Обнаружение и лечение рака

Обнаружение и лечение рака

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к обнаружению и лечению рака. Способ включает стадию введения меченых антител или меченого альфа-фетопротеина в биологическую пробу пациента с тем, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию с рецептором альфа-протеина в биологической пробе. Следующей стадией служит определение связывающих сторон рецептора альфа-протеина в биологическом материале, которые вступили в реакцию с мечеными антителами или альфа-протеином, для обнаружения рака. Предпочтительно, до стадии введения выполнить стадию исследования биологической пробы пациента. Способ включает стадию введения антитела к рецептору альфа-фетопротеина в пораженные раком клетки пациента. Затем следует стадия реакции антител рецептора альфа-фетопротеина с рецептором альфа-фетопротеина зараженных раком клеток для угнетения роста зараженных раком клеток или омертвения зараженных раком клеток. Изобретение включает также способ наблюдения за пациентом, способ лечения пациента от рака. Затем следует стадия проведения тестов у пациента в заранее установленные сроки после лечения на уровни размеров рецептора альфа-фетопротеина. Техническим результатом изобретения является создание высокоспецифичного метода диагностики и лечения рака. 5 с. и 19 з.п.ф-лы, 1 табл., 10 ил.

Настоящее изобретение относится к обнаружению и/или лечению рака. А именно, по настоящему изобретению используется наличие рецептора альфа-фетопротеина в качестве основы для обнаружения рака, сдерживания распространения или избавления от рака.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Двадцать лет назад Абелев и соавторы представили отчет о существовании первого карциноэмбрионального антигена - альфа-фетопротеина (АФП) [Абелев Г. И., Перова С.Д., Храмкова Н.И., Постникова 3.А. и Ирлин И.С., Трансплантация 1, 174, (1963)]. Хотя данный протеин является основным циркулирующим протеином во время эмбрионального периода, он практически исчезает после рождения, нормальная концентрация в сыворотке взрослого человека - ниже 50 мг/мл [Ruoslahti, Е. and Seppals, М. Int. J. Cancer 8, 374 (1971)]. Однако в случае некоторых злокачественных заболеваний, таких как печеночно-клеточный рак или эмбриональный рак, уровень плазмы может быть в тысячу раз выше [Ruoslahti, Е. and Seppals, М. Adv. Cancer Res., 29, 275 (1979)]. Данное открытие привлекло внимание не только практикующих врачей, которые предусмотрели новый способ обнаружения злокачественности и контроля за страдающими от рака пациентами, но и интерес исследователей, изучающих физиологию данного протеина во время эмбрионального периода.

Одним из первых изучаемых параметров было распределение альфа-протеина в эмбрионе. Используя способ иммунопериокисления, Бенно и Уильяме описали распределение альфа-фетопротеина в развивающемся мозгу крысы [Benno, R.H. and Williams, T. H. , Brain Res. 142, 1982 (1978)]. Некоторое время спустя ряд исследований указал на локализацию протеинов плазмы в пределах развивающихся нервных клеток различных видов, включая птиц и людей [Trojan, J. and Uriel, J. , J. Oncodevelop. Biol. Med. 1, 107, (1980); Uriel, J., Trojan, J., Dubouch, P. and Pieiro, A., Path. Biol. 30, 79 (1982); Moro, R. and Uriel, J., J. Oncodevelop. Biol. Med. 2, 391 (1981); Dziegielewska, K.M., Evans, C.A.N. , Lorscheider, E.L., Malinowska, D.H., Mollgard, K., Reynolds, M.L., and Saunders, N.R., J. Physiol. 318, 239 (1981); Mollgard, К., Jacobsen, M., Krag-Jacobsen, G., Praetorius-Claussen, P. and Saunders, N.R., Neurosci. Lett. 14, 85 (1979)]. Для определенной ткани или органа динамика окраски альфа-фетопротеина и сывороточного альбумина следует довольно постоянному паттерну у различных видов [Uriel, J., Trojan, J., Moro, R. and Pieiro, A., Ann. N.Y. Acad. Sci. 417, 321 (1983)]. Когда нервная структура недоразвита, внутриклеточный альфа-фетопротеин или сывороточный альбумин не обнаруживаются. Затем внезапно и на некоторое время, в зависимости от вида, оба протеина наблюдаются одновременно даже в пределах одной клетки [Torand-Allerand, C.D. Nature 286, 733 (1980)]. Затем интенсивность окраски постепенно снижается и количество положительных клеток уменьшается, сначала для альфа-фетопротеина, затем для сывороточного альбумина. Развитые структуры являются отрицательными для обоих протеинов. Другие составные элементы сыворотки, такие как иммуноглобулин или овальбумин куриного зародыша никогда не обнаруживаются в нервных клетках во время эмбрионального периода, несмотря на их присутствие в цереброспинальной жидкости [Fielitz, W., Esteves, A. And Moro, R., Dev. Brain Res. 13, 111 (1984)].

Поглощение альфа-фетопротеина эмбриональными клетками.

