Соматостатиновые пептиды

Соматостатиновые пептиды

Реферат

 

Описывается новый циклический гексапептид формулы (II) цикло [А - Zz_а - (D/L)Trp - Lys - Х₁ - Х₂] (II), где Х₁ означает радикал формулы (а) или (б), где R₁ означает необязательно замещенный фенил; R₂ означает -Z₁-СН₂-R₁, -СН₂-СО-О-СН₂-R₁; или (с) или (d), где Z₁ означает О или S; Х₂ представляет собой -аминокислоту, имеющую ароматический остаток на боковой цепи C, или является аминокислотным звеном Dаb; А представляет собой двухвалентный остаток, выбранный из Pro, где R₃ представляет собой NR₈R₉-(С₂-С₆)алкилен или гуанидино (С₂-С₆)алкилен; R₄ представляет собой водород или СН₃; R₁₁ представляет собой необязательно замещенный в кольце бензил, -(СН₂)_1-3 - ОН или -(СН₂)_1-5 -NН₂; R_b представляет собой -(СН₂)_1-3; каждый из R₈ и R₉ независимо друг от друга представляют собой водород, (С₁-С₄)алкил, ацил или СН₂ОН -(СНОН)_с-СН₂-, в котором с = 0, 1, 2, 3 или 4, или R₈ и R₉ образуют вместе с атомом азота, к которому они присоединены, гетероциклическую группу, которая может содержать дополнительный гетероатом, например пиридил или морфолино; Zz_а представляет собой звено природной или неприродной -аминокислоты, выбранной из группы, включающей Ala, Val, Thr, Ser, Leu, Nle, Jle, His, Trp, Arg, Tyr, Phe и NН₂-Phe, в свободной форме или в форме соли или комплексного соединения. Соединения обладают сродством по отношению к рецепторам соматостатина. 2 с. и 5 з.п.ф-лы, 2 табл.

или

Изобретение относится к соматостатиновым пептидам, способу их получения и фармацевтическим препаратам, содержащим их.

Соматостатин - это тетрадекапептид, имеющий структуру: С момента выделения и характеристики соматостатина проводился интенсивный поиск более сильнодействующих и более стабильных аналогов.

Более конкретно в настоящем изобретении предлагается аналог соматостатина, содержащий аминокислотную последовательность формулы (I) -(D/L)Trp-Lys-X₁-X₂- (I) в которой X₁ представляет собой радикал формулы (а) или (б) или где R₁ представляет собой возможно замещенный фенил, R₂ представляет собой -Z₁-CH₂-R₁, -CH₂-CO-O-CH₂-R₁, или где Z₁ представляет собой О или S, и X₂ представляет собой -аминокислоту, имеющую ароматический остаток на боковой цепи C^g, или аминокислотную единицу, выбранную из Dab, Dpr, Dpm, His, (Bzl)HyPro, тиенил-Ala, циклогексил-Ala и трет-бутил-Ala, причем остаток Lys указанной последовательности соответствует остатку Lys⁹ природного соматостатина - 14.

Эти соединения именуются здесь и далее как соединения по изобретению.

В применяемом здесь значении аналог соматостатина представляет собой прямоцепочечный или циклический пептид, производный от существующего в природе соматостатина-14, содержащий последовательность формулы I, и в котором дополнительно одна или более чем одна аминокислотная единица удалена и/или замещена одним или более чем одним другим аминокислотным радикалом(ами), и/или в котором одна или более чем одна функциональная группа замещена одной или более чем одной другой функциональной группой, и/или одна или более чем одна группа замещена одной или несколькими другими изостерическими группами. В общем понимании этот термин охватывает все модифицированные производные природного соматостатина-14, содержащие вышеуказанную последовательность формулы I, которая обладает сродством связывания в nM диапазоне с по меньшей мере одним субтипом рецепторов соматостатина, как определено здесь далее.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения предусматривается аналог соматостатина, в котором остатки в положениях 8-11 соматостатина-14 представлены последовательностью формулы I, как определено выше.

Более предпочтительно предусматривается аналог соматостатина, как определено выше, содержащий гексапептидную единицу, причем остатки в положениях 3-6 указанной гексапептидной единицы содержат последовательность формулы I. Наиболее предпочтительным является соматостатиновый гексапептид, в котором остатки в положениях 1 и 2 гексапептидной единицы могут быть любыми из известных из уровня техники (A.S.Dutta, Small Peptides, Vol.19, 292-354, Elsevier, 1993) или, в качестве заместителей, остатками Phe⁶ и/или Phe⁷ соматостатина-14.

Более конкретно, предусматривается аналог соматостатина, в котором гексапептидная единица является циклической, например, имеющей прямую пептидную связь между -карбонильной группой остатка в положении 6 и -аминогруппой остатка в положении 1.

Тогда как Lys, X₁ и X₂ в последовательности формулы I имеют L-конфигурацию, Trp может иметь D- или L-конфигурацию. Предпочтительно Trp имеет D-конфигурацию.

