Рекомбинантный аденовирусный вектор и способы его применения

Рекомбинантный аденовирусный вектор и способы его применения

Реферат

 

Изобретение относится к рекомбинантным аденовирусным векторам экспрессии, характеризующимся частичной или полной делецией фрагмента ДНК аденовируса, кодирующего белок IX, и содержащим ген чужеродного белка, или его функциональный фрагмент, или мутантную форму. Предложена фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантный аденовирусный вектор экспрессии, который содержит вставку экзогенной ДНК, содержащей ген, кодирующий чужеродный белок, и аденовирусную ДНК, имеющую делецию, начинающуюся в положении от 357 до 360 и заканчивающуюся в положении от 4020 до 4050. Указанная фармацевтическая композиция может быть использована в генной терапии, для трансформации гиперпролиферативных клеток млекопитающих, терапии рака, ингибировании пролиферации опухоли у животных, для снижения пролиферации опухолевых клеток. 7 с. и 13 з.п. ф-лы, 2 табл., 16 ил.

Для образования рекомбинантных аденовирусов, применимых в генотерапии, необходимо использовать клеточную линию, в которой по "транс" типу синтезируются продукты вирусных генов E1 области, делетированных у исходных вирусов. В настоящее время доступна единственная клеточная линия 293, первоначально описанная в 1977 Graham с соавт. Клетки линии 293 содержат приблизительно 12% (4,3 кб) левой части генома аденовируса типа 5 (Aiello, 1979; Spector, 1983).

Аденовирусные векторы, исследованные на настоящий момент для целей генной терапии, обычно имеют делеции генов Ad2 или Ad5, расположенные от точки, отстоящей на 400 кб от 5'-конца вирусного генома до точки, отстоящей приблизительно на 63,3 кб от 5'-конца, с общей делецией области E1 (2,9 кб). Таким образом, существует ограниченная область гомологии приблизительно в 1 кб между последовательностями ДНК рекомбинантного вируса и ДНК Ad5 в клеточной линии. Данная гомология определяет область потенциальной рекомбинации между вирусными и клеточными аденовирусными последовательностями. Такая рекомбинация приводит к образованию вируса фенотипически дикого типа, несущего область Ad5 E1 из клеток 293. По-видимому, именно такое рекомбинационное событие обусловливает частое обнаружение аденовируса дикого типа в препаратах рекомбинантного вируса. Кроме того, было прямо показано, что такая рекомбинация является причиной контаминации вирусом дикого типа рекомбинантного вируса Ad2/CFTR-1, созданного на основе Ad2 (Rich et al., 1993).

В силу высокой степени гомологии последовательностей в подгруппе аденовирусов типа C, подобная рекомбинация более вероятна, если для создания вектора использован любой аденовирус группы C (типы 1,2,5,6).

При мелкомасштабном производстве рекомбинантных аденовирусов проблема контаминации вирусом дикого типа может быть решена процедурой отбора, при которой контаминированные партии вируса просто отбрасываются. При увеличении масштабов культивирования для нужд генотерапии повышается вероятность загрязнения каждой отдельной партии вируса вирусом дикого типа и возрастают трудности получения неконтаминированных препаратов рекомбинантного вируса.

В текущем году будет диагностировано более миллиона случаев первичного рака, а количество смертей, обусловленных онкологическими заболеваниями, достигнет полумиллиона (Американское Противораковое Общество, 1993). Мутации гена p53 являются наиболее частым генетическим повреждением, ассоциированным с опухолями человека, они встречаются в 50-60% опухолей человека (Hollstein et al.,1991: Bartek et al., 1991: Levine, 1993). Целью генотерапии p53-дефицитных опухолей является, например, введение нормальной функциональной копии гена p53 дикого типа для восстановления контроля клеточной пролиферации. P53 играет ключевую роль в клеточном цикле, останавливая рост с тем, чтобы могли произойти репарация или апоптоз в ответ на повреждение ДНК. Недавно было показано, что p53 дикого типа является необходимым компонентом системы апоптоза, индуцируемого облучением или лечением некоторыми химиотерапевтическими препаратами (Lowe et al. , 1993, A и B). Поскольку мутации p53 с высокой частотой обнаруживаются в опухолях человека, вероятно, что эти опухоли стали устойчивыми к химио- и радиотерапии в силу утраты p53 дикого типа. "Доставка" функционального p53 в эти опухоли с высокой вероятностью сделает их чувствительными к апоптозу, обычно связанному с повреждением ДНК, индуцированным облучением или химиотерапией.

