Способ направления (индукции) иммунного ответа, днк, вектор, способ лечения

Способ направления (индукции) иммунного ответа, днк, вектор, способ лечения

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и медицине и может быть использовано для направления клеточного иммунного ответа на инфекционный агент. Млекопитающему вводят трансформированные иммунные клетки, которые экспрессируют химерный рецептор, содержащий внеклеточную часть, способную распознавать инфекционный агент, внутриклеточную часть, происходящую из полипептида CD3, или Т - клеточного рецептора, или полипептида В-клеточного рецептора, или полипептида Fc-рецептора, которая обладает способностью передавать клетке сигнал на разрушение. Включение в химерный рецептор внеклеточной части CD4, распознающей и связывающей ВИЧ, и внутриклеточной части, происходящей из полипептида CD3, или Т - клеточного рецептора, позволяет передавать клетке сигнал на разрушение ВИЧ или ВИЧ-инфицированной клетки. 12 с. и 20 з.п. ф-лы, 45 ил.

Настоящее изобретение относится к функциональным T клеточным рецепторам, Fc рецепторам или B клеточным рецепторам химер, которые способны менять направление деятельности иммунной системы. Более конкретно, оно относится к регулированию лимфоцитов, макрофагов, природных киллерных клеток или гранулоцитов за счет экспрессии в указанные клетки химер, которые заставляют клетки реагировать на мишени, распознаваемые химерами. Настоящее изобретение относится также к функциональным T клеточным рецепторам, Fc рецепторам или B клеточным рецепторным химерам, которые способны управлять терапевтическими клетками для специфического распознавания и разрушения либо клеток, инфицированных специфическим инфицирующим агентом, самого инфицирующего агента, опухолевой клетки, или автоиммунно-генерированной клетки. Более конкретно, настоящее изобретение относится к продуцированию T клеточных рецепторов или Fc рецепторов химер, способных заставить цитотоксичные T лимфоциты специфически распознать и лизировать клетки, экспрессирующие протеины HIV оболочки. Поэтому настоящее изобретение предоставляет лечение от таких заболеваний, как AIDS /синдром приобретенного иммунодефицита, СПИД/, которое вызывается вирусом HIV.

Предпосылки изобретения Распознавание T клетками антигена за счет рецептора T клетки является основой иммунологии. T клетки управляют тем, что называется клеточным иммунитетом. Он включает разрушение клетками иммунной системы чужеродных тканей или инфицированных клеток. Существует целый ряд T клеток, включая "хелперные" и "супрессорные" клетки, которые формируют иммунную реакцию, цитотоксичные /или "киллеры"/ клетки, которые непосредственно убивают ненормальные клетки.

T клетки, которые распознают и связывают уникальные антигены, расположенные на поверхности других клеток, становятся активированными; тогда они могут умножаться, и, если это цитотоксичные клетки, они могут убить связанную клетку.

Автоиммунное заболевание характеризуется продуцированием либо антител, которые реагируют с тканями хозяина, или иммунных эффекторных T клеток, которые являются автореактивными. В некоторых случаях автоантитела могут возникнуть за счет нормальной T- и B-клеточной реакции, активированной чужими веществами или организмами, которые содержат антигены, которые перекрестно реагируют с аналогичными соединениями в тканях организма. Примерами клинических автоантител являются антитела против ацетилхолиновых рецепторов в Myasthenia gravis; и анти-ДНК, анти-эритроцитные и анти-тромбоцитные антитела при системном lupus erythematorus.

HIV и иммунопатогенез В 1984 г. было обнаружено, что HIV является этиологическим агентом AIDS. С того времени определение СПИД было пересмотрено много раз с точки зрения того, какие критерии должны быть включены в диагноз. Однако, несмотря на флуктуации параметров диагностики, простым общим определителем СПИДа является инфицирование HIV и последующее развитие стойких конституциональных симптомов, и определяемые СПИД заболевания, такие, как вторичные инфекции, неоплазмы и неврологические заболевания. Harrizon's Principles of Internal Medicine 12^е изд., Mc. Graw Hill (1991).

HIV является ретровирусом человека группы лентивирусов. Четыре распознаваемых ретровируса человека принадлежат к двум различным группам: T лимфотропические /или лейкемия / ретровирусы человека HTLV-1 и HTLV-2, и вирусы иммунодефицита человека, HIV-1 и HIV-2. Первые представляют собой трансформирующиеся вирусы, тогда как последние являются цитопатическими вирусами.

