Мутации гена мтs в зародышевой линии и способ выявления предрасположенности к злокачественным опухолям в гене мтs

Мутации гена мтs в зародышевой линии и способ выявления предрасположенности к злокачественным опухолям в гене мтs

Реферат

 

Изобретение относится к области медицинской генетики, в частности к соматическим мутациям в гене многофункционального опухолевого супрессора (MTS) в случае неоплазий человека и использованию этих мутаций для диагностики и прогнозирования указанных заболеваний. Изобретение также относится к мутациям гена MTS в зародышевой линии и использованию данных мутаций для диагностики предрасположенности к таким формам рака, как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, холангиосаркома, чешуеклеточная карцинома, хронический лимфоидный лимфолейкоз, а также опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичников, матки, семенников, почек, желудка, ободочной и прямой кишки. Изобретение также имеет отношение к терапии тех неоплазий человека, при которых произошла мутация в гене MTS, включая генотерапию, заменяющую белковую терапию и использование белковых миметиков. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для скрининга препаратов в целях терапии опухолей. 5 с. и 28 з.п. ф-лы, 17 ил., 9 табл.

Изобретение относится к соматическим мутациям в гене многофункционального опухолевого супрессора (MTS) в случае неоплазий человека и использованию этих мутаций для диагностики и прогнозирования указанных заболеваний. Изобретение также относится к мутациям гена MTS в зародышевой линии и использованию данных мутаций для диагностики предрасположенности к таким формам рака как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, холангиосаркома, чешуеклеточная карцинома, хронический лимфоидный лимфолейкоз (CLL), а также опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичников, матки, семенников, почек, желудка, ободочной и прямой кишки. Изобретение также имеет отношение к терапии тех неоплазий человека, при которых произошла мутация в гене MTS, включая генотерапию, заменяющую белковую терапию и использование белковых миметиков. Наконец, изобретение относится к скринингу препаратов для терапии опухолей.

Публикации и другие материалы, использованные для описания уровня техники, и в особенности случаи из практики включены в настоящую заявку в качестве ссылок, на них имеются указания в последующем тексте и соответственно к описанию изобретения приложен список публикаций.

Генетика рака сложна и включает в себя многочисленные доминантные, позитивные регуляторы трансформированного состояния (онкогены), так же как и многочисленные рецессивные, негативные регуляторы (гены-супрессоры опухолей). Охарактеризовано более ста онкогенов. Идентифицировано менее дюжины генов-супрессоров, но ожидается что их число превысит пятьдесят (Knudson, 1993).

Участие столь многих генов подчеркивает сложность механизмов контроля роста, функционирующих в клетке для поддержания целостности нормальной ткани. Эта сложность проявляется и другим образом. Так, показано, что ни один из онкогенов не участвует в развитии всех или хотя бы большинства неоплазий человека. Наиболее часто встречающимися онкогенными мутациями являются мутации гена H-ras, обнаруживаемые в 10-15% всех солидных опухолей (Anderson et al., 1992). Наиболее часто мутирующим геном-супрессором опухолей является ген р53, мутации которого обнаруживаются приблизительно в 50% всех опухолей.

Без "мишени", общей для всех трансформированных клеток, мечта о "волшебной пуле", которая может разрушить или ревертировать раковые клетки, не повреждая нормальные ткани, остается беспочвенной. Надежда на новое поколение специфически "нацеленных" противоопухолевых препаратов может основываться на возможности идентификации генов-супрессоров опухолей и онкогенов, играющих ключевые роли в контроле клеточного деления.

На сегодня клонированы и охарактеризованы гены-супрессоры, которые определяют чувствительность к следующим видам неоплазий: 1) ретинобластоме (RB1); 2) опухоли Вилмса (WT1); 3) опухоли Ли-Фраумени (TP53); 4) семейному аденоматозному полипозу (APC); 5) нейрофиброматозу типа 1 (NF1); 6) нейрофиброматозу типа 2 (NF2); 7) синдрому фон Хиппель-Линдау (VHL) и 8) множественной эндокринной неоплазии типа 2A (MEN2A).

Локусы генов-супрессоров, которые были генетически картированы, но пока не выделены, включают гены, определяющие развитие следующих заболеваний: множественная эндокринная неоплазия типа 1 (MEN 1); синдром раковых семей Линча типа 2 (LCFS2); семейный рак молочной железы (BRCA1); нейробластома (NB); синдром невуса базальных клеток (BCNS); синдром Беквита-Вайдеманна (BWS); ренальная клеточная карцинома (RCC); бугорчатый склероз (TSC1) и бугорчатый склероз 2 (TSC2).

