Способ количественного электрохимического анализа биомолекул

Способ количественного электрохимического анализа биомолекул

Реферат

 

Изобретение касается лабораторных исследований и анализов различных биологических и природных жидкостей, проводимых с целью медицинской диагностики, производственного и экологического мониторинга. Способ предусматривает формирование биосенсора путем нанесения на поверхность потенциометрического электрода в ходе электрохимического синтеза из раствора мономера пленки электропроводящего полимера, осуществление контакта биосенсора с образцом исследуемой жидкости, составление электрохимической измерительной ячейки из погруженных в буферный раствор и связанных измерительным устройством биосенсора и электрода сравнения, регистрацию посредством измерительного устройства потенциала биосенсора относительно электрода сравнения в рабочем буферном растворе, регистрацию посредством измерительного устройства изменения потенциала биосенсора при скачкообразном изменении ионной силы рабочего буферного раствора при постоянном значении величины его pH и расчет по величине изменения потенциала биосенсора количественного содержания анализируемого компонента в исследуемой жидкости. При этом электропроводящий полимер на стадии электрохимического синтеза допируют анионами, обладающими наибольшей способностью к ионному обмену с окружающим полимер раствором, иммобилизуют в или на пленку электропроводящего полимера авидин или стрептавидин. Для иммобилизации на пленку электропроводящего полимера используют биотинилированные аффинные биорецепторы, с которыми осуществляют контакт биосенсора перед составлением электрохимической ячейки. Перед измерением потенциала биосенсора в рабочем растворе, осуществляют контакт биосенсора с дополнительными мечеными биорецепторами, а регистрацию изменения потенциала биосенсора осуществляют при изменении состава рабочего раствора. Способ дает возможность осуществить анализ малых и незаряженных биомолекул и получить строгие количественные результаты. Кроме того, он позволяет увеличить срок хранения получаемых при его реализации биосенсоров, повысить производительность и чувствительность анализа, достоверность и воспроизводимость получаемых результатов. 42 з.п. ф-лы, 12 ил.

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, сельского хозяйства, экологии и охраны окружающей среды, а именно, к способам лабораторных исследований и анализов различных биологических и природных жидкостей, проводимых с целью медицинской диагностики, производственного и экологического мониторинга.

Электрохимический анализ биомолекул, таких, как различные антигены, антитела, молекулы ДНК и др., в биологических жидкостях при помощи биосенсоров является одним из наиболее перспективных и привлекательных методов инструментального анализа. Неослабевающий интерес и большое количество публикаций обусловлены следующими основными преимуществами метода: высокой чувствительностью, простотой, возможностью использования относительно простого и дешевого оборудования.

Известен способ электрохимического анализа биомолекул при помощи биосенсора [1], заключающийся в следующем: изготавливают биосенсор, представляющий собой электрохимический датчик, включающий в себя керамическую подложку и расположенные на ее поверхности золотые планарные электроды гребенчатой формы; на поверхности одного из электродов формируют путем электрохимического синтеза из раствора, включающего в себя мономер, фоновый электролит и растворитель, пленку электропроводящего полимера; в ходе электрохимического синтеза допируют полимер бифункциональным сшивающим агентом путем добавления сшивающего агента в раствор для электрохимической полимеризации; иммобилизуют соответствующие биорецепторы (ферменты, антигены, ДНК-зонды) на пленку электропроводящего полимера после электрохимического синтеза путем химического сшивания молекул биорецепторов с пленкой полимера, для чего погружают электрод, покрытый пленкой электропроводящего полимера, допированного сшивающим агентом, в раствор, содержащий биорецепторы, с последующей инкубацией в нем в течение определенного отрезка времени, либо путем адсорбции молекул биорецепторов на поверхность электропроводящего полимера, для чего погружают электрод, покрытый пленкой электропроводящего полимера, в раствор, содержащий биорецепторы, с последующей инкубацией в нем в течение определенного отрезка времени; проводят блокировку свободной поверхности электропроводящего полимера инертным белком, для чего приводят электрод, покрытый пленкой электропроводящего полимера, в контакт с раствором инертного белка; погружают полученный описанным выше способом биосенсор и электрод сравнения в чистый буферный раствор и подключают электроды биосенсора и электрод сравнения к измерительному устройству; регистрируют относительно электрода сравнения изменение потенциала электрода, покрытого пленкой электропроводящего полимера с иммобилизованными биорецепторами, при импульсном включении тока между двумя электродами биосенсора регистрируют "кривую заряжения" U₁(t) электрода с иммобилизованными биорецепторами; переносят биосенсор в исследуемый раствор и инкубируют в нем в течение фиксированного отрезка времени; переносят биосенсор и электрод сравнения в чистый буферный раствор и вновь регистрируют "кривую заряжения" U₂(t) электрода с иммобилизованными биорецепторами; вычисляют в условных единицах величины площадей, ограниченных кривыми U₁(t) и U₂(t) (в координатах "потенциал электрода - время регистрации"); на основании отличия величин площадей, ограниченных кривыми U₁(t) и U₂(t), делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемой жидкости биомолекул, специфичных к биорецепторам, иммобилизованным на биосенсоре.