Одним из критических моментов в успешной терапии заболеваний человека при помощи генов-супрессоров опухолей является возможность воздействия на значительную долю опухолевых клеток. С этой целью на различных опухолевых моделях широко применяли ретровирусные векторы. Например, для лечения опухолей печени применение ретровирусных векторов оказалось малоэффективным, поскольку с их помощью не удавалось достигнуть высокого уровня переноса генов, необходимого для генотерапии in vivo (Huber, B.E. et al., 1991; Caruso M. etal., 1993).

С целью создания более длительного источника продукции вируса исследователи попытались преодолеть проблему низкой частоты переноса генов с помощью прямой инъекции в солидные опухоли упаковочных клеток, продуцирующих ретровирусные векторы (Caruso, M. et al., 1993; Ezzidine, Z.D. et al., 1991; Culver, K. W. et al., 1992). Однако данный подход оказался неприемлемым для лечения больных, поскольку в ответ на введение упаковочных клеток развивалась воспалительная реакция.

Другим недостатком ретровирусных векторов является их потребность в делящихся клетках для эффективной интеграции и экспрессии перенесенного рекомбинантного гена (Hubner, В.Е., 1991). Стабильная интеграция ретровирусного генома в существенный ген клетки-хозяина может привести к возникновению и наследованию различных патологий.

Рекомбинантные аденовирусы имеют существенные преимущества по сравнению с ретровирусными векторами и с другими методами переноса генов (см. обзор Siegfried, 1993). Никогда не было показано, что аденовирусы способны вызывать опухоли у человека и их вполне безопасно использовали в качестве живых вакцин (Straus, 1984). Дефектные по репликации рекомбинантные аденовирусы могут быть получены заменой области E1, необходимой для репликации, на ген, предназначенный для переноса. Аденовирус не интегрирует с геномом клеток человека, и тем самым значительно снижается риск инсерционного мутагенеза, возможного при использовании ретровирусных и аденоассоциированных (AAV) векторов. Отсутствие стабильной интеграции повышает безопасность еще и за счет того, что эффект перенесенного гена является временным, поскольку экстрахромосомная ДНК будет утрачиваться по мере деления нормальных клеток. Стабильный рекомбинантный аденовирус с высоким титром может быть получен в количествах, не достижимых в случае ретровирусных или AAV векторов, что создает возможность для лечения большого числа больных. Кроме того, аденовирусные векторы обеспечивают высокоэффективный перенос генов in vivo в разнообразные опухолевые клетки и ткани. Так, например, было показано, что перенос генов при помощи аденовирусов имеет существенное значение при генотерапии таких заболеваний как цистофиброз (Rosenfeld et al., 1992; Rich et al., 1993) и дефицит альфа-1-антитрипсина (Lemarchand et al.,1992). Хотя в настоящее время используются и альтернативные методы переноса генов, например катионные комплексы липосомы/ДНК, ни один из этих методов пока не является столь же эффективным, как перенос генов с помощью аденовирусов.

Как и в случае дефектных по p53 опухолей, целью генотерапии других опухолей является восстановление контроля над пролиферацией клеток. При дефиците p53 введение функционального гена восстанавливает контроль над клеточным циклом и делает возможной гибель клеток путем апоптоза под действием терапевтических препаратов. Аналогично, гемотерапия в равной степени может быть основана на манипуляциях с другими генами-супрессорами опухолей, которые могут применяться независимо или в сочетании с терапевтическими препаратами для контроля клеточного цикла опухолевых клеток и/или индукции гибели клеток. Кроме того, гены, которые не кодируют белки - регуляторы клеточного цикла, но непосредственно вызывают гибель клеток, например "суицидные" гены или гены, кодирующие токсичные для клетки белки, также могут быть использованы в генотерапевтических процедурах для остановки клеточного цикла в опухолевых клетках.

Независимо от того, какой ген использован для восстановления контроля над клеточным циклом, теоретические предпосылки и практическая значимость такого подхода остаются неизменными. А именно: необходимо получить высокую эффективность переноса генов для экспрессии терапевтических количеств рекомбинантного продукта. Для успеха генотерапевтического подхода важен правильный выбор вектора, обеспечивающего высокую эффективность переноса генов с минимальным риском для пациента.

Таким образом, существует потребность в векторах и методах, обеспечивающих высокую эффективность переноса генов и высокий уровень экспрессии белков, которые были бы достаточно безопасны для генотерапевтических процедур. Настоящее изобретение отвечает указанным целям и, кроме того, предоставляет ряд дополнительных преимуществ.