HIV-1 был идентифицирован как наиболее часто вызывающий СПИД во всем мире. Соответствие гомологии между HIV-2 и HIV-1 составляет около 40%, причем HIV-2 более близок к некоторым членам группы вирусов иммунодефицита /SJV/. См. Cuman J. et al. Science 329:1357-1359 /1985/; Wеiss R. et al., Nature, 324:572-575 /1986/.

HIV содержит обычные ретровирусные гены /env, gag и pol/, а также шесть дополнительных генов, вовлеченных в репликацию и другие биологические активности вирусов. Как было указано ранее, общее определение СПИД состоит в глубокой иммунодепрессии, главным образом, клеточного иммунитета. Подавление иммунитета ведет к различным возможным заболеваниям, особенно к некоторым инфекциям и неоплазмам.

Основной причиной иммунодефицита при СПИДЕ, как было обнаружено, является количественный и качественный дефицит субкомплекта лимфоцитов, продуцируемых в тимусе /T/, T₄ популяции. Этот субкомплект клеток фенотипически определяется по наличию CD4 поверхностной молекулы, которая как было продемонстрировано, является клеточным рецептором для HIV. Dalgleish et al., Nature, 312: 763 /1984/. Хотя именно T клетки являются основным типом клеток, инфицируемых HIV, важно, что любые клетки человека, которые экспрессируют CD4 молекулу на своей поверхности, способны связываться с HIV и быть инфицированы им.

Традиционно, CD₄⁺ T клеткам была приписана роль хелпера/индуктора, что указывало на функцию в обеспечении активирующего сигнала на B клетки, или индуцируя T лимфоциты, которые несут реципрокный CD8 маркер и становятся цитотоксичными/супрессорными клетками. Peilihess and Schlossman Cell, 19: 821-827 /1980/ Goldstein et al., Immunol, Rev. 68:5-42 /1982/.

HIV связывается специфически и с высоким сродством, за счет участка секвенирования аминокислот в оболочке вируса /gp 120/, с частью VI участка CD4 молекулы, расположенной вблизи ее N-конца. После связывания, вирус сливается с мембраной мишеневой клетки и интернализируется. После интернализации он использует энзим обратной транскриптазы для транскрипции своей геномной РНК в ДНК, которая внедряется в клеточную ДНК, где и существует в течение жизни клетки в качестве "провируса".

Провирус может оставаться латентным или может быть активирован до транскрипции мРНК и геномной РНК, что ведет к синтезу протеинов, сборке, образованию нового вируса и бадингу вируса с поверхности клетки. Хотя точный механизм, за счет которого вирус вызывает гибель клетки, не установлен, по-видимому, основным механизмом является массивный вирусный бадинг с поверхности клетки, который приводит к разрушению плазмы мембраны и в результате к нарушению осмотического равновесия.

Во время инфицирования организм хозяина вырабатывает антитела против протеинов вирусов, включая основные гликопротеины оболочки gp120 и gp 41. Несмотря на этот гуморальный иммунитет, заболевание прогрессирует, что приводит к летальной иммуносуппрессии, которая характеризуется множественными различными инфекциями, паразитемией, слабоумием и смертью. Неспособность анти-вирусных антител хозяина остановить развитие заболевания и представляет один из наиболее тревожных и настораживающих аспектов заболевания и является плохим предзнаменованием для попыток вакцинации на основании обычных приближений.

Два фактора могут играть роль в эффективности гуморальной реакции на вирус иммунодефицита. Во-первых, также как и остальные РНК вирусы /и подобно ретровирусам, в частности/, вирусы иммунодефицита демонстрируют высокую степень мутации в ответ на иммунный контроль хозяина. Во-вторых, сами гликопротеины оболочки являются плохо гликозилируемыми молекулами, представляющими несколько эпитопов, подходящих для связывания с высоко афинными антителами. Плохая антигенная мишень, которую представляют оболочки, предоставляет хозяину мало возможностей для ограничения вирусной инфекции за счет продуцирования специфических антител.

Клетки, инфицированные вирусами HIV, экспрессируют gp 120 гликопротеин на своей поверхности. Gp 120 способствует актам слияния между CD4⁺ клетками за счет реакции, аналогичной той, с помощью которой вирус проникает в неинфицированные клетки, что приводит к образованию коротко-живущих многоядерных гигантских клеток. Образование синцития от непосредственного взаимодействия gp 120 гликопротеина оболочки с CD4 протеином. Dalgleish et al., Supra Klatrman D. et all Nature 312:763 (1984); Mc Dougal J.S. et al., Science 231: 382 (1986); Sodroski J. et al., Nature, 322:470 (1986); Zifson J.D. et al., Nature, 323:725 (1986); Sodroski, J. et al., Nature, 321:412 (1986).