X₁ предпочтительно представляет собой остаток формулы (а) или (б), причем R₂ предпочтительно является -Z₁-CH₂-R₁ или Когда X₂ содержит ароматический остаток на боковой цепи C_g, он соответственно может являться природной или неприродной -аминокислотой, например Phe, Tyr, Trp, Nal, Pal, бензотиенил-Ala, Tic и тиронином, предпочтительно Phe или Nal, более предпочтительно Phe. X₂ предпочтительно представляет собой -аминокислоту, несущую ароматический остаток на боковой цепи C_g.

Когда R₁ представляет собой замещенный фенил, он соответственно может быть замещен, например, в орто и/или пара положении, галогеном, метилом, этилом, метоксилом или этоксилом. Более предпочтительно R₁ представляет собой незамещенный фенил.

Z₁ предпочтительно представляет собой О.

Представителем соединений по изобретению является, например, соединение формулы (II) в которой X₁ и X₂ такие, как определено выше, A представляет собой двухвалентный остаток, выбранный из Pro, где R₃ представляет собой NR₈R₉-C_2-6-алкилен, гуанидино-C_2-6-алкилен или C_2-6-алкилен-COOH, R_3a представляет собой H, C_1-4алкил или независимо имеет одно из значений, данных для R₃, R_3b представляет собой H или C_1-4алкил, R_a представляет собой OH или NR₅R₆, R_b представляет собой -(CH₂)_1-3- или -CH(CH₃)-, R₄ представляет собой H или CH₃, R_4a представляет собой возможно замещенный в кольце бензил, каждый из R₅ и R₆ независимо представляет собой H, C_1-4 алкил, -амино-C_1-4алкилен, -гидрокси-C_1-4алкилен или ацил, R₇ представляет собой прямую связь или C_1-6алкилен, каждый из R₈ и R₉ независимо представляет собой H, C_1-4 алкил -гидpoкcи-C_2-4алкилен, ацил или CH₂OH-(CHOH)_c-CH₂-, где c является 0, 1, 2, 3 или 4, или R₈ и R₉ образуют вместе с атомом азота, к которому они присоединены, гетероциклическую группу, которая может содержать дополнительный гетероатом, и R₁₁ представляет собой возможно замещенный в кольце бензил, -(CH₂)_1-3-OH, CH₃-CH(OH)- или (CH₂)_1-5-NR₅R₆, и ZZ_a представляет собой единицу природной или неприродной -аминокислоты.

ZZ_a может иметь D- или L-конфигурацию. Когда ZZ_a представляет собой единицу природной или неприродной -аминокислоты, он соответственно может являться, например, Thr, Ser, Ala, Val, Ile, Leu, Nle, His, Arg, Lys, Nal, Pal, Tyr, Trp, возможно замещенным в кольце Phe или N^g-бензил-Cly. Когда ZZ_a представляет собой Phe, его бензольное кольцо может быть замещено, например, NH₂, NO₂, CH₃, OCH₃ или галогеном, предпочтительно в пара-положении. Когда ZZ_a представляет собой Phe, его бензольное кольцо предпочтительно незамещенно.

Если A содержит Pro аминокислотный остаток, то любой заместитель, присутствующий в пролиновом кольце, например R₃-NH-CO-О- и так далее, находится предпочтительно в положении 4. Такой замещенный пролиновый остаток может существовать в цис-форме, например а также в транс-форме. Настоящее изобретение охватывает каждый геометрический изомер индивидуально, а также их смеси.

Если A представляет собой в котором NR₈R₉ образует гетероциклическую группу, то такая группа может быть ароматической или насыщенной и может содержать один гетероатом азота или один гетероатом азота и второй гетероатом, выбранный из азота и кислорода. Предпочтительно гетероциклическая группа представляет собой, например, пиридил или морфолино. C_2-6-алкилен в этом остатке представляет собой предпочтительно -CH₂-CH₂-.

Любой ацил, такой как R₅, R₆, R₈ и R₉ в A, может являться, например, R₁₂CO-, где R₁₂ представляет собой H, C_1-4алкил, C_1-4алкенил, C_3-6циклоалкил или бензил, предпочтительно метил или этил. Когда R_4a или R₁₁ в A представляет собой замещенный в кольце бензил, бензольное кольцо может быть замещено, как указано выше для ZZ_a.

Предпочтительной группой соединений по изобретению являются, например, соединения формулы (II), в которой A является свободной боковой группировкой -NH-CO-O-. Дополнительной группой предпочтительных соединений по изобретению являются, например, соединения формулы (II), в которой A содержит основной боковой радикал, например группировку R₃-NH-CO-O- или Еще одной дополнительной группой предпочтительных соединений по изобретению является группа соединений, в которых N-терминальная аминокислота содержит замещенный Pro, в частности 4-замещенный Pro, например соединения формулы II, в которых A представляет собой 4-замещенный Pro.