На фиг. 1 представлен заявленный в настоящем изобретении аденовирусный вектор. Сборку конструкта производили, как показано на фиг. 1. Полученный вирус имеет 5'-концевую делецию аденовирусных последовательностей, простирающуюся от нуклеотида 356 до нуклеотида 4020 и устраняющую гены E1a и E1b, а также все кодирующие последовательности белка IX, оставляя интактным общий сайт полиаденилирования генов Eld и P1X, что позволяет использовать его для терминации транскрипции любого желаемого гена.

На фиг. 2 приведена аминокислотная последовательность p110^RB.

На фиг. 3 представлена последовательность ДНК, кодирующей белок-супрессор ретинобластомы.

На фиг. 4 схематически представлены рекомбинантные конструкты P53/аденовирус, заявленные в настоящем изобретении. P53-рекомбинанты основаны на Ad 5, у которого область E1 (нуклеотиды 360-3325) была заменена на полноразмерную (1.4 кб) кДНК p53. При этом экспрессия p53 направлялась промотором Ad 2 MLP (A/М/53) или промотором цитомегаловируса человека (CMV) (A/C/53), за которыми следовала трехчленная лидерная кДНК Ad 2. Контрольный вирус A/М имел те же делеции генома Ad 5, что и вирус A/М/53, но не имел 1.4 кб-вставки кДНК p53. Оставшиеся последовательности E1b (705 нуклеотидов) делетировали для получения конструктов A/M/N/53 и A/C/N/53 с делецией по белку IX. Данные конструкты также имели 1.9 кб Xba 1-делецию в области E3 аденовируса типа 5.

Фиг. 5A и 5B иллюстрируют экспрессию белка p53 в опухолевых клетках, инфицированных вирусами A/М/53 и A/C/53. Фиг. 5A: клетки Saos-2 (остеосаркома) были заражены с указанной множественностью инфекции вирусом A/М/53 или вирусом A/C/53 и подвергнуты анализу спустя 24 часа после заражения. Антитела pAb 1801 к p53 использовали для окраски иммуноблотов образцов, уравненных по общей концентрации белка. В качестве маркера использовали эквивалентные по белку образцы экстракта клеток SW480, которые экспрессируют мутантный p53 в больших количествах. "О" под заголовком "A/C/53" означает псевдоинфекцию, и данный трек содержит лизат необработанных клеток Saos-2. Фиг. 5B: клетки гепатоцеллюлярной карциномы Hep B3 заражали вирусом A/М/53 или вирусом A/C/53 с указанной множественностью инфекции и анализировали, как описано в разделе "A". Стрелка указывает положение белка p53.

На фиг. 6A-6C показано зависимое от p53 изменение морфологии клеток Saos-2. Субконфлюэнтные клетки Saos-2 (1 10⁵ клеток/10 см чашку) оставляли неинфицированными (A), инфицировали с множественностью 50 контрольным вирусом A/М (B) или вирусом A/C/53 (C). Клетки фотографировали спустя 72 часа после заражения.

На фиг. 7 показано зависимое от p53 ингибирование синтеза ДНК в опухолевых клеточных линиях человека, инфицированных вирусами A/M/N/53 и A/C/N/53. Клетки девяти различных опухолевых линий инфицировали или контрольным аденовирусом A/М (-x-x-), или экспрессирующими p53 A/M/N/53 (- - -) или A/C/N/53 (-о-о-) с возрастающей множественностью инфекции, как показано на фигуре. Для каждой клеточной линии приведен тип опухоли и статус p53 (wt - дикий тип; null - белок не экспрессируется; mut - экспрессируется мутантный белок). Спустя 72 часа после заражения определяли синтез ДНК, как это описано ниже в Эксперименте N ll. Результаты приведены для трех измерений для каждой дозы (среднее +/- стандартное отклонение) и представлены как процент контроля со средой в зависимости от множественности инфекции. Клетки H69 тестировали только с вирусами A/М и A/M/N/53.

На фиг. 8 представлена туморогенность клеток Saos-2, инфицированных p53, для голых мышей. Клетки Saos-2 инфицировали или контрольным вирусом A/М или p53-рекомбинантом A/M/N/53 с множественностью инфекции 30. Обработанные клетки вводили подкожно в бок голым мышам и дважды в неделю в течение 8 недель определяли размеры опухолей (как описано в Эксперименте II). Результаты выражали как зависимость размера опухоли от дней, прошедших с момента имплантации опухолевых клеток как для контрольных A/М- инфицированных (-x-x-) клеток, так и для A/M/M/53- инфицированных клеток (- - -). Границы ошибок отражают средний размер опухолей (+/- стандартное отклонение) для каждой группы из 4-х животных для каждой временной точки.

