Очищенные белки вируса папилломы

Очищенные белки вируса папилломы

Реферат

 

Изобретение касается очищенных рекомбинантных белков вирусов папилломы (PV) человека. Очищенный белок капсидного белка вируса папилломы человека получают трансформацией дрожжевой клетки рекомбинантной молекулой ДНК, кодирующей белок, выбранный из группы HPV6a, HPV11, HPV16, белка L1, белка L2, белка L1+L2. Трансформированные дрожжевые клетки культивируют при условиях, делающих возможной экспрессию молекул рекомбинантной ДНК для получения неочищенной композиции белка. Белок вируса папилломы очищают на хроматографической колонке со смолой POROS. Изобретение позволяет разработать и коммерциализировать профилактические и терапевтические вакцины от инфекции и заболевания PV. 9 ил.

Изобретение касается очищенных рекомбинантных белков вирусов папилломы (PV) и способов их получения, измерения, применения и приготовления в виде лекарственных форм.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ Фиг. 1 представляет двунаправленный дрожжевой экспрессирующий вектор, применяемый для экспрессии капсидных белков L1 и/или L2 вируса папилломы.

Фиг. 2 - электронная микрофотография VLP L1 HPV6a, экспрессируемых в дрожжах.

Фиг. 3 - электронная микрофотография VLP L1/L2 HPV6a, экспрессируемых в дрожжах.

Фиг. 4 - схематическое представление конструирования штамма 1558 S.cerevisiae.

Фиг. 5 - схематическое представление конструирования штамма 1569 S. cerevisiae.

Фиг. 6 - основные стадии в процедуре очистки.

Фиг. 7 - список штаммов.

Фиг. 8 - ряд анализов при помощи электрофореза в ПААГ-ДСН L1+L2 HPV16, очищенных из дрожжей. Кроме конечного очищенного VLP, включены удерживаемые белки из промежуточных стадий процесса очистки. Таблица обеспечивает идентификацию пробы в каждой дорожке. Включены гель, окрашенный коллоидным красителем Кумасси, а также Вестерн-блоты, зондированные антисыворотками к белкам L1 и L2.

Фиг. 9 - схема альтернативных процессов очистки L1 вируса папилломы американского кролика.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Инфекции вирусом папилломы (PV) имеют место у множества животных, в том числе у людей, овец, собак, кошек, кроликов, обезьян, змей и коров. Вирусы папилломы инфицируют эпителиальные клетки, индуцируя обычно доброкачественные эпителиальные или фиброэпителиальные опухоли в месте инфекции. PV являются видоспецифическими инфекционными агентами; вирус папилломы человека не может инфицировать другое животное.

Вирусы папилломы могут быть классифицированы на отличающиеся группы на основании хозяина, которого они инфицируют. Вирусы папилломы человека (HPV) классифицируются далее на более чем 70 типов на основе гомологии последовательности ДНК. Типы PV являются, по-видимому, типоспецифическими иммуногенами в том смысле, что нейтрализующий иммунитет к инфекции одним типом вируса папилломы не создает иммунитета против другого типа вируса папилломы.

У людей различные типы HPV 1, 2, 3, 4, 7, 10 и 26-29 вызывают образование доброкачественных бородавок как у здоровых индивидуумов, так и у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Типы HPV 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 и 46-50 вызывают образование плоских поражений у индивидуумов с ослабленным иммунитетом. Типы HPV 6, 11, 34, 39, 41-44 и 51-55 вызывают образование незлокачественных кондилом слизистой оболочки половых органов или дыхательных путей. Типы HPV 16, 18, 31, 33, 35, 45 и 58 вызывают эпителиальную дисплазию слизистой оболочки половых органов и ассоциированы с большинством in situ и инвазивных карцином шейки матки, вагины, вульвы и анального канала.

Вирусы папилломы являются небольшими (50-60 нм), не имеющими оболочки, икосаэдральными ДНК-вирусами, которые кодируют до восьми ранних и двух поздних генов. Открытые рамки считывания (ORF) геномов этих вирусов обозначаются как E1-E7 и L1 и L2, где "E" обозначает "early (ранние)" и "L" обозначает "late (поздние)". L1 и L2 кодируют вирусные капсидные белки. Ранние (E) гены ассоциированы с функциями, такими как вирусная репликация и клеточная трансформация.

