Выделенный полипептид, выделенный слитый белок (варианты) и выделенный белок (варианты) для получения наноструктуры

Выделенный полипептид, выделенный слитый белок (варианты) и выделенный белок (варианты) для получения наноструктуры

Реферат

 

Изобретение относится к структурам нанометрового размера, используемым для конструирования микроскопических и макроскопических структур. Выделенный полипептид представляет собой вариант gp36 белка бактериофага Т4. Аминокислотная последовательность приведена в описании. Выделенный слитый белок состоит из первой части gp37 белка Т-четно-подобного бактериофага и последних 10 - 60 С-терминальных аминокислот gp36 белка или первой части gp36 белка и второй части gp34 белка Т-четно-подобного бактериофага. Аминокислотные последовательности приведены в описании. Выделенный белок включает 20 смежных аминокислот gp37 белка, или gp36 белка, или gp34 белка Т-четно-подобного бактериофага. Аминокислотные последовательности приведены в описании. Изобретение позволяет создавать материалы, свойства которых могут быть приспособлены к конкретным требованиям технологии нанометрового масштаба, улучшить прочность и консистенцию макроструктур. 6 с.п. ф-лы, 9 ил.

Изобретение относится к наноструктурам, т.е. структурам нанометрового размера, используемым для конструирования микроскопических и макроскопических структур. Главным образом, настоящее изобретение имеет отношение к наноструктурам на основе белков нитевидного отростка бактериофага T4 и их вариантам.

Хотя в соответствии с теоретическими предпосылками прочность большинства материалов на основе металлов и керамики является следствием прочности связей между молекулами их компонентов и поверхностями кристаллитов, такая прочность существенно ограничена дефектами в их кристаллической и стеклоподобной структурах. Такие дефекты обычно присущи самим исходным материалам или возникают в ходе производства и часто распространяются вследствие воздействия окружающих нагрузок.

Развивающаяся область нанотехнологии повысила ограничения, касающиеся традиционных материалов. Возможность конструирования и производства очень мелких структур (т.е. структур нанометровых размеров), способных выполнять сложные функции, зависит от использования соответствующих материалов, на которые можно воздействовать предсказуемыми и воспроизводимыми методами и которые обладают свойствами, требуемыми для каждого нового применения.

Биологические системы служат образцом сложных наноструктур. Живые клетки производят белки и объединяют их в структуры, которые сформированы совершенно и обладают устойчивостью к повреждениям в их нормальной окружающей среде. В некоторых случаях сложные структуры создаются в результате процесса самосборки, инструкции для которого заложены в компонентные полипептиды. Наконец, белки подвергаются процессам коррекции, обеспечивающим высокую степень контроля качества.

В связи со сказанным выше, в данной области техники имеется потребность в способах и композициях, использующих такие уникальные особенности белков, для образования составных частей синтетических наноструктур. Указанная потребность заключается в создании материалов, свойства которых могут быть приспособлены к конкретным требованиям технологии нанометрового масштаба. Кроме этого, поскольку субъединицы большинства макроструктурных материалов, керамики, металлов, волокон и т.п. основаны на связывании наноструктурных субъединиц, изготовление соответствующих субъединиц без дефектов, обладающих точными размерами и однородностью, должно улучшить прочность и консистенцию макроструктур, поскольку поверхности становятся более упорядоченными и могут взаимодействовать более плотно на обширных участках, чем более крупный гетерогенный материал.

В соответствии с одним из аспектов настоящее изобретение предусматривает получение изолированных белковых строительных блоков для наноструктур, содержащих модифицированные белки нитевидного отростка бактериофага T4. Белки gp34, 36 и 37 модифицируют различными методами с образованием новых стержневых структур с различными свойствами. Специфические внутренние пептидные последовательности могут быть подвергнуты делеции без влияния на их способность образовывать димеры и ассоциироваться с их естественными партнерами нитевидного отростка. С другой стороны, они могут модифицироваться таким образом, что: они будут взаимодействовать только с другими модифицированными, а не нативными партнерами нитевидного отростка; проявлять термолабильные взаимодействия с их партнерами; или содержать дополнительные функциональные группы, позволяющие осуществлять их взаимодействие с гетерологичными связующими фрагментами.

