Вакцина против свиного и репродуктивного и респираторного синдрома

Вакцина против свиного и репродуктивного и респираторного синдрома

Реферат

 

Вакцина против свиного и репродуктивного и респираторного синдрома содержит активное вещество и целевые добавки, при этом в качестве активного вещества применяют парагpиппозные вирусы 2 типа, в частности штамм SER, в живой, мертвой, ослабленной или полученной путем рекомбинантной технологии форме, целиком или в виде частей или фрагментов в эффективном количестве. Вакцина применяется для выработки у животного иммунитета против СРРС.

Изобретение относится к средствам для защиты свиней от заболеваний респираторного и репродуктивного трактов, в частности к вакцине против свиного и репродуктивного и респираторного синдрома.

С конца восьмидесятого вплоть до начала девяностого года в Северной Америке, соответственно в Европе, появилось новое эпидемически распространяющееся и связанное с высокими экономическими потерями заболевание свиней. Между тем оно получило официальное название "свиной репродуктивный и респираторный синдром" (СРРС).

Основными клиническими симптомами этого эпидемического заболевания являются ухудшениe плодовитости у свиноматок и заболевания дыхательных путей у поросят и откормочных свиней.

Наряду с нерегулярно появляющимися неспецифическими симптомами, как отсутствие аппетита, апатия и повышенная температура тела, у свиноматок заболевание характеризуется поздними выкидышами, рождением мертвых, мумифицированных и нежизнеспособных поросят. Вследствие эпидемии часто появляются симптомы в виде комплекса мастита, метрита и агалактии (ММА-комплекс) и оглушения.

Если в эндемической области в начале эпидемии заболевание поражает в основном поросят-сосунков и поросят-отъемышей, то при дальнейшем ее распространении в возрастающей мере заболевают откормочные свиньи. При этом наряду в основном с имеющими место заболеваниями респираторного тракта дополнительно могут наблюдаться в качестве сопутствующих также другие классические заболевания свиней. Эпидемия приводит к значительным экономическим потерям, которые наряду с прямыми потерями животных выражаются в снижении производственных показателей (результаты опороса и отлучения от матки, ход беременности, прирост в живом весе).

В качестве основного действующего инфекционного фактора считают новый размножающийся в макрофагах легочных альвеол РНК-вирус. С другой стороны, дальнейшие эпидемиологические исследования указывают на то, что респираторные и репродуктивные заболевания вызываются или усиливаются за счет вторичных, соответственно множественных инфекций с помощью других вирусов, соответственно вирусов и бактерий. Поэтому желательно защищать свиней не только от основного возбудителя СРРС, но и также от возбудителей, которые совместно с СРРС ответственны за репродуктивные и респираторные заболевания.

Известна вакцина против свиного репродуктивного или респираторного синдрома, содержащая выделенное из гриппозного вируса человека активное вещество и целевые добавки (см. The Veterinary Record, том 129, выпуск 1, 1991 г., с. 1991).

Задачей изобретения является расширение ассортимента вакцины против свиного репродуктивного или респираторного синдрома.

Поставленная задача решается предлагаемой вакциной против свиного и репродуктивного и респираторного синдрома, содержащей активное вещество и целевые добавки, за счет того, что она содержит в качестве активного вещества парагриппозные вирусы 2 типа, в частности штамм SER, в живой, мертвой, ослабленной или полученной путем рекомбинантной технологии форме, целиком или в виде частей или фрагментов в эффективном количестве.

