Рекомбинантные il4-антитела, используемые для лечения нарушений, связанных с действием il4

Рекомбинантные il4-антитела, используемые для лечения нарушений, связанных с действием il4

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к рекомбинантным IL4-антителам, используемым для лечения нарушений, связанных с действием IL4. Сущность изобретения включает химерные и гуманизированные IL4 Mab-антитела, которые являются производными высокоэффективных Маb-антител, а также содержащие их фармацевтические композиции и способы диагностики и лечения. Преимущество изобретения заключается в создании высокоаффинного IL4-антагониста, способного снижать уровень эозинофильного воспаления. 22 с. и 3 з.п. ф-лы, 10 ил., 3 табл.

Настоящая заявка является частично продолженной заявкой относительно заявки США с серийным номером 08/136,783 от 14 октября 1993 г., которая является продолжением заявки США с серийным номером 08/117.366 от 7 сентября 1993 г., причем на обе эти заявки ссылаются в настоящем изобретении.

Настоящее изобретение, главным образом, относится к области слитых белков, а также к белкам, используемым для лечения и диагностики болезненных состояний, связанных с действием IL 4 и избытком продуцирования IgE, более конкретно настоящее изобретение относится к химерным и гуманизированным IL 4 антителам.

Область атопических аллергических заболеваний охватывает как относительно незначительные болезни, например, такие как сезонные риниты и коньюктивиты, так и более серьезные заболевания, такие как атопический дерматит и атопическая астма, а также такие болезни, угрожающие жизни, как анафилактический шок. Общим фактором таких болезненных состояний является иммунный ответ организма на аллергены, причем такая реакция заключается в продуцировании иммуноглобулиновых E (IgE) антител у генетически предрасположенных пациентов (атопия). Ингибирование продукции IgE в течение длительного времени составляло цель специфической иммунотерапии аллергических заболеваний с использованием десенсибилизирующих вакцин. Однако в последние годы безопасность и эффективность вакционной терапии стала вызывать сомнения, однако, потребность понижения уровня IgE не отпала.

Интерлейкин 4 (IL 4) представляет собой протеиновый медиатор в лимфоидной системе. Исследования лимфоцитов, взятых у атопических пациентов, позволило обнаружить повышенное количество Т-лимфоцитов, обладающих способностью секретировать IL 4 в ответ на стимуляцию и повышенные количества IL 4, секретированного после стимуляции.

Было обнаружено, что анти-IL 4 антитело ингибирует IgE, но не ингибирует IgG₁ или IgG_2a /Finkelman с сотр., Ann. Rev. Immunol. 8:303(1990)/, а также продукцию IL 5 секретирующих Т-клеток /Maggi с сотр., J. Immunol. 148:2142 (1992)/. Кроме этого, последние данные подтвердили, что IL 4 может оказывать влияние на аккумуляцию эозинофила в тканях. См., например, Tepper с сотр. Cell, 62:457(1990); Tepper с сотр. Cell, 57; 503(1989).

В данной области техники в настоящее время сохраняется необходимость в создании высокоаффинного IL 4 антагониста, способного снижать уровень зозинофильного воспаления в результате уменьшения пролиферации IL 5 секретирующих клеток и ингибирования механизма адгезии, в результате чего зозинофилы могли бы аккумулироваться в тканях и использоваться для лечения, профилактики и диагностики аллергических реакций.

В соответствии с первым аспектом настоящее изобретение обеспечивает слитый белок, обладающий сродством к связыванию интерлейкина-4 человека, который содержит участки, определяющие комплементарность (CDR) нечеловеческого нейтрализующего моноклонального антитела (Mab), характеризующегося константой диссоциации, равной или меньшей 210^-10 М для человеческого IL 4, и первый партнер слияния, в котором, по крайней мере, один и предпочтительно все участки, определяющие комплементарность (CDR) замещены CDR моноклонального антитела нечеловеческого происхождения (Mab). Такое нейтрализующее моноклональное антитело нечеловеческого происхождения может быть выбрано из группы, состоящей из 3В9 и 6A1, в соответствии с тем, что более полно описано в подробном описании изобретения. Предпочтительно, когда слитый белок оперативно связан со вторым слитым белком, включающим всю или часть иммуноглобулиновой константной цепи.

