Полипептид, обладающий антигенными свойствами вируса гепатита с и его фрагмент (варианты), диагностический реагент (варианты), набор для обнаружения антител (варианты) , способ обнаружения антител (варианты)

Полипептид, обладающий антигенными свойствами вируса гепатита с и его фрагмент (варианты), диагностический реагент (варианты), набор для обнаружения антител (варианты) , способ обнаружения антител (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к материалам и методам сдерживания распространения инфекции вируса гепатита ни А, ни В (вируса гепатита С). Предложены полипептиды, обладающие антигенными свойствами вируса гепатита С и их фрагменты. Предложен диагностический реагент для обнаружения антител против вируса гепатита С, набор для обнаружения антител против вируса гепатита С, включающий диагностический реагент, и способ обнаружения антител против вируса гепатита С. Изобретение позволяет получить надежные диагностические и прогностические средства для определения нуклеиновых кислот, антигенов и антител, связанных с вирусом гепатита С. 17 с. и 13 з.п. ф-лы, 47 ил., 19 табл.

Изобретение относится к материалам и методам сдерживания распространения инфекции вируса гепатита ни A, ни B. Более конкретно оно касается диагностических полипептидов, диагностических реагентов, диагностических наборов и диагностических способов для обнаружения этиологического агента гепатита вируса ни A, ни B, т.е. гепатита вируса C.

Библиографические ссылки в описании к заявке Barr et al. (1986), Biotechniques 4:428.

Botstein (1979), Gene 8:17.

Brinton, M. A. (1986) in the Viruses: The togaviridae and Flaviviridae (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), p. 327-374.

Broach (1981) in: Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. Vol. 1, p.445, Cold Spring Harbor Press.

Broach et al. (1983), Meth. Enz. 101:307.

Chang et аl. (1977), Nature 198:1056.

Chirgwin et аl. (1979), Biochemistry 18:5294.

Chomczynski and Sacchi (1987), Analytical Biochemistry 162:156.

Clewell et al. (1969), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62:1159.

Clewell (1972), J. Bacteriol. 110:667.

Cohen (1972), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110.

Cousens et al. (1987), Gene 61:265.

De Boer et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 292:128.

Dreesman et al. (1985), J. Infect. Disease 151:761.

Feinstone, S.M. and Hoofnagle, J.H. (1984), New Engl. J. Med. 311:185.

Fields & Knipe (1986), Fundamental Virology (Raven Press, N.Y.).

Fiers et al. (1978), Nature 273:113.

Gerety, R. J. et al., in Viral Hepatitis and Liver Disease (Vyas, B.N., Dienstag, J. L. , and Hoofnagle, J.H., eds, Grune and Stratton, Inc., 1984) pp. 23-47.

Goeddel et al. (1980), Nucleic Acids Res. 8:4057.

Graham and Van der Ed (1978), Virology 52:546.

Grunstein and Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3961.

Grych et al. (1985), Nature 316:74.

Gubler and Hoffman (1983), Gene 25:263.

Hammerling et al. (1981), Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas.

Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg 7:149.

Hinnen et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. 75:1929.

Hitzeman et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:2073.

Holland et al. (1978), Biochemistry 17:4900.

Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385.

Houghton et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:247.

Hunyh, T. V. et al. (1985) in DNA Cloning Techniques; A Practical Approach (D. Glover, Ed., IRL Press, Oxford, U.K.) pp. 49-78.

Immun. Rev. (1982) 62:185.

Iwarson (1987), British Medical J. 295:946.

Kennett et al. (1980) Monoclonal Antibodies.

Laemmli (1970), Nature 227, 680.

Lee et al. (1988), Science 239:1288.

Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London).

Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology 65:499.

MacNamara et al. (1984), Science 226:1325.

Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:309.

Messing (1983), Methods in Enzymology 101:20-37.

Methods in Enzymology (Academic Press).

Michelle et al. Int. Symposium on Viral Hepaatitis. Monath (1986) in The Viruses: The Togaviradae and Flaviviridae (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), p.375-440.

Nagahuma et al. (1984), Anal. Biochem. 141:74.

Neurath et al. (1984), Science 224:392.

Nisonoff et al. (1981), Clin. Immunol. Immunopathol. 21:397-406.

