Тетрапептид, стимулирующий функцию сетчатой оболочки глаза, фармакологическое средство на его основе и способ его применения

Тетрапептид, стимулирующий функцию сетчатой оболочки глаза, фармакологическое средство на его основе и способ его применения

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается создания препаратов для лечения глазных болезней. Предложены: тетрапептид аланил-глутамил-аспарагил-глицин общей формулы Ala-Glu-Asp-Gly в качестве средства, обладающего способностью стимулировать функцию сетчатой оболочки глаза; фармакологическое средство, содержащее в качестве активного начала эффективное количество тетрапептида Ala-Glu-Asp-Gly или его солей по аминогруппе (ацетат, гидрохлорид, оксалат) и по карбоксильным группам (соли металлов - натрия, калия, кальция, лития, цинка, магния, а также органических и неорганических катионов - аммония, триэтиламмония); способ лечения заболеваний и патологических состояний, сопровождающихся нарушением функции сетчатой оболочки глаза, включающий профилактическое и/или лечебное введение пациенту фармакологического средства в дозах 0,01-1000 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. Технический результат: новое биологически активное соединение при низких дозах обеспечивает терапевтический эффект. 3 с. и 9 з.п.ф-лы, 9 табл.

Изобретение относится к медицине и касается использования в офтальмологии синтезированного тетрапептида для лечения глазных болезней путем стимуляции функции сетчатой оболочки глаза.

Известны следующие группы фармакологических препаратов, применяемых при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функции сетчатой оболочки глаза: сосудорасширяющие средства (никотиновая кислота, нигексин, но-шпа, никошпан, теофиллин, эуфиллин, компламин, нитрат натрия); средства, улучшающие состояние сосудистой стенки и микроциркуляцию (продектин, трентал); антикоагулянты (гепарин); биогенные стимуляторы (алоэ, торфот, плацентарная кровь, ФиБС, стекловидное тело, пелоидодистиллят, антиретикулярная цитотоксическая сыворотка); АТФ; витаминные препараты (витамины A, E, B₁, B₆, C); дезинтоксикационные препараты (унитиол); препараты нуклеиновых кислот (дронуклид, энкад, нуклеинат натрия) [1,2].

Однако вследствие неспецифичности терапии указанными препаратами их терапевтический эффект, как правило, оказывается кратковременным и нестойким, кроме того, эти препараты обладают выраженными побочными эффектами [3].

Известно использование пептидных препаратов для лечения глазных болезней. В частности известно средство, используемое в офтальмологии и восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза [4]. Этот препарат представляет собой комплекс низкомолекулярных полипептидов, полученный из сетчатки животных путем экстракции 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка и обработкой надосадочной жидкости ацетоном.

Следует отметить, что указанный способ производства лекарственного вещества имеет некоторые недостатки, к которым относятся ограниченные запасы исходного органического сырья, трудоемкость и энергоемкость производства.

Заявляемое изобретение направлено на получение нового биологически активного соединения пептидной природы, обладающего свойством стимулировать функцию сетчатой оболочки глаза, получение которого возможно в крупномасштабном производстве с минимальными затратами.

Сущность изобретения состоит в использовании тетрапептида Ala-Glu-Asp-Gly, или его солей (далее - тетрапептид), в качестве средства, обладающего способностью стимулировать функцию сетчатой оболочки глаза, с целью длительного и стойкого улучшения зрительных функций.

Тетрапептид получают классическим методом пептидного синтеза в растворе [5].

Согласно изобретению тетрапептид аланил-глутамил-аспарагил-глицин со следующей аминокислотной последовательностью: Ala-Glu-Asp-Gly, проявляет новую биологическую активность, заключающуюся в способности стимулировать функцию сетчатой оболочки глаза.

Согласно изобретению фармакологическое средство, обладающее способностью стимулировать функцию сетчатой оболочки глаза, содержит в качестве активного начала эффективное количество тетрапептида формулы аланил-глутамил-аспарагил-глицин (Ala-Glu-Asp-Gly) или его солей.

Согласно изобретению фармакологическое средство, обладающее способностью стимулировать функцию сетчатой оболочки глаза, может содержать соли по аминогруппе (ацетат, гидрохлорид, оксалат), или по карбоксильным группам (соли металлов - натрия, калия, кальция, лития, цинка, магния, а также органических и неорганических катионов - аммония, триэтиламмония).

Согласно изобретению фармакологическое средство предназначено для парентерального, парабульбарного, ретробульбарного, субконъюнктивального, локального применения, а также в виде глазных инстилляций, накожной аппликации и при физиотерапевтических воздействиях в составе любой лекарственной формы или композиции, в качестве единственного средства медикации или в комбинации с другими лекарственными препаратами.