В соответствии с родственным аспектом настоящее изобретение обеспечивает CDR нейтрализующего моноклонального антитела нечеловеческого происхождения (Mab), характеризующегося константой диссоциации, равной или меньшей 210^-10 М для человеческого IL 4 и молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие CDR.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение предусматривает гуманизированные (humanized) антитела, содержащие, по крайней мере, один и предпочтительно шесть участков, определяющих комплементарность (CDR), являющихся производными нейтрализующих моноклональных антител нечеловеческого происхождения (Mab), характеризующихся константой диссоциации, равной или меньшей 210^-10 М для человеческого IL 4.

Согласно еще одному аспекту предусматривается химерное антитело, содержащее человеческие константные области тяжелой и легкой цепей и вариабельные области тяжелой и легкой цепей, произведенные из нечеловеческих нейтрализующих моноклональных антител (Mab), характеризующихся константой диссоциации, равной или меньшей 210^-10 М для человеческого IL 4.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, которая содержит один (или более) из указанных выше слитых протеинов или Mab (например, гуманизированных, химерных и т.п.) и фармацевтически применимый носитель.

Следующий аспект настоящего изобретения предусматривает метод лечения и/или профилактики аллергических состояний людей в результате применения эффективного количества фармацевтической композиции изобретения.

Другой аспект настоящего изобретения предусматривает способы и компоненты, применяемые для рекомбинантного продуцирования слитых белков, Mab (например, гуманизированных, химерных и т.п.), их CDR, Fab или F (ab')₂ или их аналогов, являющихся производными нечеловеческих нейтрализующих моноклональных антител (Mab), характеризующихся константой диссоциации, равной или меньшей 210^-10 М для IL 4. Такие компоненты включают изолированные кодирующие нуклеиново-кислотные последовательности, рекомбинантные плазмиды, содержащие нуклеиново-кислотные последовательности, контролируемые выбранными регуляторными последовательностями, способными направлять их экспрессию в клетках-хозяевах, а также клетки-хозяева (предпочтительно млекопитающих), трансфицированные рекомбинантными плазмидами. Способ получения включает культивирование трансфицированной линии клетки-хозяина настоящего изобретения в таких условиях, что антитело, предпочтительно гуманизированное (humanized) антитело, экспрессируется в указанных клетках, и выделение продукта экспрессии.

Еще один аспект настоящего изобретения охватывает способ диагностики аллергий и других болезненных состояний, связанных с избытком образования иммуноглобулина E в организме человека, заключающийся в контактировании образца биологической жидкости со слитыми протеинами, Mab's (например, гуманизированными, химерными и т.п.) и Fab's настоящего изобретения и анализе реализации связывания между указанными слитым протеином, Mab или Fab и человеческим интерлейкином 4.

Еще один аспект предусматривает способ скрининга моноклональных антител, обладающих высоким титром по отношению к человеческому интерлейкину 4, который включает: a) получение гибридомной клеточной линии, отличающейся секретированием моноклонального антитела по отношению к человеческому интерлейкину 4; и (b) скрининг указанной гибридомной клеточной линии с альдегид-коньюгированным интерлейкином-4 или биотинилированным человеческим интерлейкином-4. Предпочтительно проводят скрининг гибридомной клеточной линии с биотинилированным человеческим интерлейкином-4.

Настоящее изобретение также предусматривает нейтрализующие Mab, обладающие высоким сродством к IL 4, их Fab фрагменты или F(ab)₂ фрагменты, полученные скринингом библиотеки гибридомных продуктов в присутствии альдегид-коньюгированного человеческого интерлейкина-4 или биотинилированного человеческого IL 4.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение предусматривает нейтрализующие моноклональные антитела грызунов, специфичные к человеческому интерлейкину-4 и обладающие сродством к связыванию, характеризующиеся константой диссоциации, равной или меньшей 210^-10 М. Примерами таких моноклональных антител могут служить мышиные Mab, 3В9, крысиные Mab, 6A1 и другие Mab с идентичными характеристиками (т.е. способностью связываться с эпитопами 3В9 или 6A1 при специфичности к человеческому IL 4 и константой диссоциации, равной или меньшей 210^-10 М). Другим аспектом настоящего изобретения является гибридома 3426A11C1B9.

Другие аспекты настоящего изобретения представлены ниже в подробном описании его предпочтительных воплощений.

На фиг. 1 (последовательности SEQ ID N: 1,2) проиллюстрирован вариабельный участок легкой цепи (аминокислоты 21-132) мышиного 114 антитела 3В9, человек/мышь 3В9 химерное антитело, а также нативная сигнальная последовательность (аминокислоты 1-20). Подчеркнутые участки обозначают CDR (Последовательности SEQ ID N: 15, 16; SEQ ID N: 17 и 18; и SEQ ID N: 19 и 20).