Overby, L.R. (1985), Curr. Hepatol. 5:49.

Overby, L.R. (1986), Curr. Hepatol. 6:65.

Overby, L.R. (1987), Curr. Hepatol. 7:35.

Peleg (1969), Nature 221:193.

Pfefferkorn and Shapiro (1974), in Comprehensive Virology, Vol. 2 (Fraenkel-Conrat & Wagner, eds. Plenum, N.Y.) pp. 171-230.

Prince, A.M. (1983), Annu. Rev. Microbiol. 37:217.

Rice et al. (1986) in The Viruses: The Togaviridae and Flaviviridae (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), p. 279-328.

Roehrig (1986) in The Viruses: The Togaviridae and Flaviviridae (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press).

Sadler et al. (1980), Gene 8:279.

Saiki et al. (1986), Nature 324:163.

Sanger et al. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463.

Schlesinger et al. (1986), J. Virol. 60:1153.

Schreier, M., et аl. (1980) Hybridoma Techniques.

Scopes (1984), Protein Purification, Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.).

Shimatake et аl. (1981), Nature 292:128.

Steimer et аl. (1986), J. Virol. 58:9.

Stollar (1980), in The Togaviruses (R. W. Schlesinger, ed. Academic Press, N.Y.), pp. 584-622.

Taylor et аl. (1976), Biochem. Biophys. Acta 442:324.

Towbin et аl. (1979), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350.

Tsu and Herzenberg (1980) in Selected Methods in Cellular Immunology (W. H. Freeman and Co.) pp. 373-391.

Vytdehaag et аl. (1985), J. Immunol. 134:1225.

Valenzuela, P. et al. (1982), Nature 298:344.

Valenzuela, P. et аl. (1984), in Hepatitis В (Millman, I. et аl., ed. Plenum Press) pp. 225-236.

Warner (1984), DNA 3:401.

Wu and Grossman (1987), Methods in Enzymology Vol. 154, Pecombinant DNA, Part E.

Wu (1987), Methods in Enzymology, Vol 155, Pecombinant DNA, Part F.

Zoller (1982), Nucleic Acids Res. 10:6487.

Ссылки на патенты Патенты США NN 4341761, 4399121, 4427783, 4444887, 4466917, 4472500, 4491632 и 4493890.

Предпосылки для создания изобретения Гепатит ни A, ни B является передающейся болезнью из семейства заболеваний, индуцированных, по-видимому, вирусом, и которые отличаются от других форм, обусловленных вирусом болезней печени, включая и те заболевания, которые вызваны известными вирусами гепатита, т.е. вирусом гепатита A, вирусом гепатита B и вирусом дельта-гепатита, а также от гепатитов, вызванных цитомегаловирусом или вирусом Эсстеина-Барра. Гепатит ни A, ни B был впервые идентифицирован у посттрансфузионных больных. Передача от человека шимпанзе и серия перепрививок у шимпанзе свидетельствуют о том, что гепатит ни A, ни B обусловлен переносимым инфекционным агентом или агентами. Однако переносимый возбудитель, ответственный за гепатит ни A, ни B, до настоящего времени не идентифицирован, и ряд агентов, которые являются причиной болезни, неизвестны.

Эпидемиологические данные наводят на мысль, что могут быть три типа гепатита ни A, ни B: эпидемический тип, связанный с водой; эпидемический тип, переносимый с кровью или иглой; и спорадически появляющийся (коммунально приобретенный) тип гепатита. Однако ряд возбудителей, которые могут вызывать гепатит ни A, ни B, неизвестен.

Клинический диагноз и идентификация гепатита ни A, ни B прежде всего осуществлялись путем исключения других вирусных маркеров. Среди методов, используемых для определения предполагаемых антигенов и антител гепатита ни A, ни B, агар-гелевая диффузия, радиоиммуноэлектрофорез, иммунофлюоресцентная микроскопия, иммуноэлектронная микроскопия, радиоиммунологические тесты, ферментосвязанный иммуносорбционный тест. Однако ни один из этих методов анализа не показал достаточной чувствительности, специфичности и воспроизводимости, чтобы быть использованным в качестве диагностического теста на гепатит ни A, ни B.