В качестве парагриппозных вирусов 2 типа следует указать: 1) полные, живые вирусные частицы, получаемые путем размножения вируса в культурах клеток или эмбрионированных куриных яйцах; 2) полные, живые, ослабленные вирусные частицы, получаемые путем длительных пассажей вируса в первичных культурах клеток, перманентных линиях клеток, эмбрионированных птичьих яйцах или подопытных животных с последующим размножением в культурах клеток или эмбрионированных куриных яйцах; 3) полные, умерщвленные вирусные частицы, получаемые обычными способами, как химическая или физическая инактивация; 4) части (субъединицы) вирусных частиц, получаемые из вируса, который размножается в культурах клеток или эмбрионированных куриных яйцах; 5) части (субъединицы) вирусных частиц, которые экспрессируются на основании рекомбинантных генных технологий систем клеток и которые в случае необходимости можно отделять от них или изолировать из них; 6) вирусные антигены, которые экспрессируются через векторные системы, причем с помощью рекомбинантных генных технологий геном вируса или его части вводят в геномные векторы, как вирусы вакцин, вирусы герпеса, аденовирусы или другие пригодные векторные системы.

Парагриппозные вирусы 2 типа (далее ПГВ-2) можно изолировать из респираторного или репродуктивного тракта свиней, у которых обнаруживают подобную СРРС симптоматику. Предпочтительный штамм SER был депонирован 12.06.1993 г. в Национальной коллекции культур и микроорганизмов (Институт Пастера, Париж, Франция) под номером I - 1331 согласно Будапештскому cоглашению.

В предлагаемой вакцине активное вещество может находиться в смеси с антигенным материалом из других вирусов или бактерий. В качестве таковых следует назвать хламиды, в особенности Chlamydia psittaci и Chlamydia pecorum в концентрациях 10⁵ - 10¹⁰ ЕВЕ/доза, Erysipelothrix rhusiopathiae в концентрациях 10⁷ - 10¹² КВЕ/доза, СРРС - вирусы в концентрациях 10⁴ - 10⁹ КИД₅₀/доза, свиной парвовирус в концентрациях 10⁴ - 10⁹ КИД₅₀/доза.

Особенно предпочтительна смесь из ПГВ-2 и хламид, в особенности Chlamydia psittaci или Chlamydia pecorum.

В нижеследующем тексте описания используют следующие понятия: котрансфекция: одновременный перенос двух различных последовательностей ДНК в клетки, в которых могут размножаться вирусы, с целью индуктировать рекомбинации вируса, которые содержат последовательности чужеродной ДНК. Различными последовательностями ДНК являются (1) чужеродная ДНК, которая может быть вставлена в шаттл-векторы, и (2) очищенный геном векторного вируса; геномный вектор: живые возбудители, в особенности вирусы, которые пригодны для вставки чужеродной ДНК и инфицируют клетки или организмы с помощью вставленной в их геном чужеродной ДНК или экспрессируют в них чужеродную ДНК; иммуногены: пептиды или протеины, которые в более высшем организме вызывают иммунологическую реакцию и могут экспрессироваться в векторах за счет последовательностей чужеродной ДНК; клонирование: введение в векторы последовательностей чужеродной ДНК; плазмида: экстрахромосомальные, кольцеобразные последовательности ДНК, которые реплицируются в клетках низших или более высших организмов; шаттл-вектор: бактериофаги или плазмиды, в особенности бактериальные плазмиды, которые содержат вставленную чужеродную ДНК, фланкированную последовательностью ДНК векторного вируса; трансфекция: перенос последовательностей ДНК в клетки низших или более высших организмов с целью индуцирования рекомбинации клеточного генома с введенными последовательностями ДНК; векторы: плазмиды, бактериофаги или вирусы, которые в своей генетической информации содержат последовательности чужеродной ДНК.

Размножение вирусов для получения полных живых вирусных частиц осуществляют обычным образом, с одной стороны, в культурах тканей клеток животных в качестве первичных клеток или перманентных линий клеток, например, в клетках свиней, обезьян или крупного рогатого скота, предпочтительно в клетках почек свиней, как, например, клонированные, перманентные клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 или их потомки) или первичные клетки почек свиней EPK, или в клетках почек обезьян, как перманентные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), или в клетках почек крупного рогатого скота, как перманентные клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), и, с другой стороны, в эмбрионированных куриных яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман).