Предпочтительно A представляет собой 4-(R₃-NH-CO-O)Pro.

Дополнительными представителями соединений по изобретению являются соединения, содержащие аминогруппу, несущую хелатирующую группу, в частности соединение формулы (II), где A содержит аминогруппу боковой цепи, которая несет хелатирующую группу, в свободной форме, в форме соли или комплексного соединения с обнаруживаемым элементом. Эти соединения наименованы здесь и далее как хелатные соединения по изобретению.

Подходящими хелатирующими группами являются физиологически приемлемые хелатирующие группы, способные к комплексообразованию с обнаруживаемым элементом. Предпочтительно хелатирующая группа имеет в значительной степени гидрофильный характер. Примеры хелатирующих групп включают в себя, например, группы, полученные из полиаминополикарбоновых кислот или ангидридов, например группы, полученные из нециклических лигандов, например, этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), этиленгликоль- O,O'-бис(2-аминоэтил)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA), N, N'-бис (гидроксибензил) этилендиамин-N, N'-диуксусной кислоты (HBED) и триэтилентетрамингексауксусной кислоты (TTHA), группы, полученные из замещенных EDTA или DTPA, например параизотиоцианато-бензил-EDTA или -DTPA, группы, полученные из макроциклических лигандов, например 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N'',N'''-тетрауксусной кислоты (DOTA) и 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан-N, N',N'',N'''-тетрауксусной кислоты (TETA) или 1,4,7,10-тетраазациклотридекан-N, N', N'', N'''- тетрауксусной кислоты (TITRA).

Хелатирующая группа может быть присоединена либо непосредственно, либо через спейсерную группу к аминогруппе соединения по изобретению. Подходящие спейсерные группы включают в себя известные из уровня техники (GB-A-2225579) группы, например двухвалентный остаток амино-карбоновой кислоты, например -Ala или двухвалентный остаток, полученный из 6-аминокапроновой кислоты.

Предпочтительными хелатирующими группами являются группы, полученные из DTPA, DOTA, TETA или замещенных EDTA или DTPA. Хелатирующие группы, полученные из DTPA или DOTA, наиболее предпочтительны.

Под обнаруживаемым элементом подразумевается любой элемент, предпочтительно ион металла, который проявляет свойство, обнаруживаемое в терапевтических или in vivo диагностических методах, например ион металла, который испускает обнаруживаемое излучение, или ион металла, который способен оказывать влияние на ЯМР релаксационные свойства.

Подходящие обнаруживаемые ионы металлов включают в себя, например, ионы тяжелых элементов или редкоземельных металлов, в частности, используемые при CAT сканировании (компьютерная осевая томография), парамагнитные ионы, например Gd³⁺, Fe³⁺, Mn²⁺ и Cr²⁺, ионы флуоресцентных металлов, например Eu³⁺, и радионуклиды, например радиолантаниды, в частности -испускающие радионуклиды, -испускающие радионуклиды, -испускающие радионуклиды, Auger-e^--испускающие радионуклиды, позитрон-испускающие радионуклиды, например ⁶⁸Ga.

Подходящие -испускающие радионуклиды включают в себя те из них, которые полезны в диагностических методах. -испускающие радионуклиды преимущественно имеют период полураспада от 1 часа до 40 дней, предпочтительно от 5 часов до 4 дней, более предпочтительно от 12 часов до 3 дней. Примерами являются радионуклиды, полученные из галлия, индия, технеция, иттербия, рения, тербия, таллия и самария, например ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ^99mTc, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁹Yb и ¹⁸⁶Re.

Подходящие -испускающие радионуклиды включают в себя те из них, которые полезны в терапевтических применениях, например ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁶⁹Er, ¹²¹Sn, ¹²⁷Te, ¹⁴³Pr, ¹⁹⁸Au, ¹⁰⁹Pd, ¹⁶⁵Dy, ³²P, ¹⁴²Pr и ¹⁵⁶Sm.

Подходящими -испускающими радионуклидами являются те из них, которые применяют в терапевтическом лечении, например ²¹¹At, ²¹²Bi или ²⁰¹Tl.

Соединения по изобретению могут существовать, например, в свободной форме или в форме соли. Соли включают в себя соли, полученные присоединением кислот, например соли органических кислот, полимерных кислот или неорганических кислот, например гидрохлориды и ацетаты, и солевые формы, получаемые с группами карбоновых кислот при их наличии, например, в хелатирующей группе, например соли щелочных металлов, таких как натрий или калий, или замещенные или незамещенные соли аммония.

Настоящее изобретение также включает в себя способ получения соединений по изобретению. Они могут быть получены по аналогии с известными способами.