Одним вопросом, возникшим в результате данных начальных наблюдений, является вопрос о том, что происходит ли поглощение альфа-фетопротеина и сывороточного альбумина от внеклеточных источников или они синтезированы in situ. В то время как все еще неясно, способны ли нервные клетки к синтезу протеинов плазмы [Ali, М. , Raul, Н. and Sahib, М. Dev. Brain Res. 1, 618 (1981); Ali, М., Mujoo, К. and Sahib, М. Dev. Brain Res. 6, 47 (1983); Schachter, B.S. and Toran-Allerand, C.D., Dev. Brain Res. 5, 95, (1982); Pieiro, A. , Calvo, M., Iguaz, F., Lampreave, F. and Naval, J. Int. J. Biochem. 14, 817 (1982)], было показано как in vitro [Uriel, J., Faivre-Bauman, A., Trojan, J. , and Foiret, D. Neurosci. Lett. 27, 171 (1981); Hajeri-Germond, M., Trojan, Uriel, J. and Hauw, J.J. Dev. Neurosci. 6, 111 (1984)], так и in vivo [Villacampa, M. J. , Lampreave, F., Calvo, M., Pieiro, A. and Uriel, J. Dev. Brain Res. 12, 77 (1984); Moro, R., Fielitz, W., Grunberg, J. and Uriel, J. , Int. Dev. Neurosci 2, 143 (1984)], что нейробласт может легко поглощать альфа-протеин и сывороточный альбумин из внеклеточных источников. Были проведены эксперименты in vivo с гомологичным и гетерологичным протеинами. В первом случае [Villacampa, M.J., Lampreave, F., Caivo, M., Pieiro, A. and Uriel, J. Dev. Brain Res. 12, 77 (1984)] было показано, что при введении беременным крысам 125I-альфа-фетопротеин локализируется в мозгу зародыша, а также в других органах зародыша, таких как кишка, кожа и язык, органах, в которых до этого был обнаружен природный внутриклеточный альфа-фетопротеин [Trojan, J. and Uriel, J., J. Oncodev. Biol. Med. 3, 13 (1982)]. Вторая серия экспериментов [Moro, R., Fielitz, W., Grunberg, J. and Uriel, J., Int. J. Dev. Neurosci 2, 143 (1984)] показала, что, когда сыворотка новорожденной крысы была введена в полость среднего мозга куриного зародыша, альфа-фетопротеин и сывороточный альбумин крысы могли быть обнаружены в тех же самых местах, как и их природные эквиваленты. Это также указывает на то, что альфа-фетопротеин и сыворотный альбумин одного вида принимаются клетками других видов, таким образом указывая на структуры и механизмы, сохранившиеся в процессе эволюции. Это в свою очередь, предполагает включение основного биологического начала.

Несмотря на высокую концентрацию вводимого иммуноглобулина крыс, окраска данного протеина была отрицательной. Это не является результатом высокого молекулярного веса (150000), который мог бы препятствовать пассивной диффузии, поскольку овальбумин (молекулярный вес = 43000) не мог быть обнаружен даже в том случае, когда он был введен в концентрации, в два раза превышающей нормальную молярную концентрацию альфа-фетопротеина в эмбрионной цереброспинальной жидкости [Fielitz, W. , Esteves, A. and Moro, R., Dev. Brain Res. 13, 111 (1984)]. Эта селективность говорит в пользу гипотезы об специфичном рецепторно опосредованном механизме эндоцитоза [Moro, R. and Uriel, J. , J. Oncodevelop. Biol. Med. 2, 391 (1981); Moro, R., Fielitz, W., Grunberg, J. and Uriel, J., Int. J. Dev. Neurosci. 2, 143 (1984)].

Поглощение альфа-фетопротеина зависит от дифференциации клеток.

Однако в настоящее время все еще не ясно, является ли поглощение альфа-фетопротеина и сывороточного альбумина явлением, зависящим от клеток, или когда окраска исчезает, результатом низкой способности внеклеточного протеина ввиду закрытия гематоэнцефалического барьера или низкой концентрации циркулирующего альфа-фетопротеина в конце эмбрионального периода. Было показано сначала на куриных зародышах [Moro, R., Neurosci. Lett. 41, 253 (1983)] , затем и на человеческом зародыше [Jacobsen, М., Lassen, I.C. and Mollgard, К., Tumor Biol. 5, 55 (1984)], что позвоночные ганглиозные нервные клетки проходят полный отрицательно-положительный-отрицательный цикл окрашивания для альфа-фетопротеина до того, как сыворотка достигает наивысшего пика. Более того, когда альфа-фетопротеин становится необнаруживаемым, сыворотный альбумин присутствует на протяжении некоторого времени, таким образом указывая, что данные сывороточные протеины достигают ганглиозных нейробластов.

Рецепторы альфа-фетопротеина в недоразвитых клетках.