Фиг. 9 иллюстрирует экспрессию rAd/p53 РНК в опухолях. Голым мышам подкожно вводили клетки H69 (SCLC) и в течение 32 дней позволяли развиться опухолям, которые к этому времени достигали размеров около 25-50 мм³. Затем случайно отобранным мышам вводили перитуморально по 10⁹ бляшкообразующих единиц или контрольного вируса A/C/бетагал или вируса A/C/53. На 2-й и 7-й дни после инъекции опухоли вырезали и из каждого образца опухоли выделяли полиА РНК. Проводили РТ-ПЦР с равными количествами РНК и с праймерами, специфичными к мРНК рекомбинантного p53. ПЦР-амплификацию проводили в течение 30 циклов при 94^oC 1 мин, 55^oC 1.5 мин, 72^oC 2 мин, и окончательное наращивание занимало 10 мин при 72^oC. Использовали термосайклер Omnigen (Hybaid). Для ПЦР использовали следующие праймеры: 5'трехчленная лидерная кДНК (5'- CGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTC-3') и 3'p53 праймер (5'- TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3'). На линиях 1, 2, 4 и 5 представлены образцы из обработанных p53 опухолей, полученные, как показано, на 2-й или 7-й дни. На линии 3 и 8 были нанесены образцы из опухолей, обработанных бета-гал. Линии 7, 8 и 9 являются соответственными повторами линий 4, 5 и 6, но амплификацию проводили с праймерами актина, чтобы удостовериться в одинаковой загрузке. На линии 10 приведен положительный контроль с плазмидой, содержащей трехчленник/p53.

На фиг. 10A и 10B показаны подавление опухолей in vivo и увеличение времени выживания под действием A/M/N/53. Голым мышам подкожно вводили клетки H69 (SCLC) и в течение 2-х недель давали возможность развиться опухолям. Дважды в неделю мышам перитуморально вводили или просто буфер (---), или контрольный аденовирус A/М (-x-x-), или вирус A/M/N/53 (- - -) (доза обоих вирусов составляла 210⁹ бое на инъекцию, всего 8 доз). Размеры опухолей определяли дважды в неделю и объем опухолей оценивали, как это описано в Эксперименте N II. A) Размер опухолей в случае введения каждого вируса ставили в зависимость от времени (число дней), прошедшего с введения клеток H69. Границы ошибок отражают средний размер опухолей (+/- стандартное отклонение) для каждой группы из 5-ти животных. Стрелки указывают дни введения вируса. B) Приведена доля выживших мышей для каждой группы в зависимости от времени, прошедшего после введения клеток H69, обработанных только буфером (---), контрольным вирусом A/М (... ... ...) или вирусом A/M/N/53 (_).

На фиг. 11A - 11C приведены карты рекомбинантных плазмидных конструктов. Конструирование плазмид проводили, как описано ниже. Жирными линиями в конструктах обозначены представляющие интерес гены, а жирным шрифтом обозначены сайты рестрикции, которые использованы для соединения фрагментов с получением плазмид, как это указано стрелками. На фиг. 11A показано конструирование плазмиды pACNTK путем субклонирования гена HSV-TK в полилинкер вектора клонирования, с последующим выделением гена TK с желаемыми концами для клонирования в вектор pACM. Вектор pACN содержит аденовирусные последовательности, необходимые для рекомбинации in vivo, приводящей к образованию рекомбинантного аденовируса (см. фиг. 12). На фиг. 11B приведено конструирование плазмиды pAANTK, начинающееся с ПЦР-амплификации фрагментов, кодирующих энхансер (AFP-E) и промотор (AFP-P) гена альфа-фетопротеина (АФП), с последующим субклонированием их в несколько этапов в конечную плазмиду, где промотор и энхансер АФП находятся "выше" гена HSV-TK, за которым следуют аденовирусные (Ad2) последовательности, необходимые для рекомбинации in vivo, приводящей к образованию рекомбинантного аденовируса. На фиг. 11C показано конструирование плазмиды pAANCAT, начинающееся с выделения из коммерчески доступной плазмиды гена хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) с последующим субклонированием его в плазмиду pAAN (см.выше) с получением конечной плазмиды pAANCAT, в которой транскрипция гена CAT, находящегося в окружении аденовирусных последовательностей, направляется промотором/энхансером АФП.