До настоящего времени не существует ни ясности, ни согласия относительно идентичности и специфичности систем антиген - антитело, связанных с возбудителями гепатита ни A, ни B. Это обусловлено, по меньшей мере частично, первичной или сопутствующей инфекцией вируса гепатита В с вирусом гепатита ни A, ни B у больных и известной сложностью растворимых и в виде частиц антигенов, связанных с вирусом гепатита B, а также интеграцией ДНК вируса гепатита В в геном клеток печени. В дополнение не исключена возможность, что гепатит ни A, ни B вызывается не одним инфекционным агентом, а также возможность того, что гепатит ни A, ни B диагностирован ошибочно. Кроме того неясно, что определяют серологические анализы в сыворотке больных гепатитом ни A, ни B. Было принято без доказательства, что агар-гелевая диффузия и радиоиммуноэлектрофоретические анализы определяют аутоиммунные реакции или взаимодействия неспецифических белков, которые иногда происходят между пробами сыворотки, и что они не представляют собой специфических реакций антиген - антитело. Иммунофлюоресценция, ферментосвязанный иммуносорбент и радиоиммунологический анализы, по-видимому, определяют низкие уровни материала, аналогичного ревматоидному фактору, который часто присутствует в сыворотке больных гепатитом ни A, ни B, а равно как и у больных с другими заболеваниями печени и болезнями, не связанными с печенью. Некоторую иммунологическую реактивность, определенную анализами, может представлять антитело к определенным хозяином цитоплазменным антигенам.

Имеется несколько кандидатов на вирус гепатита ни A, ни B. Смотрите, например, обзоры Prince (1983), Feinstone и Hoofnagle (1984) и Overby (1985, 1986 и 1987 гг.) и статью Iwarson (1987). Но нет доказательств, что какой-либо из этих кандидатов представляет собой этиологический агент гепатита ни A, ни B.

Потребность в чувствительных, специфических методах выявления и идентификации носителей вируса гепатита ни A, ни B и зараженной вирусом ни A, ни B крови и продуктов крови весьма значительная. Посттрансфузионные гепатиты появляются примерно в 10% случаев больных с переливанием крови и до 90% из этих случаев насчитывается больных гепатитом ни A, ни B. Основной проблемой при этом заболевании является частое развитие хронического поражения печени (25-55%).

Лечение больного, а также профилактика передачи гепатита ни A, ни B с кровью или продуктами крови или при тесном контакте с больными требуют надежных диагностических и прогностических средств для определения нуклеиновых кислот, антигенов и антител, связанных с вирусом гепатита ни A, ни B. В дополнение имеется необходимость также в эффективных вакцинах и иммунотерапевтических лечебных средствах для профилактики и/или лечения этой болезни.

Сущность изобретения Изобретение касается выделения и определения характеристик недавно открытого этиологического агента гепатита ни A, ни B, вируса гепатита C. Более конкретно изобретение касается семейства реплик кольцевой ДНК частей генома гепатита вируса C. Эти реплики кольцевой ДНК были выделены методом, который включает новую операцию отсеивания продуктов экспрессии их пулов кольцевой ДНК, созданных из частиц возбудителя (агента) в инфицированной ткани с сыворотками больных гепатитом ни A, ни B, для определения вновь синтезированных антигенов, производных от генома до этого выделенного и неохарактеризованного вирусного агента, и селекцию клонов, которые вырабатывают продукты, иммунологически взаимодействующие только с сыворотками инфицированных индивидов в сравнении с неинфицированными лицами.

Исследования природы генома вируса гепатита C, используя пробы, полученные из кольцевой ДНК вируса гепатита C, а также последовательность информации, содержащейся в кольцевой ДНК вируса гепатита C, говорят о том, что вирус гепатита C является флавивирусом или флавиподобным вирусом.