Соединения по изобретению могут быть получены, например, следующим образом: а) удаляют, по меньшей мере, одну защитную группу, которая присутствует в соматостатиновом пептиде, содержащем остаток формулы 1, причем соматостатиновый пептид находится в защищенной форме, или б) сшивают амидной связью две пептидные единицы, причем каждая из них содержит, по меньшей мере, одну аминокислоту в защищенной или незащищенной форме, при таком расположении амидной связи, при котором получают желаемую аминокислотную последовательность, и, если требуется, выполняют стадию, а) способа, или в) удаляют функциональную группу незащищенного или защищенного соматостатинового пептида или превращают ее в другую функциональную группу таким образом, чтобы получить другой незащищенный или защищенный пептид и, в последнем случае, выполняют стадию а) способа, или г) для получения хелатного соединения по изобретению сшивают хелатирующий агент и нехелатное соединение по изобретению в защищенной или незащищенной форме, содержащее свободную аминогруппу, таким образом, чтобы зафиксировать хелатирующую группу на желаемой аминогруппе соединения, и затем возможно выполняют стадию а) способа, и выделяют полученное таким образом соединение по изобретению в свободной форме, в форме соли или возможно в форме комплексного соединения с обнаруживаемым элементом.

Стадия б) способа приводит к получению линейного пептида, но включает в себя также циклизацию посредством амидной связи линейного пептида с образованием циклического пептида, имеющего желаемую аминокислотную последовательность. При желании боковую цепь, которая присутствует в A, можно ввести в аминокислоту до стадии пептидного сочетания б) или в конечный линейный или циклический пептид согласно стадии в). Таким образом, в последнем случае соединение формулы II, в котором A представляет собой гидрокси-Pro, можно превратить в соединение формулы II, в котором A представляет собой R₃-NH-CO-O-Pro.

Циклизацию также можно осуществить традиционным способом с помощью гидразида. Когда линейный пептид получают на смоле, обычно не имеет значения, какая аминокислота выбрана, для ее размещения в C-терминальном положении, при условии, что последовательность аминокислот в линейном пептиде соответствует последовательности в желаемом аналоге соматостатина. Как только циклизация линейного пептида проведена, можно уже не определять, какая аминокислота была на C-конце линейного пептида. Несмотря на то, что в общем случае выбор первой аминокислоты для начала цепи не играет роли, поскольку линейный пептид будет циклизован, могут иметь место другие факторы, которые могут предпочесть одну исходную аминокислоту другой. Предпочтительно линейный пептид циклизуют таким образом, чтобы получить связь от Tpr в положении 3 до ZZ_a в положении 2 или от X₂ в положении 6 до X₁ в положении 5.

Комплексообразование соединения по изобретению, содержащего аминогруппу, замещенную хелатирующей группой, может быть осуществлено взаимодействием хелатного соединения с соединением, дающим соответствующий обнаруживаемый элемент, например с металлической солью, предпочтительно водорастворимой солью. Взаимодействие можно проводить по аналогии с известными (Perrin, Organic Ligand, Cemical Data Series 22. NY Pergamon Press (1982); Krejcarit and Tucker, Biophys. Biochem. Res. Com. 77: 581 (1977); Wagner and Welch, J. Nucl. Med. 20: 428 (1979)) способами.

Поскольку получение исходных материалов детально не описано, соединения известны или могут быть получены по аналогии с известными и практикуемыми в технике способами.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Все температуры выражены в ^oC.

Используются следующие аббревиатуры: Bzl = бензил(Bzl)= -CH₂-фенил, присоединенный к кислороду или сере согласно (а) или (б) DFM (ДМФ) = диметилформамид BOC = трет-бутилоксикарбонил Fmoc = 9-флуоренилметоксикарбонил TFA = трифтороуксусная кислота DIPCI = диизопропилкарбодиимид DCCI = дициклогексилкарбодиимид HOBt = гидроксибензотриазол Dab = 2,4-диаминомасляная кислота Dpr = 2,3-диаминопропановая кислота Dpm = 2,6-диаминогептандиовая кислота Dde = 4,4-диметил-2,6-диоксоциклогекс-1-илиденэтил RT (KT) = комнатная температура HyPro = 4-гидрокси-Pro (транс-, если не установлено иначе) Tic = тетрагидроизохинолинкарбоновая кислота FAB = бомбардировка быстрыми атомами M.S. = масс-спектрометрия E.S. = эмиссионная спектроскопия ПРИМЕР 1 цикло [HyPro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe]: Смолу Fmoc-Phe-SASRIN (1,00 г, 0,65 ммоль) подвергают процедурам твердофазного синтеза Fmoc, пока не соберут в структуру пептидную смолу Fmoc-(D)Tpr-Lys-(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-Pro(y-t-OH)-Phe SASRIN Fmoc лишают защиты, применяя пиперидин. Расщепление пептидной смолы проводят с применением гидразинолиза. К 1,00 г пептидной смолы добавляют 8,3 мл ДМФ и 1,24 мл гидрата гидразина (прибл.15%-ный гидрат гидразина в ДМФ). Смесь перемешивают в течение 15 ч при КТ. После реакции смолу фильтруют и тщательно промывают ДМФ. Фильтрат собирают и упаривают в глубоком вакууме до получения маслянистого остатка гидразида. Остаток растворяют в воде и лиофилизируют до получения 480 мг линейного гидразидного продукта H-(D)Trp-Lys(Boc)-Tyr(Bzl)-Phe-HyPro-Phe-NH-NH₂. Этот гидразид растворяют в 16 мл ДМФ, охлаждают до -20^o и обрабатывают 4N раствором HCl в эфире (2,4 мл, 11,6 ммоль), а затем трет-бутилнитритом (41,3 мкл, 0,348 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 20 мин. Добавляют диизопропилэтиламин (11,6 ммоль, 2 мл) и реакционную смесь перемешивают в течение 72 ч при комнатной температуре. После того как реакция закончится, ДМФ удаляют под глубоким вакуумом. К маслянистому остатку добавляют воду до выпадения осадка. Экстракцию проводят между этилацетатом и водой. Органические фазы сушат над сульфатом натрия, и продукт выделяют. Защиту удаляют с применением смеси TFA/вода (95/5), и продукт выделяют, применяя высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC) с обращенной фазой. Осуществляют ионный обмен продукта, содержащего фракции, и лиофилизируют. В результате получают соединение, указанное в заголовке, в виде белого порошка, MH⁺ (FAB) 975, F = 1,24 []^D₂₂ = -39,0^o (95% AcOH; с = 0,1).