Принятие клетками альфа-фетопротеина предполагает существование специфичного рецептора, экспрессия которого регулируется в зависимости от степени дифференциации клетки [Uriel, J., Trojan, J., Moro, R. and Pieiro, A., Ann. N. Y. Acad. Sci. 417, 321 (1983); Moro, R., Neurosci. Lett. 41, 253 (1983)]. Предыдущий отчет [Uriel, J., Bouillon, D., Russel, C. and Dupiers, M., Proc. Nat. Acad. Sci. U. S.A. 73, 1452 (1976)] показал присутствие двух ультрацентрифугированных фракций, содержащих альфа-фетопротеин в недоразвитой цитозоли крысы: 4-ой фракции, полностью соответствующей альфа-фетопротеину и 8-ой фракции, в которой иммунологическое обнаружение альфа-фетопротеина было возможно только после обработки с 0,4 моль KCl. Эта обработка преобразовывала 8-ую фракцию в 4-ую. Весьма вероятно, что 8-ая фракция соответствовала комплексу рецептор-альфа-фетопротеин, который был диссоциирован при высоких концентрациях KCl, хотя в то время еще не появилось понятие о рецепторе альфа-фетопротеина. Эту диссоциацию комплекса рецептор-альфа-фетопротеин с KCl также наблюдали Smalley and Sarcione [Smalley, J.R. and Sarcione, E.J. Bioch. Biophys. Res. Comm. 94, 1429, (1980)], которые также представили доказательство того, что молекула альфа-фетопротеина могла бы быть синтезирована недоразвитыми клетками матки крысы.

Экспрессия рецептора альфа-фетопротеина в зараженных раком клетках.

Поскольку раковые клетки имеют ряд общих биохимических и антигенных признаков с эмбриональными клетками [Uriel, J., Adv. Cancer. Res. 29, 127, (1979)] , возможно, что клетки злокачественного новообразования, полученные от тканей, поглощающих альфа-фетопротеин во время эмбрионального периода, могут повторно экспрессировать соответствующий рецептор и таким образом еще раз принять альфа-фетопротеин. В поддержку данной гипотезы Sarcione et al. [Sarcione, E.J., Zioty, M., Delluorno, D.S., Mizejewski, G and Jacobson, H., Cancer Res. 43, 3739 (1983)] обнаружили альфа-фетопротеин в 8-ом комплексе, полученном из раковой опухоли молочной железы человека, который мог бы быть диссоциирован при обработке KCl таким же образом, как и в опытах, использующих недоразвитые цитозоли крыс. Недавно данные авторы продемонстрировали, что альфа-фетопротеин синтезируется линией клеток рака молочной железы человека MCF-7 в качестве комплекса, который необходимо подвергнуть диссоциации для возможности иммунологического обнаружения альфа-фетопротеина [Sarcione, E.J. and Hart, D., Int. J. Cancer 35, 315 (1985)]. С другой стороны, эта клеточная линия [Uriel, J., Failly-Crepin, C., Villacampa, M.J., Pieiro, A., and Gueskens, M., Tumor Biol. 5, 41 (1984)] и инфицированная никелем рабдомисаркома крысы [Uriel, J., Puopon, M.F. and Geuskens, M., Br. J. Cancer 48, 263 (1983)] показывает захват альфа-фетопротеина in vitro. В качестве подтверждения этих непрямых результатов поверхностные рецепторы для альфа-фетопротеина были обнаружены у линии MCF-7 [Villacampa, M.J., Moro, R. , Naval, J., Failly-Crepin, Ch., Lampreave, F. and Uriel, J., Bioch. Biophys. Res. Commun. 122, 1322 (1984)]. Связующие параметры указывают на двухсайтовую рецепторную модель, обладающую положительной кооперацией. Участок высокого сродства имеет Kd 1,5 х 10-9 M с n-2000/клетку. Участок низкого сродства, представленный при 320000/клетку, имеет Kd 2,2 х 10-7 M. Более поздние исследования показали наличие подобной рецепторной системы на поверхности лимфатических клеток YACT мыши, которая отсутствует у T-клеток нормальной взрослой мыши [Naval, J., Villacampa, M.J., Goguel, A.F. and Uriel, J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3301 (1985)].

Эти исследования были проведены параллельно с экспериментами in vivo, при которых в опухоли молочной железы спонтанно рожающей мыши вводят радиойодированный альфа-фетопротеин. Тканевое распределение радиоактивности показало соотношение опухолевой/нормальной ткани (печени) как 3,6 [Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. and Failly-Crepin, Ch. C.R. Acad. Sci. (Paris) 297, 589 (1983); Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. and Failly-Crepin, C., Cancer Res. 44, 5314 (1984)]. Ауторадиография опухолевых участков данных животных показала значительное накопление серебряных зернышек вокруг мембраны ядра злокачественных клеток, но не здоровых клеток [Uriel, J. , Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. and Failly-Crepin, C., Cancer Res. 44, 5314 (1984)].