Белок L 1 является основным капсидным белком и имеет мол.массу 55-60 кДа. Белок L2 является минорным капсидным белком, который имеет предсказанную мол. массу 55-60 кДа и среднюю (кажущуюся) мол.массу 75-100 кДа, как определено при помощи электрофореза в полиакриламидном геле. Иммунологические данные предполагают, что большая часть белка L2 является внутренней по отношению к белку L1. ORF L1 является высококонсервативной среди различных вирусов папилломы. Белки L2 являются менее консервативными среди различных вирусов папилломы.

Было обнаружено, что гены L1 и L2 являются хорошими мишенями для иммунопрофилактики. Было также показано, что некоторые из ранних генов являются потенциальными мишенями разработки вакцин. Исследования в системах вируса папилломы американского кролика (CRPV) и бычьего вируса папилломы (BPV) показали, что иммунизация этими белками, экспрессированными в бактериях или с использованием векторов на основе вируса осповакцины, защищали животных от вирусной инфекции. Экспрессия генов L1 вируса папилломы в бакуловирусных системах или с использованием векторов на основе вируса осповакцины приводила к сборке вирус-подобных частиц (VLP), которые были использованы для индуцирования ответов в виде высокого титра вирус-нейтрализующих антител, которые коррелируют с защитой от вирусного заражения. Кроме того, гены L1 и L2 использовали для создания вакцин для предотвращения и лечения инфекций вируса папилломы у животных. Гены L1 и L2 HPV типа 16 были клонированы в вектор на основе вируса осповакцины; полученный вектор применяли для инфекции клеток млекопитающего CV-1 для получения вирус-подобных частиц (VLP).

Разработка и коммерциализация профилактических и терапевтических вакцин от инфекции и заболевания pv, содержащих белок L1, белки L1+L2 или модифицированные белки L1 или L1+L2, тормозились отсутствием больших количеств очищенного вируса и очищенного белка. Поскольку PV не легко культивировать in vitro, трудно получить белки L1 и L2 размножением PV in vitro. Вытекающие из этого проблемы восполнения создают трудности в характеристике PV и белков PV. Поэтому важным было бы создание легко восполняемого источника неочищенных белков PV, в частности белков L1 и L2 PV или модифицированных белков L1 и L2. Была бы также ценной разработка способов очистки больших количеств неочищенных белков вируса папилломы до уровня чистоты, пригодной для иммунологических исследований и создания вакцин. Важным было бы также получение больших количеств белков вируса папилломы, имеющих создающие иммунитет свойства нативных белков, такие как конформация нативного белка. Кроме того, ценной была бы разработка способов анализа белков PV и способов определения относительной чистоты этих белков, а также композиций, содержащих эти белки. Такие высокоочищенные белки были бы также важны в приготовлении множества реагентов, применимых в исследовании инфекции PV; к таким реагентам относятся (но не только) поликлональные антитела, моноклональные антитела и аналитические стандарты.

Данное изобретение касается высокоочищенных белков L1 и L2 PV. Изобретение также касается способов, при помощи которых получают и очищают рекомбинантные белки вируса папилломы, имеющие создающие иммунитет свойства нативных белков вируса папилломы. Данное изобретение касается получения профилактических и терапевтических вакцин для инфекции вируса папилломы. Рекомбинантные белки по данному изобретению способны к образованию вирусподобных частиц. Эти VLP являются иммуногенными и предотвращают образование бородавок в модели животного. Данное изобретение иллюстрируется в виде примеров полученными из рекомбинантных дрожжей белками L1 и L1+L2 вируса папилломы американского кролика (CRPV), HPV типа 6 (подтипа 6a) и HPV типа 16 в качестве модельных систем. Способы очистки и аналитические способы данной заявки могут быть адаптированы к другим типам HPV, другим белкам HPV и другим рекомбинантным экспрессионным системам.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Данное изобретение касается очищенных рекомбинантных белков вирусов папилломы (PV) и способов их получения, измерения, применения и приготовления в виде лекарственных форм.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Данное изобретение касается очищенных рекомбинантных белков вирусов папилломы (PV) и способов их получения, измерения, применения и приготовления в виде лекарственных форм. Данное изобретение иллюстрируется в виде примеров (но не только) полученными из рекомбинантных дрожжей белками CRPV, HPV6a и HPV16. Различные варианты данного изобретения включают (но не ограничиваются ими) рекомбинантные молекулы ДНК HPV, РНК, комплементарные этим рекомбинантным молекулам ДНК HPV, белки, кодируемые рекомбинантными молекулами ДНК, антитела к рекомбинантным молекулам ДНК и относящимся к ним белкам, композиции, содержащие эти ДНК, РНК, белки или антитела, способы применения этих ДНК, РНК, белков и антител, а также их производных. К таким производным относятся (но не только) пептиды и белки, кодируемые этой ДНК, антитела к этой ДНК или антитела к белкам, кодируемым этой ДНК, вакцины, содержащие эту ДНК, или вакцины, содержащие белки, кодируемые этой ДНК, иммунологические композиции, содержащие эту ДНК или белки, кодируемые этой ДНК, наборы, содержащие эту ДНК или РНК, полученную из этой ДНК, или белки, кодируемые этой ДНК.