Охарактеризованные на сегодня гены-супрессоры кодируют продукты, имеющие сходство с белками различных типов, включая ДНК-связывающие белки (WT1), вспомогательные регуляторы транскрипции (RB1), белки, активирующие ГТФазу (GAPs) (NF1), компоненты цитоскелета (NF2), связанные с мембраной рецепторные киназы (MEN2A) и другие продукты, не имеющие явного сходства с известными белками (APC и VHL).

Во многих случаях гены-супрессоры были первоначально идентифицированы благодаря генетическим исследованиям, обнаружившим их утрату или мутацию в некоторых спорадических опухолях.

Это дало основание считать, что области хромосомных аберраций могут указывать на расположение важных генов-супрессоров, задействованных как в предрасположенности к раку, так и в спорадических неоплазиях.

Одной из важных особенностей охарактеризованных на сегодня генов-супрессоров является то, что они с высокой частотой делетированы в опухолях определенных типов. Делеция часто приводит к утрате одного аллеля (так называемая гетерозиготная утрата LOH), но встречается и гомозиготная делеция обоих аллелей. В случае LOH остающийся аллель нефункционален в силу предсуществующей наследуемой мутации или в результате вторичной случайной мутации.

Меланома является широко распространенной опухолью, от которой страдает один американец из ста (Американское противораковое общество, 1992). Факторы окружающей среды, такие как облучение ультрафиолетовым светом, вносят существенный вклад в частоту возникновения этой неоплазии, однако наследственные факторы также играют важную роль. На хромосоме 9р21 был картирован ген семейной меланомы (MLM) (Cannon-Albright et al., 1992; Nancarrow et al., 1993; Gruis et al. , 1993; Goldstein et al., 1994). Наличие единственного предрасполагающего аллеля в локусе MLM увеличивает вероятность возникновения меланомы у данного индивидуума приблизительно в 50 раз. MLM принадлежит к увеличивающемуся семейству генов, подозреваемых в качестве генов-супрессоров опухолей. Предрасположенность к меланоме наследуется как доминантный менделевский признак, хотя предрасполагающие мутации в локусе MLM, по-видимому, действуют как соматические рецессивные аллели, как это впервые предположил Knudson (1971). У индивидуума, предрасположенного к меланоме и несущего один мутантный аллель MLM и один аллель MLM дикого типа, в делящихся клетках происходят вторичные мутации, приводящие к утрате или инактивации копии MLM дикого типа; при этом реализуется наследуемый мутантный аллель MLM.

Наоборот, единственная копия гена дикого типа предотвращает развитие неоплазии.

Хромосомные аберрации в непосредственной близости от MLM в 9р21 локусе были широко охарактеризованы для опухолей нескольких различных типов, включая глиомные клеточные линии, линии немелкоклеточного рака легких и линии острого лимфобластного лейкоза (Olopade et al., 1992; Olopade et al., 1993; Lukeis et al., 1990; Diaz et al., 1988; Middleton et al., 1991; Fountain et al., 1992; Cheng et al., 1993; James et al., 1993).

Таким образом, исходя из частоты хромосомных аномалий в локусе 9р21 в немеланомных опухолевых клетках можно предположить, что область MLM содержит ген (или гены), участвующий по меньшей мере в прогрессии опухолей нескольких различных типов. В этих событиях задействована LOH, а также высокая частота гомозиготных делеций.

Клетки тканей имеют только три возможности своего существования - они могут расти и делиться, не делиться, но оставаться живыми, или же умереть через апоптоз. Опухоли возникают или в результате неприемлемого роста и деления клеток, или же при "отказе" клеток умирать, когда они должны это сделать.

Один из механизмов контроля опухолевого роста должен включать прямую регуляцию клеточного цикла. Например, гены, контролирующие инициацию репликации ДНК, являются возможными кандидатами в онкогены или гены-супрессоры опухолей, в зависимости от стимулирующей или ингибирующей роли в этом процессе. Продвижение эукариотических клеток по циклу (фазы G1, S, G2 и М) регулируется последовательным образованием, активацией и последующей инактивацией ряда циклин/циклинзависимых киназных (Cdk) комплексов. Показано участие в этих процессах циклина D's/Cdk2,4,5, циклина E/Cdk2, циклина A/Cdk2 и циклина B/A/Cdk2. Циклины D's и Cdk2, Cdk4 и Cdk5 участвуют в переходе от G1 к S, то есть на том этапе, когда в клетке "принимается решение" о начале репликации ДНК. Недавно были обнаружены дополнительные элементы контроля клеточного цикла. Это ингибиторы Cdk (Cdk-ингибиторы, CdI), к которым относятся FarI, р21, р40, р20 и р16 (Marx, 1994; Nasmyth & Hunt, 1993).