Размножение в культурах клеток осуществляют самим по себе известным образом в стационарных роллерных культурах или культурах на носителе в форме сплошных соединений клеток (монослои) или в суспендированных культурах. В качестве сред для размножения клеток используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, например, описанные в каталоге продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрассе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности минимальная необходимая среда (MEM), которая в качестве основных составных частей содержит аминокислоты, витамины, соли и углеводы, дополняемая буферными веществами, как, например, гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае необходимости сыворотками (крови) животных, как, например, сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, соответственно их плодные сыворотки. Особенно предпочтительно используют минимальную необходимую среду Игла с содержанием гидрокарбоната натрия 0,1 - 5 г/л, предпочтительно 0,5 - 3 г/л, а также плодной телячьей сыворотки в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Служащие для размножения вирусов клетки и расы клеток размножаются обычным образом почти вплоть до слияния или вплоть до оптимальной плотности клеток. Перед их инфицированием с помощью вирусов предпочтительно удаляют среду для размножения клеток, и клетки предпочтительно промывают с помощью среды для размножения вируса. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда. Затем проводят инфицирование с помощью вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус разбавлен в среде для его размножения так, что происходит инфицирование с МИ (= множественность инфекции, соответствующая соотношению числа инфекционных вирусных частиц к числу имеющихся клеток), соответствующей 0,01 - 50, предпочтительно 0,1 - 10.

Размножение вирусов осуществляют с добавкой или без нее сывороток животных. В том случае когда используют сыворотку, ее добавляют к среде для размножения в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при температурах от комнатной до 40^oC, предпочтительно при 32 - 39^oC, особенно предпочтительно при 37^oC, в течение нескольких дней, предпочтительно вплоть до полного разрушения инфицированных клеток.

Содержащую вирус среду инфицированных клеток обрабатывают далее, например, путем удаления клеток и остатков клеток посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования с ускорением вплоть до 10000 g.

Размножение в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют самим по себе известным образом в аллантоидной полости инкубационных куриных яиц, которые предварительно инкубируют в течение 9 - 12 дней, предпочтительно в течение 10 дней, при температуре 37 - 39^oC, предпочтительно 38,5^oC, и при относительной влажности воздуха 30 - 90%, предпочтительно 50 - 60%, в стандартном термостате, предпочтительно в инкубаторе.

Служащие для размножения вирусов инкубационные яйца за 1 - 3 ч, предпочтительно за 2 ч, до инфицирования помещают в термостат в вертикальном положении на острый конец яйца и затем после подготовки места инъекции инфицируют с помощью 10 - 200 мкл, предпочтительно 75 - 125 мкл вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус находится в среде для его размножения в концентрации 10¹ - 10⁷ КИД₅₀/мл (инфекционная для 50% культуры доза на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток), предпочтительно 10⁴ - 10⁵ КИД₅₀/мл. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при вышеуказанных условиях инкубации в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 2 - 5 дней, особенно предпочтительно в течение 3 дней.

Содержащую вирус аллантоидную жидкость получают путем отсасывания после вскрытия известковой скорлупы, а также подскорлуповой оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, и можно проводить ее обработку дальше, например, посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования при ускорении вплоть до 10000 g.

Ослабленный, живой вирус получают обычным образом путем длительных пассажей и/или переменных пассажей, с одной стороны, в культурах тканей клеток животных в качестве первичных клеток или перманентных линий клеток, например, в клетках свиней, обезьян или крупного рогатого скота, предпочтительно в клетках почек свиней, как, например, клонированные, перманентные клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 или их потомки) или первичные клетки почек свиней EPK, или в клетках почек обезьян, как перманентные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), или в клетках почек крупного рогатого скота, как перманентные клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), или в клетках почек собак, как перманентные клетки почек собак MDCK (ATCC CCL34 или их потомки), и, с другой стороны, в эмбрионированных яйцах кур, голубей или уток, предпочтительно в эмбрионированных куриных яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман), или в подопытных животных, предпочтительно в маленьких лабораторных животных, например, как морские свинки, крысы или мыши, в которых вирус размножается, не вызывая серьезных симптомов заболевания.