На фиг. 12 приведены схематические карты рекомбинантных аденовирусов ACNTK, AANTK и AANCAT. Для получения рекомбинантных аденовирусов из плазмид, приведенных на фиг. 11, 4 части (20 мкг) каждой из плазмид pACNTK, pAANTK или pAANCAT были линеаризованы рестриктазой EcoRI и котрансфицированы с 1-й частью (5 мкг) большого фрагмента рестрицированного Clal рекомбинантного аденовируса (rACbeta-gal), содержащего делецию области E3 (Wills et al., 1994). В полученных вирусах нуклеотиды 360-4021 вируса Ad5 заменены или промотором CMV и трехчленной лидерной кДНК (TPL) или промотором/энхансером АФП, направляющими экспрессию гена HSV-1 TK или гена CAT. Полученные рекомбинантные аденовирусы обозначены соответственно ACNTK, AANTK и AANCAT.

Фиг. 13 демонстрирует специфичность промотора при экспрессии CAT в составе рекомбинантных аденовирусных векторов. Два миллиона клеток (2 10⁶) указанной линии инфицировали с множественностью инфекции 30 или 100 рекомбинантным аденовирусом AANCAT или оставляли неинфицированными (UN). Клетки Hep G2 и Hep 3B экспрессировали АФП, тогда как остальные клетки не экспрессировали. Через три дня клетки собирали, концентрацию белка в клеточных лизатах выравнивали и определяли активность CAT, как это описано ниже в разделе "Методы". Равное число неинфицированных клеток служило контролем фоновой активности CAT, при том что ¹⁴C-хлорамфеникол (только ¹⁴C) и экстракт стабильной клеточной линии B21, экспрессирующей CAT, служили отрицательным и положительным контролями соответственно. Указан процент конверсии ацетил-CoA, при этом видно, что экспрессия CAT ограничена клетками, экспрессирующими АФП.

На фиг. 14 показан эффект обработки TK/GCV клеток гепатоцеллюлярных линий и зависимость данного эффекта от специфичности промотора. Клетки линий Hep-G2 (АФП-положительная) и HLF (АФП-отрицательная) инфицировали в течение ночи одним из следующих вирусов: ACNTK [- -], AANTK [- -] или контрольным ACN [--] с множественностью инфекции, равной 30, а затем обрабатывали единичной дозой ганцикловира в указанной концентрации. Пролиферацию клеток контролировали, добавляя ³H-тимидин приблизительно за 18 часов до сбора клеток. Включение ³H-тимидина в клеточные нуклеиновые кислоты измеряли через 72 часа после заражения (TopCount, Packard) и выражали в процентах (среднее +/- среднее отклонение) по отношению к необработанному контролю. Результаты указывают на неизбирательное дозозависимое подавление пролиферации под действием конструкта с CMV-промотором, при том что ген TK под контролем АФП-промотора избирательно подавляет клетки Hep-G2.

Фиг. 15 иллюстрирует цитотоксичность ACNTK в комплексе с ганцикловиром для клеток гепатоцеллюлярной карциномы (HCC). Клетки HLF заражали с множественностью инфекции 30 вирусом ACNTK [--] или контрольным вирусом ACN [--], а затем обрабатывали ганцикловиром в указанных дозах. Спустя 72 часа после обработки анцикловиром колориметрически определяли количество лактатдегидрогеназы (LDH), высвобожденной в клеточный супернатант. Приведен график зависимости количества LDH (среднее +/- стандартная ошибка) в зависимости от концентрации ганцикловира для двух обработанных вирусом групп.

На фиг. 16A и 16B показан эффект ACNTK в комплексе с ганцикловиром на сформировавшиеся гепатоцеллюлярные опухоли (HCC) у голых мышей. Самкам голых мышей подкожно в бок вводили десять миллионов (110⁷) клеток Hep 3B и в течение 27 дней давали возможность сформироваться опухолям. Затем мышам интратуморально или перитуморально вводили вирус ACNTK [--] или контрольный вирус ACN [--] (110⁹ инфекционных единиц в объеме 100 мкл) через день, всего три дозы (указаны стрелками). Инъекции ганцикловира (100 мг/кг, интраперитонеально) начинались 24 часа спустя после первого введения вируса и продолжались в течение 10 дней.

На фиг. 6A приведен график зависимости размера опухолей в случае каждого вируса от количества дней, прошедших после заражения (среднее +/- средняя ошибка). На фиг. 6B показан график зависимости среднего веса тела для каждой группы животных, обработанных вирусом, в зависимости от числа дней, прошедших с момента заражения.

Для уменьшения частоты контаминации аденовирусом дикого типа желательно понизить способность аденовируса или клеточной линии к рекомбинации. Например, аденовирус из группы, обладающей низкой гомологией с вирусами группы C, может быть использован для конструирования рекомбинантных вирусов с незначительной предрасположенностью к рекомбинации с Ad5-последовательностями в клетках 293. Однако, альтернативно, снижение частоты рекомбинации между вирусными и клеточными последовательностями может быть достигнуто за счет увеличения размера делеции в рекомбинантном вирусе и, следовательно, уменьшения протяженности общей последовательности между ним и AdS-генами клеток 293.