Недавно было показано прямое участие в регуляции клеточного цикла нескольких онкогенов и генов-супрессоров. Например, один из циклинов (белков, ускоряющих репликацию ДНК) был идентифицирован как онкоген (Motokura et al., 1991; Lammie et al., 1991; Withers et al., 1991; Rosenberg et al., 1991), a опухолевый супрессор Rb взаимодействует с первичными циклинсвязывающими партнерами, Cdks (Ewen et al., 1993). Идентификация локуса чувствительности к меланоме открывает путь для генетического скрининга пациентов в отношении того, например, насколько возрастает риск рака при облучении прямым солнечным светом. MTS может также предрасполагать к большому числу опухолей других локализаций, которые включают (но не ограничиваются указанными) лейкозы, астроцитому, глиобластому, лимфому, глиому, лимфому Ходжкина, множественную миелому, саркому, миосаркому, холангиосаркому, чешуеклеточную карциному, хронический лимфоидный лейкоз (CLL), а также опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичника, матки, семенников, почки, желудка, ободочной и прямой кишки. Кроме того, поскольку MTS влияет на прогрессию опухолей нескольких различных типов, анализ MTS может быть полезен для определения прогноза для раковых больных. Так, MTS может служить основой для разработки очень важных диагностических тестов, позволяющих определить предрасположенность к таким формам неоплазий, как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, холангиокарцинома, чешуеклеточная карцинома, хронический лимфоидный лейкоз (CLL), а также опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичника, матки, семеников, почки, желудка, ободочной и прямой кишки, а также прогнозировать течение ракового заболевания. Кроме того, поскольку MTS участвует в прогрессии опухолей многих типов, можно предложить прямое или непрямое использование способности MTS к супрессии опухолевого роста для общей противоопухолевой терапии. Например, восстановление нормальной функции MTS в опухолевой клетке может превратить ее в неопухолевую.

Настоящее изобретение относится к соматическим мутациям в гене многофункционального опухолевого супрессора (MTS) в злокачественных новообразованиях человека и их использованию для диагностики и прогнозирования рака. Изобретение также относится к мутациям в гене MTS в зародышевой линии и их применению для выявления предрасположенности ко многим типам злокачественных опухолей, таким как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, холангиокарцинома, чешуеклеточная карцинома, хронический лимфобластный лимфолейкоз (CLL) и опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичника, матки, семенников, почки, желудка, ободочной и прямой кишки. Кроме того, изобретение относится к терапии злокачественных опухолей человека, для которых характерна мутация в гене MTS, в том числе генной терапии, замещающей белковой терапии и применению белков-миметиков. И наконец, изобретение относится к подбору лекарственных препаратов для лечения рака.

На фиг. 1A показана родословная 3137. Во всех случаях меланомы выявлен чувствительный гаплотип. Кроме того, показаны случаи возникновения других злокачественных новообразований у индивидуумов, имеющих чувствительный гаплотип. Использованы следующие обозначения: закрашенные кружки и квадраты означают меланому; частично закрашенные кружки и квадраты означают другие злокачественные опухоли; / означает смерть больного, * означает, что у индивидуума неизвестна чувствительность гаплотипа; ** означают, что, по-видимому, индивидуум имеет чувствительный гаплотип; возраст исследованных больных обозначен цифрами. Кроме того, указан установленный диагноз.

На фиг. 1B показана родословная 3161. Во всех случаях меланомы выявлен чувствительный гаплотип. Для других злокачественных новообразований чувствительность гаплотипа не определялась. Использованы следующие обозначения: закрашенные кружки и квадраты означают меланому; частично закрашенные кружки и квадраты означают другие злокачественные опухоли; / означает смерть больного; = означает появление болезни в родословной; цифра "3" в пятиугольнике означает несколько браков; цифрами обозначен возраст больного. Кроме того, указан установленный диагноз.

На фиг. 1C показана родословная 3355. Во всех случаях меланомы выявлен чувствительный гаплотип. Для других злокачественных новообразований чувствительность гаплотипа не определялась. Использованы следующие обозначения: закрашенные кружки и квадраты означают меланому; частично закрашенные кружки и квадраты означают другие злокачественные опухоли; / означает смерть больного. Кроме того, указан установленный диагноз.

На фиг. 1D показана родословная 1771 с указанием случаев заболевания меланомой и другими злокачественными опухолями. При изучении этой родословной были идентифицированы мутации в MTS. Использованы следующие обозначения: * означает, что достоверно выявлен носитель мутации; закрашенные кружки и квадраты означают меланому; частично закрашенные кружки и квадраты означают другие злокачественные опухоли (в этой родословной - рак ободочной кишки); / означает смерть больного; цифрами обозначен возраст больного. Кроме того, указан установленный диагноз.