Известен способ электрохимического анализа биомолекул при помощи биосенсора [2], заключающийся в следующем: изготавливают биосенсор, представляющий собой электрохимический датчик, включающий в себя керамическую подложку и расположенные на ее поверхности два независимых золотых планарных электрода гребенчатой формы; на поверхности одного из электродов формируют путем электрохимического синтеза из раствора, включающего в себя мономер, фоновый электролит и растворитель, первый слой электропроводящего полимера; на поверхности первого слоя электропроводящего полимера формируют второй слой электропроводящего полимера с одновременной иммобилизацией в него биорецепторов (антител) путем добавления биорецепторов в раствор для электрохимического синтеза; погружают полученный описанным выше способом биосенсор и электрод сравнения в буферный раствор и подключают электроды биосенсора и электрод сравнения к измерительному устройству; пропускают постоянный ток заданной величины между планарными электродами биосенсора и измеряют величину потенциала электрода сравнения относительно электрода, покрытого электропроводящим полимером с иммобилизованными биорецепторами; переносят биосенсор и электрод сравнения в образец исследуемой жидкости, разведенный буферным раствором, и измеряют при том же значении величины постоянного тока величину потенциала электрода сравнения относительно электрода, покрытого электропроводящим полимером с иммобилизованными биорецепторами; переносят биосенсор и электрод сравнения в чистый буферный раствор и измеряют величину потенциала электрода сравнения относительно электрода, покрытого электропроводящим полимером; на основании величины изменения потенциала электрода сравнения в буферном растворе, содержащем образец исследуемой жидкости, делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемой жидкости биомолекул, специфичных к биорецепторам, иммобилизованным на биосенсоре.

Известен способ электрохимического анализа биомолекул при помощи биосенсора [3], заключающийся в следующем: изготавливают биосенсор, формируя на поверхности металлического потенциометрического электрода пленку электропроводящего полимера при помощи электрохимического синтеза из раствора, включающего в себя мономер, фоновый (background) электролит и растворитель; одновременно с электрохимическим синтезом осуществляют иммобилизацию в пленку электропроводящего полимера соответствующих биорецепторов, добавляя соответствующие биорецепторы в раствор для электрохимического синтеза; составляют электрохимическую ячейку, погружая связанные измерительным прибором биосенсор и электрод сравнения в емкость, заполненную буферным раствором с фиксированным значением pH; регистрируют в течение фиксированного отрезка времени величину потенциала биосенсора относительно электрода сравнения; скачкообразно изменяют ионную силу раствора в электрохимической ячейке путем контакта биосенсора с исследуемой жидкостью, вводя в емкость с буферным раствором образец исследуемой жидкости, поддерживая при этом постоянное значение pH буферного раствора; регистрируют в течение фиксированного отрезка времени изменение потенциала биосенсора относительно электрода сравнения; переносят биосенсор и электрод сравнения в чистый буферный раствор с тем же значением величины pH и регистрируют в течение фиксированного отрезка времени изменение потенциала биосенсора относительно электрода сравнения; вычисляют в условных единицах величины площадей, ограниченных кривыми изменения потенциала биосенсора (в координатах "потенциал биосенсора - время измерения"), в буферном растворе, содержащем образец исследуемой жидкости (S₁), и в чистом буферном растворе (S₂); на основании отношения S₁/S₂ делают вывод о наличии или отсутствии в исследуемой жидкости биомолекул, специфичных к биорецепторам, иммобилизованным на биосенсоре.