Пассирование в культурах клеток осуществляют самим по себе известным образом в стационарных культурах в форме сплошных соединений клеток (монослои). В качестве сред для размножения клеток используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, например, описанные в каталоге продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрассе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности минимальная необходимая среда (MEM), которая в качестве основных составных частей содержит аминокислоты, витамины, соли и углеводы, дополняемая буферными веществами, как, например, гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае необходимости сыворотками (крови) животных, как, например, сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, соответственно их плодные сыворотки. Особенно предпочтительно используют минимальную необходимую среду Игла с содержанием гидрокарбоната натрия 0,1 - 5 г/л, предпочтительно 0,5 - 3 г/л, а также плодной телячьей сыворотки в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Служащие для пассирования вирусов клетки и расы клеток размножаются обычным образом почти вплоть до слияния или вплоть до оптимальной плотности клеток. Перед их инфицированием с помощью вирусов предпочтительно удаляют среду для размножения клеток, и клетки предпочтительно промывают с помощью среды для размножения вируса. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда. Затем проводят инфицирование с помощью вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус разбавлен в среде для его размножения так, что происходит инфицирование с МИ (= множественность инфекции, соответствующая соотношению числа инфекционных вирусных частиц к числу имеющихся клеток), соответствующей 0,01 - 50, предпочтительно 0,1 - 10.

Размножение вирусов осуществляют с добавкой или без нее сывороток животных. В том случае когда используют сыворотку, ее добавляют к среде для размножения в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при температурах от комнатной до 40^oC, предпочтительно при 32 - 39^oC, особенно предпочтительно при 37^oC, в течение нескольких дней, предпочтительно вплоть до полного разрушения инфицированных клеток.

Содержащую вирус среду инфицированных клеток применяют для инфицирования свежей культуры клеток (последующее пассирование).

Пассирование в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют самим по себе известным образом в аллантоидной полости инкубационных куриных яиц, которые предварительно инкубируют в течение 9 - 12 дней, предпочтительно в течение 10 дней, при температуре 37 - 39^oC, предпочтительно 38,5^oC, и при относительной влажности воздуха 30 - 90%, предпочтительно 50 - 60%, в стандартном термостате, предпочтительно в инкубаторе.

Служащие для пассирования вирусов инкубационные яйца за 1 - 3 ч, предпочтительно за 2 ч, до инфицирования помещают в термостат в вертикальном положении на острый конец яйца и затем после подготовки места инъекции инфицируют с помощью 10 - 200 мкл, предпочтительно 75 - 125 мкл вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус находится в среде для его размножения в концентрации 10¹ - 10⁷ КИД₅₀/мл (инфекционная для 50% культуры доза на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток), предпочтительно 10⁴ - 10⁵ КИД₅₀/мл. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при вышеуказанных условиях инкубации в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 2 - 5 дней, особенно предпочтительно в течение 3 дней.

Содержащую вирус аллантоидную жидкость получают путем отсасывания после вскрытия известковой скорлупы, а также подскорлуповой оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца. Ее применяют для инфицирования свежих, предварительно инкубированных, эмбрионированных яиц (последующий пассаж).

Пассирование в подопытных животных осуществляют самим по себе известным образом путем парентерального введения вирусной суспензии и выделения вируса снова из органов и тканей подопытных животных.