Настоящее изобретение также охватывает слитые белки, которые содержат последовательности из двух или более различных белков нитевидного отростка. Белок gp35, который образует угловое соединение, модифицируют таким образом, чтобы образовывались средние углы, отличные от природного среднего угла в 137^o (7^o) или 156^o ( 12^o), и осуществлялись термолабильные взаимодействия с его партнерами.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагаются наноструктуры, содержащие нативные и модифицированные белки нитевидного отростка бактериофага T4. Такие наноструктуры могут представлять собой одномерные стержни, двухмерные многоугольники либо открытые или закрытые слои, или открытые трехмерные камеры, или закрытые твердые объекты.

На фиг. 1A и 1B представлено схематическое изображение частицы бактериофага T4 (фиг. 1A) и схематическое изображение нити отростка бактериофага T4 (фиг. 1B).

На фиг. 2 представлено схематическое изображение элементарного блока.

Фиг. 3A-3D изображают схематический вид: одномерного многозвенного стержня, соединенного вдоль оси x (фиг. 3A); замкнутых простых слоев (фиг. 3B); замкнутых слоев в виде кирпичной кладки (фиг. 3C); и открытых слоев в виде кирпичной кладки (фиг. 3D).

На фиг. 4 представлено схематическое изображение двух элементарных единиц, используемых для конструирования пористых и твердых слоев (верхнего и нижнего), которые при попеременном нанесении образуют многоярусный набор камер, изображенный на чертеже.

Фиг. 5 изображает схематический вид угловой структуры с углом 120^o .

Фиг. 6 изображает последовательность ДНК (SEQ 1A N:1) генов 34, 35, 36 и 37 бактериофага T4.

Фиг. 7 изображает аминокислотные последовательности (представленные однобуквенными кодами) генных продуктов генов 34 (SEQ 1D N:2, ORFX SEQ 1D N:3), 35 (SEQ 1D N:4), 36 (SEQ 1D N:5) и 37 (SEQ 1D N:6) бактериофага T4. Аминокислотные последовательности (нижняя линия каждой пары) выстроены в линию относительно нуклеотидных последовательностей (верхняя линия каждой пары). Следует отметить, что выведенная белковая последовательность гена 35 (из базы данных NCB1), по-видимому, не может считаться точной.

На фиг. 8A-8B представлено схематическое изображение: образования P37 димерного инициатора из молекулы, превратившейся путем самосборки в димер (фиг. 8A); и образование P37 тримерного инициатора из молекулы, превратившейся в результате самосборки в тример (фиг. 8B).

На фиг. 9 представлено схематическое изображение образования полимера (P37-36)_n с помощью инициатора, представляющего собой димер, образовавшийся в ходе самосборки.

Детальное описание изобретения.

Все патенты, заявки на патенты и литературные ссылки, цитированные в описании, полностью охватываются ссылками на них, содержащимися в настоящем документе. В случае противоречий предпочтение отдается, включая определения, настоящему описанию.

Хотя настоящее изобретение описано со ссылкой, главным образом, на белки нитевидного отростка бактериофага T4, следует иметь в виду, что изобретение также применимо к белкам нитевидного отростка другого фага, подобного T-четному фагу, например, семейства T4 (например, T4, Tu1a, Th1b) и семейства T2 (T2, T6, K3, Ox2, M1 и т.п.).

Обозначения.

Используемый в тексте термин "наноструктуры" относится к структурам различных размеров и форм, которые собраны из белковых компонентов нанометрового размера.

Термином "химеры" в тексте обозначаются химерные белки, в которых по крайней мере, амино- и карбокси-терминальные области являются производными различных исходных полипептидов независимо от того, являются ли исходные полипептиды полипептидами естественного происхождения или модифицированными в результате мутагенеза.

Используемый в тексте термин "гомодимеры" относится к совокупностям практически идентичных белковых субъединиц, образующих выраженную трехмерную структуру.

Обозначение "gp" относится к мономерному полипептиду, тогда как обозначение "P" относится к гомоолигомерам. P34, P36 и P37, предположительно, представляют собой гомодимеры или гомотримеры.