Были получены синтезированные в бактериях L1 и L2 бычьего вируса папилломы. Нейтрализующие сыворотки к этим рекомбинантным бактериальным белкам перекрестно реагировали с нативным вирусом при низких уровнях, что, вероятно, обусловлено различиями в конформациях нативных и полученных в бактериях белков.

Рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие ORF L1 HPV16 или 12 HPV16, использовали для инфицирования клеток насекомых SF9 и получения белков L1 и L2. Вестерн-блоттинги показали, что полученные из бакуловирусов белки L1 и L2 реагировали с антителами к HPV16. L1, произведенный бакуловирусом, образует VLP.

Сообщалось о получении неочищенных белков L1 и L2 HPV16 при помощи рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae. Эти рекомбинантные белки получали в виде внутриклеточных и в виде секретируемых продуктов. При внутриклеточной экспрессии этих белков было обнаружено, что большая часть белка является нерастворимой при лизисе клеток в отсутствии денатурирующих агентов. О чистоте этих белков не сообщалось.

Было показано, что рекомбинантные белки, секретируемые из дрожжей, содержат произведенные дрожжами углеводы. Присутствие этих N-связанных олигосахаридов может маскировать нативные эпитопы. Кроме того, секретируемые рекомбинантные белки могут содержать другие модификации, такие как удерживание секреторной лидерной последовательности. Процесс секреции также может быть менее эффективным.

Разработка и коммерциализация профилактических и терапевтических вакцин для инфекции и заболевания PV, содержащих белок L1, белки L1+L2 или модифицированные белки L1 или L1+L2, тормозились отсутствием больших количеств очищенного вируса и очищенного белка. Поскольку PV нелегко культивировать in vitro, трудно получить требуемые количества белков L1 и L2 размножением in vitro PV. Трудности, связанные с культивированием PV in vitro, приводят также к трудностям в химической, иммунологической и биологической характеристике PV и белков PV. Поэтому было бы важным создание легко восполняемого источника неочищенных белков PV, в частности белков L1 и L2 PV или модифицированных белков L1 и L2. Ценной была бы также разработка способов очистки больших количеств неочищенных белков вируса папилломы до уровней чистоты, пригодной для иммунологических исследований и разработки вакцин. Было бы также важно получение больших количеств белков вируса папилломы, имеющих создающие иммунитет свойства нативных белков, такие как конформация нативного белка. Кроме того, важным является создание способов анализа белков PV и способов определения относительной чистоты этих белков, а также композиций, содержащих эти белки. Такие высокоочищенные белки были бы также важны в приготовлении множества реагентов, применимых в исследовании инфекции PV; такими реагентами являются (но не только) поликлональные антитела, моноклональные антитела и аналитические стандарты.

Фармацевтически применимые композиции, содержащие эту ДНК или белки, кодируемые этой ДНК, могут быть приготовлены в соответствии с известными способами, такими как смешивание с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры таких носителей и способов приготовления могут быть найдены в Remington's Pharmaceutical Sciences. Для образования фармацевтически приемлемой композиции, пригодной для эффективного введения, такие композиции должны содержать эффективное количество белка или VLP. Такие композиции могут содержать белки или VLP, произведенные из более чем одного типа HPV.

Терапевтические или диагностические композиции этого изобретения вводят индивидууму в количествах, достаточных для лечения или диагностики инфекций PV. Это эффективное количество может изменяться в соответствии с различными факторами, такими как состояние, вес, пол и возраст индивидуума. К другим факторам относится способ введения. Обычно композиции должны вводиться в дозах, находящихся в пределах от приблизительно 1 мкг до приблизительно 1 мг.