Сцинтриграфическая визуализация опухолей мыши с использованием 131I-альфа-фетопротеина Используя ¹³¹I-альфа-фетопротеин, были получены положительные сцинтриграфические изображения опухолей молочной железы мыши размером 3-4 мм [Uriel, J. , Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. and Failly-Crepin, C., Cancer Res. 44, 5314 (1984); Moro, R., Heuguerot, C., Vercelli-Retta, J., Fielitz, W. , Lpez, J. J. and Roca, R. Nuclear Med. Comm. 5, 5 (1984)]. В действительности, одиннадцать из двенадцати случаев подобной опухоли были обнаружены с помощью стандратной гамма-камеры, подсоединенной к компьютеру. Другая опухоль мыши, нейробластома, могла быть также сканирована подобным образом [Hajeri-Germond, М. , Naval, J., Trojan, J. and Uriel, J., Br. J. Cancer 51, 791 (1985)].

Экспрессия захвата альфа-фетопротеина или прямое доказательство рецептора альфа-фетопротеина было показано на нескольких различных типах опухолей, таких как: рабдомиосаркома крысы [Uriel, J., Puopon, M.F. and Geuskens, М. , Br. J. Cancer 48, 263 (1983)], нейробластома мыши [Hajeri-Germond, М., Naval, J., Trojan, J. and Uriel, J., Br. J. Cancer 51, 791 (1985)], рак молочной железы мыши и человека [Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J., Failly-Crepin, Ch. , Lampreave, F. and Uriel, J., Bioch. Biophys. Res. Commun. 122, 1322 (1984); Naval, J., Villacampa, M.J., Goguel, A.F. and Uriel, J. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3301, (1985); Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro, R. , Naval, J., and Failly-Crepin, Ch., C.R. Acad. Sci. (Paris) 297, 589 (1983); Uriel, J., Villacampa, M.J., Moro, R., Naval, J. and Failly-Crepin, Ch., Cancer Res. 44, 5314 (1984); Moro, R., Heuguerot, C., Vercelli-Retta, J. , Fielitz, W., Lpez, J.J. and Roca, R., Nuclear Med. Comm. 5, 5 (1984); Biddle, W. and Sarcione, E.J. Breast Cancer Res. Treat. 10, 281 (1987)] , T-лимфомы мыши [Naval, J. , Villacampa, M.J., Goguel, A.F. and Uriel, J. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3301 (1985)], лимфомас T-клеток и C-клеток человека [Laborda, J., Naval, J., Aliouche, M., Calvo, M., Georgoulias, V. , Mishal, Z. and Uriel, J. Int. J. Cancer 40, 314 (1987)]; Calvo, M., Laborda, J., Naval, J., Georgoulias, V. and Uriel, J., представлено на XIII заседании ISOBM (Париж 1985); Torres, J.M., Anel. A. and Uriel, J. , J. Cell Physiol. 150, 458 (1992); Torres, J.M., Gueskens, M. and Uriel, J. Int. J. Cancer 47, 112 (1991)], а также фитогемагглютинин, возбужденный T-лимфоцитами человека [Torres, J.M., Laborda, J., Naval, J., Darracq, N., Calvo, M. , Mishai, Z. and Uriel, J. Mol. Immunology 26, 851 (1989)], линия моноцитных клеток злокачественного новообразования U937 [Suzuki, Y., Zeng, C. Q. , Alpert, E. J. Clinic. Invest. 90, 1530 (1992)] и линия клеток рака толстой кишки человека НТ29 [Esteban, С., Gueskens, M. and Uriel, J., Int. J. Cancer 49, 425 (1991)].

Данные открытия указывают на положение рецептора альфа-фетопротеина как широко распространенного карциноэмбрионального антигена, относящегося к наличию злокачественной опухоли, а не к типу новообразования.

Моноклональные антитела против рецептора альфа-фетопротеина.

Меченый альфа-фетопротеин (FITC, радиоактивный индикатор) не связывается с опухолевыми клетками на срезах парафиновой ткани вероятно ввиду частичной денатурации связывающих рецепторы сайтов в процессе фиксации и ввиду сравнительно низкого сродства, которое он проявляет по отношению к рецептору. Таким образом моноклональные антитела в отношении рецептора альфа-фетопротеина были продуцированы с помощью пула рака молочной железы человека в качестве иммуногена [Moro, R., Tamaoki, T., Wegmann, T.G., Longenecker, В.М. and Laderoute, М.Р. Tumor Biol. 14, 116 1993), включенная с ссылкой].

Два иммуногена, производящие моноклональные антитела, распознают 67 KD двойной связки на геле PAGE в невосcтанавливающих условиях. 67 KD связки также реагируют с ¹²⁵I-альфа-фетопротеином. Данные моноклональные антитела вступают в реакцию со связующим сайтом рецептора альфа-фетопротеина, поскольку они ингибируют связывание альфа-фетопротеина с опухолевыми клетками, и наоборот, они ингибируют связывание с клетками в присутствии большого избытка альфа-фетопротеина. Моноклональные антитела не взаимодействуют с альфа-фетопротеином. Они распознают эмбриональные клетки и раки молочной железы на срезах ткани, но не аденомы молочной железы или большинство других здоровых развитых тканей.