Понятие "фармакологическое средство", используемое в данной заявке, подразумевает использование лекарственной формы, приемлемой для способа введения и содержащей тетрапептид или его соли, которые могут найти профилактическое и/или лечебное применение в медицине в качестве средства, стимулирующего функцию сетчатой оболочки глаза.

Понятие "эффективное количество", используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Согласно изобретению способ лечения заболеваний и патологических состояний включает профилактическое или лечебное введение пациенту заявляемого фармакологического средства в дозах от 0,01 до 1000 мкг/кг массы тела не менее одного раза в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта в зависимости от характера течения патологического процесса.

Согласно изобретению тетрапептид активен при введении его в дозах от 0,01 мкг/кг массы тела, хотя могут быть использованы и более низкие дозы в зависимости от характера течения патологического процесса.

Изобретение иллюстрируется примером синтеза тетрапептида формулы аланил-глутамил-аспарагил-глицин (Ala-Glu-Asp-Gly) (пример 1), примерами, наглядно демонстрирующими выявленные новые свойства исследуемого препарата в экспериментальных моделях (примеры 2, 3, 4, 5), а также примерами результатов клинического применения фармакологического средства у ограниченного контингента больных, демонстрирующими его фармакологические свойства и подтверждающими возможность достижения профилактического и/или лечебного эффекта (примеры 6, 7, 8, 9, 10).

ПРИМЕР 1 Синтез тетрапептида формулы аланил-глутамил-аспарагил-глицин (Ala-Glu-Asp-Gly) 1) BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (I), N-трет.бутилоксикарбонил- (- бензил)глутамил- бензил)аспартат.

N-оксисукцинимидный эфир N-трет.бутилоксикарбонил- (- бензил)глутаминовой кислоты BOC-Glu(OBzl)-OSu 4,34 г (0,0100 моль) растворяют в 20 мл диметилформамида, добавляют триэтиламин 1,72 мл (0,0125 моль) и -бензиласпартат 2,80 г (0,0125 моль). Перемешивают при комнатной температуре 24 час. Продукт высаживают 0,5 н. раствором серной кислоты (150 мл), экстрагируют в этилацетат (3х30 мл), промывают 0,5 н. раствором серной кислоты (2х20 мл), водой, 5% раствором бикарбоната натрия (1х20 мл), водой, 0,5 н. раствором серной кислоты (2х20 мл), водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Этилацетат фильтруют, упаривают в вакууме при 40^oC, остаток сушат в вакууме над P₂O₅. Получают масло 5,68 г (100%). R_f = 0,42 (бензол-ацетон 2: 1, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление УФ и хлор/бензидин).

2) TFAH-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (II), трифторацетат (- бензил)-глутамил- ( -бензил)аспартата.

N-трет. бутилоксикарбонил- (- бензил)глутамил- (- бензил)аспартат (I) 5,68 г (0,01 моль) растворяют в 20 мл смеси дихлорметан-трифторуксусная кислота (3:1). Через 2 часа растворитель упаривают в вакууме при 40^oC, упаривание повторяют с новой порцией дихлорметана (2х10 мл), остаток сушат в вакууме над NaOH. Получают масло 5,80 г (100%). R_f= 0,63 (н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода, 15:10:3:12).

3) Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-OH (III), N-карбобензоксиаланил- (- бензил)-глутамил- (- бензил)аспартат.

Трифторацетат (- бензил)глутамил- (- бензил)аспартата (II) 5,65 г (0,01 моль) растворяют в 10 мл диметилформамида, добавляют триэтиламин 2,80 мл (0,02 моль) и N-оксисукцинимидный эфир N-карбобензоксиаланина 4,14 г (0,013 моль). Смесь перемешивают 24 часа при комнатной температуре. Продукт высаживают 0,5 н. раствором серной кислоты (150 мл), экстрагируют в этилацетат (3х30 мл), промывают 0,5 н. раствором серной кислоты (2х20 мл), водой, 5% раствором бикарбоната натрия (1х20 мл), водой, 0,5 н. раствором серной кислоты (2х20 мл), водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Этилацетат фильтруют, упаривают в вакууме при 40^oC, остаток закристаллизовывают в системе этилацетат/гексан. Продукт отфильтровывают и сушат в вакууме над P₂O₅. Выход 4,10 г (66 %). Т_пл.= 154^oC. R_f= 0,48 (бензол-ацетон, 1:1), R_f = 0,72 (н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода, 15:10:3:12).

4) Z-Ala-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Gly-OBzl (III), бензиловый эфир N-карбобензоксиаланил-(- бензил)глутамил- ( -бензил)аспартилглицина.