На фиг. 2 показаны YAC (Yeast Artificial Chromosome) и P1-клоны в области, связанной IFNA-s и D9S171. Центромера находится справа. Для P1-клонов стрелки указывают направление к последовательности T7-промотора в векторе. YACs, сгруппированные вместе, соответствуют клонам, которые сходным образом расположены относительно STSs области. Предположительно, эти YACs не идентичны. YACs A5, B11, C6 и F9 содержат IFN-1 и IFN-s. YACs D1, F5 и E3 содержат D9S126 и D9S171. Ни проксимальные концы YACs, содержащие D9S171, ни дистальные концы YACs, содержащие IFNA-s, не показаны. Расстояния приведены не в масштабе. Маркеры, внутренние по отношению к IFNA-s и D9S171, показаны на фиг. 2. Маркеры, которые начинаются с "с", происходят из концевых последовательностей космид. Космиды не показаны. Расстояния между c1b и с5.3 и между 760-L и D9S171 неизвестны.

На фиг. 3 приведена диаграмма делеций, наблюдаемых в меланомных клеточных линиях. Делеции сгруппированы в 12 классов на основе набора маркеров, которые делетированы. Одиннадцать клеточных линий утратили все маркеры, показанные на чертеже. Этот класс не приведен. Количество делеций каждого из 12 других классов указано в колонке, обозначенной "#-линии". Расположение точек разрыва в результате делеций в классах 1-10 показано как приходящееся на маркер, прилегающий к делетированной ДНК; т.е. последний позитивный маркер в серии указывает на делецию. Для классов 11 и 12 сайты делеций обозначены закрашенными треугольниками.

На фиг. 4A показана карта космиды с5. Релевантные STSs, использованные для делеционного анализа, одинаковы для космид и P1-клонов. C1.b-маркер находится проксимально по отношению к Р1-1062 и не показан. Транскрипционные ориентации MTS1 и MTS2 отмечены стрелками.

На фиг. 4B показана карта рестрикции и STS-карта космиды с5. Положения кодирующих экзонов для MTS1 и MTS2 отмечены черными прямоугольниками. E1 и E2 обозначают кодирующий экзон 1 и кодирующий экзон 2. "В" обозначает BamHI, "S" - SalI, "R" - EcoRI и "R5" - EcoRV.

На фиг. 5A и 5B сравниваются геномная последовательность MTS1, содержащая 5'-нетранслируемую область, экзон 1 и часть интрона 1, и опубликованная последовательность p16 (Serrano et al. , 1993). Стартовый кодон (подчеркнут черной линией) находится в положении 891, а участок сплайсинга (отмечен стрелкой) находится в положении 1016. Последовательность MTS1, показанная на фиг. 5A-B, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 3. Последовательность р16, показанная на фиг. 5B, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 24.

На фиг. 6A и 6B сравниваются геномная последовательность MTS1, содержащая экзон 2 и часть интрона 2, и опубликованная последовательность р16 (Serrano et al., 1993). Участки сплайсинга (отмечены стрелками) расположены до положения 192 и после положения 498. Последовательность MTS1, показанная на фиг. 6A-B, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 4. Последовательность р16, показанная на фиг. 6A, идентична последовательности нуклеотидов 192-498 SEQ ID NO: 4.

На фиг. 7A и 7B сравнивается геномная последовательность MTS2, содержащая часть интрона 1, "экзон 2" и промежуточные участки, и опубликованная последовательность р16. Последовательность "экзона 2" сходна с экзоном 2 MTS1 от нуклеотида 273 до 580. Сайт сплайсинга в MTS2 и р16 отмечены стрелками. Точка, в которой начинается расхождение, обозначена "o". Кодон терминации MTS2 расположен в экзоне 2 в положении 532 и обозначен "*". Последовательность MTS2, показанная на фиг. 7B, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 5. Последовательность р16, показанная на фиг. 7А, идентична последовательности нуклеотидов 192-498 SEQ ID NO: 4.

На фиг. 8 сравниваются последовательности ДНК MTS1 и MTS2, включающие экзон 2 и часть каждого окружающего интрона. Положения 3'-сплайсингового соединения интрона 1 и 5'-сплайсингового соединения интрона 2 в MTS1 обозначены треугольниками. Точка расхождения около 3'-конца кодирующего экзона 2 отмечена стрелкой. Приведенная последовательность MTSI соответствует последовательности нуклеотидов 92-548 SEQ ID NO: 4. Приведенная последовательность MTS2 соответствует последовательности нуклеотидов 174-630 SEQ ID NO: 5.

На фиг. 9 показаны делеции различных STS в опухолевых клеточных линиях. В каждую ПЦР включали позитивные и негативные контроли. Клеточные линии, в которых были делетированы только одна или две STS (например, класс 21) повторно тестировали по крайней мере дважды.