ПРИМЕР 2 цикло [{4-(NH₂-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro}-Phe-DTrp-Lys- Tyr(Bzl)-Phe] Fmoc-HyPro-OMe по каплям добавляют в раствор трисфосгена (0,6 экв.) в ТГФ. По истечении 1ч добавляют диметиламинопиридин (1,0 экв.) и N-BOC-диаминоэтан (6,0 экв. ), и реакционную смесь перемешивают при КТ. После того, как проведут операции тонкослойной хроматографии (TLC), растворитель удаляют в вакууме, и Fmoc-4-(N-BOC-аминоэтиламинокарбонилокси)Pro-OMe экстрагируют из двухфазной системы этилацетат/0,1М HCl с получением неочищенного продукта (MH⁺ = 554). Неочищенный метиловый эфир, выделенный ранее, затем расщепляют до свободной кислоты путем обработки 1N NaOH в системе диоксан/вода, и продукт, Fmoc-4- (аминоэтиламинокарбонилокси)-Pro-OH, очищают на силикагеле, (MNa⁺ = 562).

Смолу Fmoc-Phe-SASRIN (1,0 г, 0,65 ммоль) подвергают процедурам твердофазного синтеза Fmoc, пока не будет собрана в структуру пептидная смола Fmoc-(D)Trp(BOC)-Lys(ВOC)-Tyr(Bzl)- Phe-Pro(y-t-N-BOC-диаминоэтанкарбамоил)-Phe-SASRIN. Fmoc лишают защиты, применяя пиперидин. Расщепление пептидной смолы проводят путем ее обработки в стеклянной колонке 2%-ным раствором TFA в CH₂Cl₂. Нейтрализацию проводят 1М раствором NaHCO₃. Растворитель испаряют в вакууме, и защищенный линейный пептид лиофилизируют (MH⁺ = 1379,8). Защищенный линейный пептид подвергают циклизации путем обработки DCCI (6,0 экв.) и HOBt (6,0 экв.) за период в 5 дней.

Затем удаляют защиту путем обработки смесью TFA:H₂O (95:5), и циклический пептид очищают препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) и подвергают ионному обмену с получением ацетатной соли с помощью ионообменной смолы AG4-X4 с получением соединения, указанного в заголовке.

(FAB-MH⁺= 1061,7).

ПРИМЕР 3 цикло [{ 4-(морфолино-этил-аминокарбонилокси)-Pro} -Phe-DTrp-Lys- Tyr(Bzl)-Phe] Синтез гидроксипролиновых производных осуществляют следующим образом.

Fmoc-HyPro-OMe по каплям добавляют в раствор трисфосгена (0,6 экв.) в ТГФ. По истечении 1ч добавляют диметиламинопиридин (1,0 экв.) и N-этиламиноморфолин (6,0 экв.) и перемешивают смесь при КТ. После операций тонкослойной хроматографии (TLC) растворитель удаляют в вакууме и Fmoc-4- (морфолиноэтиламинокарбонилокси)Pro-OMe очищают на силикагеле, (MH⁺ 524). Затем метиловый эфир расщепляют путем обработки 1N NaOH в системе диоксан/вода, и продукт, Fmoc-4-(морфолиноэтиламинокарбонилокси)Pro-OH, очищают на силикагеле, (MH⁺ 510).