Упоминание в тексте изолированного полипептида, который "в основном состоит из" специфической аминокислотной последовательности, относится к полипептиду со специфической последовательностью или к полипептиду, содержащему консервативные замены в такой последовательности. Как должно быть понятно специалисту в данной области, консервативные замены представляют собой такие замены, в которых кислый остаток замещают на кислый остаток, основной остаток заменяют на основной остаток или гидрофобный остаток заменяют гидрофобным остатком. Сферой изобретения также охватывается полипептид, у которого отсутствуют одна или более аминокислот на амино-конце или карбокси-конце, вплоть до пяти на любом конце, когда отсутствие конкретных остатков не оказывает заметного влияния на структуру или функцию полипептида при практической реализации настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к новому классу белковых строительных блоков, размеры которых измеряются в нанометрах, которые используются в конструировании микроскопических и макроскопических структур. Не ограничиваясь конкретной теорией, предполагается, что основное звено представляет собой гомодимер, состоящий из двух идентичных белковых субъединиц, имеющих кросс--конформацию, хотя возможны также и трехмерные структуры. Таким образом, должно быть ясно, что ссылки на "гомодимер" или "димеризацию", используемые в тексте, во многих случаях могут рассматриваться как относящиеся также к гомотримеру или тримеризации. Такие длинные, жесткие и устойчивые стержнеобразные единицы могут объединяться с другими стержнями с использованием сшивающих устройств, которые могут присоединяться генетически или in vitro. Концы одного стержня могут присоединяться к различным концам других стержней или аналогичных стержней. Вариации в длине стержней, углах присоединения и их характеристиках гибкости делают возможной самосборку разнопрофильных структур in situ. Таким образом, элементарные ячейки могут подвергаться самосборке в заранее определенные более крупные структуры, имеющие одно, два или три измерения. Самосборка может осуществляться с образованием структур с точными размерами и однородной прочностью в результате бездефектного биологического производства компонентов. Стержни могут также модифицироваться генетическими и химическими методами с образованием определенных специфичных участков присоединения для других химических объектов, что обеспечивает формирование сложных структур.

Важным аспектом настоящего изобретения является тот факт, что белковые звенья могут конструироваться таким образом, что они включают стержни различной длины и могут дополнительно модифицироваться таким образом, чтобы они включали отличительные признаки, изменяющие их поверхностные свойства определенным образом и/или влияющие на их способность к соединению с другими идентичными или различными звеньями. Кроме этого, возможности самосборки могут быть расширены путем получения химерных белков, объединяющих свойства двух различных представителей данного класса. Такой конструкционный отличительный признак достигается путем манипулирования со структурой генов, кодирующих такие белки.

Как будет подробно описано ниже, композиции и способы настоящего изобретения используют свойства натуральных белков, т.е. полученные в результате структуры являются жесткими, прочными, устойчивыми в водной среде, термостойкими, протеаза-устойчивыми и могут быть биодеградируемыми. Большое число звеньев может быть легко создано в микроорганизмах. Кроме этого, для облегчения автоматизации большие количества частей и субагрегатов могут храниться и использоваться по мере необходимости.

Последовательности белковых субъединиц основаны на компонентах нитевидного отростка бактериофага T4 E.coli. Следует понимать, что изложенные принципы и методы могут быть применены к нитевидным отросткам других T-четных фагов или других родственных бактериофагов с аналогичными отростковыми и/или нитевидными структурами.

Структура нитевидного отростка бактериофага T4 (проиллюстрированного на фиг. 1) схематически может быть представлена следующим образом (N =амино-конец, C= карбокси-конец): N[P34]C - N[gp35]C - N[P36]C - N[P37]C. P34, P36 и P37 представляют собой жесткие, стержнеобразные белковые гомодимеры, в которых две идентичные -складки, ориентированные в одинаковом направлении, сливаются в ориентации поверхность - к поверхности в результате гидрофобных взаимодействий между наложенными друг на друга пластами при вращательной оси симметрии в 180^o по длинной оси стержня. (Такая структура будет изменяться, если P34, P36 и P37 представляют собой гомотримеры). В отличие от этого, gp35 представляет собой мономерный полипептид, который специфически присоединяется к N-окончанию P36 и затем к C-окончанию P34 и образует угловое соединение между двумя стержнями. В ходе инфицирования E.coli бактериофагом T4 два gp37 мономера димеризуются с образованием P37 гомодимера; предполагается, что процесс димеризации инициируется вблизи C-конца P37 и требует наличия двух белков-чаперонов E. coli. (Вариантный gp37 с температурно-чувствительной мутацией вблизи C-окончания, используемый в настоящем изобретении, требует для димеризации наличия лишь одного чаперона, gp57). В ходе димеризации N-конец P37 инициирует димеризацию двух P36 мономеров в P36 стержень. Соединение между C-концом P36 и N-концом P37 является плотным и жестким, но нековалентным. Затем N-конец P36 присоединяется к gp35 мономеру; такое взаимодействие стабилизирует P36 и образует колено нитевидного отростка. Наконец, gp35 присоединяется к C-концу P34 (который использует gp57 для димеризации). Таким образом, самосборка нитевидного отростка регулируется определенным порядком взаимодействия специфических субъединиц, в результате чего структурное созревание, вызванное образованием первого субагрегата, обеспечивает взаимодействие с новыми (ранее запрещенными) субъединицами. В результате этого образуется структура с точной спецификацией из случайной смеси компонентов.