TosOHH-Gly-OBzl, тозилат бензилового эфира глицина 1,01 г (3 ммоль) суспендируют в 15 мл тетрагидрофурана и при перемешивании добавляют триэтиламин 0,4 мл (3 ммоль), далее через 5 мин. N-карбобензоксиаланил- (- -бензил)глутамил- ( -бензил)аспартат (III) 1,28 г (2 ммоль), N-оксибензотриазол 0,27 г (2 ммоль) и охлаждают смесь до 0^oC. Затем добавляют охлажденный до 0^oC раствор N, N'-дициклогексилкарбодиимида 0,42 г (2 ммоль) в 5 мл тетрагидрофурана, перемешивают смесь при этой температуре 2 часа и оставляют на ночь перемешиваться при комнатной температуре. Осадок дициклогексилмочевины отфильтровывают, растворитель упаривают в вакууме, остаток растворяют в 30 мл этилацетата и промывают раствор 1 н. раствором соляной кислоты, водой, 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой, 1 н. раствором соляной кислоты, водой и сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель упаривают в вакууме и продукт закристаллизовывают в системе этилацетат/гексан. Выход 1,30 г (82%). Т_пл. = 146-148^oC. R_f= 0,75 (бензол-ацетон, 2:1).

5) H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH (IV), аланил-глутамил-аспартил-глицин.

Бензиловый эфир N- карбобензоксиаланил- (- бензил)глутамил- ( -бензил)аспартилглицина (III) 1,25 г гидрировали в системе метанол-вода-уксусная кислота (3:1:1) над катализатором Pd/C. Контроль за полнотой деблокирования в ТСХ системах бензол-ацетон (2:1) и ацетонитрил- уксусная кислота-вода (5: 1:3). По окончании реакции катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме и остаток закристаллизовывают в системе вода/метанол. Продукт сушат в вакууме над КОН. Выход 520 мг (95%). R_f = 0,73 (ацетонитрил- уксусная кислота-вода, 5: 1:3). Для очистки 390 мг препарата растворяли в 4 мл 0,01% трифторуксусной кислоты и подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50х250 мм Diasorb-130-C16T, 7 mkm. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module, 168 Diode Array Detector Module. Условия хроматографирования A: 0,1% TFA; B: 50% MeCN/0,1% TFA, градиент B 0 ---> 5% за 80 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при 215 нм, сканирование 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин. Отбирали фракцию 54,0-66,0 мин. Растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше 40^oC, упаривание многократно (5 раз) повторяли с 10 мл 10% раствора уксусной кислоты. Окончательно остаток растворяли в 20 мл деионизованной воды и лиофилизовывали. Получено 290 мг очищенного препарата в виде аморфного белого порошка без запаха.

Полученный пептид в виде ацетата переводят в свободную форму обработкой анионитом IRA или аналогичным в (OH^-) - форме. Далее получают соли по аминогруппе, прибавляя эквивалент соответствующей кислоты (соляной или щавелевой). Полученный водный раствор лиофилизуют и анализируют как готовый продукт.

Для получения соответствующих солей по карбоксильным группам к свободному тетрапептиду добавляют рассчитанное количество водного раствора гидроокиси соответствующего металла (NaOH, KOH, Zn(OH)₂, LiOH, Ca(OH)₂, Mg(OH)₂, NH₄OH). Для получения триэтиламмониевой соли обработку проводят аналогичным образом, используя в качестве основания триэтиламин.

Содержание основного вещества определяют методом ВЭЖХ на колонке Supelco LC-18-DB 4,6х250 mm, gard. LC-18-DB. A:0,1% TFA; B: 50% MeCN/0,1% TFA; grad B 0 ---> 20% за 20 минут. Скорость потока 1 мл/мин. Детекция при 220 нм, сканирование 190-600 нм, проба 20 мк. Содержание основного вещества 98,45%.

Определение аминокислотного состава проводят на анализаторе после 6 часового гидролиза в 6 н. HCl при 125^oC 24 часа. Содержание аминокислот: Glu: Asp:Ala:Gly составляет 1,02:1,00:1,01:1,00 соответственно.

Фармакологическое средство в инъекционной форме, содержащее в качестве активного начала тетрапептид, получают следующим образом. Пептид, полученный описанным выше способом, растворяют в изотоническом растворе натрия хлорида 0,9%. Содержимое одного флакона составляет 1 мл раствора с концентрацией тетрапептида 10 мкг/мл.

При экспериментальном исследовании тетрапептида выявлены такие его не известные ранее фармакологические эффекты, как стимулирование зрительных функций и уменьшение деструктивных процессов в сетчатке при ее токсической дистрофии, предотвращение развития токсической дистрофии сетчатки, предотвращение развития абиотрофических изменений и улучшение зрительной функции при наследственной абиотрофии сетчатки, ускорение восстановления световой чувствительности сетчатки после зрительной дезадаптации.

