. Нестеродные противовоспалительные средства. - Киев, - 1975. - 239 с./.

Стерильные ватные шарики массой 15 мг имплантировали под кожу крыс в области спины в асептических условиях. Экстракт панцерии в дозе 100 мг/кг и настой панцерии в дозе 100 мг/кг (в пересчете на абсолютно сухое сырье), вводили животным перорально 1 раз в сутки в течение 7 дней. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в аналогичных объемах и режиме. На 8-е сутки у животных извлекали гранулемы и проводили взвешивание их в сыром виде и после высушивания при температуре 70^oC в течение 24 часов. По разности в массах гранулем у крыс, получавших экстракт и настой и животных, получавших дистиллированную воду, судили о влиянии испытуемых средств на фазу пролиферации. Полученные данные приведены в таблице 3. Из этих данных, можно заключить, что экстракт панцерии в дозе 100 мг/кг не оказывает статистически значимого влияния на образование фиброзно-грануляционной ткани.

Таким образом, данные проведенных серий исследований свидетельствуют, что экстракт панцерии в дозе 100 мг/кг оказывает выраженное противовоспалительное действие, оптимизируя течение воспалительной реакции, что очевидно обусловлено наличием в нем комплекса биологически активных веществ, в частности флавоноидов и других природных соединений.

На основании качественного фитохимического анализа суммы флавоноидов и экстрактивных веществ установлено наличие: 1) Флавоноидов: двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки "Filtrak" FN - 12 в системах растворителей: 1 - бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5) 2 - уксусная кислота 15%.

При просматривании хроматограммы в УФ-свете до и после обработки 2% раствором алюминия хлорида обнаружены: рутин - Rf = 0,38 (1), Rf = 0,4 (2); кверцетин = Rf = 0,73 (1), Rf = 0,04 (2). Идентификацию проводили с аутентичными образами.

2) Фенолкарбоновых кислот: двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки FN-12 в системе растворителей: 1-н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:5), 2 - 15% уксусная кислота.

После обработки хроматограммы в парах аммиака и просматривании в УФ-свете идентифицированы с аутентичными образцами: кофейная кислота Rf = 0,79 (1), Rf = 0,53 (2).

хлорогеновая кислота Rf = 0,75 (1), Rf = 0,63 (2).

3) Дубильных веществ: 0,05 г полученного экстракта растворяют в 5 мл воды очищенной. К 2 мл полученного раствора добавляют 2 - 3 капли раствора железоаммониевых квасцов, появляется черно-синее окрашивание.

2. Количественное определение.

Сумма флавоноидов.

Аналитическую пробу измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстия 1 мм.

Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 100 мл 50% спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин, периодически встряхивая для смывания частиц сырья со стенок. Горячее извлечение фильтруют через фильтр в мерную колбу вместимостью 200 мл, аналогично проводят вторую и третью экстракцию 50 мл 50% этанола. После охлаждения объединенные извлечения доводят 50% спиртом до метки и перемешивают (р-ра А).

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл р-ра А и 1 мл 2% р-ра алюминия хлорида в 95% этаноле и доводят объем раствора 95% спиртом до метки. Через 40 минут измеряют оптическую плотность р-ра на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл извлечения, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 95% спиртом до метки в мерной колбе на 25 мл.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин на абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D_о - оптическая плотность раствора ГСО рутина; m - масса сырья в граммах; m_о - масса ГСО рутина в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Примечание. Приготовление раствора ГСО рутина.

Около 0,5 г (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при T - 130-135^oC в течение 3 ч, растворят в 85 мл 95% этилового спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом, до метки и перемешивают.

Найдено 5,19% 0,048.

Предлагаемый способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях по выпуску лекарственных препаратов и оздоровительных средств.

Для установления оптимальных технологических режимов были изучены основные факторы, влияющие на процессы экстрагирования растительного материала: природа экстрагента, его соотношение с сырьем, температурный режим, степень измельчения сырья, продолжительность и кратность экстракций.