В соответствии с настоящим изобретением гены, кодирующие такие белки, могут модифицироваться таким образом, что образуются стержни различных длин с различными комбинациями окончаний. В этом отношении свойства нативных белков обладают особыми преимуществами. Во-первых, -складка состоит из антипараллельных - цепей с -изгибами по левому (L) и правому (R) краям. Во-вторых, аминокислотные боковые цепочки чередуются и выходят вниз из плоскости пласта. Первое свойство обеспечивает удлинение изгибов с образованием симметричных и специфичных сайтов присоединения между L и R поверхностями, а также с образованием сайтов присоединения для других структур. Кроме этого, стержневые секции -складки могут укорачиваться или удлиняться в результате генетических манипуляций, например путем сплайсинга ДНК областей, кодирующих -изгибы на том же краю пласта, с образованием новых изгибов, исключающих наличие мешающих пептидов, или инсерцией сегментов пептида, осуществляемой аналогичным образом путем сплайсинга на углах изгиба. Второе свойство позволяет аминокислотным цепочкам удлиняться над и под поверхностью -складки, модифицируемой методом генетического замещения или химического сшивания. Важно отметить, что все перечисленные выше модификации достигаются без ущерба для структурной целостности стержня. Как должно быть ясно специалисту в данной области, такие свойства обеспечивают большую гибкость при конструировании единиц, которые могут собираться с образованием большого числа разнообразных структур, некоторые из которых подробно обсуждаются ниже.

Структурные единицы.

Стержни настоящего изобретения выполняют функции, аналогичные функциям деревянных 2 х 4 штифтов или стальных брусков, используемых для конструирования. В этом случае поверхности точно воспроизводимы на молекулярном уровне и вследствие этого подходят для специфических присоединений к одинаковым или различным стержням ячеек на фиксированных участках соединения. Такие поверхности также модифицируют таким образом, чтобы они были более или менее гидрофильными, включая положительно или отрицательно заряженные группы, и имели выступы, встроенные для специфического связывания с другими ячейками или с промежуточным соединением с двумя рецепторными сайтами. Поверхности стержня и схема элемента стержня проиллюстрированы на фиг. 2. Три измерения стержня обозначены следующим образом: x, измерение от обратной стороны (B) к фронтальной части (F); Y, измерение снизу (D) вверх (U); и Z, измерение слева (L) направо (R).

Одномерные многоединичные стержни могут быть наиболее легко собраны из единичных элементарных стержней, соединенных вдоль оси x (фиг. 3A), однако регулярное соединение субъячеек в любом из двух других измерений будет также формировать удлиненную структуру, но с различными сечениями относительно структуры по измерению x.

Двухмерные конструкции представляют собой пласты, сформированные в результате взаимодействия стержней вдоль двух любых осей.

1) Замкнутые простые пласты образуются из поверхностей, которые точно перекрываются вдоль двух любых осей (фиг. 3B). 2) Замкнутые пласты типа кирпичной кладки образуются в результате взаимодействия между единицами, имеющими точно перекрывающиеся поверхности в одном измерении и специальный тип перекрывания в другом измерении (фиг. 3C). В этом случае может существовать два различных ряда дополнительных соединений, расположенных на расстоянии точно в 1/2 единицы ячейки между ними. Если они отцентрованы (т.е. каждый ряд на 1/4 от конца, то каждое соединение окажется в центре ячеек, расположенных сверху и снизу. Если они сдвинуты, то соединение также окажется сдвинутым. В такой конструкции дополнительно взаимодействующие сайты схематически обозначены, как ^.и^... Если каждый из взаимодействующих сайтов симметричен, то чередующиеся ряды могут взаимодействовать со стержнями в любом направлении. Если они не симметричны и могут взаимодействовать лишь с взаимодействующими рядами, расположенными в одном или противоположных направлениях, получают пласт из однонаправленных стержней или слоев стержней в переменных направлениях.