Части последовательности оснований кольцевой ДНК, производные от вируса гепатита C, полезны как пробы для определения присутствия вируса в образцах и для выделения встречающихся в природе вариантов вируса. Эти фрагменты кольцевой ДНК позволяют также оценить полипептидные последовательности антигенов вируса гепатита C, закодированные в геноме (геномах) вируса гепатита C, и позволяют продуцирование полипептидов, которые полезны в качестве стандартов реагентов в диагностических тестах и/или в качестве компонентов вакцин. Антитела, как поликлональные, так и моноклональные, направленные против эпитопов вируса гепатита C, содержащихся в этих полипептидных последовательностях, также полезны для диагностических тестов, в качестве терапевтических средств, для отсеивания противовирусных агентов и для изоляции (выделения) возбудителя вируса ни A, ни B, от которого получены эти фрагменты кольцевой ДНК. В дополнение при использовании проб, полученных от этих частей кольцевой ДНК, возможно выделить и оценить последовательность других частей генома вируса гепатита C, получая таким образом дополнительные пробы и полипептиды, полезные для диагностики и/или лечения, как в профилактическом, так и в лечебном воздействии на гепатит ни A, ни B.

Аспектами изобретения являются: очищенный вирус гепатита C; приготовление полипептидов из очищенного вируса гепатита C; очищенный полипептид вируса гепатита C; очищенный полипептид, содержащий эпитоп, иммунологически идентифицируемый эпитопом, содержащимся в вирусе гепатита C.

Включенными аспектами изобретения являются: рекомбинантный полипептид вируса гепатита C; рекомбинантный полипептид, содержащий последовательность, полученную от генома вируса гепатита C или от кольцевой ДНК вируса гепатита C; рекомбинантный полипептид, содержащий эпитоп вируса гепатита C и конденсированный полипептид, полипептид слияния, содержащий полипептид вируса гепатита C.

Аспекты изобретения, касающиеся комплектов диагностических средств, следующие: образцы для анализа на присутствие полинуклеотидов, производных от вируса гепатита C, включающие пробу, содержащую последовательность нуклеотидов вируса гепатита C примерно 8 или более нуклеотидов, в подходящей упаковке; образцы для анализа на присутствие антигена вируса гепатита C, содержащие антитело, направленное против антигена вируса C, подлежащего определению, в подходящей упаковке; образцы для анализа на присутствие антител, направленных против антигена вируса гепатита C, включающие полипептид, содержащий эпитоп вируса гепатита C, присутствующий в антигене вируса гепатита C, в соответствующей упаковке.

Другими аспектами изобретения являются: полипептид, содержащий этипоп вируса гепатита C, фиксированный на твердом субстрате, и антитело к эпитопу вируса гепатита C, фиксированное на твердом субстрате.

Следующими аспектами изобретения являются: метод получения полипептида, содержащего эпитоп вируса гепатита C, включающий инкубирование клеток хозяина, трансформированных экспрессионным вектором, содержащим последовательность кодирования полипептида, содержащего эпитоп вируса гепатита C в условиях, допускающих экспрессию упомянутого полипептида, и полипептид, содержащий эпитоп, полученный этим метолом.

Изобретение включает также способ определения нуклеиновых кислот в образце, содержащем реагирующие нуклеиновые кислоты образца с пробой на полинуклеотид вируса гепатита C в условиях, позволяющих образование полипептидного дуплекса между пробой и нуклеиновой кислотой вируса гепатита C образца, и определение полинуклеотидного дуплекса, который содержит проба.

Иммунологические исследования также включены в объем изобретения. Они включают иммунологический анализ для определения антигена вируса гепатита C, включающий инкубирование образца, подознительного на содержание антигена вируса гепатита C, с антителом пробы, направленным против антигена вируса гепатита C, подлежащего определению в условиях, позволяющих образование комплекса антиген - антитело; и определение комплекса антиген - антитело, содержащего антитело пробы. Иммунологический анализ для определения антител, направленных против антигена вируса гепатита C, включающий инкубирование образца, подозрительного на содержание антител антивируса гепатита C, с полипептидом пробы, которая содержит эпитоп вируса гепатита C, в условиях, допускающих образование системы антитело - антиген, и определение системы антитело - антиген, содержащей антиген пробы.

В объем изобретения включены также вакцины для лечения инфекции вируса гепатита C, включающие иммуногенный пептид, содержащий эпитоп вируса гепатита C, или инактивированный препарат вируса гепатита C, или аттенуированный препарат вируса гепатита C.

Другим аспектом изобретения является культура ткани растущих клеток, инфицированных вирусом гепатита C.

Еще иным аспектом изобретения является способ получения антител к вирусу гепатита C, включающий введение больному выделенный иммуногенный полипептид, содержащий эпитоп вируса гепатита C в количестве, достаточном для продуцирования иммунной реакции.