Количественная оценка велась по выходу суммы экстрактивных веществ /Государственная фармакопея. Т. 11, вып. 1, - 295 с./ и содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин-стандарт. Метрологическая характеристика определения суммы экстрактивных веществ и суммы флавоноидов проводилась на образцах панцерии шерстистой, собранной в окрестностях поселка Сокол, Бурятии в 1998 году (таблица 4).

Подбор оптимального экстрагента является одним из основных условий при получении извлечений. Экстрагент, действуя как активный компонент смеси, влияет на полноту, скорость и качество экстракции биологически активных веществ из растительного материала.

В качестве экстрагентов были использованы горячая вода (90 - 100^oC) и этиловый спирт следующих концентраций: 10, 20, 30, 30, 50, 60, 70, 80, 90, 95.

На основании экспериментальных данных установлено, что оптимальным экстрагентом по выходу суммы экстрактивных веществ и флавоноидов выбран 50% этиловый спирт (таблица 5).

Нами проведено изучение зависимости выхода суммы флавоноидов и экстрактивных веществ, в зависимости от температуры экстракции в интервале температур от 20 до 100^oC. Результаты представлены в таблице 6.

На основании данных анализа установлено, что оптимальная температура экстракции 60 2,5^oC. Дальнейшее увеличение температуры нецелесообразно, поскольку возможно разрушение термолабильных веществ.

Общеизвестно влияние степени измельченности растительного материала, которое ведет к увеличению поверхности экстрагируемого материала за счет разрыва клеток, за счет которого происходит увеличение контакта между растворителем и материалом, вследствие чего ускоряется процесс экстракции.

Для изучения влияния степени измельченности растительного материала на выход суммы флавоноидов и экстрактивных веществ сырье подвергалось измельчению до диаметра частиц 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 7,0; 10,0. Результаты приведены в таблице 7.

Оптимальной степенью измельчения для сырья является размер частиц 0,5 мм.

Нами проведено изучение зависимости выхода суммы флавоноидов и экстрактивных веществ от соотношения сырье - экстрагент. Результаты исследования приведены в таблице 8.

С целью определения продолжительности и кратности числа экстракций изучена зависимость времени достижения равновесной концентрации в системе сырье - экстрагент при трехкратной экстракции сырья. Для этого проводили экстракцию измельченного сырья 50% этиловым спиртом в соотношении 1 : 14 на водяной бане при температуре 60^oC при постоянном перемешивании с обратным холодильником.

Через заданные промежутки времени (30, 60, 90, 120 мин) извлечения фильтровали (1 контакт фаз), определяя сумму флавоноидов в пересчете на рутин и содержания экстрактивных веществ. Аналогичным образом проводили две последующие экстракции отжатого сырья при том же промежутке времени, добавляя каждый раз 50% этанол в количестве, равном объему слитого извлечения (2-ой и 3-ий контакт фаз), также анализировали на содержание суммы флавоноидов и экстрактивных веществ. Экспериментальные данные свидетельствуют, что равновесное состояние наступает при первом, втором и третьем контакте фаз через 60 минут (таблица 9).

В течение 1-го контакта фаз экстрагируется около 60 - 70% суммы флавоноидов и суммы экстрактивных веществ. Второй контакт обеспечивает выход около 25-30%, третий - около 5-10%, то есть для полноты истощения достаточно трехкратной экстракции.

Предлагаемый способ по сравнению с известным (таблица 10) позволяет получить препарат постоянного состава с более высокой противовоспалительной активностью за счет увеличения содержания действующих веществ.

Посчитать экономическую эффективность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствует рациональному использованию лекарственного растительного сырья и открывают перспективу внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.

Формула изобретения

Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, путем экстрагирования растительного материала, отличающийся тем, что в качестве растительного материала используют лекарственное растение - панцерию шерстистую, которую экстрагируют 50 - 55% этиловым спиртом в соотношении растительный материал : экстрагент, равном 1 : 14 - 16, три раза по 60 мин при температуре 55 - 65^oС.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3