3) Открытые пласты типа кирпичной кладки (или сетки) образуются в том случае, когда ячейки отделены друг от друга на расстояние больше половины ячейки (фиг. 3D). Размеры отверстий (или пор) зависят от расстояния (dx), разделяющего взаимодействующие сайты и расстояния (dy), на которое эти сайты отделяют одну поверхность от другой.

Трехмерные конструкции требуют осуществления стерически совместимых взаимодействий между всеми тремя поверхностями с образованием твердых веществ. 1) Замкнутые твердые системы могут быть собраны из ячеек, которые точно перекрываются во всех трех измерениях (например, в случае точного перекрывания замкнутых простых пластов). Аналогичным образом, замкнутые пласты типа кирпичной кладки могут образовывать замкнутые твердые системы в результате точного перекрывания пластов или в результате перемещения с переносом кирпичной кладки в третье измерение. Такой вариант требует соответствующего набора соединений во всех трех парах параллельных лицевых поверхностей ячейки. 2) Пористые твердые системы получают путем соединения открытых пластов типа кирпичной кладки различными способами. Так например, если ячейки точно перекрываются в третьем измерении, то образуется твердая система с множеством отверстий точных размеров, проходящих перпендикулярно к плоскости листа. Если же вместо этого требуется материал с замкнутыми пространственными элементами со слоями ширины dz (т.е. в измерении U--->D), то простой замкнутый пласт наносят слоем на открытый пласт типа кирпичной кладки с целью закрытия отверстий. Если перекрывание открытого пласта типа кирпичной кладки составляет, например, 1/4 ячейки, то для получения пласта используют стержень длиной 3/4 ячейки. Затем требуются соединения в измерении Z. Две такие ячейки используют для полимеризации таких чередующихся слоев, и сами слои схематично изображены на фиг. 4.

Все описанные выше структуры состоят из простых линейных стержней. Вторая ячейка, угловая ячейка, расширяет тип и пространственную конфигурацию возможных структур. Угловая ячейка соединяет два стержня под углом, отличным от 180^o, подобно углу железа. Средний угол и степень его жесткости встраиваются в такую соединительную структуру. Так например, структура, изображенная на фиг. 5, имеет угол 120^o и различные специфические сайты соединения в позициях a и b. Далее приведены примеры структур, полученных с использованием угловых соединений.

1) Открытые пласты типа кирпичной кладки удлиняются и упрочняются в направлении, перпендикулярном направлению стержня путем добавления углов, перпендикулярных к пласту. В этом случае образуется трехмерная сетчатая структура. Присоединение углов величиной 90^o к концам стержней образует угол, лежащий почти в плоскости пласта, что позволяет добавлять новые стержни к таким углам (которые должны иметь некоторый зазор вне плоскости исходного пласта для присоединения в первую очередь) с образованием нового пласта, почти параллельного первому с ориентацией, нормальной в отношении его верхнего или нижнего соседа.

2) Шестиугольники получают из смеси стержней и угловых связок, образующих углы 120^o. В этом случае имеется два исключительных набора соединений. Каждый набор собирают из одного из двух концов стержня и одного из двух комплементарных сайтов при угле. Полученная структура является линейной в том смысле, что шестиугольник имеет направление (либо по часовой, либо против часовой стрелки). Она может быть превращена в двухмерную открытую сетку (т. е. двухмерную соту) путем соединения сторон шестиугольника. Она может образовывать шестигранные трубки в результате соединения вершины нижнего шестиугольника с нижней лицевой поверхностью верхнего шестиугольника. Если такие трубки соединяются по их сторонам, то они образуют открытую трехмерную составную шестигранную трубку.