Фармацевтические композиции могут вводиться индивидууму различными способами, такими как подкожное, местное, пероральное, трансмукозное, внутривенное и внутримышечное введение.

Вакцины данного изобретения содержат ДНК, РНК или белки, кодируемые этой ДНК, которые содержат антигенные детерминанты, необходимые для индукции образования нейтрализующих антител в хозяине. Такие вакцины являются также достаточно безопасными для введения без риска клинической инфекции; не имеют побочных токсических действий; могут вводиться эффективным способом; стабильны и совместимы с вакцинными носителями.

Вакцины могут вводиться различными путями, например перорально, парентерально, подкожно, через слизистую оболочку, внутривенно или внутримышечно. Вводимая доза изменяется в зависимости от состояния, пола, веса и возраста индивидуума; способа введения и типа PV конкретной вакцины. Вакцину можно использовать в виде дозированных лекарственных форм, таких как капсулы, суспензии, эликсиры или жидкие растворы. Вакцина может быть приготовлена с иммунологически приемлемым носителем.

Вакцины вводят в терапевтически эффективных количествах, то есть в количествах, достаточных для генерирования иммунологически защитного ответа. Терапевтически эффективное количество может изменяться в соответствии с типом PV. Вакцину можно вводить в виде одной дозы или в виде множественных доз.

Очищенные белки данного изобретения можно применять в приготовлении иммуногенных композиций. Такие композиции при введении в подходящего хозяина способны индуцировать иммунный ответ в этом хозяине.

Очищенные белки данного изобретения или их производные можно использовать для генерирования антител. Термин "антитело" в применении здесь включает в себя как поликлональные, так и моноклональные антитела, а также их фрагменты, такие как Fv, Fab и F(ab)2, которые способны связывать антиген или гаптен.

Белки и белковые производные данного изобретения можно использовать для серотипирования инфекции PV и скрининга HPV. Очищенные белки, VLP и антитела пригодны для приготовления наборов для обнаружения и серотипирования HPV. Такой набор должен содержать компартментализованный носитель, пригодный для удерживания в тесных границах по меньшей мере одного контейнера. Носитель может содержать, кроме того, реагенты, такие как рекомбинантные белки L1, или VLP, или HPV6a, или антитела против HPV6a, или рекомбинантные белки L1, или L2, или VLP HPV16 или антитела против HPV16, пригодные для обнаружения различных типов HPV. Носитель может также содержать средства для детектирования, такие как меченый антиген или субстраты ферментов или т.п.

Очищенные белки применимы также в качестве иммунологических стандартов, маркеров молекулярной массы и маркеров молекулярного размера.

Поскольку генетический код является вырожденным, более чем один кодон может использоваться для кодирования конкретной аминокислоты и, следовательно, аминокислотная последовательность может кодироваться любым из набора сходных ДНК-олигонуклеотидов. Только один член этого набора будет идентичен последовательностям HPV6a или HPV16, но будет способен гибридизоваться с ДНК HPV6a или HPV16 даже в присутствии ДНК-олигонуклеотидов с неправильными спариваниями оснований при соответствующих условиях. При других условиях неправильно спаренные ДНК-олигонуклеотиды могут все еще гибридизоваться с ДНК HPV6a или HPV16, что позволяет идентифицировать и выделять кодирующую ДНК HPV6a или HPV16.

Очищенную ДНК HP V6a или HPV16 по этому изобретению или ее фрагменты можно использовать для выделения и очистки гомологов и фрагментов HPV6a из других источников. Для выполнения этого первую ДНК HPV6a можно смешать с пробой, содержащей ДНК, кодирующую гомологи HPV6a, при подходящих условиях гибридизации. Гибридизованный ДНК-комплекс можно выделить и из него можно очистить ДНК, кодирующую эту гомологичную ДНК.

Известно, что имеется значительное количество избыточности в различных кодонах, кодирующих специфические аминокислоты. Таким образом, данное изобретение касается также тех последовательностей ДНК, которые содержат альтернативные кодоны, кодирующие возможную при некоторых обстоятельствах трансляцию идентичной аминокислоты. Для целей этой заявки последовательность, несущая один или несколько замененных кодонов, будет называться вырожденной вариацией. В сфере действия данного изобретения находятся также мутации либо в ДНК-последовательности, либо в транслированном белке, которые по существу не изменяют конечные физические свойства экспрессируемого белка. Например, замена лейцина валином, лизина аргинином или глутамина аспарагином может не вызывать изменения в функциональности данного полипептида.