На фиг. 10А-10С показана экспрессия мРНК MTS2. На фиг. 10А отражен относительный уровень транскриптов MTS2 мРНК (Clonetech), полученной из различных тканей человека. Линия 1 - мозг; линия 2 - молочная железа; линия 3 - почки; линия 4 - легкие; линия 5 - лимфоциты; линия 6 - яичники; линия 7 - поджелудочная железа; линия 8 - предстательная железа; линия 9 - селезенка; линия 10 - желудок; линия 11 - тимус. Происхождение продуктов с иной, чем ожидаемая, молекулярной массой (см. линию 1) неизвестно.

На фиг. 10В отражен относительный уровень транскриптов MTS2 в лимфоцитах человека как функция времени после митогенной индукции. Линия 1 - 0 часов; линия 2 - 1 час; линия 3 - 2 часа; линия 4 - 4 часа; линия 5 - 8 часов; линия 6 - 16 часов; линия 7 - 24 часа; линия 8 - 32 часа; линия 9 - 40 часов; линия 10 - 48 часов; линия 11 - 56 часов; линия 12 - 64 часа. Большая часть клеток находится в S-фазе (40-50 часов после индукции).

На фиг. 10С отражен уровень транскриптов MTS2 как функция Rb-статуса. Rb-позитивными клеточными линиями являются следующие: полоса 1 - KIT (Hori et al. , 1987); полоса 2 - диплоидные фибробласты человека MRC5, пассаж 28; полоса 3 - VWSCC2; полоса 4 - Bris-tol 8; полоса 7 - T24. RB-негативными клеточными линиями являются следующие: полоса 8 - MDA MB 468; полоса 9 - 5637; полоса 10 - С33А; полоса 11 - SiHa; полоса 12 - CaSki; полоса 13 - WERI.

На фиг. 11 показана последовательность кДНК (и соотвествующего полипептида) для 5'-нетранслируемого участка MTS2. Начало экзона 2 находится в положении 491 и отмечено стрелкой. Приведенная последовательность соответстует последовательности SEQ ID NO: 15, а аминокислотная последовательность - последовательности SEQ ID NO: 16.

На фиг. 12А и 12В показана последовательность кДНК (и соотвествующего полипептида) MTS1E1-бета. Сайты сплайсинга отмечены стрелками. Начало экзона 2 находится в положении 335, а экзон начинается в положении 642. Приведенная последовательность соответствует последовательности SEQ ID NO: 13, a аминокислотная последовательность - последовательности SEQ ID NO: 14.

На фиг. 13 приведена физическая карта области р16. Положения экзона 1-альфа (E1-альфа), экзона 1-бета (E1-бета), экзона 2 (E2) и экзона 3 (E3) отмечены закрашенными прямоугольниками. Отмечена локализация сайтов рестрикции EcoRI (R1), EcoRV (RV) и SalI (S). Выше рестрикционной карты показаны геномные космидные клоны с5 и P1 1063. Ниже рестрикционной карты показаны делеции в клеточных линиях А375 и SK-mel 93. Пунктирная линия соответствует делетированной ДНК.

На фиг. 14 показаны совпадения между последовательностями транскриптов р16-бета человека и мыши. Заглавными буквами обозначены идентичные нуклеотиды. Стоп-кодоны в рамке считывания р16 подчеркнуты. Сплайсинговое соединение между E1-бета и E2 отмечено знаком V. Приведенная бета-последовательность мыши соответствует последовательности SEQ ID NO: 25. Приведенная бета-последовательность человека соответствует последовательности нуклеотидов 193-461 SEQ ID NO: 13.

На фиг. 15 показана экспрессия альфа-транскрипта в клеточных линиях, которые содержат делеции E1-бета. кДНК получают при использовании тотальной РНК, выделенной из указанных образцов. В реакциях амплификации Р16-транскриптов использовали радиоактивно-меченый праймер. Смешивали эквивалентные объемы для амплификации альфа и бета и разделяли продукты в денатурирующем 5%-ном полиакриламидном геле: полоса 1 - T-клетки в состоянии покоя; полоса 2 - клеточная линия SK-mel 93; полоса 3 - клеточная линия А375.

На фиг. 16 A-16D показана экспрессия транскриптов Р16. В реакциях амплификации Р16-транскриптов использовали радиоактивно-меченый праймер и продукты разделяли в денатурирующем 5%-ном полиакриламидном геле.