Делеции, лежащие на расстоянии 3,5 кб от 5'-конца аденовирусного генома, могут затрагивать ген аденовирусного белка IX? и их присутствие в аденовирусном векторе не может считаться желательным.

У аденовирусов ген белка IX кодирует минорный компонент наружного аденовирусного капсида, который стабилизирует девятичленные гексоны, составляющие в основном вирусный капсид (Stewart, 1993). Исследования делеционных мутантов аденовирусов первоначально дали основания считать белок IX не необходимым компонентом аденовируса, хотя его отсутствие было ассоциировано с увеличенной по сравнению с вирусом дикого типа термолабильностью (Colby and Shenk, 1981). Недавно было обнаружено, что белок IX необходим для упаковки полноразмерной вирусной ДНК в капсиды и что в отсутствие этого белка в качестве рекомбинантных вирусов могут размножаться только те, которые содержат геном по меньшей мере на 1 кб меньше, чем у вируса дикого типа (Ghosh-Chooudhury et al., 1987). С учетом указанных ограничений делеции белка IX не рассматривались при конструировании аденовирусных векторов.

В данной заявке приведены ссылки на стандартные учебники молекулярной биологии, которые содержат определения и способы выполнения основных методик, используемых в настоящем изобретении. См., например, Sambrook et al., (1989), а также приведенные в этой книге ссылки. Эта книга и другие цитированные публикации включены в текст настоящего описания в качестве ссылок.

В противоположность известному из уровня техники в настоящем изобретении заявлено использование рекомбинантных аденовирусов, имеющих делеции в гене белка IX, что приводит к снижению риска контаминации вирусом дикого типа при получении вирусных препаратов для диагностических и терапевтических целей, таких как генотерапия. Термин "рекомбинант" означает вирусное потомство, сформированное в результате генно-инженерных манипуляций. Данные делеции могут удалять дополнительно 500-700 пар оснований из последовательностей ДНК, в норме присутствующих в обычных E1-делетированных вирусах (возможны меньшие, не столь желательные делеции частей гена p1X, которые также включены в объем настоящего изобретения) и доступны для рекомбинации с последовательностями Ad 5, интегрированными в геном клеток 293. Рекомбинантные аденовирусы, основанные на любом представителе группы C, серотипа 1, 2, 5 и 6, включены в объем настоящего изобретения. Данным изобретением также защищен рекомбинантный вирус, основанный на гибриде Ad2/Ad5, который обеспечивает экспрессию кДНК p53 человека под контролем главного позднего промотора аденовируса типа 2. Этот конструкт был собран, как показано на фиг. 1. Полученный вирус несет 5'-делецию аденовирусных последовательностей с 357-го по 4020-й нуклеотиды, и в нем удалены гены E1a и E1b, так же как и все кодирующие последовательности белка IX. При этом оставлен интактным сайт полиаденилирования, общий для генов E1b и белка IX, что позволяет терминировать транскрипцию любого желаемого гена. Альтернативно, делеция может быть увеличена на 30-40 пар оснований, что не влияет на соседний ген белка IVa2, хотя в данном случае требуется экзогенный сигнал полиаденилирования для терминации транскрипции генов, введенных в рекомбинантный вирус. Исходный вирус с данной делецией легко размножается в клетках 293 без признаков контаминации вирусом дикого типа и направляет сильную экспрессию p53 с транкрипционного блока, введенного в сайт делеции.

Емкость рекомбинантных вирусов, имеющих описанную выше делецию гена белка IX, составляет около 2,6 килобаз. Это достаточно для большинства генов, включая кДНК p53. Емкость векторов может быть повышена путем введения в аденовирусный "скелет" других делеции, например делеции в ранних областях 3 или 4 (см. Graham and Prevec, 1991). Например, может быть использован аденовирусный "скелет" с делецией 1,9 кб не необходимых последовательностей в ранней области 3. С такой дополнительной делецией емкость вектора возрастает приблизительно до 4,5 килобаз, что достаточно для большинства крупных кДНК, включая кДНК гена-супрессора ретинобластомы.