На фиг. 2 (SEQ ID N: 3 и 4) проиллюстрированы вариабельный участок тяжелой цепи (аминокислоты 20-140) мышиного 3В9, а также нативная сигнальная последовательность (аминокислоты 1-19). Подчеркнутые участки обозначают CDR (SEQ ID N:21, 22; SEQ ID N: 23 и 24; и SEQ ID N: 25,26).

На фиг. 3 (SEQ ID N: 9, 10) проиллюстрирован вариабельный участок тяжелой цепи (аминокислоты 21-141) человек/мышь 3В9 химерного антитела и его сигнальная последовательность (аминокислоты 1-19; SEQ ID N: 5 и 6). Подчеркнутые части обозначают CDR, являющиеся производными 3В9 (SEQ ID N: 21, 22; SEQ ID N: 23, 24 и SEQ ID N: 25, 26).

На фиг. 4 проиллюстрированы (SEQ ID N: 11, 12) вариабельный участок тяжелой цепи (аминокислоты 20-141) гуманизированного 3В9 антитела с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-19; SEQ ID N: 5, 6). Подчеркнутые участки обозначают CDR, являющиеся производными 3В9 (SEQ ID N: 54, 22; SEQ ID N: 55, 24; и SEQ ID N: 56 и 26).

На фиг. 5 (SEQ ID N: 13, 14) проиллюстрирован вариабельный участок легкой цепи (аминокислоты 21-131) гуманизированного 3В9 антитела и сигнальная последовательность (аминокислоты 1-20; SEQ ID N: 7, 8). Подчеркнутые участки обозначают CDR, являющиеся производными 3В9 (SEQ ID N: 53, 16; SEQ ID N: 17, 18 и SEQ ID N: 27, 28).

На фиг. 6A (SEQ ID N: 5, 6) показана сигнальная последовательность тяжелой цепи, используемая в приведенном ниже примере 4.

На фиг. 6B (SEQ ID N: 7, 8) показана сигнальная последовательность легкой цепи, используемая в представленном ниже примере 4.

На фиг. 7 дано схематическое изображение плазмиды plL4chhc3-pcd, используемой для экспрессии химерной IL 4 тяжелой цепи в клетках млекопитающих. Такая плазмида содержит бета-лактамазный ген (BETA LAC), точку начала репликации SV40 (SV40), цитомегаловирусную промоторную последовательность (CMV), сигнальную последовательность, химерную вариабельную тяжелую цепь от SEQ ID N 9, 10, константный участок человеческой тяжелой цепи, поли A сигнал бычьего гормона роста (BGH), бетаглобиновый промотор (beto glopro), дигидрофолатредуктазный ген (DHFR) и другая BGH последовательность поли A сигнала в среде pVC19.

На фиг. 8 представлена схема плазмиды pIL 4 chlc-pcdn, используемой для экспрессирования химерного IL 4 легкоцепного вариабельного участка SEQ ID N 1 и 2 в клетках млекопитающего. Эта плазмида отличается от изображенной на фиг. 7 тем, что она содержит химерный легкоцепной вариабельный участок, отличный от химерной тяжелой цепи, постоянный участок человеческой легкой цепи и неомициновый ген (Neo) помимо DHFP.

На фиг. 9 представлена схема плазмиды pIL 4 hzhc-1-pcd, используемой для экспрессии синтетического IL 4 вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID N 11 и 12 в клетках млекопитающего. Такая плазмида отличается от изображенной на фиг. 7 тем, что содержит вариабельный участок гуманизированной тяжелой цепи, отличный от того, который присутствует в химерной тяжелой цепи.

На фиг. 10 представлена схема плазмиды pIL 4hzlc-O-Pcn, используемой для экспрессии вариабельного участка гуманизированной IL 4 легкой цепи SEQ ID N 13 и 14 в клетках млекопитающего. Такая плазмида отличается от той, что изображена на фиг. 8 тем, что содержит вариабельный участок гуманизированной легкой цепи, отличающейся от той, что присутствует в химерной легкой цепи и не кодирует DHFP ген.

Настоящее изобретение обеспечивает ряд антител, их фрагментов и слитых белков, главным образом гуманизированных антител, которые характеризуются связующей специфичностью в отношении человеческого IL 4, нейтрализующей активностью и высоким сродством к человеческому IL 4, как это показано в примерах, относящихся к мышиным Mab или крысиным Mab 6A1. Такие продукты находят применение в терапевтических и фармацевтических композициях для лечения реакций, вызванных действием IL 4 и IgE. Такие продукты также используются для диагностики вызванного действием IL 4 болезненного состояния в результате измерений (например, методом твердофазного иммуноферментного анализа (EL1SA) циркуляционного эндогенного уровня IL 4 у людей.