К недостаткам описанных выше способов следует отнести: сложность и невысокую технологичность процесса изготовления биосенсора; нестабильность характеристик получаемых биосенсоров; невозможность хранения получаемых биосенсоров без потери их работоспособности; невоспроизводимость получаемых в ходе анализа результатов; низкую производительность анализа; невозможность осуществления анализа малых и незаряженных биомолекул; невозможность получения в ходе анализа достоверных количественных результатов.

Технический результат, достигаемый заявленным изобретением, заключается в разработке способа количественного электрохимического анализа биомолекул, в значительной степени лишенного недостатков, характерных для способов, описанных выше, а именно, в расширении области его применения за счет возможности осуществления анализа малых и незаряженных биомолекул и возможности получения строгих количественных результатов, повышении его технологичности, увеличении срока хранения получаемых биосенсоров, увеличении производительности и чувствительности анализа, повышении достоверности и воспроизводимости получаемых результатов.

Сущность изобретения заключается в достижении упомянутого технического результата в способе количественного электрохимического анализа биомолекул, предусматривающем формирование биосенсора путем нанесения на поверхность потенциометрического электрода в ходе электрохимического синтеза из раствора мономера пленки электропроводящего полимера, осуществление контакта биосенсора с образцом исследуемой жидкости, составление электрохимической измерительной ячейки из погруженных в буферный раствор и связанных измерительным устройством биосенсора и электрода сравнения, регистрацию посредством измерительного устройства потенциала биосенсора относительно электрода сравнения в буферном растворе, регистрацию посредством измерительного устройства изменения потенциала биосенсора при скачкообразном изменении ионной силы буферного раствора при постоянном значении величины его pH, в котором (дополнительно) допируют электропроводящий полимер на стадии электрохимического синтеза анионами, обладающими наибольшей способностью к ионному обмену с окружающим полимер раствором, иммобилизуют в/на пленку электропроводящего полимера авидин или стрептавидин, для иммобилизации на пленку электропроводящего полимера используют биотинилированные аффинные биорецепторы, используют дополнительные меченые биорецепторы, перед составлением электрохимической ячейки осуществляют контакт биосенсора с биотинилированными аффинными биорецепторами, перед измерением потенциала биосенсора в буферном растворе осуществляют контакт биосенсора с дополнительными мечеными биорецепторами, регистрацию изменения потенциала биосенсора осуществляют при изменении состава буферного раствора, Более подробно изобретение заключается в следующем.

1. Наносят на поверхность потенциометрического электрода при помощи электрохимического синтеза из раствора мономера пленку электропроводящего полимера.

Электропроводящий полимер выполняет при этом двоякую функцию, обеспечивая, с одной стороны, фиксацию биологического материала на поверхности биосенсора и, с другой стороны, чувствительность биосенсора к изменению состава буферного раствора.

2. Для увеличения чувствительности анализа и уменьшения времени его проведения допируют электропроводящий полимер на стадии его электрохимического синтеза анионами, обладающими наибольшей способностью к ионному обмену с анионами окружающего полимер раствора, для чего добавляют в раствор для электрохимической полимеризации соль, анионы которой обладают большим ионным радиусом.

3. Для максимального увеличения срока хранения работоспособного биосенсора, повышения технологичности процесса получения биосенсора, а также с целью увеличения достоверности получаемых в ходе анализа результатов осуществляют иммобилизацию авидина или стрептавидина в пленку электропроводящего полимера на стадии его электрохимического синтеза путем включения молекул авидина или стрептавидина в структуру электропроводящего полимера или на пленку электропроводящего полимера после его электрохимической полимеризации путем адсорбции на поверхность полимера.