На протяжении последних десятилетий ученые пытались охарактеризовать антигены, связанные со злокачественными образованиями. Рецептор альфа-фетопротеина, который должен рассматриваться как карциноэмбриональный антиген, мог бы соответствовать многим требованиям, предъявляемым к клинически используемому маркеру опухоли.

Дальнейшая работа с использованием моноклональных антител против данного широко распространенного антигена, относящегося к раку, позволит установить их клиническую полезность, а также изучить физиологическую роль рецептора альфа-фетопротеина.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Данное изобретение относится к способу обнаружения рака у пациента. Способ включает стадии введения меченых антител или меченого альфа-фетопротеина в биологическую пробу пациента, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию со связующими участками рецептора альфа-фетопротеина в биологической пробе. Затем следует стадия определения связующих участков рецептора альфа-фетопротеина в биологическом материале, которые вступают в реакцию с мечеными антителами или меченым альфа-фетопротеином для определения наличия рака. Желательно до стадии введения взять биологическую пробу из организма пациента.

Настоящее изобретение относится к способу лечения раковых клеток у пациента. Данный способ включает стадии введения антител рецептора альфа-фетопротеина в раковые клетки пациента. Затем следует стадия реакции антител рецептора альфа-фетопротеина с рецептором альфа-фетопротеина раковых клеток для угнетения роста раковых клеток или омертвения раковых клеток.

Настоящее изобретение относится к способу наблюдения за пациентом. Способ включает стадии лечения рака у пациента. Затем следует стадия проведения тестов у пациента в заранее установленные сроки после лечения уровней клеточного рецептора альфа-фетопротеина.

Настоящее изобретение относится к способу лечения пациента. Данный способ включает стадии проведения тестов у пациента на рецептор альфа-фетопротеина. Затем следует стадия введения антител рецептора альфа-фетопротеина или альфа-фетопротеина в организм пациента для реакции с раковыми клетками пациента в случае, если тесты указывают на наличие рецепторов альфа-фетопротеина у пациента.

Настоящее изобретение относится к способу лечения раковых клеток пациента. Данный способ включает стадии введения модифицированного альфа-фетопротеина в раковые клетки пациента. Затем следует стадия взаимодействия модифицированного альфа-фетопротеина с рецептором альфа-фетопротеина раковых клеток для угнетения роста раковых клеток или омертвения раковых клеток.

Целью изобретения является диагностика и последующий контроль за раковыми заболеваниями и беременностью путем обнаружения рецептора альфа-фетопротеина в жидкостях организма и тканях. Хотя принципы и способы обнаружения рецептора альфа-фетопротеина в растворе (общая вода организма) или твердой основе (срезы ткани) похожи, они будут описаны отдельно для наведения ясности.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Предпочтительное осуществление изобретения и предпочитаемые способы применения изобретения приводятся в прилагаемых чертежах: Фиг. 1 - диаграмма раковых и доброкачественных опухолей.

Фиг. 2 - фотография рака молочной железы, где светлые клетки - раковые.

Фиг. 3 - фотография рака молочной железы, где темно-коричневые клетки - раковые.

Фиг. 4 - доброкачественная аденома молочной железы.

Фиг. 5 - фотография рака легкого, где коричневые клетки являются раковыми клетками.

Фиг. 6 - фотография рака желудка, где темно-коричневые клетки - раковые.

Фиг. 7 - фотография рака кишки.

Фиг. 8 - диаграмма, демонстрирующая угнетение роста Р-388 рецептором альфа-фетопротеина-1.

Фиг. 9 - фотография трех животных под наблюдением наверху и четырех животных, подвергнутых лечению, через пять дней после инъекции.

Фиг. 10 - фотография животных другого опыта, в котором три животных здоровы, и два страдают от крупных опухолей.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Настоящее изобретение относится к способу обнаружения рака у пациента. Способ включает стадии введения меченых антител или меченого альфа-фетопротеина в биологическую пробу пациента с тем, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию со связующими участками рецептора альфа-фетопротеина в биологической пробе. Биологической пробой может быть кровь, слюна, ткань, сыворотка, слизь, мокрота, моча, слезы или материал, содержащий раковые клетки. Биологической пробой может быть срез ткани. Срезом ткани может быть либо неподвижная ткань, свежая ткань или замороженная ткань. Антителами могут быть моноклональные антитела или поликлональные антитела. Затем следует стадия определения связующих участков рецептора альфа-фетопротеина в биологическом материале, которые вступили в реакцию с мечеными антителами или меченым альфа-фетопротеином для определения наличия рака. Желательно до стадии введения провести стадию получения биологической пробы из организма пациента.