1. Принятые определения.

Термин "слитый белок" относится к белку, закодированному слитой молекулой, который может быть получен экспрессией в выбранной клетке-хозяине. Такие слитые белки представляют собой генно-инженерные антитела, например химерные или гуманизированные антитела, или фрагменты антитела, в которых полностью или частично отсутствует константный участок иммуноглобулина, например Fy, Fab или F(ab)₂ и т.д.

Термин "слитые молекулы" относится к нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей участки, определяющие комплементарность (CDR) нечеловеческого иммуноглобулина, которые вставлены в первый партнер слияния, включающий человеческие вариабельные каркасные последовательности. Иногда первый партнер слияния оперативно связан со вторым партнером слияния.

Термин "первый партнер слияния" относится к нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей человеческий каркас или вариабельный участок человеческого иммуноглобулина, где нативные (или встречающиеся в природе) CDRS замещены CDR донорского антитела. Человеческая вариабельная область может представлять собой иммуноглобулиновую тяжелую цепь, легкую цепь (или обе такие цепи), а также аналог их функциональных фрагментов. Такие CDR или CDR области, находящиеся внутри вариабельных участков антител (иммуноглобулинов), могут детерминироваться (определяться) известными способами. Так, например, Kabat с сотр. /Sequences of Protein of Immunological Interest, 4-е изд. Департамент здравоохранения США, Национальный Институт здоровья (1987)/ описывает правила расположения CDR. Кроме этого известны компьютерные программы идентификации участков или структур CDR.

Термин "высокий титр" относится к антителу с высокой аффиностью связывания, характеризующемуся Kd, равной или меньшей 210^-10 М для человеческого IL 4.

Под термином "специфичность связывания относительно человеческого IL 4" подразумевается высокий титр (или сродство) в отношении человеческого, но не в отношении бычьего или мышиного IL 4.

Термин "второй партнер слияния" относится к другим нуклеотидным последовательностям, кодирующим протеин или пептид, с которыми коньюгирован первый партнер слияния в рамке или с использованием необязательной традиционной линкерной последовательности (например, путем оперативного связывания). Предпочтительно это вещество представляет собой иммуноглобулин. Второй партнер слияния может включать нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую полный константный район того же самого (например, вариант гомологии, когда первый и второй белки слияния имеют одинаковое происхождение) или дополнительного (например, гетерологичного) нужного антитела. Это вещество может представлять собой иммуноглобулиновую тяжелую или легкую цепи (либо обе такие цепи как часть единого полипептида). Второй партнер слияния не ограничивается конкретным классом иммуноглобулина или изотипом. Кроме этого, второй партнер слияния может включать часть иммуноглобулинового константного участка, такого как Fab или F(ab)₂ (например, дискретную часть соответствующего человеческого константного участка или участка каркаса). Такой второй партнер слияния может также включать последовательность, кодирующую интегрально-мембранный протеин, экспонированный на внешней поверхности клетки-хозяина, например, как часть фаговой библиотеки, или последовательность, кодирующую белок в целях диагностики, например пероксидазу хрена, -галактозидазу и т.п.

Термины Fy, Fc, Fab или F(ab)₂ используются в стандартных значениях (см. , например, Harlow с сотр., Antibodies Alaboratore Manual, лаборатория Колд Спринг Харбор (1988).

Используемый в тексте термин "инженерное антитело" относится к типу слитого белка, т.е. синтетического антитела (например, химерного или гуманизированного антитела), в которых часть вариабельных доменов легкой и/или тяжелой цепей выбранного акцепторного антитела замещена на аналогичные части одного или более донорских антител, обладающих специфичностью в отношении выбранного эпитопа. Так, например, указанные молекулы могут включать антитела, характеризующиеся наличием гуманизированной тяжелой цепи, связанной с немодифицированной легкой цепью (либо химерной легкой цепью) или наоборот. Инженерные антитела могут также характеризоваться изменением нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих вариабельные доменные каркасные участки легкой и/или тяжелой цепей акцепторного антитела с тем, чтобы сохранить специфичность к связыванию донорского антитела. Такие антитела могут включать замену одного или более CDR (предпочтительно всех) от акцепторного антитела на CDR от донорского антитела, описанного в настоящем документе.