ПРИМЕР 2 Влияние лечебного курса тетрапептида на функцию и морфологию сетчатки при токсической дистрофии.

2.1. Влияние лечебного курса тетрапептида на параметры электроретинограммы при токсической дистрофии сетчатки кроликов.

Исследовано возможное лечебное действие тетрапептида на сетчатку в условиях ее экспериментальной дистрофии на глазах 15 половозрелых кроликов породы "шиншилла" массой 2,5-3,5 кг. Экспериментальную токсическую дисторофию сетчатки создавали путем внутривенного введения 4%-ного раствора монойодуксусной кислоты (далее - МЙУК) в дозах 15 мг/кг (тяжелая степень повреждения сетчатки) и 5 мг/кг (средняя степень повреждения сетчатки). Степень поражения сетчатки оценивали по уровню ее биоэлектрической активности, определяемой методом электроретинографии (ЭРГ). ЭРГ регистрировали в условиях адаптации к темноте до введения монойодуксусной кислоты (исходные значения), а также через 20 мин, 5, 10, 15 и 35 суток после ее введения. Животные опытной группы на протяжении всего эксперимента получали ежедневные однократные внутримышечные инъекции тетрапептида в дозе 1 мкг/кг, начиная с 3-х суток после введения монойодуксусной кислоты. Животные контрольной группы получали соответствующие инъекции стерильного физиологического раствора.

Результаты исследования биоэлектрической активности сетчатки глаз кроликов опытной и контрольной группы представлены ниже в таблице 1.

Как видно, амплитуда волны "в" ЭРГ уже через 20 минут после введения монойодуксусной кислоты составила 4% от исходных значений при тяжелом поражении и 40% от исходных значений при средней степени поражения сетчатки.

Применение тетрапептида приводит к достоверному повышению волны "в" ЭРГ по сравнению с контролем. Так, при средней степени тяжести повреждения сетчатки лечебный эффект тетрапептида обнаруживается уже на 15-е сутки наблюдения, достигая своего максимума к 35 суткам. Амплитуда волны "в" ЭРГ у опытных животных за этот период достигает 85% от фонового уровня и почти в 2 раза превышает таковую в контрольной группе. Положительный эффект тетрапептида наблюдается и в случае тяжелых повреждений сетчатки. Если в контрольной группе после введения монойодуксусной кислоты (15 мг/кг) ЭРГ практически не регистрировалась в течение всего периода наблюдения у всех животных, то в опытной группе на фоне применения тетрапептида у 50% животных регистрировалась волна "в", а к 35 суткам исследования амплитуда волны "в" ЭРГ составила 18% от исходного уровня. Как показывают данные таблицы, еще одним подтверждением положительного влияния тетрапептида на функцию поврежденной сетчатки является стабилизация амплитуды волны "в" ЭРГ на начальном этапе развития дистрофии в опытной группе, в то время как в контрольной группе наблюдалось стойкое снижение амплитуды волны "в" ЭРГ в последующие 5-10 суток после инъекции монойодуксусной кислоты.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что заявляемый тетрапептид стимулирует функции поврежденной сетчатки при токсической дистрофических заболеваниях сетчатки, вызванных токсическим агентом.

2.2. Влияние лечебного курса тетрапептида на морфологию сетчатки при токсической дистрофии сетчатки кроликов.

Действие, стимулирующее функции сетчатки, исследовано при действии тетрапептида на сетчатку в условиях ее экспериментальной дистрофии на глазах 15 половозрелых кроликов породы "шиншилла" массой 2-3 кг. Экспериментальную токсическую дистрофию сетчатки создавали путем внутривенного введения 3%-ного раствора йодистого калия в дозе 30 мг/кг. Животные опытной группы (10 кроликов) в течение 7 суток получали ежедневные однократные внутримышечные инъекции тетрапептида в дозе 0,3 мкг/кг, начиная с 10-х суток после введения токсического агента. Животные контрольной группы получали соответствующие инъекции стерильного физиологического раствора. Проводили ежедневное офтальмоскопическое исследование, а также гистологическое исследование глаз в различные сроки после введения йодистого калия.

Через 1 час после введения токсического агента наблюдался отек диска зрительного нерва и сетчатки, более выраженный по периферии. Гистологически на 2-е сутки после введения йодистого калия выявлено, что сетчатка резко отечна, слои разрыхлены, в области I и III нейронов значительное накопление жидкости, кровеносные сосуды радужной оболочки переполнены. На 7-е сутки офтальмоскопически отмечалось появление аморфных очагов серовато-черного цвета по периферии глазного дна. В дальнейшем сохранялся отек сетчатой оболочки глаза, а по периферии сетчатки наблюдалось скопление пигментных клеток, расположенных ближе к углу глаза. В цилиарном теле обнаруживали сращение между собой отростоков с образованием "пещеристых лакун".