3) Спиральные шестигранные трубки получают аналогично шестиугольникам, но шестую ячейку не соединяют с первой для закрытия шестиугольника. Вместо этого конец перемещают из плоскости шестиугольника и добавляют седьмую и следующую ячейки с образованием шестигранной трубки, которая может представлять собой пружину, если между ячейками спирали действуют незначительные или отсутствуют силы адгезии, либо они может представлять собой жесткий стержень, если такая сила существует в непосредственной близости от соединяемых ячеек.

Специалисту в данной области должно быть ясно, что композиции и способы настоящего изобретения также охватывают другие многоугольные структуры, такие как восьмиугольник, а также открытые твердые системы, такие как тетраэдр и двадцатигранники, сформированные из трехугольников, и кубов, полученных из квадратов и прямоугольников. Круг структур ограничен лишь типами угловых ячеек и заместителями, которые могут быть сооружены по различным осям стержневых ячеек. Так например, другие встречающиеся в природе углы обнаружены в нитях бактериофага T7, имеющего угол 90^o (Steven с сотр., J.Mol.Biol. 200:352-365, 1988).

Конструкция и получение стержневых белков.

Белковые субъячейки, используемые для конструирования наноструктур настоящего изобретения, основаны на четырех полипептидах, которые входят в состав нитевидных отростков бактериофага T4, т.е. gp34, gp35, gp36 и gp37. Гены, кодирующие такие белки, были подвергнуты клонированию и были установлены их ДНК и белковые последовательности (для генов 36 и 37 см. статью Oliver с сотр. , J. Mol. Biol. 153: 545-568, 1981). ДНК и аминокислотные последовательности генов 34, 35, 36 и 37 представлены на следующих ниже фиг. 6 и 7.

Gp34, gp35, gp36 и gp37 получали естественным путем после инфицирования клеток E. coli частицами интактного T4-фага. После синтеза в цитоплазме бактериальной клетки gp34, 36 и 37 мономеры образуют гомодимеры, которые достаточны для сборки в зреющие фаговые частицы. Таким образом, E.coli служит эффективной и удобной фабрикой для синтеза и димеризации белковых субъячеек, описанных ниже.

При практической реализации настоящего изобретения гены, кодирующие рассматриваемые белки (нативные, модифицированные или рекомбинантные), внедряют в векторы экспрессии ДНК, которые хорошо известны в данной области. Такие кольцевые плазмиды обычно содержат селектируемые гены-маркеры (обычно придающие антибиотическую устойчивость трансформированным бактериям), последовательности, позволяющие осуществлять репликацию плазмиды с большим числом копий в E.coli, и множественный клонирующий сайт, расположенный сразу в прямом направлении относительно индуцибельного промотора, а также сайт связывания с рибосомой. Примерами выпускаемых промышленностью векторов, подходящих для использования в настоящем изобретении, могут служить pET система (Новаген, Инк., Мэдисон, W1) и векторы Суперлинкер pSE380 и pSE280 (Инвитроген, Са-Диего, CA).

Используемая стратегия состоит в 1) конструировании интересующего гена и его клонировании в множественный клонирующий сайт; 2) трансформации клеток E. coli с помощью рекомбинантной плазмиды; 3) индуцировании экспрессии клонированного гена; 4) тестировании на синтез белкового продукта; и, наконец, 5) тестировании на образование функциональных гомодимеров. В некоторых случаях дополнительные гены также клонируют в ту же плазмиду, когда их функция требуется для димеризации интересующего белка. Так например, при экспрессии gp37 дикого типа или его версий подключают также бактериальный чапероновый ген 57; при экспрессии gp36 дикого типа или модифицированного gp36 подключают версию дикого типа или модифицированную версию гена gp37. Модифицированный gp37 должен обладать способностью к димеризации и содержать N-конец, который может сопровождать димеризацию gp36. Такой метод позволяет осуществлять образование мономерных генных продуктов и, в некоторых случаях, способствует созреванию мономеров в гомодимерные стержни в отсутствии других фагиндуцированных белков, обычно присутствующих в T4-инфицированной клетке.