Для пассирования в подопытных животных используют предпочтительно ювенильных, маленьких лабораторных животных, которых специально выращивают в беспатогенных условиях, например, как морские свинки (Hsd/Win: DH, фирма Харлан-Винкельман Гмбх, Борхен), крысы (Hsd/Win: WU, фирма Харлан-Винкельман Гмбх, Борхен) или мыши (Hsd/Win: NMR 1, фирма Харлан-Винкельман Гмбх, Борхен, Бальб/С/ЛСО, Иффа Кредо, Бельгия). Подопытных животных инфицируют с помощью 0,1 - 2,0 мл вирусной суспензии парентерально, например, путем чрескожного, внутримышечного, внутриносового, интраперитонеального, внутривенного или подкожного введения. В вирусной суспензии вирус в среде для размножения вируса находится в таком количестве, что подопытные животные, смотря по обстоятельствам, получают дозу вируса 10¹ - 10⁷ КИД₅₀, предпочтительно 10³ - 10⁵ КИД₅₀ (инфекционная доза для 50% культур на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток). В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Размножение вируса осуществляют в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 1 - 12 дней.

Вирус снова выделяют известным образом из тканей, предпочтительно из внутренних органов подопытных животных. Для этого у подопытных животных извлекают внутренние органы, например, легкие, печень или селезенку. Из органов или частей органов путем механического размельчения, например, с помощью ножниц и ступки, готовят высокодисперсную суспензию в среде для размножения вируса, которую обрабатывают далее, например, путем удаления клеток и остатков клеток посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования с ускорением вплоть до 10000 g. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Полученную содержащую вирус среду применяют для инфицирования новых подопытных животных (последующие пассажи).

Процесс последующего пассажа повторяют многократно, предпочтительно 10 - 20 раз, в одинаковой системе размножения (гомологичные пассажи) или в различных системах размножения (гетерологичные пассажи).

Повторный контроль вируса на ослабление осуществляют путем экспериментального инфицирования полностью восприимчивых подопытных животных, предпочтительно свиней, с помощью вирусной суспензии, которую получают из последнего пассажа ряда последующих пассажей.

Если еще появляются типичные симптомы заболевания, например, выкидыши или рождения мертвых поросят у супоросных свиноматок или респираторные заболевания, то исходя из вирусов последнего последующего пассирования осуществляют дальнейшие гомологичные или гетерологичные длительные пассирования.

Если более не появляются никакие типичные симптомы заболевания, то вирусы последнего последующего пассирования размножают как описано выше, и фильтраты или надосадочные жидкости после центрифугирования содержащих вирус надосадочных жидкостей культур или аллантоидных жидкостей применяют для приготовления вакцин.

Размножение вирусов для получения умерщвленных вирусных частиц осуществляют обычным образом, с одной стороны, в культурах тканей клеток животных в качестве первичных клеток или перманентных линий клеток, например, в клетках свиней, обезьян или крупного рогатого скота, предпочтительно в клетках почек свиней, как, например, клонированные, перманентные клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 или их потомки) или первичные клетки почек свиней EPK, или в клетках почек обезьян, как перманентные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), или в клетках почек крупного рогатого скота, как перманентные клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), и, с другой стороны, в эмбрионированных куриных яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман).

Размножение в культурах клеток осуществляют самим по себе известным образом в стационарных роллерных культурах или культурах на носителе в форме сплошных соединений клеток (монослои) или в суспендированных культурах. В качестве сред для размножения клеток используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, например, описанные в каталоге продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрассе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности минимальная необходимая среда (MEM), которая в качестве основных составных частей содержит аминокислоты, витамины, соли и углеводы, дополняемая буферными веществами, как, например, гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае необходимости сыворотками (крови) животных, как, например, сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, соответственно, их плодные сыворотки. Особенно предпочтительно используют минимальную необходимую среду Игла с содержанием гидрокарбоната натрия 0,1 - 5 г/л, предпочтительно 0,5 - 3 г/л, а также плодной телячьей сыворотки в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Служащие для размножения вирусов клетки и расы клеток размножаются обычным образом почти вплоть до слияния или вплоть до оптимальной плотности клеток. Перед их инфицированием с помощью вирусов предпочтительно удаляют среду для размножения клеток, и клетки предпочтительно промывают с помощью среды для размножения вируса. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда. Затем проводят инфицирование с помощью вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус разбавлен в среде для его размножения так, что происходит инфицирование с МИ (= множественность инфекции, соответствующая соотношению числа инфекционных вирусных частиц к числу имеющихся клеток), соответствующей 0,01 - 50, предпочтительно 0,1 - 10.