4. Для расширения области применения анализа, повышения технологичности процесса получения биосенсора, а также с целью увеличения достоверности получаемых в ходе анализа результатов для иммобилизации на пленку электропроводящего полимера используют биотинилированные аффинные биорецепторы - специфичные к анализируемым биомолекулам биорецепторы, молекулы которых коньюгированы с биотином.

В качестве биорецепторов используют моноклональные и поликлональные антитела, антигены, однонитевые молекулы ДНК, ДНК-зонды.

5. Для придания биосенсору с иммобилизованным авидином или стрептавидином специфичности к анализируемым биомолекулам осуществляют реакцию между иммобилизованным на биосенсоре авидином или стрептавидином с биотинилированными аффинными биорецепторами, для чего приводят биосенсор в контакт с раствором биотинилированных аффинных биорецепторов после осуществления иммобилизации авидина или стрептавидина в/на пленку электропроводящего полимера или непосредственно перед контактом биосенсора с образцом исследуемой жидкости, или в процессе контакта биосенсора с образцом исследуемой жидкости.

6. Для расширения области применения анализа за счет осуществления анализа малых и незаряженных биомолекул и возможности получения строгих количественных результатов используют дополнительные меченые биорецепторы - биорецепторы, специфичные либо к биотинилированным аффинным биорецепторам, либо к анализируемым биомолекулам, при этом молекулы которых коньюгированы с зарядовой или ферментной метками.

7. Осуществляют в течение фиксированного отрезка времени контакт биосенсора с образцом исследуемой жидкости.

8. Осуществляют в течение фиксированного отрезка времени контакт биосенсора с дополнительными мечеными биорецепторами после контакта биосенсора с образцом исследуемой жидкости или в процессе контакта биосенсора с образцом исследуемой жидкости или, в процессе контакта биосенсора с образцом исследуемой жидкости и одновременно с биотинилированными аффинными биорецепторами.

9. Составляют электрохимическую измерительную ячейку, приводя биосенсор и электрод сравнения, связанные посредством измерительного устройства, в контакт с буферным раствором.

10. Осуществляют в течение фиксированного отрезка времени регистрацию посредством измерительного устройства величины потенциала биосенсора относительно потенциала электрода сравнения.

11. Скачкообразно изменяют ионную силу буферного раствора, повышая или понижая ее, или для увеличения чувствительности анализа и расширения области его применения изменяют состав буферного раствора.

12. Осуществляют в течение фиксированного отрезка времени регистрацию посредством измерительного устройства изменение величины потенциала биосенсора относительно потенциала электрода сравнения при изменении ионной силы или состава буферного раствора.

13. На основании количественных характеристик изменения величины изменения потенциала биосенсора при изменении ионной силы или состава буферного раствора делают вывод о количественном содержании анализируемых биомолекул в исследуемой жидкости.

Новизна заявленного технического решения состоит в том, что заявителем предложен новый способ с новой совокупностью признаков, отличающихся от прототипов.

Все признаки, характеризующие заявленный объект и внесенные в формулу изобретения являются существенными, т.к. только благодаря их совокупности достигается тот положительный эффект, который ожидается от использования заявленного технического решения.

Кроме того, указанные отличительные признаки проявляют новые свойства, неизвестные в науке и технике.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна", "положительный эффект" и "существенные отличия".

Заявленный способ поясняется чертежами, где изображены основные этапы его осуществления.

Фиг. 1A: нанесение на поверхность потенциометрического электрода (1) пленки электропроводящего полимера (2) и иммобилизация в нее молекул авидина или стрептавидина (3).

Фиг. 1B: нанесение на поверхность потенциометрического электрода (1) пленки электропроводящего полимера (2) и иммобилизация на нее молекул авидина или стрептавидина (3).

Фиг. 2A: придание биосенсору специфичности к анализируемым антигенам путем проведения реакции между иммобилизованным в пленку авидином или стрептавидином с антителами (4), коньюгированными с биотином (5).

Фиг. 2B: придание биосенсору специфичности к анализируемым антителам путем проведения реакции между иммобилизованным в пленку авидином или стрептавидином с антигеном (6), коньюгированными с биотином (5).