Известно, что последовательности ДНК, кодирующие пептид, могут быть изменены таким образом, что они будут кодировать пептид, имеющий свойства, отличающиеся от свойств природно встречающегося пептида. Способы изменения последовательностей ДНК включают в себя сайт-специфический мутагенез (но не ограничиваются им).

В применении здесь "функциональным производным" HPV6a является соединение, которое обладает биологической активностью (функциональной или структурной), которая в основном сходна с биологической активностью HPV6a. Термин "функциональные производные" предназначен для "фрагментов", "вариантов", "вырожденных вариантов", "аналогов" и "гомологов" или "химических производных" HPV6a. Термин "фрагмент" относится к любой полипептидной подсерии HPV6a. Термин "вариант" относится к молекуле, в основном сходной по структуре и функции либо со всей молекулой HPV6a, либо с ее фрагментом. Молекула "в основном сходна" с HPV6a, если обе эти молекулы имеют по существу сходные структуры или если обе молекулы обладают одинаковой биологической активностью. Таким образом, если две молекулы обладают по существу одинаковой активностью, они рассматриваются как варианты, даже если структура одной из этих молекул не обнаружена в другой и даже если эти две аминокислотные последовательности не являются идентичными. Термин "функциональное производное" не включает в себя HPV6a.

Термин "аналог" относится к молекуле, в основном сходной по функции либо со всей молекулой HPV6a, либо с ее фрагментом.

Многие способы, известные в данной области, можно применять для молекулярного клонирования ДНК HPV6a. К этим способам относится (но они не ограничиваются этим) прямая функциональная экспрессия генов HPV6a после конструирования библиотеки HPV6a-содержащей кДНК или геномной ДНК в подходящей системе экспрессирующего вектора. Другим способом является скрининг библиотеки HPV6a, содержащей кДНК или геномную ДНК, сконструированной в бактериофаге или плазмидном челночном векторе, меченым олигонуклеотидным зондом, построенным на основе аминокислотной последовательности HPV6a. Дополнительный способ состоит из скрининга библиотеки HPV6a, содержащей кДНК или геномную ДНК, сконструированной в бактериофаге или плазмидном челночном векторе, при помощи частичной ДНК, кодирующей HPV6a. Эту частичную ДНК получают амплификацией при помощи специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК-фрагментов HPV6a посредством конструирования вырожденных олигонуклеотидных праймеров на основе аминокислотной последовательности очищенного HPV6a. Другой способ заключается в выделении РНК из продуцирующих HPV6a клеток и трансляции этой РНК в белок при помощи системы трансляции in vitro или in vivo. Трансляция этой РНК в пептид или белок приведет к образованию по меньшей мере части белка HPV6a, который можно идентифицировать, например, по активности белка HPV6a или по иммунологической реактивности с антителами против HPV6a. В этом способе пулы РНК, выделенной из продуцирующих HPV6a клеток, могут быть анализированы на присутствие РНК, которая кодирует по меньшей мере часть HPV6a. Дальнейшее фракционирование этого пула РНК может быть осуществлено для очистки РНК HPV6a от РНК, не относящейся к HPV6a. Пептид или белок, продуцируемый по этому способу, можно анализировать для обеспечения аминокислотных последовательностей, которые, в свою очередь, используют для создания праймеров для получения кДНК HPV6a, или РНК, используемую для трансляции, можно анализировать для обеспечения нуклеотидных последовательностей, кодирующих HPV6a, и получения зондов для скрининга библиотеки кДНК HPV6a. Эти способы известны в данной области и их можно найти, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, NY. 1989.

Специалистам в данной области понятно, что для выделения HPV6a-кодирующей ДНК можно использовать другие типы библиотек, а также библиотеки, сконструированные из других клеток или типов клеток. Другие типы библиотек включают в себя (но не ограничиваются ими) библиотеки кДНК, полученные из других клеток или клеточных линий, содержащих HPV типа 6a, и библиотеки геномной ДНК.