Стадия введения может включить стадию введения антител, меченных радиоизотопом, или альфа-фетопротеина, меченного радиоизотопом, в биологическую пробу пациента с тем, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию с рецептором альфа-фетопротеина в биологической пробе. Определяющая стадия включает стадию определения наличия радиоактивности в биологической пробе или может включать стадии покрытия биологической пробы фотографической эмульсией, проявления фотографической эмульсии и наблюдения за биологической пробой с покрытием. Альтернативно биологической пробой является пациент, и стадия введения включает введение в организм пациента антител, меченных радиоизотопом, или альфа-фетопротеина, меченного радиоизотопом.

При альтернативном осуществлении стадия введения включает стадию введения антител, меченных ферментом, или альфа-фетопротеина, меченного ферментом, в биологическую пробу пациента с тем, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию со связующими участками рецептора альфа-фетопротеина в биологической пробе. Антитело, меченное ферментом, или альфа-фетопротеин, меченый ферментом, изменяют цвет биологической пробы с известным цветом для определения наличия рака. Фермент может переокислиться, и стадия введения может включить стадия введения антитела, меченного перекисным соединением, в ткань пациента. Альтернативно стадия введения может включить стадии помещения капли биологической пробы на участок на нитроцеллюлозу или нейлон и добавления антитела, меченного перекисным соединением, к участку. Определяющая стадия включает стадию определения, поменял ли цвет участок на нитроцеллюлозе или нейлоне.

При другом осуществлении изобретения антитело, меченное ферментом, или альфа-фетопротеин, меченный ферментом, выделяет ионы, которые изменяют электрическую проводимость раствора, в котором помещена биологическая проба. Определяющая стадия включает стадию измерения электрической проводимости раствора для определения наличия рака в биологической пробе.

При другом осуществлении изобретения стадия введения может включать стадию введения антител, меченных флюорохромом, или альфа-фетопротеин, меченный флюорохромом, в биологическую пробу пациента с тем, чтобы меченые антитела или меченый альфа-фетопротеин вступили в реакцию с рецептором альфа-фетопротеина в биологической пробе. Определяющая ступень включает стадии облучения биологической пробы ультрафиолетовым излучением и измерения излучения фотона из облученной биологической пробы. В качестве другого примера биологической пробой может быть мазок биологического материала, содержащего раковые клетки на предметном стекле, и определяющая стадия включает стадию обследования мазка с помощью микроскопа или флюроцитометрией.

Настоящее изобретение относится к способу лечения раковых клеток пациента. Способ включает стадии введения антител рецептора альфа-фетопротеина в раковые клетки пациента. Антителами могут быть моноклональные антитела, поликлональные антитела, антитела других видов, помимо организма пациента, или антитела, произведенные в искусственной среде от лимфоцитов такого же вида, как и в организме пациента. Затем следует стадия взаимодействия антител рецептора альфа-фетопротеина с рецептором альфа-протеина раковых клеток для угнетения роста раковых клеток или омертвения раковых клеток.

Стадия введения может включать стадию введения антител рецептора альфа-фетопротеина в организм пациента. Стадия введения включает стадию введения антител рецептора альфа-фетопротеина внутривенно в кровяное русло пациента. Альтернативно стадия введения может включать стадию введения антител рецептора альфа-фетопротеина пациенту в участок, проксимальный раковым клеткам.

Альтернативно стадия введения может включать стадию вакцинации пациента против раковых клеток. Стадия вакцинации может включать стадию введения рецептора альфа-фетопротеина вида, помимо пациента, пациенту с тем, чтобы вызвать производство антител рецептора альфа-фетопротеина пациентом против введенного рецептора альфа-фетопротеина. Антитела рецептора альфа-фетопротеина, произведенные пациентом, вступят в перекрестную реакцию с рецептором альфа-фетопротеина или раковыми клетками пациента.

Стадия реакции может включать стадию реакции рецептора альфа-фетопротеина раковых клеток пациента с антителами рецептора альфа-фетопротеина с тем, чтобы рецептор альфа-фетопротеина раковых клеток был блокирован или его функциональность была нарушена. Альтернативно антитела рецептора альфа-фетопротеина являются антителами рецептора альфа-фетопротеина, которые фиксируются на комплементе. Затем стадия реакции включает стадию реакции антител рецептора альфа-фетопротеина, которые фиксируются на комплементе, с раковыми клетками с тем, чтобы во время возникновения реакции цепи комплемента, отверстия проколаны в мембране раковых клеток, которые убивают раковые клетки.

Альтернативно, антитела рецептора альфа-фетопротеина соединяются с лекарственными препаратами или токсинами. Затем стадия реакции включает стадию реакции антител рецептора альфа-фетопротеина, соединенного с лекарственными средствами или токсинами, с раковыми клетками с тем, чтобы раковые клетки поглотили лекарственные средства или токсины, где ферменты раковых клеток отрезают лекарственные средства или токсины от антител, наносимых непоправимый ущерб или вызывающих омертвение клеток.