Доказательством того, что CD4-gp 120 связывание ответственно за вирусную инфекцию клеток, несущих CD4 антиген, включает обнаружение того, что между gp120 и CD4 образуется специфический комплекс. Mc Dougal et al., Supra. Другие исследователи показали, что клеточные линии, которые были неинфективны для HIV, были превращены в инфицируемые клеточные линии для HIV, с последующей трансфекцией и экспрессией CD4 кДНК гена человека. Madolon et al. Cell, 46:333-348 /1968/.

Терапевтические программы на основании растворимого CD4 как пассивного агента, который помешал бы вирусной адсорбции и осуществляемой через синцитий клеточной трансмиссии, были предложены и с успехом продемонстрированы in vitro рядом исследовательских групп /Deen at al., 3321:82-84 /1988/; Fisher et al. , Nature, 331: 76-78 /1988/; Hussey et al., Nature 331:78-81 /1988/; Smith et al., Science, 238:1704-1707 /1987/; Franecker et al., Nature, 331: 84-86 /1988 /, а CD4 протеины слияния иммуноглобулина с увеличенным сроком полужизни и умеренной биологической активностью были последовательно разработаны /Nature, 337:525-531/1989/; Fraunecker et al., Nature, 339: 68-70 /1989/; Byrn et al., Nature, 344:667-670 /1990/; Zcttlemeissl at al. , DNA Cell Biol. 9:347-353 /1990/. Хотя конъюгаты CD4 иммунотоксина или протеины слияния демонстрируют потенциальную цитотоксичность для инфицированных in vitro клеток /Chaudhary et al. , Nature, 335:369-372 /1988/; Fill et. al., Science, 242:1166-1168 /1988//, латентность синдрома иммунодефицита делает маловероятным эффективность какой-либо разовой терапии по исключению основы вирусов, а антигенность чужих протеинов слияния, по-видимому, ограничит их применимость при лечении требуемыми повторными дозами. Эксперименты на обезьянах, зараженных SIV, показали, что растворимый CD4, если его вводить животным без видимой CD4 цитопении, может понизить титр SIV и повысить in vitro степень миелоидного потенциала /Watanabe et al., Nature, 337:267-270 /1989 /. Однако, после окончания лечения наблюдалось немедленное повторное появление вируса, что предполагает необходимость пожизненного введения препарата для предотвращения прогрессирующего вырождения иммунной системы.

T клетки и Fc рецепторы Поверхностная клеточная экспрессия большинства многочисленных форм T клеточного антигенного рецептора /TCR/ требует совместной экспрессии, по крайней мере, 6 различных полипептидных цепей /Weiss et al., J. Exp. Med. 160:1284-1299 /1984/; Orloffhashi et al., Nature 316:606-609 /1985/; Berghout et al., J. Biol. Chem., 263:8528 - 8536 /1988/; Sussman et al., Cell, 54: 85-95 /1988/ /; / антиген связывающих цепей, трех полипептидов CD3 комплекса и z. Если отсутствует любая из этих цепей, не происходит стабильной экспрессии остальных членов комплекса. z является лимитирующим полипептидом для поверхностной экспрессии полного комплекса /Suss man et al., Cell, 52: 85-95 /1988/ и, как известно, осуществляет, по крайней мере, часть клеточных активационных программ, которые включаются рецептором распознавания лиганда /Weiss man et al., EMBO J. 8:3651 - 3656 /1989/; Frank et al., Science, 249: 174 - 177 /1990//. 32 кДа типа I интегральный мембранный гомодимер, z /зета/ имеет 9 остаточных внеклеточных доменов, причем нет участков для присоединения I-связанных гликанов, и 112 остатков /мышиных/ или 113 остатков /человеческих/ внутриклеточных доменов /Weiss man et al., Science, 238:1018 - 1020 /1988a/; Weiss man et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:9709 - 9713 /1988b//. Изоформа z, называемая /эта/ /Baniyash et al., J. Biol. Chem., 263: 9874 - 9878 /1988/; Orloff et al., J. Biol. Chem. 264:14812 - 14817 /1989//, которые образуются в результате другого направления иРНК сплайсинга /Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:3319 - 3323 /1990/, присутствуют в пониженных количествах в клетках, экспрессирущих рецептор антигена. z - гетеродимеры, как обнаружено, осуществляют образование инозитолфосфатов, а также инициируемую рецепторами запрограммированную гибель клеток, называемую апоптозисом /Mercep et al., Science, 242:571 - 574 /1988/, Mercep et al., Science, 246:1162 - 1165 /1989//.