Термин "химерное антитело", используемый в данном тексте, относится к типу инженерных антител, которые содержат природный вариабельный район (легкая цепь и тяжелые цепи), произведенный из донорского антитела, ассоциированного с константными районами легкой и тяжелой цепей, произведенных из акцепторного антитела.

Термин "гуманизированное антитело" относится к антителу инженерного типа с его CDR от нечеловеческого донорского иммуноглобулина, причем другие оставшиеся иммуноглобулиновые части молекулы являются производными одного (или более) человеческого иммуноглобулина. Следует отметить, что каркасные опорные остатки могут подвергаться изменению с тем, чтобы сохранить связующую аффинность (см. , например, Queen с сотр., Proc. Natl. Acad. Sci. UCA 86, 10029-10032 (1989), Hodgson с сотр., Bio /Technology, 9:421 (1991).

Используемый в тексте термин "донорское антитело" относится к антителу (поликлональному, моноклональному или рекомбинантному), которое способствует передаче нуклеиново-кислотным последовательностям его вариабельных участков, CDR или других его функциональных фрагментов или аналогов к первому партнеру слияния, в результате чего образуется слитая молекула и экспрессированный слитый протеин с антигенной специфичностью и нейтрализующей способностью, характерными для донорского антитела. Примером донорского антитела, подходящего для использования в настоящем изобретении, может служить нечеловеческое нейтрализующее моноклональное антитело (например, мышиное), обозначаемое как 3В9. Антитело 3В9 определяется, как обладающее высоким титром, человеческий-IL 4 специфичное (т.е. не распознающее бычий или мышиный IL 4), нейтрализующее антитело изотипа IgG₁, имеющее ДНК вариабельной легкой цепи и аминокислотные последовательности SEQ ID N 1 и 2, а также ДНК вариабельной тяжелой цепи и аминокислотные последовательности SEQ ID N 3 и 4 в константной области подходящего мышиного IgG.

Термин "акцепторное антитело" относится к антителу (поликлональному, моноклональному или рекомбинантному), гетерологичному донорскому антителу, которое способствует передаче всех (или любой их части, но предпочтительно всех) нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих каркасные районы его тяжелой и/или легкой цепи и/или константные районы его тяжелой и/или легкой цепи второму партнеру слияния. Предпочтительно человеческое антитело представляет собой акцепторное антитело.

Термин "CDRS" относится к определяющему комплементарность участку аминокислотных последовательностей антитела, которые представляют собой гипервариабельный участок иммуноглобулиновых легких и тяжелых цепей. См., например, Kabat с сотр. Последовательности протеинов, имеющих иммунологическое значение, 4-е изд., Департамент здравоохранения США, Национальный институт здоровья (1987). Имеется по три CDR (или CDR районов) в тяжелой и легкой цепях в вариабельной части иммуноглобулина. В связи с этим, используемый в тексте термин "CDR" относится ко всем трем CDR тяжелой цепи или всем трем CDR легкой цепи (либо ко всем CDR как легкой, так и тяжелой цепей).

CDR обеспечивают множество константных остатков для связывания антитела с антигеном или эпитопом. CDR настоящего изобретения являются производными последовательностей вариабельных тяжелой и легкой цепей донорского антитела и содержат аналоги встречающихся в природе CDR, причем такие аналоги обладают частью или сохраняют ту же антигенсвязующую специфичность и/или нейтрализующую способность, что и донорское антитело, из которого они произошли.

Под термином "распределение антигенсвязующей специфичности или нейтрализующей способности" предполагается, например, что хотя Mab 3В9 может характеризоваться некоторым уровнем антигенного сродства, а CDR, закодированный нуклеиново-кислотной последовательностью 3В9 в подходящем структурном окружении, может обладать более низким или более высоким сродством, предполагается, что CDR 3В9 в таких условиях все-таки будут распознавать тот же эгритоп, что и 3В9. Примерами тяжелоцепных CDR 3В9 могут служить последовательности ID N 22; последовательность ID N 24; последовательность ID N 26; а примерами легкоцепных CDR 3В9 могут служить последовательность ID N 16; последовательность ID N 18 и последовательность ID N 20.

Термин "функциональный фрагмент" относится к неполной вариабельной последовательности тяжелой или легкой цепи (например, небольшие делеции на амино- или карбоксиконцах иммуноглобулинового вариабельного участка), сохраняющей ту же антигенсвязующую специфичность и/или нейтрализующую способность, что и антитело, из которого был получен данный фрагмент.