Стадии 1-4 описанной выше стратегии осуществляются с помощью методов, хорошо известных в области технологии рекомбинантной ДНК и экспрессии белка в бактериях. Так например, на стадии 1 расщепление рестриктазами в множественных сайтах с последующим лигированием фрагментов используется для конструирования делеций во внутреннем стержневом сегменте gp34, 36 и 37 (см. ниже, Пример 1). С другой стороны, расщепление единственной или множественными рестриктазами с последующим экзонуклеазным перевариванием (EXO - SIZE, New England, Biolabs, Beverly, MA) используются для делеции ДНК-последовательностей в одном или обоих направлениях от исходного сайта расщепления; при объединении с последующей стадией лигирования такой метод обеспечивает образование гнездовой серии делеций с увеличивающимися размерами. Аналогичным образом стандартные способы используются для перестройки сегментов ДНК из двух различных генов нитевидного отростка с образованием химерных генов, кодирующих слитые белки (называемые в данном описании "химерами"). Как правило, последний способ используется для обеспечения чередования N- и C-концов, и, таким образом, для создания новых комбинаций концов, что обеспечивает новые примеры соединения различных стержневых сегментов. Представитель химер такого типа, слияние gp37-36, представлен и описан в Примере 2. Предпочтительными хозяевами для продуцирования таких белков (Стадия 2) являются E.coli штамм BL21 (DE3) и BL21 (DE3/pLysS) (полученные коммерческим путем от Novagen, Madison, Wl), хотя могут также использоваться другие совместимые recA штаммы, такие как HMS 174 (DЕ3) и HMS 174 (DE3/pLysS). Трансформация с помощью рекомбинантной плазмиды (Стадия 2) осуществляется стандартными способами (Sambrook J., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N, V; эта книга также является источником стандартных методов с использованием рекомбинантной ДНК, применяемых в настоящем изобретении). Трансформированные бактерии выбирают с учетом их устойчивости к действию антибиотиков, например, ампициллина и канамицина. Способ, с помощью которого индуцируется экспрессия клонированных генов нитевидного отростка (Стадия 3), зависит от конкретной природы используемого промотора. Предпочтительным промотором является plac (с Iaciq на векторе для уменьшения фоновой экспрессии), который может регулироваться добавлением изопропилтиогалактозида (IPTG). Второй предпочтительный промотор представляет собой pT7/10, являющийся специфичным по отношению к T7 РНК полимеразе и не распознаваемый E.coli РНК полимеразой. T7 РНК полимераза, которая устойчива к рифамицину, закодирована на дефектном лямбда DE лизогене на ВL21 хромосоме E. coli. T7 полимераза на BL21 (DE3) суперрепрессирована Iaciq геном в плазмиде и индуцируется и регулируется с помощью IPTG.

Обычно культуру трансформированных бактерий инкубируют в присутствии индуктора в течение нескольких часов, осуществляя при этом мониторинг синтеза интересующего белка. В данном случае готовят экстракты бактериальных клеток и белки нитевидного отростка T4 детектируют, например, методом гель-электрофореза в системе додецилсульфат натрия (SDS) - полиакриламид.

После обнаружения модифицированного белка в бактериальных экстрактах необходимо выяснить, образует ли он соответствующие гомодимеры (Стадия 4). Вначале такую стадию осуществляют путем тестирования на предмет распознавания такого белка антисывороткой, специфичной к зрелой димеризованной форме белка.

Антисыворотку, специфичную к хвостовому волокну, готовят в соответствии с известным способом (Edgar R.S. u Lielausis I., Genetics 52:1187, 1965; Ward с сотр. J.Mol.Biol. 54:15, 1970). Вкратце, такой метод состоит в том, что целый T4 фаг используют в качестве иммуногена; необязательно, полученную в результате антисыворотку далее адсорбируют безотростковыми фаговыми частицами, удаляя, таким образом, все антитела за исключением тех, что направлены против белков нитевидного отростка. На последующей стадии различные аликвоты антисыворотки индивидуально адсорбируют экстрактами, в каждом из которых отсутствует конкретный белок нитевидного отростка. Например, если экстракт, содержащий только компоненты нитевидного отростка P34, gp35 и gp36 (произведенные из клетки, инфицированной мутантным T4, у которого отсутствует функциональный gp37 ген) используется для адсорбции, то полученная в результате антисыворотка будет распознавать лишь зрелый P37 и димеризованный P36-P37. Аналогичный подход может использоваться для приготовления индивидуальных антисывороток, распознающих лишь зрелые (т.е. гомодимеризованные) P34 и P36 путем адсорбции экстрактами, содержащими дистальные половинные нити отростка или P34, gp35 и P37, соответственно. Альтернативой может служить индуцирование антитела против половинок очищенного нитевидного отростка, например, P34 и gp35-P36-P37. Затем анти-gp35-P36-P37 могут адсорбироваться P36-P37 с получением анти-gp35, а анти-P36 можно получить адсорбцией с помощью P37 и gp35. Анти-P37, анти-gp35 и анти-P34 также могут быть непосредственно получены с использованием очищенных P37, gp35 и P34 в качестве иммуногенов. Другой подход состоит в выработке специфичных моноклональных антител к различным хвостовым волоконным компонентам нитевидного отростка или их сегментам.