При другом альтернативном осуществлении антитела рецептора альфа-фетопротеина мечены радиоактивным изотопом. Затем стадия реакции включает стадию реакции меченных радиоактивным изотопом антител рецептора альфа-фетопротеина с раковыми клетками пациента с тем, чтобы радиация от меченных радиоактивным изотопом антител рецептора альфа-фетопротеина в близости от ДНК раковой клетки наносила повреждение ДНК, таким образом вызывая омертвение раковых клеток.

Настоящее изобретение относится к способу наблюдения за пациентом. Данный способ включает стадии лечения рака у пациента. Затем следует стадия проведения тестов у пациента в заранее определенные сроки после лечения уровней рецептора альфа-фетопротеина.

Настоящее изобретение относится к способу лечения пациента. Данный способ включает стадии обследования пациента на рецептор альфа-фетопротеина. Затем следует стадия введения антител рецептора альфа-фетопротеина или альфа-фетопротеина в организм пациента для проведения реакции с раковыми клетками пациента в случае, если обследование указывает на наличие рецептора альфа-фетопротеина у пациента.

Настоящее изобретение относится к лечению раковых клеток пациента. Данный способ включает стадии введения модифицированного альфа-фетопротеина в раковые клетки пациента. Модифицированный альфа-фетопротеин получен либо синтетически, либо он является частью альфа-фетопротеина. Затем следует стадия реакции модифицированного альфа-фетопротеина с рецептором альфа-фетопротеина раковых клеток для угнетения роста раковых клеток или омертвления раковых клеток.

Стадия введения может включать вливание модифицированного альфа-фетопротеина в организм пациента. Вливание может быть вливанием модифицированного альфа-фетопротеина внутривенно в кровяное русло пациента. Альтернативно вливание является вливанием модифицированного альфа-фетопротеина в организм пациента в участок, проксимальный раковым клеткам.

Стадия реакции может включать взаимодействие рецептора альфа-фетопротеина раковых клеток пациента с модифицированным альфа-фетопротеином таким образом, чтобы участки рецептора альфа-фетопротеина раковых клеток были блокированы или их функциональность была повреждена.

В общем, за исключением применения или использования альфа-фетопротеина, модифицированный альфа-фетопротеин или антитела, вступающие в реакцию с рецептором альфа-фетопротеина, вышеописанные приемы являются известными специалисту в данной области.

Способы изобретения В жидкостях организма.

Либо путем секреции, либо пассивной диффузии после омертвения клетки рецептор альфа-фетопротеина от раковых или эмбриональных тканей может быть введен в кровяное русло и затем во многие другие жидкости организма, такие как моча, слезы, слюна и т.д. Концентрация рецептора альфа-фетопротеина в жидкостях организма (включая сыворотку) будет значительно отличаться у здоровых пациентов и беременных или зараженных раком пациентов. Данный факт может использоваться в целях диагностики. Также изменение концентрации рецептора альфа-фетопротеина в жидкостях организма может быть использовано в процессе последующих наблюдений за пациентом. Например, у пациента был установлен диагноз аденокарцинома молочной железы, и сывороточная концентрация рецептора альфа-фетопротеина высокая. В результате проведенной операции опухоль была удалена. Последующие исследования рецептора альфа-фетопротеина показывают значительное уменьшение немедленно после операции, затем процесс останавливается. Тем не менее через шесть месяцев концентрация рецептора альфа-фетопротеина в сыворотке начинает увеличиваться, что указывает на рецидив или метастаз рака, что будет предшествовать традициональным клиническим или другим диагностическим способам. Предупрежденный этим недорогим тестом, предложенным выше, врач теперь будет искать злокачественную массу с помощью более сложных, дорогостоящих и, если необходимо, инвазивных способов.

В пробах тканей.

Рецептор альфа-фетопротеина присутствует в большинстве раковых клеток. Таким образом, он может быть обнаружен иммунотканевым средством или инкубацией с альфа-фетопротеином, меченным надлежащим образом (хотя он не был успешно использован на парафиновых срезах, он хорошо работает на замороженных срезах). Исходя из вышесказанного может быть произведена диагностика злокачественности. Помимо этого, используя флюоресценцию в качестве метки, только несколько положительных клеток могут быть обнаружены на срезе ткани, что сокращает возможность ошибки, совершаемой при использовании классического патологического анализа, при котором несколько раковых клеток в пределах нормальной согласно другим параметрам ткани могут быть не обнаружены. Также, поскольку экспрессия альфа-фетопротеина зависит не от анатомических изменений, а от дифференциации и биохимических изменений, существует вероятность того, что клетки, которые выглядели бы нормальными, но на самом деле находятся на ранней стадии онкогенеза, будут положительными в результате теста обнаружения рецептора альфа-фетопротеина.

Для более полного понимания, хотя и не существует принципиальной разницы и используются только незначительные различия в технологии, обнаружение рецептора альфа-фетопротеина в жидкостях организма и на срезах ткани описано далее отдельно.

Жидкости организма.

Пример 1.