Гистологически через 5 суток после окончания курса лечения у контрольных (нелеченых) животных сохранялся умеренный отек сетчатки и наблюдались аморфные очаги по периферии сетчатки. При офтальмоскопии у кроликов, получавших тетрапептид, выявлено снижение отека сетчатки, уменьшение размеров аморфных очагов. Это подтверждали данные гистологического исследования, проведенного через 5 суток после окончания курса лечения тетрапептидом: у опытных животных отека сетчатки не обнаруживалось, сохранившиеся очаги отличались меньшими по сравнению с контролем размерами.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют, что тетрапептид, введенный на фоне развивающихся дистрофических изменений сетчатки, вызванных токсическим агентом, уменьшает степень выраженности деструктивных изменений, предотвращает дальнейшее развитие патологического процесса и способствует нормализации структур сетчатки. Такое свойство тетрапептида позволяет предположить его высокую терапевтическую ценность при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функции сетчатки, в частности при вторичных хориоретинальных дистрофиях, ретинопатиях различного генеза, сосудисто-ретинальных нарушениях, макулярных дегенерациях и периферических дегенерациях сетчатки, отслойке и дефектах сетчатки, поражениях сетчатки химическими и физическими факторами, других хориоретинальных расстройствах.

ПРИМЕР 3 Влияние профилактического курса тетрапептида на морфологию сетчатки при токсической дистрофии.

Исследовано возможное профилактическое действие тетрапептида на развитие экспериментальной дистрофии сетчатки на глазах 12 половозрелых кроликов породы "шиншилла" массой 2-3 кг. Животные опытной группы в течение 30 суток получали ежедневные однократные внутримышечные инъекции тетрапептида в дозе 0,3 мкг/кг. Животные контрольной группы получали соответствующие инъекции стерильного физиологического раствора. После окончания инъекций у животных моделировали экспериментальную токсическую дистрофию сетчатки путем внутривенного введения 3%-ного раствора йодистого калия в дозе 30 мг/кг. В дальнейшем в течение 2-х недель проводили ежедневное офтальмоскопическое исследование, а также гистологическое исследование глаз на различные сроки после введения йодистого калия.

У контрольных животных после введения йодистого калия офтальмоскопически и гистологически определяли выраженный отек сетчатки и диска зрительного нерва, формирование аморфных очагов по периферии сетчатой оболочки. В отличие от контроля у животных, получавших профилактические инъекции тетрапептида, офтальмоскопически отека диска зрительного нерва и появления аморфных очагов на сетчатке не выявлено. При гистологическом исследовании сетчатки животных опытной группы патологических изменений не обнаружено.

Таким образом, результаты исследования свидетельствуют, что тетрапептид, введенный в течение 1 месяца до начала действия токсического агента, обладает выраженным защитным действием и предотвращает развитие токсической дистрофии сетчатки. Такое свойство тетрапептида позволяет предположить его высокую профилактическую ценность при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функции сетчатки, в частности при вторичных хориоретинальных дистрофиях, ретинопатиях различного генеза, сосудисто-ретинальных нарушениях, макулярных дегенерациях и периферических дегенерациях сетчатки, отслойке и дефектах сетчатки, поражениях сетчатки химическими и физическими факторами, других хориоретинальных расстройствах.

ПРИМЕР 4 Применение тетрапептида при наследственной дегенерации сетчатки у крыс линии CAMBELL.

Исследовали влияние тетрапептида на функцию сетчатки глаза 19 крыс линии Campbell, характеризующейся развитием наследственной дегенерации сетчатки. Пигментная атрофия сетчатки у крыс линии Campbell начинает развиваться спустя 17-20 суток после рождения и приводит к полной слепоте животных к концу 2-го месяща после рождения. Животные опытной группы (10 крыс) в течение всего срока исследования получали ежедневные однократные внутримышечные инъекции тетрапептида в дозе 1 мкг/кг, начиная с 17-х суток после рождения. Животные контрольной группы (9 крыс) получали соответствующие инъекции стерильного физиологического раствора.