Получение библиотек кДНК может быть осуществлено стандартными способами, хорошо известными в данной области. Способы конструирования библиотек кДНК можно найти, например, в Sambrook, J., et al., supra. Специалистам в этой области ясно, что ДНК, кодирующего HPV6a, можно также выделить из соответствующей библиотеки геномной ДНК. Конструирование библиотек геномных ДНК можно выполнять стандартными способами, известными в данной области. Способы конструирования библиотек геномных ДНК можно найти в Sambrook, et al., supra.

Клонированные ДНК HPV6a или их фрагменты, полученные описанными здесь способами, могут рекомбинантно экспрессироваться молекулярным клонированием в экспрессирующий вектор, содержащий подходящий промотор и другие подходящие регуляторные элементы транскрипции, и переноситься в прокариотические или эукариотические клетки-хозяева для продуцирования рекомбинантного HPV6a. Способы таких манипуляций полно описаны в Sambrook, J., et al., supra и известны в этой области.

Экспрессирующие векторы определяются здесь как ДНК-последовательности, которые необходимы для транскрипции клонированных копий генов и трансляции их мРНК в соответствующем хозяине. Такие векторы можно использовать для экспрессии эукариотических генов в многочисленных хозяевах, таких как бактерии, сине-зеленые водоросли, клетки растений, клетки насекомых, клетки грибов и клетки животных. Специально сконструированные векторы позволяют перемещать ДНК между такими хозяевами, как бактерии-дрожжи, или бактерии-клетки животных, или бактерии-клетки грибов, или бактерии-клетки позвоночных животных. Правильно сконструированный экспрессирующий вектор должен содержать затравку репликации для автономной репликации в клетках-хозяевах, селектируемые маркеры, ограниченное число применимых сайтов рестриктаз, потенциал для высокой копийности и активные промоторы. Промотор определяется как ДНК-последовательность, которая направляет РНК-полимеразу на связывание с ДНК и инициирует синтез РНК. Сильным промотором является такой промотор, который обусловливает высокую частоту инициации мРНК. Экспрессирующие векторы могут быть (но не только) клонирующими векторами, модифицированными клонирующими векторами, специально сконструированными плазмидами или вирусами.

Разнообразные экспрессирующие векторы млекопитающих можно использовать для экспрессии ДНК HPV6a или ее фрагментов в клетках млекопитающих. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы млекопитающих, которые могут быть пригодными для экспрессии рекомбинантного HPV6a, включают (но не ограничиваются ими) pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) и ZD35 (ATCC 37565).

Множество бактериальных экспрессирующих векторов можно использовать для экспрессии ДНК HPV6a и ее фрагментов в бактериальных клетках. Коммерчески доступные бактериальные экспрессирующие векторы, которые могут быть пригодными для экспрессии рекомбинантного HPV6a, включают (но не ограничиваются ими) pET11a (Novagen), лямбда gt11 (Invitrogen), pcDNA11 (Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).

Множество экспрессирующих векторов грибных клеток можно использовать для экспрессии HPV6a или его фрагментов в грибных клетках. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы грибных клеток, которые могут быть пригодными для экспрессии рекомбинантного HPV6a, включают (но не ограничиваются ими) pYES2 (Invitrogen), экспрессирующий вектор Pichia (Invitrogen).

Множество экспрессирующих векторов клеток насекомых можно использовать для экспрессии ДНК HPV6a или ее фрагментов в клетках насекомых. Коммерчески доступные экспрессирующие векторы клеток насекомых, которые могут быть пригодными для рекомбинантной экспрессии HPV6a, включают (но не ограничиваются ими) pBlueBacIII (Invitrogen).

Экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующую HPV6a или его фрагменты, может быть использован для экспрессии белков HPV6a или фрагментов белков HPV6a в клетке, ткани, органе или животном. Животным (в применении здесь) может быть и человек. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, в том числе (но не только) бактериями, такими как E.coli, клетками грибов, такими как дрожжи, клетками млекопитающих, в том числе (но не только), клеточными линиями человека, быка, свиньи, обезьяны и грызуна, и клетками насекомых, в том числе (но не только), клеточными линиями, произведенными из Drosophila и тутового шелкопряда. Клеточными линиями, произведенными из видов млекопитающих, которые могут быть пригодными и которые являются коммерчески доступными, являются (но не ограничены ими) L-клетки L-M(TK^-) (ATCC CCL 1.3), L-клетки L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1(ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), N1H/3T3 (ATCC CRL 1658), Hela (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) и MRS-5 (ATCC CCL 171).