Fmoc-Phe-SASRIN подвергают процедурам твердофазного синтеза Fmoc как в предыдущем примере, пока не будет собрана в структуру смола Fmoc-(D)Trp(BOC)-Lys(BOC)-Tyr(Bzl)- Phe(морфолиноэтиламинокарбамат)HyPro-Phe-SASRIN. Удаляют защиту Fmoc, применяя пиперидин. Расщепление пептидной смолы проводят путем ее обработки в стеклянной колонке 2%-ной TFA в CH₂Cl₂. Нейтрализацию проводят 1М раствором NaHCO₃. Растворитель удаляют в вакууме, и защищенный линейный пептид лиофилизируют. Защищенный линейный пептид подвергают циклизации путем обработки DCCI (6,0 экв.) и HOBt (6,0 экв.) за период в 5 дней. Затем удаляют защиту путем обработки смесью TFA:H₂O (95:5), и циклический пептид очищают препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) и подвергают ионному обмену с получением ацетатной соли с помощью ионообменной смолы AG4-X4 до получения соединения, указанного в заголовке.

MH⁺ (FAB): 1131.

[]^D₂₂ = -55,0^o (95% AcOH; с = 0,1).

Путем повторения операций, как показано выше, но с использованием соответствующих исходных материалов, могут быть получены соединения формулы: цикло[X-Y-DTrp-Lys-Z-Phe] в которой X, Y и Z определены ниже в Таблице 1.

Пептид из примера 29 может быть получен следующим образом.

Защищенный пептид, цикло[(NH₂-C(=NH)-NH-C₂ H₄-NH-CO-O-)]-Pro-Tyr-DTrp-Lys(Dde)-Tyr(Bzl)-Phe, собирают на смоле, применяя процедуру твердофазного синтеза Fmoc, как описано в Примере 2. Вместо N^g-Boc-Lys используют N^g-Dde-Lys, чтобы предпочтительно ввести функциональность гуанидинила в основную боковую цепь остатка HyPro. После того, как сборку пептида в структуру заканчивают, концевую Fmoc группу удаляют, пептид подвергают циклизации и в конце удаляют защиту, как в Примере 2. Этот пептид растворяют в ДМФ, добавляют диизопропилэтиламин (3 экв.) и HOBt (4 экв.), затем добавляют 3,5-диметилпиразолилформамидиния нитрат (4 экв.) и раствор перемешивают в течение 72 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривают в вакууме, а затем подвергают обработке безводным гидразином (2% в ДМФ) в течение 30 мин для удаления группы Dde на Lys. Неочищенный пептид, указанный в заголовке (Пример 29), затем очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) в системе ацетонитрила и водного фосфата триэтиламмония.

ПРИМЕР 41 цикло[4-(NH₂-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro-Ala-DTrp- Lys-Tyr(3-Bzl)-Phe] MH⁺ (E.S.): 984,5 ПРИМЕР 42 цикло[{4-(NH₂-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro}- (p-NH₂)-Phe-DTrp-Lys-Tyr(3-Bzl)-Phe] MH⁺ (E.S.): 1076,6 ПРИМЕР 43 цикло[4-HyPro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)- Nal] MH⁺ (E.S.): 1025,5 ПРИМЕР 44 цикло[4-HyPro-Phe-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Tyr] MH⁺ (E.S.): 991,6 ПРИМЕР 45 цикло[MePhe-His-DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Dab] MH⁺ (E.S.): 1005 ПРИМЕР 46 a) цикло[4-(NH₂-C₂H₄-NH-CO-O-) Pro-Phe-DTrp-Lys( -Boc)-Tyr(Bzl)-Phe] 60 мг цикло [4-(NH₂-C₂H₄-NH-CO-O)Pro-Phe- DTrp-Lys-Tyr(Bzl)-Phe], 12 мг NaHCO₃ и 12 мг (BOC)₂O растворяют в 10 мл смеси ДМФ/вода (7/3) и выдерживают при комнатной температуре при перемешивании в течение ночи. После удаления растворителя указанный в заголовке продукт выделяют хроматографией на силикагеле с применением системы метиленхлорид/метанол/уксусная кислота_50% (8/2/0,25) в качестве подвижной фазы.

б) цикло[4-(DTPA-NH-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro-Phe-DTrp- Lys) -Boc)-Tyr(Bzl)-Phe] 120 мг DTPA-гидразида растворяют в 5 мл ДМФ и доводят до pH 3 добавлением по каплям смеси диэтиловый эфир/3N HCl. После охлаждения до -15^o в реакционную смесь добавляют 4 мкл трет- бутилнитрита и раствор из 15 мг соединения, полученного выше в а), в 3 мл ДМФ, содержащего 15 мкл основания Хюнига (Hunig). По истечении 4 часов растворитель удаляют выпариванием, и удаляют защиту полученного остатка без какой-либо дополнительной очистки.

в) цикло[4-(DTPA-NH-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro-Phe-DTrp-Lys- yr(Bzl)-Phe] Неочищенный продукт со стадии б) обрабатывают 5 мл смеси TFA/вода (95/5) при 0^o в течение 10 минут. После разбавления 50 мл воды раствор непосредственно переносят на колонку RP18-HPLC и элюируют градиентом вода/ацетонитрил/TEA_0,1%. Чистые фракции объединяют и лиофилизируют.