Фиг. 2C: придание биосенсору специфичности к анализируемым молекулам ДНК путем проведения реакции между иммобилизованным в пленку авидином или стрептавидином с ДНК-зондом (7), коньюгированным с биотином (5).

Фиг. 3A: осуществление контакта биосенсора с образцом исследуемой жидкости, содержащей антигены (6), специфичные к иммобилизованным на биосенсоре биотинилированным антителам.

Фиг. 3B: осуществление контакта биосенсора с образцом исследуемой жидкости, содержащей антитела (4), специфичные к иммобилизованным на биосенсоре биотинилированным антигенам.

Фиг. 3C: осуществление контакта биосенсора с образцом исследуемой жидкости, содержащей молекулы ДНК (8), специфичные к иммобилизованным на биосенсоре ДНК-зондам.

Фиг. 4A: осуществление контакта биосенсора с раствором коньюгированных с зарядовой меткой (10) дополнительных биорецепторов (9), специфичных к анализируемому антигену.

Фиг. 4B: осуществление контакта биосенсора с раствором коньюгированных с зарядовой меткой (10) дополнительных биорецепторов (11), специфичных к анализируемым антителам.

Фиг. 5A: осуществление контакта биосенсора с раствором коньюгированных с зарядовой меткой (10) дополнительных биорецепторов (12), специфичных к биотинилированным антителам.

Фиг. 5B: осуществление контакта биосенсора с раствором коньюгированных с зарядовой меткой (10) дополнительных биорецепторов (13), специфичных к биотинилированным антигенам.

Фиг. 6A: осуществление контакта биосенсора с раствором коньюгированных с ферментной меткой (14) дополнительных биорецепторов (9), специфичных к анализируемому антигену.

Фиг. 6B: осуществление контакта биосенсора с раствором коньюгированных с ферментной меткой (14) дополнительных биорецепторов (11), специфичных к анализируемым антителам.

Фиг. 7A: осуществление контакта биосенсора с раствором коньюгированных с ферментной меткой (14) дополнительных биорецепторов (12), специфичных к биотинилированным антителам.

Фиг. 7B: осуществление контакта биосенсора с раствором коньюгированных с ферментной меткой (14) дополнительных биорецепторов (13), специфичных к биотинилированным антигенам.

Фиг. 8A: проведение анализа, с последовательным осуществлением контакта биосенсора с раствором биотинилированных биорецепторов [фиг. 8A1], с образцом исследуемой биологической жидкости [фиг. 8A2], с раствором дополнительных меченых биорецепторов [фиг. 8A3] и с последующим измерением потенциала биосенсора относительно потенциала электрода сравнения [фиг. 8A4].

Фиг. 8B: проведение анализа, при котором вначале осуществляют контакт биосенсора с раствором биотинилированных биорецепторов [фиг. 8B1], далее осуществляют контакт биосенсора с образцом исследуемой биологической жидкости, в который добавляют раствор дополнительных меченых биорецепторов [фиг. 8B2], и далее осуществляют измерение потенциала биосенсора относительно потенциала электрода сравнения [фиг. 8B3].

Фиг. 8C: проведение анализа, при котором вначале в образец исследуемой биологической жидкости добавляют раствор биотинилированных биорецепторов [фиг. 8C1], далее осуществляют контакт биосенсора с образцом исследуемой биологической жидкости, содержащим биотинилированные биорецепторы и дополнительные меченые биорецепторы [фиг. 8C2] , и далее осуществляют измерение потенциала биосенсора относительно потенциала электрода сравнения [фиг. 8C3] .

Фиг. 9: кривые изменения потенциала биосенсора при скачкообразном изменении ионной силы или состава буферного раствора (в координатах "милливольты - время") после инкубации биосенсора с образцом исследуемой биологической жидкости, не содержащим специфичного к биотинилированным биорецепторам компонента (кривая 1) и после инкубации биосенсора с образцом исследуемой биологической жидкости, содержащим специфичный к биотинилированным биорецепторам компонент (кривая 2).

Фиг. 10: калибровочный график зависимости разности в милливольтах между фоновым и конечным потенциалами биосенсора, измеренными относительно потенциала электрода сравнения, от концентрации HBsAg в образцах сывороток крови.