Термин "аналог" относится к аминокислотной последовательности, модифицированной, по меньшей мере, одной аминокислотой, причем указанная модификация может быть осуществлена химически, представлять собой замещение или перегруппировку нескольких аминокислот (как правило не более 10) и такая модификация позволяет аминокислотной последовательности сохранять биологические характеристики, например специфичность к антигену, высокий титр или аффинность, присущие немодифицированной последовательности. Так, например, молчащие мутации могут реализоваться путем замещений с целью создания рестрикционных эндонуклеазных сайтов внутри или в пределах окружающих CDR области.

Аналоги могут также возникать в ходе аллельных вариаций. Под термином "аллельная вариация или модификация" подразумевается изменение нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей аминокислотную или пептидную последовательности изобретения. Такие вариации или модификации могут быть связаны с дегенерацией генетического кода или достигнуты в результате обдуманного конструирования с целью придания желаемых характеристик. Такие вариации или модификации могут в результате приводить или не приводить к изменению в любой кодирующей аминокислотной последовательности. Так, например, аминокислотные последовательности CDR легкой цепи, последовательность ID N 16 идентична нативной мышиной последовательности и гуманизированного 3В9 антитела. Однако такая CDR последовательность закодирована как SEQ ID N: 15, так и SEQ ID N: 53. Аналогичным образом, CDR SEQ ID N: 22 закодирована как SEQ ID N: 21, так и SEQ ID N:54, CDR SEQ ID N: 24 закодирована как SEQ ID N: 23, так и SEQ ID N: 55; и CDR SEQ ID N: 26 закодирована как SEQ ID N: 25, так и SEQ ID N:56.

Термин "эффекторные агенты" относится к непротеиновым молекулам-носителям, с которыми обычными методами могут быть связаны слитые протеины и/или природная или синтетическая, легкая или тяжелая цепь донорского антитела или других фрагментов донорского антитела. Такие небелковые носители могут включать традиционные носители, используемые в области диагностики, например полистирол или другие пластиковые шарики, полисахариды, например те, что используются в системе BlAcope /Pharmacia / или другие небелковые вещества, используемые в медицине и безопасные при применении на людях и животных. Другие агенты-эффекторы могут включать макроцикл для хелатирования атома тяжелого металла или радиоизотопы. Такие эффекторы могут также использоваться для повышения времени полураспада слитых протеинов; к таким агентам относится полиэтиленгликоль.

II. Высокоаффинные IL 4-моноклональные антитела.

Для осуществления конструирования антител, фрагментов и слитых протеинов изобретения могут применяться нечеловеческие разновидности (например, материалы, полученные от коров, овец, приматов, грызунов (например, мышей и крыс) и т.д.) и они используются для генерации желаемого иммуноглобулина путем представления с помощью нативного человеческого IL 4 или его пептидного эпитопа. Традиционные гибридомные методы используются для обеспечения гибридомной клеточной линии, секретирующей нечеловеческий Mab к IL 4. Затем такие гибридомы подвергают скринингу с использованием IL 4, ковалентно связанного с 96-луночными пластинами, или с использованием биотинилированного IL 4, предназначенного для применения в скрининге в соответствии с методикой, подробно описанной в следующем ниже примере 2. Таким образом, одним из отличительных признаков настоящего изобретения является способ детекции Mab на человеческий IL 4, в котором используемые аналитические средства позволяют избежать денатурацию IL 4. Согласно такому способу было обнаружено, что могут детектироваться Mab с высоким титром (или высоким сродством) к человеческому IL 4.

В качестве одного из примеров вначале будет описано получение нейтрализующего Mab с высоким титром из мышиного донора. Mab 3В9, представляющие собой желательное мышиное (донорское) антитело для использования в выработке химерного или гуманизированного антитела, подробно описано в следующем ниже примере 1. 3В9 Mab характеризуется антигенсвязующей специфичностью на человеческий IL 4 с K_d < 2 10^-1 М (около 1,8 10^-10 М) в отношении IL 4. K_d для 114 фрагмента Fab такого 3В9 имеет значение менее 310^-10 М. Эпитоп такого антитела не может картироваться с помощью IL 4 линейных пептидов и, следовательно, такой эпитоп рассматривается как связывающийся с несоприкасающимся эпитопом. Картина связывания предполагает наличие связующего сайта в области B-C петля (остатки 60-69) ---> C-спираль (остатки 70-93). В отношении картированного обозначения таких участков можно сослаться на работы Cook с сотр. J.Mol. Biol. 218:675-678 (1991), Walter с сотр., J.Biol. Chem. 267: 20371-20376 (1992), Wlodaver с сотр., FEBS Lett. 309: 59-64(1992), Redfield с сотр. Biochem 30: 11029-11035 (1991), Smith с сотр., J.Mol. Biol. 224: 899-904(1992), Garrett с сотр., (1992) и Rowers c coтр. Biochem. 31: 4334-4346 (1992) и Science 256:1673-1677 (1992).