Размножение вирусов осуществляют с добавкой или без нее сывороток животных. В том случае когда используют сыворотку, ее добавляют к среде для размножения в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при температурах от комнатной до 40^oC, предпочтительно при 32 - 39^oC, особенно предпочтительно при 37^oC, в течение нескольких дней, предпочтительно вплоть до полного разрушения инфицированных клеток.

Содержащую вирус среду инфицированных клеток обрабатывают далее, например, путем удаления клеток и остатков клеток посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования с ускорением вплоть до 10000 g.

Размножение в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют самим по себе известным образом в аллантоидной полости инкубационных куриных яиц, которые предварительно инкубируют в течение 9 - 12 дней, предпочтительно в течение 10 дней, при температуре 37 - 39^oC, предпочтительно 38,5^oC, и при относительной влажности воздуха 30 - 90%, предпочтительно 50 - 60%, в стандартном термостате, предпочтительно в инкубаторе.

Служащие для размножения вирусов инкубационные яйца за 1 - 3 ч, предпочтительно за 2 ч, до инфицирования помещают в термостат в вертикальном положении на острый конец яйца и затем после подготовки места инъекции инфицируют с помощью 10 - 200 мкл, предпочтительно 75 - 125 мкл вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус находится в среде для его размножения в концентрации 10¹ - 10⁷ КИД₅₀/мл (инфекционная для 50% культуры доза на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток), предпочтительно 10⁴ - 10⁵ КИД₅₀/мл. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при вышеуказанных условиях инкубации в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 2 - 5 дней, особенно предпочтительно в течение 3 дней.

Содержащую вирус аллантоидную жидкость получают путем отсасывания после вскрытия известковой скорлупы, а также подскорлуповой оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, и можно проводить ее обработку дальше, например, посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования при ускорении вплоть до 10000 g.

Инактивацию вируса осуществляют обычным образом с помощью физических способов, например, путем воздействия нагрева, ультрафиолетового или -облучения, или предпочтительно с помощью химических способов, например, путем воздействия этанола, формальдегида, -пропиолактона и предпочтительно с помощью этиленаминов.

Химическую инактивацию осуществляют самим по себе известным образом в пригодных реакционных сосудах, которые оснащены устройством для поддерживания постоянной реакционной температуры, а также для постоянного движения реакционной смеси (например, ферментер). В качестве инактивирующего средства используют предпочтительно этиленамины, особенно предпочтительно 2-бром-этиламин-гидробромид (2-БЭА) в концентрации 1 - 10 ммоль/л, предпочтительно 2,5 - 7,5 ммоль/л.

Перед добавкой раствора 2-бром-этиламин-гидрохлорида в вирусной суспензии с концентрацией 10^4,0 - 10^9,0 КИД₅₀/мл, предпочтительно 10^5,0 - 10^8,0 КИД₅₀/мл, которую получают из одного или нескольких процессов размножения вируса, устанавливают значение pH, равное 8,1 - 8,7, предпочтительно 8,3 - 8,5.

Инактивацию осуществляют при 4 - 40^oC, предпочтительно при 23 - 37^oC, особенно предпочтительно при 36 - 37^oC, в течение 6 - 48 ч, предпочтительно 16 - 20 ч.