Функцию сетчатки у животных обеих групп оценивали по электроретинограмме (ЭРГ), регистрировавшейся на 30-е и 47-е сутки после рождения. Всех животных содержали при естественном освещении. Перед регистрацией ЭРГ крыс адаптировали к темное в течение 2-х часов. ЭРГ отводили под нембуталовым наркозом при помощи фитилькового электрода, касающегося увлажненной роговицы. Зрачок расширяли 1% раствором атропина, роговицу анестезировали 0,25%-ным раствором дикаина. В качестве фотостимула использовали белый рассеиватель. Применяли световые вспышки длительностью 100 мс, максимальная яркость стимула составляла 510⁴ нт. Частоту стимуляции изменяли от одиночных до 34 импульсов в секунду. Критерием оценки эффективности тетрапептида было изменение амплитуды волны "в" ЭРГ при различных частотах воспроизведения ритма фотостимуляции.

Показатели ЭРГ у животных обеих групп на 30-е сутки после рождения представлены ниже в таблице 2.

Как видно, у крыс, получавших тетрапептид, амплитуда волны "в" ЭРГ на 30-е сутки достоверно более высокая по сравнению с контролем, причем эта разница наблюдается во всем диапазоне частоты стимулов. Кроме того, у контрольных крыс при частоте 34 имп/с не представлялось возможным вызвать соответствующие волны ЭРГ, что свидетельствует о снижении функциональных возможностей рецепторных элементов сетчатки к воспроизведению ритма стимуляции. Напротив, у животных, леченных тетрапептидом, такая способность к воспроизведению ритма стимуляции сохранялось. Следует отметить, что существенных различий в картине глазного дна у животных изученных групп выявить не представлялось возможным, однако поведенческая реакция крыс контрольной группы свидетельствовала о снижении зрительной функции.

Показатели ЭРГ у животных обеих групп на 47-е сутки после рождения представлены ниже в таблице 3.

Как и на 30-е сутки, амплитуда волны "в" ЭРГ у крыс, получавших тетрапептид, достоверно более высокая по сравнению с контролем во всем диапазоне частоты стимулов. При анализе динамики ЭРГ у контрольных животных отмечается снижение амплитуды волны "в" на 50-80% по сравнению с 30-м днем, в то время как у животных, леченных тетрапептидом, это снижение по сравнению с 30-м днем составило лишь 15-20%. Кроме того, у контрольных животных при частоте импульсов 24 в минуту и более рецепторные элементы сетчатки не воспроизводили ритм стимуляции, а у крыс, получавших тетрапептид, способность к воспроизведению ритма сохранялась при всех уровнях частоты фотостимуляции.

На глазном дне у крыс контрольной группы в эти сроки отмечались признаки абиотрофических изменений сетчатки; выраженность этих изменений в опытной группе оказалась значительно меньшей. Резкие отличия обнаруживались и в поведенческой реакции. Так, у крыс контрольной группы в отличие от опытных животных наблюдались признаки резкого падения зрительной функции.

Таким образом, проведенное исследование показывает высокую эффективность тетрапептида в предотвращении развития и лечении абиотрофии сетчатки наследственного генеза. Такое свойство ретилина позволяет предположить его высокую терапевтическую и профилактическую ценность при таких заболеваниях, как наследственные дистрофии сетчатки и врожденные аномалии глаза, сопровождающиеся нарушением функции сетчатки.

ПРИМЕР 5 Влияние тетрапептида на скорость восстановления световой чувствительности сетчатки после дезадаптирующего фотостимула.

Проведено исследование влияния тетрапептида на скорость восстановления световой чувствительности сетчатки по восстановлению волны "в" электроретинограммы (ЭРГ) после дезадаптирующих вспышек света. У 18 кроликов массой 3-4 кг после предъявления дезадаптирующего фотостимула регистрировали ЭРГ (контроль), затем однократно внутримышечно вводили исследуемый тетрапептид в дозе 1 мкг/кг. После темновой адаптации и последующего повторного воздействия дезадаптирующего фотостимула снова регистрировали ЭРГ. Результаты исследования представлены в таблице 4.

Как видно, тетрапептид существенно ускоряет восстановление световой чувствительности сетчатки на начальном этапе зрительной дезадаптации, что проявляется в достоверно более высоких значениях амплитуды волны "в" ЭРГ по сравнению с контролем.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что тетрапептид ускоряет восстановление световой чувствительности сетчатки после зрительной дезадаптации. В связи с этим можно сделать вывод об эффективности заявляемого средства при лечении и профилактике заболеваний сетчатки, а также иных заболеваний и патологических состояний, которые сами по себе либо посредством своих осложнений приводят к снижению функции сетчатки и могут сопровождаться такими расстройствами зрения, как нарушение полей зрения, нарушение цветоощущения, гемералопия и др.