И еще одним аспектом изобретения является способ выделения кольцевой ДНК, полученной из генома неидентифицированного инфекционного агента, включающий: (a) получение клеток хозяина, трансформированных векторами экспрессии, содержащимися в пуле кольцевой ДНК, приготовленном из нуклеиновых кислот, выделенных из ткани, инфицированной агентом, и выращивание клеток хозяина в условиях, допускающих экспрессию полипептида(ов), закодированных в кольцевой ДНК; (b) взаимодействие продуктов экспрессии кольцевой ДНК с содержащим антитело компонентом тела больного, инфицированного упомянутым инфекционным возбудителем в условиях, позволяющих иммунную реакцию, и определение комплексов антитело - антиген, образованных в результате взаимодействия; (c) выращивание клеток хозяина, осуществляющих экспрессию полипептидов, которые образуют комплексы антитело - антиген на операции (b) в условиях, допускающих их выращивание как индивидуальных клонов, и выделение упомянутых клонов; (d) выращивание клеток из клонов, полученных на операции (с) в условиях, допускающих экспрессию полипептида(ов), закодированных в кольцевой ДНК, и взаимодействие продуктов экспрессии с содержащими антитело компонентами тела индивидов, отличных от больного на операции (а), которые инфицированы инфекционным агентом, и с контрольными лицами, не инфицированными агентом, и определение комплексов антитело - антиген, образованных в результате взаимодействия; (e) выращивание клеток хозяина, которые осуществляют экспрессию полипептидов, которые образуют комплексы антитело - антиген с содержащими антитело компонентами тела инфицированных индивидов и лиц, подозрительных на инфекцию, но не с компонентами лиц в контрольной группе, в условиях, допускающих как развитие отдельных клонов, так и выделение упомянутых клонов; и (f) выделение кольцевой ДНК из клонов клеток хозяина, полученных на операции (e).

На фиг. 1 показана двунитчатая последовательность нуклеотидов кольцевой ДНК вируса гепатита C, вставленная в клон 5-1-1, и предполагаемая последовательность аминокислот полипептида, закодированного в ней.

На фиг. 2 представлены гомологи перекрытия последовательностей кольцевой ДНК вируса гепатита C в клонах 5-1-1, 81, 1-2 и 91.

На фиг. 3 показана сложная последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C, полученная от перекрытия клонов 81, 1-2 и 91, и последовательность аминокислот, закодированная в ней.

На фиг. 4 показана последовательность двунитчатых нуклеотидов кольцевой ДНК вируса гепатита C, вставленной в клон 81, и предполагаемая последовательность аминокислот, закодированная в ней.

На фиг. 5 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 36, сегмент которой перекрывает кольцевую ДНК вируса гепатита ни A, ни B в клоне 81, и последовательность полипептидов, закодированная в клоне 36.

На фиг. 6 представлена объединенная открыто читаемая структура кольцевой ДНК вируса гепатита C в клонах 36 и 81 и полипептиды, закодированные в ней.

На фиг. 7 показана последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 32, сегмент которой перекрывает клон 81, и закодированный в ней полипептид.

На фиг. 8 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 35, сегмент которой перекрывает клон 36, и закодированный в ней полипептид.

На фиг. 9 представлена объединенная открыто читаемая структура кольцевой ДНК вируса гепатита C в клонах 35, 36, 81 и 32 и закодированный в ней полипептид.

На фиг. 10 показана последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 37b, сегмент которой перекрывает клон 35, и закодированный в ней полипептид.

На фиг. 11 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 33b, сегмент которой перекрывает клон 32, и закодированный в ней полипептид.

На фиг. 12 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 40b, сегмент которой перекрывает клон 37b, и закодированный в ней полипептид.

На фиг. 13 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 25c, сегмент которой перекрывает клон 33b, и закодированный в ней полипептид.

На фиг. 14 представлена последовательность нуклеотидов и закодированный в ней полипептид открыто читаемой структуры, которая простирается через кольцевую ДНК вируса гепатита C в клонах 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b и 25c.