Другим желаемым донорским антителом является крысиный Mab, 6A1. Получение такого Mab описано ниже в примере 7. Такой Mab характеризуется тем, что является изотипом IgG_2a и имеет константу диссоции в отношении IL 4 менее 2 10^-10 М (около 1,610^-10 М). Как и в случае 3В9 эпитоп-мишень такого 6A1 не картируется с IL 4 линейными пептидами и поэтому такой эпитоп рассматривается как несоприкасающийся и трехмерный. Картина связывания с IL 4 мутеинами и его биологическая активность указывают на связывание в области D-спирали человеческого IL 4 (аминокислотные остатки 109-127), по-видимому в области тирозина на аминокислотном остатке # 124.

Настоящее изобретение не ограничивается использованием 3В9 Mab, 6A1 Mab или их гипервариабельных (т.е. CDR) последовательностей. Любые другие подходящие IL 4 антитела с высоким титром, характеризующиеся константой диссоциации, равной или меньшей 2 10^-10 М в отношении человеческого IL 4, и соответствующие анти-IL 4 CDR могут служить заменой указанным материалам. В следующем ниже описании донорское антитело идентифицируется как 3В9 или 6A1, причем такое обозначение дается лишь в целях иллюстрации и упрощения описания.

Ill. Фрагменты антител Настоящее изобретение также охватывает использованием Fab фрагментов или F(ab)₂ фрагментов, являющихся производными Mab, направленных против человеческого IL 4. Такие фрагменты используются в качестве агентов, защищающих in vivo от IL 4 - IgE-медиаторных состояний или in vitro в качестве части IL 4 диагностического средства. Фрагмент Fab содержит полную легкую цепь и аминотерминальную часть тяжелой цепи; а фрагмент F(ab')₂ представляет собой фрагмент, образованный двумя фрагментами Fab, связанными посредством дисульфидной связи. Mab 3В9, 6A1 и другие аналогичные высокоаффинные, IL 4 связывающие антитела представляют собой источники фрагментов Fab и F(ab'), которые могут быть получены традиционными методами, например расщеплением Mab с помощью соответствующих протеолитических энзимов, папаина и/или пепсина, или рекомбинантными методами. Такие фрагменты Fab и F(ab')₂ сами по себе используются в качестве терапевтических, профилактических или диагностических агентов, а также в качестве доноров последовательностей, включающих вариабельные участки и CDR последовательностей, используемых для образования рекомбинантных или гуманизированных антител, как это описано в настоящем документе.

IV. Анти-114 аминокислотная и нуклеотидные последовательности.

Mab 3В9 или другие описанные выше антитела могут обеспечивать последовательности, например вариабельные пептидные последовательности тяжелой и легкой цепей, рамочные последовательности, CDR последовательности, их функциональные фрагменты и аналоги, а также иодирующие их нуклеиново-кислотные последовательности, применяемые для конструирования и получения различных слитых протеинов (включая генно-инженерные антитела), которые характеризуются антигенсвязующей специфичностью донорского антитела.

Таким образом, в качестве одного из примеров настоящее изобретение предусматривает последовательности вариабельной легкой цепи и вариабельной тяжелой цепи из IL 4 мышиного антитела 3В9 и последовательности, являющиеся их производными. Вариабельный участок тяжелой цепи 3В9 характеризуется аминокислотными остатками 20-140 SEQ ID N: 4. CDR области указаны путем подчеркивания на фиг. 2 и представлены в SEQ ID N: 22; SEQ ID N: 24 и SEQ ID N: 26. Вариабельная область клона легкой цепи характеризуется аминокислотными остатками 21-132 на фиг. 1 /SEQ ID N: 2/. CDR области даны аминокислотными остатками 44-58 /SEQ ID N: 16/; 74-80/ SEQ ID N: 18/ и 113-121 / SEQ ID N: 20/.