Фиг. 16А и 16D иллюсстрируют эксперимент, в котором до проведения гель-электрофореза реакционные смеси амльфа и бета из одного образца смешивали между собой. На фиг. 16А показан относительный уровень Р16-транскриптов во фракции РНК, полученной из различных тканей и клеток человека. Полоса 1 - мозг; полоса 2 - молочная железа; полоса 3 - почки; полоса 4 - легкие; полоса 5 - лимфоциты; полоса 6 - яичники; полоса 7 - поджелудочная железа; полоса 8 - предстательная железа; полоса 9 - селезенка; полоса 10 - желудок; полоса 11 - тимус. На фиг. 16В показано относительное количество бета-транскрипта в лимфоцитах человека как функции времени после митогенной индукции: полоса 1 - 0 часов; полоса 2 - 1 час; полоса 3 - 2 часа; полоса 4 - 4 часа; полоса 5 - 8 часов; полоса 6 - 16 часов; полоса 7 - 24 часа; полоса 8 - 32 часа; полоса 9 - 40 часов; полоса 10 - 48 часов; полоса 11 - 56 часов; полоса 12 - 64 часа.

На фиг. 16С показано относительное количество альфа-транскрипта в лимфоцитах человека как функции времени после митогенной индукции: полосы означают то же, что и на фиг. 16В, однако временная точка, соответствующая 1 часу, опущена. Анализировалась также экспрессия других молекул, для которых предполагается их влияние на ход клеточного цикла и образование которых регулируется на транскрипционном уровне во время клеточного цикла. В соответствии с предварительными результатами уровни CDK4 GoS2 (молекулы неизвестной функции, но транскрипция которых индуцируется при вхождении покоящихся T-клеток в клеточный цикл) возрастали при индукции T-клеток (Russell and Forsdyke, 1991; Matsushime et al., 1992; Geng and Weinberg, 1993). В противоположность этому уровни РНК р27, по-видимому, не изменялись во время осуществления эксперимента (Tiyshima and Hunter, 1994; Kota et al., 1994).

На фиг. 16В показан уровень транскриптов Р16 как функции Rb-статуса. Rb-негативные клеточные линии: полоса 1 - WERI; полоса 2 - CaSki; полоса 3 - SiHa; полоса 4 - С334; полоса 5 - 5637; полоса 6 - MDA MB 468. Rb-положительные клеточные линии: полоса 12 - диплоидные фибробласты человека MRC5, пассаж 28; полоса 13 - KIT (Hori et al., 1987).

На фиг. 17 показана последовательность кДНК MTS1, включая некодирующие участки кДНК. Треугольниками обозначены сплайсинговые соединения. Разбивка в последовательности второго сплайсингового соединения только выделяет его и не означает пропущенных оснований. Приведенная последовательность соответствует последовательности SEQ ID NO: 36.

Настоящее изобретение относится к соматическим мутациям гена многофункционального супрессора опухолей (MTS) при раковых заболеваниях человека и использованию этих мутаций для диагностики и прогнозирования раковых заболеваний. Изобретение также относится к зародышевым мутациям гена MTS и к их использованию для диагностики предрасположенности к различным формам рака, таким как меланома, окулярная меланома, лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина, множественная миелома, саркома, миосаркома, холангиокарцинома, чешуеклеточная карцинома легких, хронический лимфоидный лимфолейкоз (CLL), а также опухоли поджелудочной железы, молочной железы, мозга, простаты, мочевого пузыря, щитовидной железы, яичника, матки, семенников, почек, желудка, ободочной и прямой кишки. Изобретение относится к терапии злокачественных опухолей человека, для которых характерна мутация в гене MTS, в том числе генной терапии, замещающей белковой терапии и применению миметических белков. И наконец, изобретение относится к подбору лекарственных препаратов для лечения рака.

В настоящем изобретении заявлены выделенные полинуклеотиды, представляющие целый локус MTS или его часть или мутированный локус MTS, протяженностью не менее восьми оснований и не более 100 тысяч оснований. Подобные полинуклеотиды могут быть антисмысловыми полинуклеотидами. В настоящем изобретении заявлена также рекомбинантная конструкция, содержащая подобный полинуклеотид, например рекомбинантная конструкция, применимая для экспрессии в трансформированных клетках.

Кроме того, в настоящем изобретении заявлены методы обнаружения полинуклеотида, представляющего часть локуса MTS, или продукт его экспрессии. Подобный метод может включать этап амплификации части локуса MTS, а также этап создания набора полинуклеотидов, являющихся праймерами для амплификации указанной части локуса MTS. Метод применим как для диагностики предрасположенности к раку, так и для диагностики и прогнозирования рака. В настоящем изобретении заявлены также антитела, предпочтительно моноклональные антитела, которые специфически связываются с выделенным полипептидом, представляющим по меньшей мере пять аминокислотных остатков, кодируемых локусом MTS.