Фиг. 11: кривая зависимости разности в милливольтах между фоновым и конечным потенциалами биосенсора, измеренными относительно потенциала электрода сравнения, от разведения HBsAg-позитивной сыворотки крови.

Фиг. 12: кривые статистического распределения величины разности в милливольтах между фоновым и конечным потенциалами биосенсора, измеренными относительно потенциала электрода сравнения, при использовании образцов, содержащих ДНК комплементарную и некомплементарную к иммобилизованному на биосенсорах ДНК-зонду.

Новизна заявленного технического решения состоит в том, что заявителем предложен новый способ с новой совокупностью признаков, отличающихся от прототипа.

Все признаки, характеризующие заявленный объект и внесенные в формулу изобретения, являются существенными, т.к. только благодаря их совокупности достигается тот положительный эффект, который ожидается от использования заявленного технического решения.

Кроме того, указанные отличительные признаки проявляют новые свойства, неизвестные в науке и технике.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения "новизна", "положительный эффект" и "существенные отличия".

Заявленный способ осуществляют следующим образом.

1. Наносят на поверхность потенциометрического электрода пленку электропроводящего полимера.

Основными требованиями, предъявляемыми к материалу электрода, используемого для осуществления заявленного способа, являются наличие электропроводности и устойчивость в водных растворах. В качестве электрода можно использовать как стандартные потенциометрические электроды, так и специально сконструированные для осуществления заявленного способа.

Перед проведением электрохимического синтеза электроды предварительно дважды промывают в 2-5%-ном растворе KOH в течение 30 минут, далее ополаскивают деионизованной водой и дважды промывают в ацетоне в течение 5 минут, после чего высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение 20 минут. После этого электроды помещают в аппарат Сокслета, где промывают горячим изопропиловым спиртом в течение 0,5 - 2 часов. Затем электроды извлекают из аппарата Сокслета и высушивают в парах изопропилового спирта. Далее электроды помещают в герметично закрытую посуду, где хранят не более 1,5 - 2 часов до начала процесса электрохимического синтеза.

Выбор электропроводящих полимеров, таких, как полипиррол, политиофен, полифуран, для формирования биосенсора обусловлен следующими их свойствами: высокой химической стойкостью, высокой электропроводностью, простотой и технологичностью получения пленок полимеров путем электрохимического синтеза, возможностью варьирования свойств образующейся полимерной пленки (структуры, электропроводности, ион-чувствительности и т.п.) на стадии ее синтеза.

Электрохимический синтез пленки электропроводящего полимера осуществляют из раствора, содержащего мономер, полярный растворитель и фоновый электролит.

В качестве мономера используют пиррол, тиофен, фуран, анилин. В качестве полярного растворителя используют деионизованную воду. Мономер перегоняют в стандартной аппаратуре с водяным охлаждением при атмосферном давлении при температуре 135-140^oC и хранят в герметичной посуде темного стекла под N₂ при температуре -20-5^oC. Концентрацию мономера в растворе для электрохимической полимеризации варьируют в зависимости от типа анализа в пределах 0,3 - 1,0 М. После смешивания компонентов раствора его обрабатывают ультразвуком в течение 2-4 минут. Непосредственно перед проведением синтеза удаляют O₂ из раствора путем пропускания через него N₂ в течение 10 - 15 минут.

Электрохимический синтез проводят в трехэлектродной электрохимической ячейке, включающей рабочий электрод, электрод сравнения и вспомогательный электрод. В качестве рабочего электрода используют предварительно подготовленный, так как это было описано выше, потенциометрический металлический электрод, в качестве вспомогательного электрода - золотую или платиновую проволоку, а в качестве электрода сравнения - хлорсеребряный электрод.

Синтез осуществляют при помощи потенциостата, используя режим непрерывной развертки напряжения на рабочем электроде. В зависимости от желаемой толщины полимерной пленки и ее свойств, варьируют нижнюю границу развертки потенциала, верхнюю границу развертки потенциала, скорость развертки напряжения и количество циклов развертки в пределах от -500 мВ до +800 мВ, от +1000 мВ до +2000 мВ (относительно Ag/AgCl-электрода сравнения), 25 - 200 мВ/с и 3-30 соответственно.