Подобно z и , связанная с Fc рецептором цепь экспрессируется в комплексы клеточной поверхности дополнительными полипептидами, некоторые из которых осуществляют распознавание лиганда, а другие имеют неопределенные функции.

/гамма/ имеет гомодимерную структуру и вся ее организация весьма схожа с организацией z, и она является компонентой как маст клетки /базофила с высоким сродством с IgE рецептором Fc RI, который состоит из, по крайней мере, трех различных полипептидных цепей /Blank et al., Nature, 337:187 - 189 /1989/; Ra et al., Nature, 241:752 - 754 /1989//, так и одного из рецепторов с низким сродством к IgG, представленным у мышей Fc RII /Ra et al., J. Biol. Chem J. Biol. Chem. 264:1523 - 1527 /1989//, и у человека CD16 субтипом экспрессии макрофагов и природных киллерных клеток, CD6_TM /CD16 трансмембрана/ /Zanier et al., Nature, 342:803 - 805 /1989/; Andersonet al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87:2274 - 2278 /1990//, и с полипептидом неидентифицированной функции /Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 2274-2278 /1990/. Недавно сообщалось, что экспрессируют T клеточные линии мышей, CTL, в которых он образует гомодимеры, также, как - z и - гетеродимеры /Orloff et al., Nature, 347:189 - 191 /1990//.

Fc рецепторы определяют патоцитолиз иммунных комплексов, трансцитолиз и зависимую от антител клеточную цитотоксичность /АДСС/ /Pavetch and Kinet Annu. Rev. Immunol. 9:457 - 492 /1991/; Unkeless et al., Annu, Rev. Immunol. 6: 251 - 281 /1988/; and Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 /1988/. Недавно было показано, что одна из изоформ мышиных с низким сродством Fc рецепторов /Fc R IIIBI/ определяет интернализацию Ig-покрытых мишеней в покрытые клатрином литы, и что другой рецептор с низким сродством /Fc IIA/ осуществляет ADCC за счет ассоциации с одной или более из мембран небольшого семейства "триггерных молекул" /Miettineu et al., Cell 58:317-327. /1989/; и Hunziker and Mellman J. Cell, Biol. 109:3291 - 3302 /1989/. Эти триггерные молекулы, T клеточный рецептор /TCR/ z цепи, TCR цепи и Fc рецептор цепи, взаимодействуют с доменами распознавания лиганда различных рецепторов иммунных систем и могут автономно инициировать клеточные эффекторные программы, включая цитолиз, с последующей аггрегацией /Samelson et al., Cell 43: 223-231 (1985); Weissman et al., Science 239:1018-1020 (1988): Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990); Blank et al., Nature 337: 187-189 (1989); Lanier et al., Nature 342:803-805 (1989); Kurosaki and Ravetch, Nature 342:805-807 (1989); Hibbs et al., Science 246:1608-1611 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:2274-2278 (1990); and Irving and Weiss, Cell 64:891-901 (1991).

Проводя параллели между семействами Fc рецепторов с низким сродством мышей и людей, однако, стало очевидным, что Fc IIA и C изоформы человека не содержат мышиных дубликатов. Отчасти из-за этого их функции до сих пор не определены.

Благодаря тому, что гуморальные агенты на основе CD4 могут иметь ограниченное применение in vivo, авторы изобретения начали использовать возможность придания клеточного иммунитета HIV. В результате они сообщают о получении протеиновых химер, в которых внеклеточный домен CD4 слит с трансмембранным и/или внутриклеточным доменами T клеточного рецептора, J gG Fc рецептора, или B клеточного рецепторного трансдукторного сигнального элемента. Цитолитические T клетки, экспрессирующие химеры, которые включают внеклеточный CD4 домен, демонстрируют потенциальное MHC-независящее разрушение клеточных мишеней, экспрессирующих протеины оболочки HIV. Крайне важный и новый компонент этого приближения состоит в идентификации одиночного T клеточного рецептора, или Fc рецептора, и B клеточного рецептора цепей, аггрегации которых достаточно для инициирования клеточной реакции.