В настоящем изобретении заявлены наборы для обнаружения в пробах полинуклеотидов, представляющих часть локуса MTS. Эти наборы представляют собой полинуклеотиды, комплементарные части локуса MTS, упакованные в подходящий контейнер и снабженные инструкцией по применению.

В настоящем изобретении заявлены также методы получения полинуклеотидов, представляющих собой полимеризующиеся полинуклеотиды, которые образуют последовательность, состоящую по меньшей мере из восьми последовательных нуклеотидов локуса MTS; методы получения полипептида, представляющего собой полимеризующиеся аминокислоты, которые образуют последовательность, состоящую по меньшей мере из пяти аминокислот, кодируемых локусом MTS.

Кроме того, в настоящем изобретении заявлены методы скрининга лекарств для терапии опухолей с целью идентификации препаратов для восстановления функции продукта гена MTS.

Наконец, в настоящем изобретении изложена стратегия создания генных терапевтических подходов, направленных на раковые клетки. Подобные терапевтические агенты могут иметь вид полинуклеотидов, представляющих часть или полный локус MTS, помещенных в соответствующие векторы или доставленные в клетку-мишень другими, более прямыми методами, с целью восстановления функции белка MTS. Терапевтические агенты могут иметь также вид полипептидов, основанных на частичной или полной белковой последовательности MTS. Они могли бы функционально замещать активность MTS in vivo.

Открытием настоящего изобретения является тот факт, что локус MTS (ранее обозначавшийся как меланомный локус, MLM), который предрасполагает индивидуума к меланоме и другим видам рака, является геном MTS1, который является ингибитором Cdk, в частности Cdk4. Этот ген обозначен MTS1. Открытием настоящего изобретения является еще и тот факт, что локус MTS содержит вторую кодирующую последовательность, MTS2, которая весьма сходна с MTS1 в части последовательностей. Установлено также, что ген MTS1 имеет два отдельных промотора - альфа и бета. При использовании промотора альфа РНК состоит из экзона 1-альфа, экзона 2 и экзона 3. Она обозначена как MTS1. При использовании промотора бета образующаяся РНК состоит из экзона 1-бета, экзона 2 и экзона 3. Она обозначена как MTS1E1-бета. Открытием настоящего изобретения является тот факт, что мутации локуса MTS в зародышевой линии являются показателями для предрасположенности к меланоме и другим видам рака. Наконец, показано, что соматические мутации в локусе MTS ассоциированы с большинством, если не со всеми, видами опухолей и, таким образом, являются общим индикатором рака и могут служить для прогнозирования рака. Мутационные события в локусе MTS могут включать делеции, инсерции и точечные мутации как в кодирующих, так и в некодирующих последовательностях.

Локус MLM был впервые генетически картирован при выявлении драматической связи между генетическими маркерами и предрасположенностью к меланоме в нескольких родословных в Юте и одной родословной в Техасе (Cannon-Albright, 1992). Область, определенная по рекомбинантам в родословных, фланкирована маркерами D9S736 и D9S171. Впоследствии эти и другие генетические маркеры были использованы для локализации гена путем анализа гомозиготных делеций в меланомных и немеланомных опухолевых клеточных линиях, содержащих делеции. Минимальная область перекрывания делеций была фланкирована маркерами IFNA-s и D9S171. Библиотеки YAC (Yeast atrificial chromosomes - искусственная хромосома дрожжей) были проскринированы с целью идентификации геномных клонов, окружающих эти маркеры. Клоны P1, выделенные в результате "прогулки про хромосоме", оказались непрерывными от IFNA-s до D9S171 за исключением двух пробелов.

Специфические STS (site-tagged sequences) получали для конструирования более подробной молекулярной карты. С использованием этих маркеров, а также делеционного анализа, область перекрывания делеций была определена возле маркеров с5.1 и c5.3, обнаруженных в космиде с5. Наиболее часто делетированным оказался маркер c5.3, наиболее близкий к MTS.

Анализ маркера с5 на наличие "CpG"-островков показал, что он содержит по меньшей мере один "ген-кандидат" в MTS. Были определены последовательности ДНК EcoRI-фрагментов с5, которые сравнили с последовательностями из генного банка. Две различные области с5 оказались сходными с ранее идентифицированным геном, кодирующим ингибитор Cdk4 человека, или р16 (Serrano et al., 1993). Эти два гена-кандидата были обозначены как MTS1 и MTS2. Скрининг кДНКовых библиотек из лимфоцитов, эмбрионального мозга и нормальной молочной железы при помощи пробы из экзона 2 MTS1 привел к обнаружению дополнительного кандидата, названного MTS1E1-бета.