Процесс образования пленки электропроводящего полимера контролируют по виду вольтамперной кривой и суммарному количеству электричества, прошедшего через рабочий электрод, при помощи самописца или другого регистрирующего прибора, соединенного с потенциостатом. При этом следят, чтобы величина прошедшего через рабочий электрод электричества для первого и последующих циклов не отличалась более чем на 15%.

2. Для увеличения чувствительности анализа и уменьшения времени его проведения проводят допирование электропроводящего полимера на стадии его электрохимического синтеза. Допирование осуществляют противоионами, обладающими наибольшей способностью к ионному обмену с окружающим полимер раствором. Для этого в качестве фонового электролита при приготовлении раствора для электрохимической полимеризации используют соли, анионы которых обладают большим ионным радиусом.

Как было показано в ряде работ [4, 5], легкость ионного обмена и скорость достижения ионного равновесия для электропроводящих полимеров, погруженных в раствор, в основном зависит от размера противоиона, введенного на стадии электрохимического синтеза: чем больше ионный радиус противоиона, тем легче протекают ионообменные реакции и быстрее устанавливается равновесное состояние, а это напрямую связано с величиной и скоростью изменения потенциала системы "металлический электрод - электропроводящий полимер" в ответ на изменение ионного состава раствора [6].

В качестве солей, анионы которых обладают большим ионным радиусом, используют додецилсульфат натрия (SDS), декстрансульфат натрия и т.п., концентрацию которых в растворе для электрохимической полимеризации варьируют в зависимости от типа анализа в пределах 0,005 - 0,05 М.

3. Осуществляют иммобилизацию в/на пленку электропроводящего полимера авидина или стрептавидина.

Авидин или стрептавидин используют с целью максимального увеличения срока хранения работоспособного биосенсора, повышения технологичности процесса получения биосенсора, а также с целью увеличения достоверности получаемых в ходе анализа результатов.

Одной из основных проблем, характерных для электрохимических методов анализа с использованием биосенсоров, является проблема длительного сохранения нативных свойств иммобилизованных на биосенсорах биорецепторов. Относительный прогресс в этой области достигнут лишь для ограниченного ряда ферментных биосенсоров [7] . Для большинства же известных из литературы электрохимических биосенсоров с использованием аффинных рецепторов [8, 9, 10] срок сохранения их работоспособности просто не указывается, что косвенным образом свидетельствует о его крайне малой величине. Особенно остро проблема сохранения нативных свойств иммобилизованных биорецепторов стоит в том случае, когда в качестве биорецепторов используются антитела, что связано с их высокой конформационной изменчивостью.

С другой стороны, известно, что антитела и другие биорецепторы сохраняют свою работоспособность в течение весьма продолжительного времени при хранении их в виде концентрированных растворов, поэтому задача длительного хранения биосенсоров без потери их рабочих характеристик может быть решена путем проведения быстрой иммобилизации аффинных биорецепторов непосредственно перед осуществлением контакта биосенсора с образцом исследуемой жидкости или даже в ходе этого контакта.

В заявленном изобретении эту задачу решают, используя хорошо известную аффинную пару "авидин (стрептавидин) - биотин". Авидин, белок, выделяемый из сырых яиц, содержит в своей структуре четыре одинаковые пептидные субъединицы, каждая из которых имеет один сайт связывания молекулы биотина. Авидин, выделенный из некоторых бактериальных культур, например, Streptomyces avidinii, носит название стрептавидин. Авидин и стрептавидин обладают одинаковыми способностями быстро и необратимо связывать молекулы биотина и могут быть равнозначно использованы для осуществления заявленного способа.

Исследованиями, проведенными авторами заявленного изобретения, было показано, что авидин и стрептавидин, иммобилизованные в пленку электропроводящего полимера, сохраняют свои нативные свойства в течение длительного периода времени (до одного года) и в течение всего этого периода могут быть использованы для связывания с биотином, коньюгированным с аффинными биорецепторами.