В настоящем изобретении описан рекомбинантный аденовирусный вектор, характеризующийся полной или частичной делецией ДНК аденовирусного белка IX и имеющий ген, кодирующий чужеродный белок, или его функциональный фрагмент, или мутант. Данные векторы применимы для безопасного рекомбинантного получения диагностических и терапевтических полипептидов и белков, и, что более важно, для введения генов при генотерапии. Так, например, представленный в настоящем изобретении аденовирусный вектор может содержать чужеродный ген, направляющий экспрессию белка, который участвует в регуляции клеточного цикла, такого как p53, Rb, или митозин, или белка, индуцирующего гибель клеток, такого как кодируемый обычным "суицидным" геном тимидинкиназы. (Последний должен использоваться в сочетании с метаболитом тимидинкиназы для достижения эффекта). В представленных в настоящем изобретении векторах могут быть использованы любые кассеты экспрессии. Под "кассетой экспрессии" подразумевается молекула ДНК, включающая промотор/энхансер транскрипции, например, такой как промотор/энхансер цитомегаловируса (CMV), чужеродный ген, и, как в некоторых описанных ниже случаях, сигнал полиаденилирования. Термином "чужеродный ген" обозначена молекула ДНК, не представленная в нужной ориентации и в нужном положении в геномной ДНК аденовируса дикого типа. Чужеродный ген может представлять собой молекулу ДНК размером до 4,5 килобаз. "Вектор экспрессии" означает вектор, обеспечивающий экспрессию вставленных последовательностей ДНК при наращивании в подходящих клетках-хозяевах, другими словами, белок или полипептид, кодируемый данной ДНК, синтезируется в данных клетках. Рекомбинантный аденовирусный вектор экспрессии может содержать часть гена, кодирующего аденовирусный белок IX, при том что биологически активный белок IX или его фрагмент не продуцируются. Примером такого вектора является вектор экспрессии, рестрикционная карта которого приведена на фиг. 1 или 4.

В заявленном в настоящем изобретении векторе могут быть также использованы индуцибельные промоторы. Данные промоторы инициируют транскрипцию только в присутствии дополнительной молекулы. Примерами индуцибельных промоторов служат промоторы генов бета-интерферона, генов теплового шока, гена металлотионеина, а также промоторы генов, экспрессирующихся под действием стероидных гормонов. Тканеспецифическая экспрессия достаточно изучена, и тканеспецифические и индуцибельные промоторы хорошо известны из уровня техники. Указанные гены используются для регулирования экспрессии чужеродного гена после его переноса в клетку-мишень.

В объем настоящего изобретения включен также рекомбинантный аденовирусный вектор экспрессии, аналогичный описанным выше, но имеющий менее протяженные делеции последовательностей гена белка IX, в частности в одном из воплощений изобретения делеции расположены от точки, отстоящей на 3500 пар оснований от 5' конца вирусного генома до точки, отстоящей примерно на 4000 пар оснований от 5'-конца. В другом, отдельном воплощении изобретения рекомбинантный аденовирусный вектор экспрессии может иметь также дополнительную делецию не необходимых последовательностей ДНК аденовируса в ранней области 3 и/или 4 и/или делецию последовательностей ДНК аденовируса, обозначаемых как E1a и E1b.

В данном случае чужеродный ген может представлять молекулу ДНК размером до 4.6 килобаз. В другом воплощении изобретения вектор имеет делецию размером до сорока нуклеотидов, расположенную к 3'-концу по отношению к делеции E1a и E1b и p1X, а также в состав вектора включена чужеродная молекула ДНК, кодирующая сигнал полиадефилирования, расположенная таким образом по отношению к чужеродному гену, чтобы регулировать его экспрессию.

Согласно целям настоящего изобретения рекомбинантный аденовирусный вектор может быть получен из группы аденовирусов дикого типа, серотипов 1, 2, 5 или 6.

В одном из воплощений изобретения рекомбинантный аденовирусный вектор экспрессии имеет в качестве чужеродного гена ген, кодирующий функциональный белок-супрессор опухолей или его биологически активный фрагмент. Термин "функциональный" по отношению к генам-супрессорам опухолей означает гены-супрессоры опухолей, которые кодируют белки-супрессоры опухолей, которые в свою очередь эффективно подавляют превращение нормальных клеток в опухолевые. Функциональные гены могут включать, например, обычные гены дикого типа и модифицированные нормальные гены, которые сохраняют свою способность кодировать эффективные белки-супрессоры опухолей, а также другие противоопухолевые гены, такие как кодирующие "суицидный" белок или токсин.

Аналогично, термин "нефункциональный" используется в данном контексте как синоним термина "инактивированный". Нефункциональные или дефектные гены могут возникнуть в результате различных событий, включая, например, точечные мутации, делеции, метилирование и другие явления, хорошо известные из уровня техники.