Одним из особенно ценных применений этого приближения было изобретение химер между CD4 и Z, или , которые заставляют цитолитические T лимфоциты распознавать и убивать клетки, экспрессирующие HIV gp120.

Краткое содержание изобретения Хотя нативные T клетки, В клетки и Fc рецепторы являются, или могут быть, весьма сложными многомерными структурами, не позволяющими проводить с ними обычные манипуляции, настоящее изобретение демонстрирует легкость создания химер между внутриклеточным доменом любой из многочисленных молекул, которые способны выполнять задачу распознавания мишени. В частности, создание химер, состоящих из внутриклеточной части T клетки/ Fc рецепторных зета, эта или гамма цепей, присоединенных к внеклеточной части подходящим образом сконструированных молекул антител, позволяет специфически изменить направление мишеневого потенциала распознавания клеток иммунной системы на распознавание антигена за счет внеклеточного участка антитела. Таким образом, имея участки антител, способные распознавать некоторые детерминанты на поверхности патогенов, клетки иммунной системы, снабженные химерами, будут реагировать на патоген с эффекторной программой соответствующей им линии дифференцировки, например, хелперные T лимфоциты будут реагировать цитотоксичной активностью против мишени, а В лимфоциты будут активизированы на синтез антител. Макрофаги и гранулоциты будут осуществлять свод эффекторные программы, включая выделение цитокина, фагоцитов и вырабатывая реакционноспособный кислород. Аналогично, имея участок антител, способный распознавать опухолевые клетки, реакция иммунной системы на опухоль будет с выгодой усилена. Имея антитела, способные распознавать иммунные клетки, обладающие вредной реакционной способностью с самодетерминантами, автореактивные клетки могут селективно направляться на разрушение. Хотя эти примеры, описывающие использование химер антител в качестве удобного описательного инструмента, настоящее изобретение не ограничивается объемом химер антител, и, естественно, использование специфических неантительных внеклеточных доменов может дать важные преимущества. Так, например, внеклеточная часть, то есть рецептор для вируса, бактерии или паразита, клетки, снабженные химерами, будут специфически поражать клетки, экспрессирующие вирусные, бактериальные или паразитические детерминанты. Выгода такого приближения по сравнению с антителами состоит в том, что нативный рецептор для патогена может иметь уникально высокую селективность или сродство с патогеном, обеспечивая большую степень точности в получении иммунной реакции. Аналогично, для исключения клеток иммунной системы, с неправильными реакциями с самим антигеном, может оказаться достаточным соединить антиген /или его интактный протеин в случае терапии делеции B клеток/ с внутриклеточными зета, эта или гамма цепями, и за счет этого обеспечить специфическое поражение клеток, неправильно реагирующих на свои детерминанты.

Другим применением химер является контроль за популяциями клеток in vivo, следующими за другими формами генетического конструирования. Так, например, использование опухолевых инфильтрующих лимфоцитов или природных киллерных клеток для переноса цитотоксинов в определенные участки опухоли, было предложено. Настоящее изобретение обеспечивает удобные средства для регулирования количества и активности таких лимфоцитов и клеток, не удаляя их из организма пациента для амплификации in vivo. Так, благодаря тому, что внутриклеточные домены химерических рецепторов осуществляют пролиферативные реакции клеток, координирование внеклеточных доменов за счет различных стимулов аггрегации, специфичных для внеклеточных доменов /например, антител, специфичных для внеклеточных доменов/ приведет к пролиферации клеток, несущих химеры.

Хотя конкретные варианты настоящего изобретения включают химеры между зета, эта и гамма цепями или их активными фрагментами /например, описываемыми далее/, любая рецепторная цепь с аналогичными функциями к этим молекулам, например, гранулоцитам или B лимфоцитам, может быть использована для раскрытых здесь целей. Отличительные характеристики целевых иммунных триггерных молекул включают способность быть автономно экспрессированными /например, как отдельная цепь/, способность сливаться с внеклеточным доменом так, чтобы полученная химера присутствовала на поверхности терапевтической клетки, и способность инактивировать клеточные эффекторные программы после аггрегации после столкновения с мишеневым лигандом.