FAB-MS: 1436,6 ПРИМЕР 47 Соединение из Примера 46 в), меченое ¹¹¹In 1 мг соединения из Примера 46 в) растворяют в 5 мл 0,01М раствора уксусной кислоты. Полученный раствор пропускают через 0,22-микронный фильтр Millex -GV (товарный знак зарегистрирован), делят на порции по 0,1 мл и хранят при -20^o. ¹¹¹InCl₃ (Amersham, 1 мкюри/100 мкл) предварительно разбавляют равным объемом 0,5М раствора ацетата натрия и проводят мечение путем смешивания лиганда с раствором InCl₃ и мягкой гомогенизации при комнатной температуре.

Затем добавляют буфер HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2- этансульфоновая кислота) с pH 7,4 и получают раствор концентрации 10^-6 М.

ПРИМЕР 48 цикло[4-(DOTA-NH-C₂H₄-NH-CO-O)Pro-Phe-DTrp-Lys-Ser (Bzl)-Phe] M.S.: 1371,57 Это соединение метят изотопом ⁹⁰Y следующим образом: 20 мкл ⁹⁰Y (1,2 мкюри, 0,04М HCl) добавляют к 20 мкл из 50 мкМ указанного выше соединения (0,15 М NH₄= Ac, 0,3% BSA (бычий сывороточный альбумин), pH 4,5). Этот раствор инкубируют при 100^o в течение 15 минут. Отбирают аликвоту и разбавляют ее 4 мМ DTPA (pH 4,5) перед тем, как анализировать с помощью колонки C18 HPLC с обращенной фазой для определения количества свободного нехелатного ⁹⁰Y в реакционной смеси (по присутствию [⁹⁰YDTPA]^2-).

ПРИМЕР 49 116 мг соединения из Примера 46 а), 12 мг NaCNBH₃ и 2 эквивалента соответствующего альдегида растворяют в 25 мл смеси DMF/HOAc_1% и выдерживают при 60^o до тех пор, пока исходный материал можно будет определить тонкослойной хроматографией (TLC). После удаления растворителя остаток очищают хроматографией на силикагеле (метиленхлорид/метанол/HOAc_50% 9/1/0,125 ---> 8/2/0,25) для того, чтобы разделить моно- и диалкилированный конечный продукт.

1) Альдегид: (D)-глюкоза X₁ = HOCH₂-(CHOH)₄-CH₂- X₂=H E.S. -MH⁺ = 1225,4 2) Альдегид: (D)-глюкоза X₁ = X₂= HOCH₂-(CHOH)₄-CH₂- E.S. -MH⁺ = 1389,6 3) Альдегид: 2,3-O-изопропилилен-(D)-глицеральдегид X₁ = HOCH₂-CHOH-CH₂- X₂ = H 4) Альдегид: 2,3-O-изопропилиден-(D)-глицеральдегид X₁ = X₂ = HOCH₂-CHOH-CH₂- E.S. -MH⁺ = 1209,4 5) Альдегид: гидроксиацетальдегид X₁ = X₂ = HOCH₂-CH₂- E.S. -MH⁺ = 1149,4 Как в свободной форме, так и в форме фармацевтически приемлемых солей и комплексов соединения по данному изобретению демонстрируют ценные фармакологические свойства, о которых свидетельствуют испытания как in vivo, так и in vitro, и являются, таким образом, показанными для лечения.

В частности, соединения по данному изобретению связываются с по меньшей мере одним подтипом рецепторов к соматостатину. Клонированы и описаны 5 подтипов рецепторов к соматостатину: SST-1, SST-2, SST-3, SST-4 и SST-5.

hSST-1, hSST-2, hSST-3 и их последовательности известны (Y. Yamada et al. in Proc. Nat. Acad. Sci., 89, 251-255 (1992)). hSST-4 и его последовательность известны (L. Rohrer et al. in Proc. Acad. Sci., 90, 4196-4200 (1993)). hSST-5 и его последовательность известны (R. Panetta et al. in Mol. Pharmacol. 45, 417-427, 1993).

Анализ связывания может быть проведен, как описано ниже, используя мембраны, приготовленные из селективных по отношению к hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 или hSST-5 линий клеток, например клеток CHO, стабильно экспрессирующих hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 или hSST-5.