После окончания инактивации избыточный 2-бром-этиламин-гидрохлорид нейтрализуют путем добавки гидролизующих агентов. Для этой цели пригоден в особенности тиосульфат натрия, который добавляют в конечной концентрации 40 - 80 ммоль/л, предпочтительно 50 ммоль/л. Нейтрализацию проводят при 4 - 40^oC, предпочтительно при 2 - 8^oC, в течение 2 - 16 ч, предпочтительно 4 - 8 ч.

Размножение вирусов для получения субъединиц осуществляют обычным образом, с одной стороны, в культурах тканей клеток животных в качестве первичных клеток или перманентных линий клеток, например, в клетках свиней, обезьян или крупного рогатого скота, предпочтительно в клетках почек свиней, как, например, клонированные, перманентные клетки почек свиней PK15 (ATCC CCL33 или их потомки) или первичные клетки почек свиней EPK, или в клетках почек обезьян, как перманентные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (ATCC CCL81 или их потомки), или в клетках почек крупного рогатого скота, как перманентные клетки почек крупного рогатого скота MDBK (ATCC CCL22 или их потомки), и, с другой стороны, в эмбрионированных куриных яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман).

Размножение в культурах клеток осуществляют самим по себе известным образом в стационарных роллерных культурах или культурах на носителе в форме сплошных соединений клеток (монослои) или в суспендированных культурах. В качестве сред для размножения клеток используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, например, описанные в каталоге продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрассе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности минимальная необходимая среда (MEM), которая в качестве основных составных частей содержит аминокислоты, витамины, соли и углеводы, дополняемая буферными веществами, как, например, гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае необходимости сыворотками (крови) животных, как, например, сыворотки крупного рогатого скота, лошадей, соответственно их плодные сыворотки. Особенно предпочтительно используют минимальную необходимую среду Игла с содержанием гидрокарбоната натрия 0,1 - 5 г/л, предпочтительно 0,5 - 3 г/л, а также плодной телячьей сыворотки в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Служащие для размножения вирусов клетки и расы клеток размножаются обычным образом почти вплоть до слияния или вплоть до оптимальной плотности клеток. Перед их инфицированием с помощью вирусов предпочтительно удаляют среду для размножения клеток, и клетки предпочтительно промывают с помощью среды для размножения вируса. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда. Затем проводят инфицирование с помощью вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус разбавлен в среде для его размножения так, что происходит инфицирование с МИ (= множественность инфекции, соответствующая соотношению числа инфекционных вирусных частиц к числу имеющихся клеток), соответствующей 0,01 - 50, предпочтительно 0,1 - 10.

Размножение вирусов осуществляют с добавкой или без нее сывороток животных. В том случае когда используют сыворотку, ее добавляют к среде для размножения в концентрации 1 - 30 об.%, предпочтительно 2 - 10 об.%.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при температурах от комнатной до 40^oC, предпочтительно при 32 - 39^oC, особенно предпочтительно при 37^oC, в течение нескольких дней, предпочтительно вплоть до полного разрушения инфицированных клеток.

Содержащую вирус среду инфицированных клеток обрабатывают далее, например, путем удаления клеток и остатков клеток посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования с ускорением вплоть до 10000 g.

Размножение в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют самим по себе известным образом в аллантоидной полости инкубационных куриных яиц, которые предварительно инкубируют в течение 9 - 12 дней, предпочтительно в течение 10 дней, при температуре 37 - 39^oC, предпочтительно 38,5^oC, и при относительной влажности воздуха 30 - 90%, предпочтительно 50 - 60%, в стандартном термостате, предпочтительно в инкубаторе.

Служащие для размножения вирусов инкубационные яйца за 1 - 3 ч, предпочтительно за 2 ч, до инфицирования помещают в термостат в вертикальном положении на острый конец яйца и затем после подготовки места инъекции инфицируют с помощью 10 - 200 мкл, предпочтительно 75 - 125 мкл вирусной суспензии. В вирусной суспензии вирус находится в среде для его размножения в концентрации 10¹ - 10⁷ КИД₅₀/мл (инфекционная для 50% культуры доза на 1 мл суспензии = степень разбавления, при которой инфицируются еще 50% используемых культур клеток), предпочтительно 10⁴ - 10⁵ КИД₅₀/мл. В качестве среды для размножения вируса используют любые сами по себе известные среды для культур клеток, как в особенности вышеуказанная минимальная необходимая среда.