В настоящее время наиболее удобным способом доставки химер в иммунную клеточную систему является способ, включающий некоторые формы генетической терапии. Однако, реконструирование клеток иммунной системы химерическими рецепторами за счет смешения клеток с подходящим солюбилизированным очищенным химерическим протеином также привело бы в результате к образованию популяций сконструированных клеток, способных реагировать на мишени, распознаваемые внеклеточными доменами химер. Аналогичное приближение можно использовать, например, для введения интактного HIV рецептора, CD4, в эритроциты с терапевтическими целями. В этом случае сконструированные клетки не будут способны к самообновлению.

Настоящее изобретение относится к функционально упрощенным T клеточным рецепторным, B клеточным рецепторным и Fc клеточным рецепторным химерам, которые способны изменять направление действия иммунной системы. Более конкретно, оно относится к регулированию лимфоцитов, макрофагов, природных киллерных клеток или гранулоцитов за счет экспрессии в указанные клетки химер, которые вызывают клеточную реакцию на мишени, распознаваемые химерами. Настоящее изобретение относится также к способу направления клеточной реакции на инфицирующий агент, опухолевые или канцерогенные клетки, или на клетки, вырабатываемые автоиммунно. Способ управления клеточной реакцией у млекопитающих включает введение эффективного количества терапевтических клеток указанному млекопитающему, причем указанные клетки способны распознавать и разрушать указанный инфицирующий агент, опухолевые, раковые клетки или автоиммунно генерированные клетки.

В другом варианте способ направления клеточной реакцией на инфицирующие клетки включает введение терапевтических клеток, которые способны распознавать и разрушать указанный агент, причем агентом является специфический вирус, бактерия, простейшее или грибок. Еще более конкретно, способ направлен против таких агентов, как HIV и Pneumocystis carinii.

Специфически настоящее изобретение предлагает способ направления клеточной реакции на клетки, инфицированные HIV.

Способ включает введение пациенту эффективного количества цитотоксичных T лимфоцитов, причем указанные лимфоциты способны специфически распознавать и подвергать лизису клетки, инфицированные HIV.

Таким образом, в одном из вариантов, настоящее изобретение представляет способ направления клеточной реакции на клетки, инфицированные HIV, включающий введение пациенту эффективного количества цитотоксичных T лимфоцитов, которые способны специфически распознавать и подвергать лизису клетки, инфицированные HIV.

В еще одном варианте изобретения предложены химерические рецепторные протеины, которые направляют цитотоксичные T лимфоциты на распознавание и лизис клеток, инфицированных HIV. Еще один вариант изобретения включает клетки хозяина, трансформированные вектором, содержащим химерические рецепторы.

В еще одном варианте настоящее изобретение предлагает антитела против химерических рецепторов настоящего изобретения.

Для получения цитотоксичных T лимфоцитов, которые специфически связывают и разрушают клетки, инфицированные HIV, авторы изобретения испробовали рецепторные химеры. Эти химерические рецепторы функционально активны и обладают экстраординарной способностью специфически связывать и разрушать клетки, экспрессирующие gp120.

Еще одной целью настоящего изобретения стало создание способа лечения индивидуумов, инфицированных HIV. В настоящем изобретении предложен ряд важных достижений в лечении СПИДа.

Эти и другие нелимитирующие варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам из последующего подробного описания изобретения.

В нижеследующем подробном описании будут сделаны ссылки на различные методологии, известные специалистам в области молекулярной биологии и иммунологии. Публикации и другие материалы, представленные далее для таких методик, на которые сделаны ссылки, включены сюда по ссылкам на их содержание.

Стандартные работы, в которых суммированы общие принципы технологии рекомбинантных ДНК, включают: Watson, J. D, et al., Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, the Bеnjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell, J. E. et al., Molecular Cell Biology. Scientific American Books, Inc. , Publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin, B.M., Genes II, John Wiley & Sons, publishers, New York, N.Y, (1985); Old, R.W., et al,. Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2d edition, University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T. , et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989); and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989).

Определения Под "клонированием" подразумевают in vitro рекомбинантную методику включения конкретного гена или другой ДНК последовательности в векторную молекулу. Для успешного клонирования целевого гена, необходимо использовать способы создания ДНК фрагментов для соединения этих фрагментов с векторной молекулой, для введения композитной ДНК молекулы в клетки хозяина, в которых они могут реплицироваться, и для отбора клона, содержащего мишеневый ген из реципиентных клеток хозяина.

Под "кДНК" подразумевают комплемент или копию ДНК, полученную из РНК темплата под действием РНК зависимой ДНК полимеразы /обратной транскриптазы/. Так, "кДНК клон" означает дуплексную ДНК последовательность, комплементарную РНК молекуле вставки, содержащей клонирующий вектор.