На фиг. 15 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клонах 40b и 33c, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 16 представлена последовательность оснований (кольцевой) ДНК вируса гепатита C в клоне 8h, сегмент которой перекрывает клон 33c, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 17 представлена последовательность оснований в кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 7е, сегмент которой перекрывает клон 8h, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 18 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 14c, сегмент которой перекрывает клон 25c, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 19 представлена последовательность оснований в кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 8f, сегмент которой перекрывает клон 14c, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 20 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 33f, сегмент которой перекрывает клон 8f, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 21 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 33g, сегмент которой перекрывает клон 33f, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 22 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 7f, сегмент которой перекрывает последовательность оснований в клоне 7e, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 23 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 11b, сегмент которой перекрывает последовательность оснований в клоне 7f, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 24 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 14i, сегмент которой перекрывает последовательность оснований в клоне 11b, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 25 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 39c, сегмент которой перекрывает последовательность оснований в клоне 33g, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 26 представлена сложная последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C, полученная от объединения кольцевых ДНК в клонах 14i, 11b, 7f, 7e, 8h, 33с, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, 14c, 8f, 33f и 33g, а также представлена последовательность аминокислот полипептида, закодированная в протяженной открыто читаемой структуре в полученной последовательности оснований.

На фиг. 27 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 12f, сегмент которой перекрывает клон 14i, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 28 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 35f, сегмент которой перекрывает клон 39c, и закодированная в ней последовательность аминокислот.

На фиг. 29 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне 19g, сегмент которой перекрывает клон 35f, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 30 представлена последовательность оснований в клоне 26g, сегмент которой перекрывает клон 19g, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 31 представлена последовательность оснований в клоне 15e, сегмент которой перекрывает клон 26g, и закодированные в ней аминокислоты.

На фиг. 32 представлена последовательность оснований в сложной кольцевой ДНК, которая получена объединением клонов с 12f до 15e в направлении 5' к 3'; представлены также аминокислоты, закодированные на непрерывной открыто читаемой структуре.

На фиг. 33 представлена фотография западных пятен, полученная на конденсированном белке, пероксиддисмутазе - ни A, ни B_5-1-1 с сывороткой шимпанзе, инфицированной вирусами гепатита ни A, ни B, A и B.

На фиг. 34 представлена фотография западных пятен, полученная на конденсированном белке, пероксиддисмутазе - ни A, ни B_5-1-1 с сывороткой человека, инфицированного вирусом гепатита ни A, ни B, вирусом гепатита A, вирусом гепатита B и от контрольной группы лиц.

На фиг. 35 представлена диаграмма существенных признаков вектора рAB24.

На фиг. 36 представлена предполагаемая последовательность аминокислот карбоксиокончания конденсированного полипептида C100-3 и закодированная в ней последовательность нуклеотидов.

На фиг. 37A представлена фотография окрашенного синим красителем полиакриламидного геля, который идентифицирует полипептид C100-3, экспрессированный в дрожжах.

На фиг. 37B представлено западное пятно полипептида C100-3 с сывороткой инфицированного вирусом ни A, ни B человека.

На фиг. 38 представлена ауторадиография северного пятна РНК, выделенной из печени инфицированной вирусом BB-ни A, ни B шимпанзе, исследованной вирусом BB-ни A, ни B кольцевой ДНК клона 81.

На фиг. 39 представлена ауторадиография нуклеиновой кислоты вируса ни A, ни B, обработанной рибонуклеазой A или дезоксирибонуклеазой I и исследованной кольцевой ДНК вируса BB-ни A, ни B клона 81.

На фиг. 40 представлена ауторадиография нуклеиновых кислот, экстрагированных из частиц вируса ни A, ни B, отловленных в инфицированной анти-ни A, ни B_5-1-1 плазме, и исследованных меченной фосфором-32 кольцевой ДНК вируса ни A, ни B из клона 81.

На фиг. 41 представлена ауторадиограмма фильтров, содержащих выделенные аминокислоты вируса ни A, ни B, исследованные меченными фосфором-32 и плюс окрашенными пробами для ДНК, полученными из кольцевой ДНК вируса ни A, ни B в клоне 81.

На фиг. 42 представлены гомологи между полипептидом, закодированным в кольцевой ДНК вируса гепатита C и NS-белком флавивируса Денгье.