Выявленные в результате экспериментального изучения новые свойства препарата тетрапептида позволяют считать показанным его лечебное и профилактическое применение для стимулирования функций сетчатки при ряде заболеваний и патологических состояний, сопровождающихся нарушением функции сетчатой оболочки глаза. Перечень заболеваний и патологических состояний приводится в соответствии с международной классификацией заболеваний (ICD-9-CM, Вашингтон, 1989).

360 Поражения глазного яблока 360.0 Гнойный эндофтальмит 360.00 Гнойный эндофтальмит (неклассифицированный иным образом) 360.01 Острый эндофтальмит 360.02 Панофтальмит 360.03 Хронический эндофтальмит 360.04 Витреальный абсцесс 360.1 Другие эндофтальмиты 360.11 Симпатический уевит 360.12 Пануевит 360.13 Паразитарный эндофтальмит (неклассифицированный иным образом) 360.19 Другие Факоанафилактический эндофтальмин 360.2 Дегенеративные поражения глазного яблока 360.20 Дегенеративное поражение глазного яблока (неклассифицированное иным образом) 360.21 Прогрессирующая высокая (дегенеративная) миопия Злокачественная миопия 360.23 Сидероз 360.24 Другие металлозы Халькоз 360.29 Другие 361 Отслойки и дефекты сетчатки 361.0 Отслойка сетчатки с ретинальным дефектом Регматогенная отслойка сетчатки 361.00 Отслойка сетчатки с ретинальным дефектом (неклассифицированная иным образом) 361.01 Свежая отслойка, частичная, с одиночным дефектом 361.02 Свежая отслойка, частичная, с множественными дефектами 361.03 Свежая отслойка, частичная, с гигантским разрывом 361.04 Свежая отслойка, частичная, с ретинальным диализом Диализ (юношеский) сетчатки (с отслойкой) 361.05 Свежая отслойка, тотальная или субтотальная 361.06 Старая отслойка, частичная Ограниченная старая отслойка сетчатки 361.07 Старая отслойка, тотальная или субтотальная 361.1 Ретиношизис и кисты сетчатки 361.10 Ретиношизис (неклассифицированный иным образом) 361.11 Плоский ретиношизис 361.12 Буллезный ретиношизис 361.13 Первичные кисты сетчатки 361.14 Вторичные кисты сетчатки 361.19 Другие Псевдокиста сетчатки 361.2 Серозная отслойка сетчатки Отслойка сетчатки без ретинального дефекта 361.3 Дефекты сетчатки без отслойки 361.30 Дефект сетчатки (неклассифицированный иным образом) Разрыв(ы) сетчатки (неклассифицированные иным образом) 361.31 Округлое отверстие сетчатки без отслойки 361.32 Подковообразный разрыв сетчатки без отслойки Разрыв сетчатки с "крышечкой" 361.33 Множественные дефекты сетчатки без отслойки 361.8 Другие формы отслойки сетчатки 361.81 Тракционная отслойка сетчатки Тракционная отслойка с витреоретинальной организацией 361.89 Другие 361.9 Неклассифицированная отслойка сетчатки 362 Другие поражения сетчатки 362.0 Диабетическая ретинопатия Также: Диабет с офтальмологическими проявлениями (250,5) 362.01 Фоновая диабетическая ретинопатия Диабетические ретинальные микроаневризмы Диабетическая ретинопатия (неклассифицированная иным образом) 362.02 Пролиферативная диабетическая ретинопатия 362.1 Другие вторичные ретинопатии и сосудисто-ретинальные нарушения 362.10 Вторичная ретинопатия, неспецифическая 362.11 Гипертоническая ретинопатия 362.12 Экссудативная ретинопатия Синдром Коутса 362.13 Изменение внешнего вида сосудов Утолщение стенки сосудов сетчатки Атеросклероз сосудов сетчатки (440.8) 362.14 Ретинальные микроаневризмы (неклассифицированные иным образом) 362.15 Ретинальная телеангиэктазия 362.16 Ретинальная неоваскуляризация (неклассифицированная иным образом) Неоваскуляризация: хлоридальная субретинальная 362.17 Другие интраретинальные микрососудистые нарушения Ретинальные варикозы 362.18 Ретинальные васкулиты Болезнь Илза Ретинальный: артериит эндартериит Ретинальный: периваскулит флебит 362.2 Другие пролиферативные ретинопатии 362.21 Ретролентальная фиброплазия 362.29 Другие недиабетические пролиферативные ретинопатии 362.3 Окклюзия сосудов сетчатки 362.30 Окклюзия сосудов сетчатки (неклассифицированная иным образом) 362.31 Окклюзия центральной ретинальной артерии 362.32 Окклюзия ветви артерии 362.33 Частичная артериальная окклюзия Бляшка Холленхроста Ретинальная микроэмболия 