Используют ткань мозга или гипофиза, в которой визуализируют hSST посредством, например, гибридизации in situ и/или ауторадиографии рецепторов. Мембраны приготавливают в соответствии с известными способами (JC. Reubi et al. in J. Clin. Endocrinol. Metab. 1987, 65, 1127-1137). Мембраны, приготовленные из селективных по отношению к hSST линий клеток, например клеток CHO, стабильно экспрессирующих hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 или hSST-5, трижды инкубируют в общем объеме 300 мкл при температуре 22^oC в течение 30 минут с возрастающими концентрациями: [¹²⁵I-Tyr³]-октреотида в буфере Hepes (pH 7,6) с концентрацией 10 ммоль/л, содержащем 0,5% BSA. Инкубацию прерывают посредством быстрой фильтрации через стекловолоконные фильтры Whatman GF/B, каждый из которых затем промывают четыре раза 5 мл охлажденного на льду раствора 10 ммоль/л Трис/150 ммоль/л NaCl. Фильтры обсчитывают в счетчике LKB с эффективностью подсчета 78%. Специфическое связывание представляет собой общее связывание минус неспецифическое связывание в присутствии 1 мкмоль/л соматостатина-14. Эксперименты проводят трижды. Константу сродства (K_d) и количество сайтов связывания рассчитывают, исходя из графиков данных по Statchard.

ИК₅₀ (концентрация, при которой ингибирование составляет половину от максимального в конкурентном анализе связывания с использованием [¹²⁵I-Tyr³] -октреотида, т. е. того же радиолиганда, что указан выше) соединений по данному изобретению, указанных, например, выше, в вышеописанных анализах связывания с hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 и/или hSST-5 находится, соответственно, в диапазоне нМолей, а предпочтительно составляет от 0,1 до 10 нМ (см. табл. 2).

Более того, соединения по данному изобретению обладают способностью ингибировать высвобождение гормона роста (GH), о чем свидетельствует ингибирование высвобождения GH из культуры клеток гипофиза in vitro. Передние доли гипофизов взрослых крыс-самцов нарезают на маленькие кусочки и диспергируют, используя 0,1%-ный трипсин в 20 мМ буфере Hepes. Диспергированные клетки выращивают в течение четырех дней в MEM(Gibco), дополненной 5% фетальной телячьей сыворотки, 5% лошадиной сыворотки, 1 мМ NaHCO₃, 2,5 нМ дексаметазона, 2,5 мг/мл инсулина и 20 Ед/мл пенициллина/стрептомицина. В день эксперимента присоединившиеся клетки дважды промывают средой Кребса-Рингера (Krebs-Ringer), забуференной 2 мМ Hepes и дополненной 5 мМ глюкозы и 0,2% BSA. Затем клетки инкубируют с исследуемым соединением в присутствии фактора высвобождения гормона роста в концентрации 310^-10 М в течение от 2-4 часов. Количество высвобождаемого в среду гормона роста измеряют посредством радиоиммунного анализа (RIA). Соединения по изобретению ингибируют высвобождение GH зависимым от концентрации образом от 10^-11 до 10^-6 М. ИК₅₀ соединения по Примеру 2 составляет 0,4 нМ.

Соединения по изобретению также ингибируют высвобождение инсулина и/или глюкагона, о чем свидетельствуют стандартные опыты на крысах-самцах. Исследуемое вещество вводят в различных, изменяющихся логарифмически, дозах, применяя каждую дозу у по меньшей мере 5 крыс. Через 1 час после подкожного введения исследуемого вещества производят забор крови. Определение уровня инсулина и глюкагона в крови производят посредством радиоиммунного анализа. В данном опыте соединения по данному изобретению активны при введении их в дозах от 0,02 до 1000, например 10 мкг/кг подкожно. ЕК₅₀ соединения по Примеру 9 в отношении секреции инсулина составляет 1,8 мкг/кг подкожно.

Соединения по изобретению, соответственно, являются полезными в лечении заболеваний, этиология которых состоит в избыточной секреции гормона роста или связана с ней, например в лечении акромегалии, а также в лечении сахарного диабета (в особенности его осложнений, таких как ангиопатия, пролиферативная ретинопатия, феномен "утренней зари" и нефропатия) и прочих метаболических расстройств, связанных с высвобождением инсулина или глюкагона.

Соединения по изобретению также ингибируют секрецию кислого желудочного содержимого, эндокринную и экзокринную секрецию поджелудочной железы и секрецию различных пептидов в желудочно-кишечном тракте, о чем свидетельствуют стандартные опыты, например на крысах с желудочными или панкреатическими фистулами, в которых соединения по данному изобретению активны в дозах от 0,01 до 10 мг/кг.

Таким образом, соединения по изобретению также являются полезными в лечении желудочно-кишечных заболеваний, например в лечении пептических язв, кишечных и панкреатических свищей, синдрома и болезни "раздраженной" кишки, демпинг-синдрома, синдрома водянистой диарреи, диарреи, связанной со СПИДом или обусловленной химиотерапией, острого или хронического панкреатита и опухолей, секретирующих гастроинтестинальные гормоны (например, випом, глюкагоном, инсулином, карциноидов и т.п.), а также желудочно-кишечных кровотечений.

Соединения по изобретению также эффективны при лечении опухолей, содержащих рецепторы к соматостатину, в особенности опухолей, содержащих hSST-1, hSST-2, hSST-3, hSST-4 и/или hSST-5, на что указывают результаты исследования пролиферации различных линий