Также предусмотрены вариабельная область химерной тяжелой цепи и сигнальная нуклеотидная и аминокислотная последовательности. Эти последовательности идентичны тяжелой цепи 3В9 за исключением сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность химерной тяжелой цепи показана в SEQ ID N: 5 и 6. Области CDR подчеркнуты на фиг. 3 и они идентичны по аминокислотной последовательности нативным мышиным CDR /SEQ ID N: 21-26/. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного района химерной легкой цепи идентичны немодифицированным 3В9 последовательностям (аминокислотные остатки 21-132 SEQ ID N: 2), что делает возможным использование природных мышиных сигнальных последовательностей (аминокислотные остатки 1-20 SEQ ID N: 2).

Вариабельная область гуманизированной тяжелой цепи и сигнальные последовательности проиллюстрированы на фиг. 4 /SEQ ID N: 11 и 12/. Сигнальная последовательность также показана в SEQ ID N: 5 и 6. Другие подходящие сигнальные последовательности, известные специалистам в данной области, могут служить заменой сигнальным последовательностям, представленным в примерах. CDR аминокислотные последовательности такой конструкции идентичны CDR нативной мышиной и химерной тяжелой цепи и они показаны в SEQ ID N: 22 (закодированной SEQ ID N: 54), SEQ ID N: 24 (закодированной SEQ ID N: 55) и SEQ ID N: 56 (закодированной SEQ ID N: 26).

Приведенная в качестве примера (синтетическая) вариабельная последовательность гуманизированной легкой цепи проиллюстрирована на фиг. 5 /SEQ ID N: 13 и 14/. Такая сигнальная последовательность включает аминокислотные остатки 1-19 последовательности ID N: 8. CDR последовательности на этом чертеже обозначены путем подчеркивания и они отличаются от CDR нативной мышиной CDR по сигнальной аминокислотной последовательности SEQ ID N: 20. Таким образом, CDR гуманизированной легкой цепи представлены SEQ ID N: 53 и 16, SEQ ID N: 17 и 18 и SEQ ID N 27 и 28. Имеющееся отличие подробно описано в примере 3.

Нуклеиново-кислотные последовательности настоящего изобретения или их фрагменты, кодирующие пептидные последовательности вариабельной легкой цепи и тяжелой цепи, используются в немодифицированной форме или могут быть синтезированы с целью введения желаемых модификаций, например рестрикционных сайтов. Выделенные нуклеиново-кислотные последовательности природного или синтетического происхождения, являющиеся производными Mab 3В9 или других желательных IL 4 антител с высоким титром, могут необязательно содержать рестрикционные сайты, облегчающие инсерцию или лигирование в подходящую нуклеиново-кислотную последовательность, например ту, что кодирует каркасную область желаемого антитела, лигирование с мутантными CDR или слияние с нуклеиново-кислотной последовательностью, кодирующей выбранный второй партнер слияния.

Принимая во внимание вырожденности генетического кода, могут быть сконструированы различные кодирующие последовательности, которые способны кодировать вариабельные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи, а также CDR последовательности изобретения и их функциональные фрагменты и аналоги, которые делят антигенную специфичность донорского антитела. Выделенные нуклеиново-кислотные последовательности изобретения или их фрагменты, кодирующие пептидные последовательности вариабельной цепи или CDR, могут использоваться для получения слитых протеинов, химерных или гуманизированных антител или других инженерных антител настоящего изобретения при оперативном соединении со вторым партнером слияния.

Эти последовательности также используются для мутагенного введения специфических изменений в нуклеиново-кислотные последовательности, кодирующие CDR или каркасные области, а также для введения полученной в результате модифицированной или слитой нуклеиново-кислотной последовательности в плазмиду для экспрессии. Так, например, молчащие замещения в нуклеотидной последовательности каркасной и CDR-кодирующей областей использовали для создания рестрикционных сайтов, которые облегчают вставку мутагенизированных CDR (и/или каркасных) областей. Такие CDR области использовали для конструирования гуманизированного антитела изобретения.

Следует отметить, что помимо выделенных нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих части слитого белка и антител, описанных в настоящем документе, могут использоваться и другие нуклеиново-кислотные последовательности, например, комплементарные нативным последовательностям. Используемые ДНК последовательности включают такие последовательности, которые гибридизуются в строгих условиях /см. T.Maniatis с сотр. Молекулярное клонирование (Лабораторное руководство), лаборатория Колд Спринг Харбор (1982), стр. 387-389/ с ДНК-последовательностями. Одним из примеров такой гибридизации в строгих условиях является гибридизация при 4XSSC при 65^oC с последующей промывкой в 0,1 XSSC при 65^oC в течение часа. Другим примером гибридизации в строгих условиях может служить обработка в 50% формамиде, 4 XSSC при 42^oC. Предпочтительно, чтобы такие гибридные ДНК-последователь