362.34 Транзиторная артериальная окклюзия Преходящая слепота (ammaurosis fugax) 362.35 Окклюзия центральной ретинальной вены 362.36 Окклюзия венозной ветви 362.37 Венозный застой Окклюзия ретинальной вены: начальная частичная 362.4 Отслойка слоев сетчатки 362.40 Отслойка ретинального слоя (неклассифицированная иным образом) 362.41 Центральная серозная ретинопатия 362.42 Серозная отслойка пигментного эпителия сетчатки Экссудативная отслойка пигментного эпителия сетчатки 362.43 Геморрагическая отслойка пигментного эпителия сетчатки 362.5 Дегенерация макулы и заднего полюса 362.50 Сенильная макулярная дегенерация (неклассифицированная иным образом) 362.51 Неэкссудативная сенильная макулярная дегенерация Сенильная макулярная дегенерация: атрофическая сухая 362.52 Экссудативная сенильная макулярная дегенерация Дегенерация Кунта-Юниуса Сенильная макулярная дегенерация: дисциформная влажная 362.53 Кистевидная макулярная дегенерация 362.54 Макулярная киста, углубление или псевдоуглубление 362.55 Токсическая макулопатия 362.56 Макулярная складчатость Преретинальный фиброз 362.57 Друзы (дегенеративные) 362.6 Периферические дегенерации сетчатки 362.60 Периферическая дегенерация сетчатки (неклассифицированная иным образом) 362.61 Дегенерация типа "булыжной мостовой" 362.62 Микрокистовидная дегенерация Кисты Блессига Кисты Иванова 362.63 Решетчатая дегенерация Частокольная дегенерация сетчатки 362.64 Вторичная пигментная дегенерация Пигментный псевдоретинит 362.65 Вторичные витреоретинальные дегенерации 362.7 Наследственные дистрофии сетчатки 362.70 Наследственная дистрофия сетчатки (неклассифицированная иным образом) 362.71 Дистрофия сетчатки при системных или цереброретинальных липидозах C указанием основного заболевания, например: Цереброретинальные липидозы (330.1) Системные липидозы (272.7) 362.72 Дистрофия сетчатки при других системных расстройствах и синдромах C указанием основного заболевания, например: синдром Бессена-Корнцвейга (272.5) болезнь Рефсума (356.3) 362.73 Витреоретинальные дистрофии Юношеский ретиношизис 362.74 Пигментная дистрофия сетчатки Бело-точечная ретинальная дистрофия Пигментный ретинит 362.75 Другие дистрофии с первичным поражением сенсорного слоя сетчатки Прогрессирующая дистрофия колбочек (палочек) Болезнь Штаргардта 362.76 Дистрофии с первичным поражением пигментного эпителия сетчатки Желто-пятнистое глазное дно Вителлиформная дистрофия 362.77 Дистрофия с первичным поражением мембраны Бруха Дистрофии: гиалиновая псевдовоспалительная фовеальная Наследственные друзы 362.8 Другие расстройства сетчатки 362.81 Кровоизлияние в сетчатку Кровоизлияние: преретинальное ретинальное (глубокое, поверхностное) субретинальное 362.82 Экссудаты и отложения в сетчатку 362.83 Отек сетчатки ватообразные пятна ретинальный отек (очаговый) (макулярный) (периферический) 362.84 Ишемия сетчатки 362.85 Дефекты нервных волокнистых пучков сетчатки 362.89 Неклассифицированное расстройство сетчатки 363 Хориоретинальное воспаление, рубцы и другие расстройства сосудистой оболочки глаза 363.0 Фокальный хориоретинит и фокальный ретинохориоидит 363.00 Фокальный хориоретинит (неклассифицированный иным образом) Фокальный: хориоидит или хориоретинит ретинит или ретинохориоидит 363.01 Фокальный хориоидит и хориоретинит, юкстапапиллярный 363.03 Фокальный хориоидит и хориоретинит заднего полюса глаза другой локализации 363.04 Фокальный хориоидит и хориоретинит, периферический 363.05 Фокальный ретинит и ретинохориоидит, юкстапапиллярный Нейроретинит 363.06 Фокальный ретинит и ретинохориоидит, макулярный или парамакулярный 363.07 Фокальный ретинит и ретинохориоидит заднего полюса глаза другой локализации 363.08 Фокальный ретинит и ретинохориоидит, периферический 363.1 Диссеминированный хориоретинит и диссеминированный ретинохориоидит 363.10 Диссеминированный хориоретинит (неклассифицированный иным образом) Диссеминированный: хориоидит или хориоретинит ретинит или ретинохориоидит 363.11 Диссеминированный хориоидит и хориоретинит, заднего полюса 363.12 Диссеминированный хориоидит и хориоретинит