Экспрессирующий вектор может быть введен в клетки-хозяева посредством одного из ряда способов, таких как (но не только) трансформация, трансфекция, липофекция, слияние протопластов и электропорация. Содержащие экспрессирующий вектор клетки клонально размножают и индивидуально анализируют для определения, продуцируют ли они белок HPV6a. Идентификацию экспрессирующих HPV6a клонов клеток-хозяев можно осуществлять несколькими способами, в том числе (но не только) по иммунологической реактивности с антителами против HPV6a и по присутствию ассоциированной с клеткой-хозяином активности HPV6a, такой как связывание HPV6a-специфического лиганда или трансдукция сигнала, определяемая как ответная реакция, опосредованная взаимодействием HPV6a-специфических лигандов при HPV6a.

Экспрессия ДНК-фрагментов HPV6a может также осуществляться с использованием продуцируемой in vitro синтетической мРНК или нативной мРНК. Синтетическая мРНК или мРНК, выделенная из продуцирующих HPV6a клеток, может эффективно транслироваться в различных бесклеточных системах, таких как (но не только) экстракты зародышей пшеницы и экстракт ретикулоцитов, а также может эффективно транслироваться в системах на основе клеток, в том числе (но не только), посредством микроинъекции в ооциты лягушки, причем этот способ является предпочтительным.

После экспрессии белков HPV6a в клетке-хозяине белок HPV6a может быть извлечен для обеспечения HPV6a в очищенном виде. Доступны и пригодны несколько способов очистки HPV6a. Как описано здесь, рекомбинантный белок HPV6a может быть очищен из клеточных лизатов и экстрактов различными сочетаниями или отдельным применением солевого фракционирования, ионообменной хроматографии, гель-фильтрации, адсорбционной хроматографии на гидроксилапатите и хроматографии гидрофобного взаимодействия.

Кроме того, рекомбинантный HPV6a может быть отделен от других клеточных белков при помощи иммуноаффинной колонки, приготовленной с моноклональными или поликлональными антителами, специфическими для полноразмерного насцентного (строящегося) HPV6a или полипептидных фрагментов HPV6a. Моноклональные и поликлональные антитела могут быть получены в соответствии со множеством способов, известных в данной области. Моноклональные или моноспецифические антитела, в применении здесь, определяются как молекулы одного антитела или молекулы множественных антител с однородными характеристиками связывания в отношении HPV6a. Однородным связыванием здесь называют способность молекул антитела связываться со специфическим антигеном или эпитопом.

Специалистам в данной области ясно, что способы получения моноспецифических антител могут быть использованы для получения антител, специфических для полипептидных фрагментов HPV или полноразмерных полипептидов HPV. В частности, специалистам в данной области ясно, что могут быть получены моноспецифические антитела, которые являются специфическими для полностью функциональных белков HPV или их фрагментов.

Данное изобретение касается также способов скрининга на соединения, которые модулируют экспрессию ДНК или РНК, кодирующих HPV, а также функцию (функции) белка (белков) HPV6a in vivo. Соединениями, которые модулируют эти активности, могут быть ДНК, РНК, пептиды, белки или небелковые органические молекулы. Соединения могут модулировать эти активности увеличением или аттенюированием экспрессии ДНК или РНК, кодирующих HPV6a, или функции белка HPV6a. Соединения, способные модулировать экспрессию ДНК или РНК, кодирующих HPV6a, или функцию белка HPV6a, могут быть обнаружены различными тестами. Такой тест может быть простым тестом "нет/да" для определения, имеется ли изменение в экспрессии или функции. Тест может быть сделан количественным путем сравнения экспрессии или функции испытуемой пробы с уровнями экспрессии или функции в стандартной пробе.

Могут быть приготовлены наборы, содержащие ДНК HPV6a, фрагменты ДНК HPV6a, антитела к ДНК HPV6a или к белку HPV6a, РНК HPV6a или белок HPV6a. Такие наборы используют для обнаружения ДНК, которая гибридизуется с ДНК HPV6a, или для обнаружения присутствия белка (белков) HPV6a или пептидных фрагментов этих белков в пробе. Такая характеристика является ценной для многочисленных целей, в том числе (но не только) для судебных анализов и эпидемиологических исследований.