Под "кДНК библиотекой" подразумевают коллекцию рекомбинантных ДНК молекул, содержащих кДНК вставки, которые содержат ДНК копии иРНК, которые были экспрессированы клеткой во время создания кДНК библиотеки. Такую кДНК библиотеку можно получить способами, известными специалистам и описанными, например, в Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual supra. Обычно РНК вначале выделяют из клеток организма, из генома которого предстоит клонировать конкретный ген. Предпочтительными для целей настоящего изобретения являются клеточные линии лимфоцитов млекопитающих и особенно человека. Предпочтительным вектором для этой цели является штамм вакцины вируса WR.

Под "вектором" подразумевают молекулу ДНК, полученную, например, из плазмид, бактериофагов или вирусов человека или насекомых, в которую можно включить или клонировать фрагменты ДНК. Вектор должен содержать один или более из рестрикционных сайтов и может быть способен автономно реплицироваться в определенном организме хозяина или носителя, таким образом, чтобы клонированная последовательность была репродуцируема. Так, под термином "вектор экспрессии ДНК" подразумевают автономный элемент, способный направлять синтез рекомбинантных пептидов. Такие ДНК векторы экспрессии ДНК включают бактериальные плазмиды и плазмиды и вирусы млекопитающих и насекомых.

Под "практически чистым" понимают соединение, например, протеин, полипептид или антитела, которые практически не содержат компонентов, которые в природе их сопровождают. Обычно соединение называют практически чистым, если, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере, 75%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% всего материала составляет представляющее интерес соединение. Чистоту определяют соответствующими способами, например, с помощью хроматографии на колоннах, электрофореза в полиакриламидном геле или с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии /HPLC = ВЖХ/. Если это касается нуклеиновых кислот, термин "практически чистый" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, сегменту ее или фрагменту, который не содержит генов, который фланкирует ее в ее природно-встречающемся состоянии /например, не содержит последовательностей, которые фланкируют нуклеиновую кислоту в ее нативном геномном положении/. Под "функциональным производным" подразумевают "фрагменты", "варианты", "аналоги" или "химические производные" молекулы. "Фрагмент" молекулы, например, кДНК последовательности настоящего изобретения, означают, что этот термин относится к любому нуклеотидному субсету молекулы. "Вариант" такой молекулы относится к природно встречающейся молекуле, практически аналогичной либо целой молекуле, либо ее фрагменту, "Аналог" молекулы относится к не-активной молекуле, практически аналогичной либо всей молекуле, либо ее фрагменту. Говорят, что молекула "практически аналогична" другой молекуле, если последовательность аминокислот в обеих молекулах практически одинакова. Практически аналогичные молекулы аминокислот будут обладать аналогичными биологическими активностями. Так, при условии, что две молекулы обладают аналогичными активностями, их считают вариантами, так как этот термин используют даже, если одна молекула содержит дополнительно /или меньше/ аминокислотные остатки, которые не найдены в другой, или если последовательность аминокислотных остатков не идентична. В том смысле, как здесь использовано, говорят, что молекула является "химическим производным" другой молекулы, если она содержит дополнительные химические фрагменты, которые обычно не составляют части этой молекулы. Такие фрагменты могут повысить растворимость молекул, адсорбцию, биологическую полужизнь и т.д. Эти фрагменты в другом варианте могут снизить токсичность молекулы, исключить или ослабить любые нежелательные побочные эффекты молекулы и т.д. Фрагменты, способные осуществить такие эффекты, раскрыты, например, в Reminston's Pharmaceutical Sciences, 16^th ed. Mack Publishing Co., Easton, Peuu (1980).

Аналогично, "функциональное производное" рецептора химеры настоящего изобретения подразумевает "фрагменты", "варианты" или "аналоги" гена, который может быть "практически аналогичен" нуклеотидной последовательности и который кодирует молекулу, обладающую аналогичной активностью с, например, T клеточными, B клеточными или Fc рецепторными химерами.