На фиг. 43 представлена гистограмма распределения инфекции вируса гепатита C в выбранных наугад образцах, как определено иммуноферментным твердофазным анализом.

На фиг. 44 представлена гистограмма распределения инфекции вируса гепатита C в случайных образцах, полученная с использованием двух конфигураций сопряжения иммуноглобулин - фермент в иммуноферментном твердофазном анализе.

На фиг. 45 представлены последовательности в первичной смеси, полученной из сохраненной последовательности в NS1 флавивирусов.

На фиг. 46 представлена последовательность оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C в клоне k9-l, сегмент которой перекрывает кольцевую ДНК на фиг. 26, и закодированные на ней аминокислоты.

На фиг. 47 представлена последовательность оснований сложной кольцевой ДНК, полученной при соединении клонов k9-1 до 15e в направлении 5' к 3'; представлены также аминокислоты, закодированные в открыто читаемой протяженной структуре.

Способы осуществления изобретения I. Определения Термин "вируса гепатита C" предназначался разработчиками в данной области для дотоле неизвестного этиологического агента ни A, ни B. Следовательно, употребленный в описании "вируса гепатита C" касается возбудителя гепатита ни A, ни B, который ранее относился к вирусу ни A, ни B и/или BB-ни A, ни B. Термины "вируса гепатита C, вирус гепатита ни A, ни B и вирус гепатита BB-ни A, ни B" используются здесь как равнозначные. Как расширение этой терминологии болезнь называлась вирус гепатита C, прежде названная гепатит ни A, ни B, гепатит C. Термины гепатит ни A, ни B и гепатит C могут быть использованы здесь как равнозначные.

Термин "вируса гепатита C", используемый в описании, означает виды вирусов, вызывающих гепатит ни A, ни B, и ослабленные штаммы и дефектные вирусные частицы, производные от этих штаммов. Как показано будет ниже, геном вируса гепатита C состоит из РНК. Известно, что РНК-содержащие вирусы имеют относительно высокие уровни спонтанной мутации, т.е. по опубликованным данным порядка 10^-3-10^-4 на нуклеотид (Fields и Knipe, 1986). Поэтому имеют место множественные штаммы внутри вида вируса гепатита C, определенные ниже. Составы и методы, описанные здесь, делают возможным репродукцию, идентификацию, детектирование и выделение различных родственных вирусов. Более того, они позволяют также обеспечить получение диагностических средств и вакцин для различных штаммов и полезны в процессе отбора противовирусных агентов для фармакологического использования, так как они ингибируют репликацию вируса гепатита C.

Приведенная здесь информация, хотя и получена на одном штамме вируса гепатита C, вызываемого далее CDC/HCV1, является достаточной для того, чтобы вирусный таксономист идентифицировал другие штаммы, которые принадлежат этому виду вирусов. Как описывалось уже, мы открыли, что вирус гепатита C относится к флавивирусу или флавиподобному вирусу. Морфология и состав частиц флавивируса известны и описаны Brinton (1986). Вообще, принимая во внимание морфологии, флавивирусы содержат центральный нуклеокапсид, окруженный липидным двуслоем. Вирионы сферической формы и имеют диаметр около 40-50 нм. Их ядра имеют диаметр около 25-30 нм. Вдоль наружной поверхности оболочки вириона имеются выросты длиной примерно 5-10 нм с концевыми выпуклостями диаметром около 2 нм.

Вирус гепатита C кодирует эпитоп, который иммунологически тождественен эпитопу в геноме вируса гепатита C, от которого происходят кольцевые ДНК, записанные в нем. Эпитоп является единственным в своем роде к вирусу гепатита C, если сравнить с другими известными флавивирусами. Уникальность эпитопа может быть определена его иммунологической реактивностью с вирусом гепатита C и отсутствием иммунологической реактивности с другими видами флавивирусов. Способы определения иммунологической реактивности известны в данной области, например радиоиммунологическим анализом, иммуноферментным твердофазным анализом, гемагглютинацией, и несколько примеров подходящих методов анализа даны в описании.