В контексте данного изобретения под "активным фрагментом" гена подразумеваются меньшие участки гена, которые сохраняют способность кодировать белки с антиопухолевой активностью. P56 RB, более подробно описанный ниже, является одним из примеров активного фрагмента функционального гена-супрессора опухолей. Модификации генов-супрессоров опухолей, такие как добавления, делеции или замены, также применимы по отношению к их активным фрагментам при том, чтобы последние сохраняли функциональную активность немодифицированного гена.

Другим примером гена-супрессора опухолей является ген ретинобластомы (RB). Полная нуклеотидная последовательность кДНК RB и предсказанная аминокислотная последовательность белка RB (обозначенного p110^RB) были опубликованы Lee et al., (1987) и приведены на фиг. 3. Также полезной для экспрессии ретинобластомного белка-супрессора опухолей является молекула ДНК, кодирующая аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 2, или имеющая последовательность ДНК, приведенную на фиг. 3. Усеченный вариант p110RB, p56RB, также может оказаться полезным. Последовательность p56RB опубликована Huang et al., (1991). В представленных в настоящем изобретении векторах могут быть использованы дополнительные гены-супрессоры опухолей, кодирующие соответствующие белки. Для иллюстрации можно назвать некоторые из них: белок p16 (Kamb et al.,1994), белок p21, белок WT1 опухоли Вилма, митозин, h-NUC или белок DCC карциномы прямой кишки. Митозин описан X.Zhu и W-H Lee в заявке на изобретение США N 08/141,239, поданной 22 октября 1993 г, и в дальнейшем частичном продолжении указанной заявки тех же авторов, юридической выписке N P-CJ 1191, выданной 24 октября 1994 г. Оба документа приведены в настоящей заявке в качестве ссылок. Аналогично, h-NUC описан W-H Lee и P.L. Chen в заявке на изобретение США N 08/170,586, поданной 20 декабря 1993 г и приведенной здесь в качестве ссылки.

Как известно из уровня техники, термин "протеин" ("белок") означает линейный полимер аминокислот, соединенных пептидными связями в специфическую последовательность. Термин "аминокислота" относится к D или L стереоизомерным формам аминокислоты, если другое не оговорено специально. В объем настоящего изобретения включены также эквивалентные белки или эквивалентные пептиды, имеющие биологическую активность очищенного белка-супрессора опухолей дикого типа. "Эквивалентные белки" и "эквивалентные полипептиды" означают соединения, отличающиеся от линейной последовательности природных белков или полипептидов, но которые имеют аминокислотные замены, не изменяющие их биологической активности. Данные эквиваленты могут отличаться от исходных последовательностей заменой одной или более аминокислот сходными аминокислотами, например, сходно заряженными аминокислотами, или же заменой или модификацией боковых цепей или функциональных групп.

Определение функционального белка-супрессора опухолей распространяется на любой белок, чье присутствие снижает туморогенность, злокачественность или гиперпролиферативный фенотип клетки-хозяина. Согласно данному определению примерами генов- супрессоров опухолей являются (но не ограничиваются указанными) p110RB, p56RB, митозин, h-NUC и p53. "Туморогенность" означает способность образовывать опухоли или способность вызывать образование опухолей и является синонимом неопластического роста. "Злокачественность" характеризует способность туморогенной клетки к метастазированию и созданию угрозы для жизни хозяйского организма. "Гиперпролиферативный фенотип" характеризует рост и деление клеток, которые происходят со скоростью, превышающей нормальную для клеток данного типа. Понятие "неопластический" относится к клеткам, утратившим эндогенный функциональный белок-супрессор опухолей, или означает неспособность клетки экспрессировать эндогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую функциональный белок-супрессор опухолей.

Примером заявленного в настоящем изобретении вектора является рекомбинантный аденовирусный вектор экспрессии, содержащий в качестве чужеродного гена ген, кодирующий белок p53 или его активный фрагмент. Кодирующая последовательность гена p53 приведена в Таблице 1.

Любой из описанных здесь векторов экспрессии является применимым в качестве средства диагностики или терапии. Векторы могут быть использованы для скрининга многочисленных генов-супрессоров опухолей в отношении их применимости для генотерапии. Например, подозреваемые в неопластичности клетки могут быть взяты у пациента или у животного. Затем в соответствующих условиях данные клетки могут быть обработаны эффективным количеством рекомбинантного вектора, заявленного в настоящем изобретении и несущего один из функциональных генов-супрессоров. Вызывает ли введение данного гена реверсию злокачественного фенотипа, можно определить путем колониеобразования в мягком агаре или введением обработанных клеток голым мышам.

Если злокачественный фенотип ревертирован, то данный ген может рассматриваться как положительный кандидат для успешной генотерапии данного пациента или животного. При фармацевтическом применении такой ген может использоваться в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Данн