Подробное сравнение геномных последовательностей с5 с последовательностью мРНК р16 показало, что MTS1 содержит фрагмент в 307 пар нуклеотидов, идентичный части кодирующей последовательности р16. Этот фрагмент MTS1 был фланкирован узнаваемыми последовательностями сплайсинговых соединений. Дальнейшие исследования MTS1 показали, что он включает полную кодирующую последовательность р16 и еще два интрона. Интрон 1 был локализован на 126 пар оснований "ниже" сайта начала трансляции; интрон 2 был локализован на 11 пар оснований "выше" сайта окончания трансляции. Два интрона разделяют кодирующие последовательности р16 на три области, 5'-область в 126 пар оснований (кодирующий Экзон 1), среднюю область в 307 пар оснований (кодирующий Экзон 2) и 3'-область в 11 пар оснований (кодирующий Экзон 3).

MTS2 содержал область последовательностей ДНК, почти идентичную р16 в той части, которая простирается от 5'-конца кодирующего экзона 2 приблизительно на 200 пар нуклеотидов по направлению к интрону 2. Однако сходство последовательностей уменьшалось к точке 51 пара нуклеотидов "выше" интрона 2 MTS1, в которой две последовательности дивергировали полностью. Это положение соответствует локализации последнего кодона MTS2. Сравнение последовательностей MTS1 и MTS2 показало, что сходство последовательностей этих двух генов также простирается на 50 пар нуклеотидов "выше" 3'-сплайсингового соединения интрона 1. Таким образом, фрагменты некодирующей ДНК оказались более консервативными, чем некоторые области предположительно кодирующей ДНК. Чтобы исключить возможность того, что дивергенция последовательностей является артефактом клонирования, были сконструированы ПЦР-праймеры для специфической амплификации последовательности в точке дивергенции MTS2. Эти праймеры амплифицировали фрагмент предсказанного размера из космиды P1 и геномной ДНК. Таким образом, дивергированная последовательность, расположенная "ниже" 3'-конца экзона 2 MTS2, является bona fide геномной последовательностью.

MTS1E1-бета содержит экзон 1, названный экзон 1-бета или E1-бета, который имеет последовательность, отличную от обнаруживаемой в экзоне 1 MTS1 и MTS2. MTS1E1-бета также содержит экзон 2 (E2) и экзон 3 (E3), которые идентичны экзонам 2 и 3 MTS1. Экзон 1-бета локализован "выше" экзона 1 MTS1 и не содержит какой-либо кодирующей последовательности. В результате MTS1E1-бета кодирует р10, для которого началом трансляции служит первый ATG-кодон экзона 2.

MTS1 и MTS2 исследовали на соответствие с генетической чувствительностью локуса MTS путем анализа геномной ДНК индивидуумов, предположительно несущих предрасполагающие MLM-аллели. Полиморфизмы ДНК были обнаружены в экзоне 2 MTS1 одного из восьми индивидуумов. Мутация представляла собой замену одного нуклеотида, что приводило к замене аминокислоты. Этот полиморфизм сегрегировал вместе в предрасполагающим MLM-аллелем.

Преобладание повреждений в MTS1 (делеции и замены нуклеотидов) указывает на то, что MTS1 или другой близко расположенный локус участвуют в формировании опухолевого фенотипа.

Клетки, имеющие подобные повреждения, получают селективное преимущество перед теми клетками, которые не имеют таковых.

Альтернативное объяснение, состоящее в том, что указанные повреждения являются случайными и не имеют отношения к росту клеток, представляется неубедительным по ряду причин. Во-первых, высокая корреляция между опухолевым фенотипом и мутациями MTS1 указывает на причинно-следственные отношения между мутациями MTS1 и образованием опухолей. Во-вторых, MTS1 определяет чувствительность к меланоме и потому действует независимо как ген-супрессор опухолей. В-третьих, биохимическая роль р16 как мощного ингибитора Cdk хорошо согласуется с моделью, согласно которой MTS1 действует in vivo как общий ингибитор начала репликации ДНК.

В соответствии с диагностическими и прогностическими методами настоящего изобретения, обнаружены изменения в локусе MTS дикого типа. Кроме того, может быть использован метод для обнаружения локуса MTS дикого типа и подтверждения отсутствия предрасположенности к неоплазии и самой неоплазии. Термин "изменения гена дикого типа" подразумевает все формы мутаций, включая делеции, инсерции и точечные мутации в кодирующих и некодирующих областях. Делеции могут затрагивать ген целиком или его части. Точечные мутации могут приводить к образованию стоп-кодонов, сдвигам рамки считывания и замене аминокислот. К соматическим мутациям относятся те, которые обнаруживаются в какой-либо из тканей организма, например в опухолевой ткани, и не наследуются в зародышевой линии. Мутации в