Нуклеотидные последовательности, комплементарные кодирующей последовательности ДНК HPV6a, могут быть синтезированы для терапии при помощи антисмысловых последовательностей. Такими антисмысловыми молекулами могут быть ДНК, стабильные производные ДНК, такие как фосфоротиоаты или метилфосфонаты, РНК, стабильные производные РНК, такие как 2'-O-алкилРНК, или другие антисмысловые олигонуклеотидные миметики HPV6a. Антисмысловые молекулы HPV6a могут быть введены в клетки микроинъекций, инкапсулированием в липосомы или экспрессией из векторов, несущих эту антисмысловую последовательность. Терапия при помощи антисмысловых молекул HPV6a может быть, в частности, применима для лечения заболеваний, при которых выгодно уменьшение активности HPV6a.

Термин "химическое производное" относится к молекуле, которая содержит дополнительные химические части молекулы, которые в норме не являются частью основной молекулы. Такие части молекулы могут улучшать растворимость, продолжительность жизни, абсорбцию и т.д. основной молекулы. Альтернативно, эти части молекулы могут ослаблять нежелательные побочные эффекты основной молекулы или снижать токсичность основной молекулы. Примеры таких частей молекул описаны во многих руководствах, таких как Remington's Pharmaceutical Sciences.

Соединения, идентифицированные согласно описанным здесь способам, можно использовать отдельно при подходящих дозах, определяемых рутинным тестированием, для получения оптимального ингибирования HPV6a или его активности при минимизации любой потенциальной токсичности. Кроме того, может быть желательным совместное введение или последовательное введение других агентов.

Предпочтительно соединения по данному изобретению могут быть введены в виде одной суточной дозы или общая суточная доза может вводиться в виде нескольких разделенных доз. Кроме того, соединения по данному изобретению могут вводиться посредством таких способов, как (но не только) интраназальный, трансдермальный способы, при помощи суппозиториев, перорально и т.д.

Для комбинированного лечения более чем одним активным агентом, когда активные агенты находятся в раздельных дозированных готовых формах, активные агенты могут вводиться совместно или каждый может быть введен отдельно.

Схему введения соединений по данному изобретению выбирают в соответствии с различными факторами, такими как тип, вид, возраст, вес, пол и медицинское состояние пациента; тяжесть состояния, которое должно быть подвергнуто лечению, способ введения; функционирование почек и печени пациента; и конкретное применяемое соединение. Врач с обычной квалификацией может легко определить и прописать эффективное количество лекарства, требующееся для предотвращения, противодействия или остановки прогрессирования данного состояния. Оптимальная точность в достижении концентраций лекарственного средства в пределах, которые дают эффективность без токсичности, требует схемы, основанной на кинетике доступности данного лекарственного средства для сайтов-мишеней. Это включает в себя рассмотрение распределения, равновесия и элиминации лекарственного средства.

В способах по данному изобретению описанные здесь подробно соединения могут образовать активный ингредиент и их обычно вводят в смеси с подходящими фармацевтическими разбавителями, наполнителями или носителями (называемыми здесь в общем виде материалами - "носителями"), выбранными в соответствии с предполагаемой формой введения, т.е. введения в виде пероральных таблеток, капсул, эликсиров, сиропа, суппозиториев, гелей и т.п., и соответствующими обычной фармацевтической практике.

Например, для перорального введения в форме таблетки или капсулы активный лекарственный компонент может комбинироваться с пероральным нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как этанол, глицерин, вода и т.п. Кроме того, при желании или при необходимости, в эту смесь могут быть включены подходящие связующие вещества, дезинтегрирующие агенты и красители. К подходящим связующим веществам (без ограничения) относятся крахмал, желатина, природные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, сахаристые вещества из кукурузы, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, полиэтиленгликоль, воски и т.п. К смачивающим веществам, используемым в таких лекарственных формах, относятся (без ограничения) олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и т.п. Дезинтеграторы включают в себя (без ограничения) крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую камедь и т.п.

Для жидких форм активный лекарственный компонент может комбинироваться с подходящими содержащими корригент суспендирующими или диспергирующими агентами, такими как синтетические и природные камеди, например трагакант, аравийская камедь, метилцеллюлоза и т.п. Другими диспергирующими агентами, которые могут применяться, являются глицерин и т.п. Для парентерального введения желательны стерильные суспензии и растворы. В случае внутривенного введения желательно использование изотонических препаратов, которые обычно содержат подходящие ко