Помимо увеличения срока хранения биосенсора иммобилизация авидина или стрептавидина в/на пленку электропроводящего полимера также существенно увеличивает достоверность получаемых в ходе анализа результатов за счет снижения неспецифических взаимодействий компонентов исследуемой жидкости в ходе контакта с ней биосенсора, что связано с блокировкой молекулами авидина или стрептавидина свободной поверхности электропроводящего полимера, а также повышает технологичность процесса изготовления биосенсора, позволяя избежать дополнительной процедуры блокировки его поверхности.

Иммобилизацию авидина или стрептавидина в/на пленку электропроводящего полимера на биосенсоре осуществляют либо на стадии электрохимического синтеза электропроводящего полимера (фиг. 1A), либо по его завершении (фиг. 1B). Выбор конкретного способа иммобилизации обусловлен конкретным типом анализа.

В первом случае раствор авидина или стрептавидина добавляют в раствор для электрохимического синтеза непосредственно перед проведением синтеза. Время хранения конечного раствора не должно превышать 30 минут. Концентрацию авидина или стрептавидина в растворе в зависимости от конкретного типа анализа варьируют в пределах 5,00 - 100,00 мкг/мл. Электрохимический синтез электропроводящего полимера из раствора, содержащего авидин или стрептавидин, осуществляют так, как это было описано выше. По завершении электрохимического синтеза полученный биосенсор промывают последовательно деионизованной водой и 0,01 М фосфатно-солевым буферным раствором и далее в зависимости от типа анализа либо помещают в специальный буферный раствор для хранения, содержащий ингибиторы микробного роста, либо высушивают на обеспыленном воздухе при комнатной температуре.

Во втором случае биосенсор после завершения процесса электрохимического синтеза промывают деионизованной водой и помещают в свежеприготовленный 0,02 М карбонатный буферный раствор, где выдерживают в течение 15 - 60 минут. Далее осуществляют контакт биосенсора со свежеприготовленным 0,02 М карбонатным буферным раствором, содержащим авидин или стрептавидин в концентрации 1,00 - 50,00 мкг/мл, погружая биосенсор в емкость, заполненную раствором, или нанося каплю раствора на поверхность биосенсора. Инкубацию биосенсора с раствором авидина или стрептавидина проводят в течение 1 - 24 часов при температуре +4^oC. После завершения инкубации биосенсор промывают деионизованной водой и помещают на 1 - 4 часа в 0,1 М фосфатно-солевой буферный раствор. Далее в зависимости от типа анализа биосенсор либо помещают в специальный буферный раствор для хранения, содержащий ингибиторы микробного роста, либо высушивают на обеспыленном воздухе при комнатной температуре.

4. Используют биотинилированные аффинные биорецепторы.

Биотин (витамин H, hexahydro-2-oxo-1H-thieno [3, 4] umidoazole-4-pentanoic acid) является фактором роста и присутствует в очень небольших количествах во всех клетках живых организмов. Способность молекул биотина вступать в аффинную реакцию с молекулами авидина или стрептавидина и образовывать в ходе этой реакции практически недиссоциирующие комплексы "биотин - авидин" (константа диссоциации - 10^-15 М/л) хорошо известна, и на ней основан ряд методов анализа, в основном, в области генной инженерии [11, 12].

Коньюгирование биотина с соответствующими биорецепторами - биотинилирование - проводят по одной из известных методик, например, описанной в [12] . Полученные биотинилированные аффинные биорецепторы переводят путем диализа в буферный раствор для хранения, содержащий ингибиторы микробного роста, и хранят в герметично закрытой посуде при температуре +4^oC.

В зависимости от типа анализа в качестве аффинных биорецепторов используют моноклональные или поликлональные антитела (фиг. 2A), антигены (фиг. 2B), однонитевые молекулы ДНК (фиг. 2C) и пр.

Исследованиями, проведенными как авторами заявленного изобретения, так и другими авторами [12], было показано, что биотинилирование биорецепторов не приводит к изменению их свойств (аффинности, способности храниться и др.) по сравнению с их небиотинилированными аналогами.

Для осуществления ряда анализов, например, для анализа различных иммуноглобулинов, используют готовые коммерчески доступные препараты