Инфицирование и размножение вируса осуществляют при вышеуказанных условиях инкубации в течение нескольких дней, предпочтительно в течение 2 - 5 дней, особенно предпочтительно в течение 3 дней.

Содержащую вирус аллантоидную жидкость получают путем отсасывания после вскрытия известковой скорлупы, а также подскорлуповой оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, и можно проводить ее обработку дальше, например, посредством фильтрации при использовании фильтров с размерами пор, например, 0,1 - 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования при ускорении вплоть до 10000 g.

Вирус выделяют путем изопикнического или зонального центрифугирования, например, с градиентами плотности сахарозы. Для этой цели содержащую вирус среду, соответственно аллантоидную жидкость, после удаления остатков клеток подвергают зональному центрифугированию с ускорением 100000 g вплоть до седиментации вирусных частиц. В более чистом виде вирусные частицы получают путем зонального центрифугирования в водном растворе с более высокой плотностью, чем содержащая вирус среда. В качестве водного раствора может служить, например, 30 - 60 мас.%, предпочтительно 35 - 50 мас.% буферированный раствор сахарозы. Еще более высокой степени чистоты достигают путем центрифугирования с градиентом плотности. Для этой цели освобожденный от клеток и остатков клеток сконцентрированный с помощью зонального центрифугирования вирус выделяют путем изопикнического или зонального центрифугирования с градиентом плотности, например, 30 - 50 мас.% сахарозы в буферированном водном растворе при ускорении центрифугирования, например, 100000 - 150000 g.

Таким образом полученные вирусные концентраты обрабатывают детергентами.

Пригодными детергентами являются анионоактивные поверхностно-активные агенты, как лаурилсульфат натрия, сульфаты простых эфиров спиртов жирного ряда, моноэтаноламинная соль сложного эфира ортофосфорной кислоты и простого моно-/ди-алкилполигликолевого эфира, алкиларилсульфонат кальция, дезоксихолят натрия; катионоактивные поверхностно-активные агенты, как цетилтриметиламмонийхлорид; амфотерные поверхностно-активные агенты, как ди-натрий-N-лаурилиминодипропионат или лецитин; неионные поверхностно-активные агенты, например, полиоксиэтилированное касторовое масло, полиоксиэтилированный сорбитан-моноолеат, сорбитан-моностеарат, глицеринмоностеарат, полиоксиэтиленстеарат, алкилфенолполигликолевый простой эфир.

Предпочтительно следует назвать следующие неионные детергенты: неионные, водорастворимые эмульгаторы с ГЛБ (значение гидрофильно-липофильного баланса) более 10, например, эмульгатор НП 40 (Байер АГ), алкиларилполигликолевый простой эфир; Ренекс 678 (Атлас Кемикал Индастри), полиоксиэтиленалкилариловый простой эфир; Твин 20 (Атлас), полиоксиэтиленсорбитанмонопальмитат; Майри 53 (Атлас), полиоксиэтиленстеарат; Атлас Г 3707, полиоксиэтиленлауриловый простой эфир; Атлас Г 3920, полиоксиэтиленолеиловый простой эфир; Атлас Г 9046 Т, полиоксиэтиленманнитанмонолаурат; эмульгатор 1371 Б (Байер АГ), алкилполигликолевый простой эфир; эмульгатор 1736 (Байер АГ), алкилполигликолевый простой эфир (олеилполигликолевый простой эфир); эмульгатор ОКС (Байер АГ), алкилполигликолевый простой эфир (додецилполигликоле