Так, в том смысле, как здесь использовано, T клеточные, B клеточные или Fc рецепторные химерические протеины также включают любые функциональные производные, варианты, аналоги или химические производные, которые могут быть существенно аналогичны "дикого типа" химерам и которые обладают аналогичной активностью, то есть, наиболее предпочтительно 90%, более предпочтительно 70%, предпочтительно 40% или, по крайней мере, 10% активности дикого типа рецепторных химер. Активность функциональных химерических рецепторных производных включает специфическое связывание /с их внеклеточной частью/ с мишеневым агентом и в результате разрушение /направляемое его внутриклеточной или трансмембранной частью/ агента или клетки; причем такую активность можно определить, используя любые аналитические способы, описанные далее.

ДНК последовательность, кодирующую T клеточные, B клеточные или Fc рецепторные химеры настоящего изобретения, или их функциональные производные, можно рекомбинировать вектором ДНК в соответствия с обычными способами, включая тупые концы или болтающиеся концы для лигирования, расщепления рестрикционным энзимом до получения соответствующих концов, заполняя их липкими концами соответствующим образом, обрабатывая щелочной фосфатазой во избежание нежелательных присоединений, и лигирования соответствующей лигазой. Методики таких манипуляций раскрыты Maniatis T., et al: supra, и хорошо известны специалистам.

Говорят, что молекулы нуклеиновых кислот, такие как ДНК, "способны к экспрессии" полипептида, если они содержат нуклеотидную последовательность, которая содержит транскрипционную и трансляционную регуляторную информацию, и такие последовательности являются "операбельно связанными" с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют полипептид. Операбельной связью является такая связь, в которой регуляторные ДНК последовательности и ДНК последовательности, которые нужно экспрессировать, связаны таким образом, чтобы обеспечить экспрессию гена. Точная природа регуляторных участков, необходимых для экспрессии гена, может меняться от организма к организму, но должна, вообще, включать промоторный участок, который, у прокариотов, содержит оба промотора /которые руководят инициированием РНК транскрипции/, а также ДНК последовательности, которые будучи транскрибированы в РНК, дадут сигнал начала синтеза протеина, такие участки обычно включают те 5'-некодирующие последовательности, которые связаны с инициированием транскрипции и трансляции, такие как TATA, CAAT последовательности и т.п.

При желании, некодирующий 3'-участок генной последовательности, кодирующий протеин, можно получить вышеописанными способами. Этот участок можно сохранить для его трансляционной терминационной регуляторной последовательности, например, для терминации и полиаденилирования. Так, сохраняя 3'-участок, смежный с ДНК последовательностью, кодирующей протеин, можно получить сигналы окончания транскрипции. Если сигналы окончания транскрипции функционируют недостаточно при экспрессии клеток хозяев, тогда 3'-участок, функциональный в клетках хозяина, можно заменить.

Считают, что две ДНК последовательности /такие как последовательность промотерного участка и T клеточный рецептор, B клеточный рецептор или Fc рецепторная химера, кодирующая последовательность/ операбельно связаны, если природа связи между двумя ДНК последовательностями /1/ не приводит к введению мутации со сдвигом рамки, /2/ не мешает способности промотерного участка последовательности управлять транскрипцией рецепторной химерической генной последовательности, или /3/ не мешает способности рецепторной химерической генной последовательности быть транскрибированной промотерным участком последовательности. Промотерный участок должен быть операбельно связан с ДНК последовательностью, если промотер был способен осуществлять транскрипцию ДНК последовательности. Таким образом, для того чтобы осуществить экспрессию протеина, необходимы транскрипционный и трансляционные сигналы, распознаваемые соответствующим хозяином.

Настоящее изобретение охватывает экспрессию T клеточного рецептора, B клеточного рецептора или Fc рецепторного химерического протеина /или их функциональных производных/ либо в прокариотические, либо в эукариотические клетки, хотя предпочтительна экспрессия в эукариотические /и особенно, лимфоцитов человека/ клетки.

Антитела по способу настоящего изобретения можно получить любым из множества различных способов. Так, например, клетки, экспрессирующие рецепторный химерический протеин, или его функциональные производные, можно ввести животным для того, чтобы вызвать продуцирование сыворотки, содержащей поликлональные антитела, которые способны связывать химеры.

В предпочтительном способе изобретения, антитела являются моноклональными антителами. Такие моноклональные антитела можно получить, используя технологию гибридом /Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur J. Immunol, 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al., In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.J. p. 563-684 (1981)/. Вообще, такие процедуры включают иммунизацию животного T клеточным рецепторным, B клеточным рецепторным или Fc рецепторным химерическим антигеном. Спленоциты таких животных экстрагируют и сливают с подходящей миеломной клеточной линией. В способе настоящего изобретения мож