По этому примеру 22 пробы сыворотки не зараженных раком пациентов и 17 проб зараженных раком пациентов были испытаны иммуноферментным анализом на концентрацию рецептора альфа-фетопротеина. Была использована следующая технология: на 96-луночный планшет иммуноферментного анализа были нанесены на 1 час или на всю ночь пробы сыворотки вышеописанных групп, разведенных 1/16384 в фосфатно-солевом буферном растворе (0,05 М РO₄, 0,15 М NaCl, pH 7,5). На некоторые лунки были нанесены подобным образом плевральный выпот пациента, страдающего от метастаз в легком при раке молочной железы, разбавленные 1/256. Данный материал, код названия которого Р89, был использован в качестве стандарта по причине его большого количества, что позволило использование Р89 в качестве стандарта для сравнения всех проб против остальных во всех опытах. После 3 обработок фосфатно-солевым буфером неспецифичные связующие участки были блокированы 1% овальбумином или желатином в фосфатно-солевом буферном растворе на 1 час. После 3 обработок 100 мкл раствора 1/200 в 1% овальбумине в фосфатно-солевом буфере асцитов моноклональных антител, полученных в мышах и направленных против рецептора альфа-фетопротеина (моноклональное антитело 167Н4, как описано в [Moro, R., Tamaoki, Т., Wegmann, T.G., Longenecker, В.М., М.Р. Tumour Biol. 14, 116 (1993)], включенная со ссылкой), был инкубирован в каждой лунке на протяжении 3 часов. Затем лунки были обработаны 3 раза фосфатно-солевым буфером и коммерческий конъюгат перекисного соединения иммуноглобулина был добавлен в концентрации, рекомендованной поставщиком (Sigma Chemicals, С. Льюис). Через час лунки были обработаны 3 раза фосфатно-солевым буфером, и цветовой субстрат для перекисного соединения был добавлен в концентрации, рекомендованной поставщиком (Sigma). Все инкубации были произведены при комнатной температуре. Через 30 минут оптическая плотность в каждой лунке достигла 405 нм, был использован стандартный счетчик Titertek. Результаты отражены на фиг.1 и далее по тексту: ОРГАН - ТИП ОПУХОЛИ 1 Яичник - Аденокарцинома 2 - Лейкоз, лимфоидный 3 Конечность - Саркома 4 Матка - Аденокарцинома 5 Мягкая ткань - Саркома 6 Яичник - Аденокарцинома, кистозная 7 Прямая кишка - Аденокарцинома 8 Таз - Карциноматоз 9 - Распространенная опухоль 10 Мозг - Астроцитома 11 Легкое - Неоплазия 12 Печень - Первичная гепатома 13 Таз - Неоплазия 14 Почка - Неоплазия (метастатическая) 15 Ободочная кишка - Неоплазия 16 Кость - Остеосаркома В таблице (см. в конце описания) указан пациент, тип опухоли и соотношение между пробой и Р89, используемого в качестве стандарта на протяжении всего изучения. Результаты указывают на то, что у всех, кроме одного, страдающих от раковых заболеваний пациентов результаты были положительными, когда порог между положительным и отрицательным был установлен на 54% Р89. Результаты не зараженных раком пациентов были все отрицательными, кроме одного, с использованием такого же порога. Независимый T-тест показал следующие результаты (используя анализ данных в Excel (ТМ)).

Т-тест: Две пробы с неравными изменениями.

Переменная 1 - Переменная 2 Средняя 84,74571 - 33,26582 Изменения 709,9173 - 300,2051 Наблюдения 16 - 22 Корреляция Пирсона N - нет Группированная варианса - 3,5 Коэффициент очистки - 24,02215 Транслокация - 6,758736 P(T т) однохвостовый - 2,72Е-07 т Критический однохвостовый - 1,710882 P(T т) двухвостовый - 5,44Е-07 т Критический двухвостовый - 2,063898 Двухвостовый анализ - p= 0,00000054, значительная цифра даже для небольшого количества рассматриваемых проб.

Пациент (не указанный в таблице), который относился к отрицательной группе контроля, был положительным. Принимая во внимание полученные данные, лечащий врач провел сканирование пациента компьютерной аксиальной томографией и обнаружил опухоль, которая оказалась злокачественной гипернефромой. Данная злокачественность была обнаружена первоначально с использованием данного теста и ЗАТЕМ была подтверждена клинически.

Фиг. 1 отражает такие же результаты, как и графа, где ось X была разделена на две части (злокачественная и незлокачественная, единицы не имеют отношения), и ось Y представляет процент Р89 для каждого пациента. Горизонтальная линия представляет 54% порога.

Пример 2.

При другом осуществлении изобретения адекватный пластмассовый или стеклянный субстрат (пластинки для иммуноферментного анализа или пробирки) покрыт моноклональными антителами против рецептора альфа-фетопротеина в надлежащей концентрации. После того как остатки моноклональных антител были вымыты, субстрат блокируется протеином или смесью аминокислоты для предотвращения неопределенной связи, и надлежащий пробный разбавленный раствор жидко