Специфичные антитела на субъячейки или части отростка используются любым из следующих способов для обнаружения соответствующим образом гомодимеризованных белков нитевидного отростка: 1) Бактериальные колонии подвергают скринингу с целью установления тех систем, которые экспрессируют зрелые белки нитевидного отростка путем непосредственного перенесения колоний, или, выборочно, образцов лизированных или нелизированных культур, на нитроцеллюлозные фильтры, осуществлением, если необходимо, лизиса бактериальных клеток на фильтре и инкубации в присутствии специфичных антител. Образование иммунных комплексов затем детектируют с помощью методов, широко используемых в данной области (например, с помощью вторичных антител, конъюгированных с хромогенным энзимом или радиомеченным стафилококковым белком A). Такой способ особенно полезен для отбора большого числа колоний, например, тех, что получают методом EXO - SIZE делеции, в соответствии с описанным выше). 2) Бактериальные клетки, экспрессирующие белок, вначале метаболически метят ³⁵S-метионином, после чего готовят экстракты и проводят инкубацию в присутствии антисыворотки. Затем иммунные комплексы регенерируют путем инкубации с иммобилизованным белком A с последующим центрифугированием, после которого они могут быть разделены методом гель-электрофореза в системе SDS-полиакриламид.

Альтернативный конкурентный анализ на тестирование сохранения внутренне делетированными белками нитевидного отростка, препятствующими тем не менее инфицированию фагом, способности к димеризации и ассоциации с их соответствующими партнерами, включает использование in vitro комплементарной системы. 1) Бактериальный экстракт, содержащий интересующий модифицированный белок, в соответствии с описанным выше, смешивают со вторым экстрактом, приготовленным из клеток, инфицированных T4-фагом, представляющим собой мутант в интересующем гене.

2) Через несколько часов инкубации добавляли третий экстракт, который содержал версию дикого типа, подлежащего тестированию белка, и инкубацию продолжали еще в течение нескольких часов. 3) Наконец, экстракт титровали на инфекционные фаговые частицы путем инфицирования E.coli и количественно определяли число образовавшихся в результате стерильных пятен. Модифицированный белок нитевидного отростка, правильно димеризованный и способный соединяться с его партнерами, включали в нити отростка нефункциональным образом на стадии 1, в результате чего предотвращали включение версии дикого типа такого белка на стадии 2; результатом этой операции было уменьшение титра полученного в результате фагового образца. В отличие от этого, если модифицированный белок не способен димеризоваться и таким образом образовывать надлежащие N - и/или C-концы, то он не будет включаться в фаговые частицы на стадии 1 и вследствие этого не будет конкурировать со сборкой интактных фаговых частиц на стадии 2; таким образом, титр фага должен быть равен титру, наблюдаемому без добавления модифицированного белка на стадии 1 (отрицательный контроль).

Другой путь тестирования сохранения химерами и внутренне делетированными белками нитевидного отростка способности к димеризации и ассоциации с их соответствующими партнерами заключается в проведении эксперимента in vivo. Такой анализ позволяет определять способность таких химер и делетированных белков к конкуренции с частями нормального фага за сборку, таким образом уменьшая размер области дифференцировки фага дикого типа, инфицирующего ту же клетку-хозяина, в которой осуществляется рекомбинантная экспрессия химер или подвергнутых делеции белков. Таким образом, экспрессия из вектора экспрессии, кодирующего химеру или делетированный белок, индуцируется внутри клетки, которую далее инфицируют фагом дикого типа. Ингибирование продуцирования фага дикого типа демонстрирует способность рекомбинантной химеры или белка к ассоциации с соответствующими белками нитевидного отростка тако