В дополнение к описанному выше применимы следующие параметры, либо в отдельности, либо в сочетании при идентификации штамма как вируса гепатита C. Поскольку штаммы вируса гепатита C эволюционно родственны, то следует ожидать, что полная гомология геномов на нуклеотидном уровне будет около 40% или более, предпочтительно около 60% или более и еще более предпочтительно около 80% или более; и в дополнение, что будут иметь место соответствующие близкие последовательности по меньшей мере около 13 нуклеотидов. Соответствие между геномной последовательностью предполагаемого вируса гепатита C и последовательностью оснований кольцевой ДНК вируса гепатита C CDC/CHl может быть определена методами, известными в данной области. Например, они могут быть определены непосредственным сравнением последовательной информации полинуклеотида от предполагаемого вируса гепатита C и последовательности(ей) кольцевой ДНК вируса гепатита C, записанной в нем. Например, они могут быть, таким образом, определены гибридизацией полинуклеотидов в условиях, в которых образуются стабильные дуплексы между гомологическими участками, например те, которые должны быть использованы до ферментации с последующей ферментацией однотяжевой специфической нуклеазой(ами), сопровождаемой определением размеров ферментационных фрагментов.

По причине эволюционного родства штаммов вируса гепатита C предполагаемые штаммы вируса гепатита C тождественны по своей гомологии на полипептидном уровне. Вообще штаммы вируса гепатита C более чем на 40% являются гомологическими, предпочтительно более чем на 60% гомологи и даже еще более предпочтительно более чем на 80% гомологи на полипептидном уровне. Методы определения гомологии последовательности аминокислот известны в данной области. Например, последовательность аминокислот может быть определена непосредственно и сравнена с последовательностями, предусмотренными при этом заранее. Например, также нуклеотидная последовательность геномного материала предполагаемого вируса гепатита C может быть определена (обычно через промежуточную кольцевую ДНК): закодированная в ней последовательность аминокислот может быть определена и соответствующие участки сравнены.

Как использовано в описании, полинуклеотид, "производный от" (полученный из) указанной последовательности, например кольцевой ДНК вируса гепатита C, в особенности из тех, которые приведены в примерах на фиг. 1-32, или от генома вируса гепатита C, относится к полинуклеотидной последовательности, которая содержит примерно последовательность по меньшей мере 6 нуклеотидов, является предпочтительно по меньшей мере последовательностью около 8 нуклеотидов и более предпочтительно по меньшей мере 10-12 нуклеотидов и еще более предпочтительно по меньшей мере 15-20 нуклеотидов соответственно, т.е. гомологично или комплементарно к участку указанной последовательности нуклеотидов. Предпочтительно, чтобы последовательность участка, из которого происходит полинуклеотид, являлась гомологичной или комплементарной последовательности, которая уникальна для генома вируса гепатита C. Будет или нет эта последовательность уникальна к геному вируса гепатита C, можно определить методами, известными специалистам в данной области. Например, последовательность можно сравнить с последовательностями в банке данных, т.е. в банке генов, чтобы определить, присутствует ли она у неинфицированного хозяина или в других организмах. Последовательность можно также сравнить с известными последовательностями других вирусных агентов, включая тех, которые известны как возбудители гепатита, т.е. вируса гепатита A, вируса гепатита B и вируса гепатита D, и с другими членами семейства флавивирусов. Соответствие или несоответствие взятой последовательности другим последовательностям может быть также определено гибридизацией в соответствующих строгих условиях. Методы определения комплементарности последовательностей нуклеиновых кислот посредством гибридизации известны в данной области и обсуждаются ниже. См. также, например, Maniatis и др. (1982). В дополнение несоответствия двойных полинуклеотидов, образованных при гибридизации, можно определить известными методами, включающими, например, ферментацию нуклеазой, такой как S1, которая специфически сбраживает однотяжевые участки в двойных полинуклеотидах. Области, из которых может быть "произведена" типичная последовательность ДНК, включают, но этим не ограничиваясь, например, области, кодируемые специфическими эпитопами, а также нетранскрибированные и/или нетранслированные области.

Производный нуклеотид не обязательно является физически произведенным от показанной последовательности нуклеотидов, а может быть получен любым образом, включающим, например, химический синтез или репликацию ДНК или обратную транскрипцию или транскрипцию, которая основана на информации, даваемой последовательностью оснований в участке (в участках), от которых происходит полинуклеотид. В дополнение сочетания участков, соответствующих таковым известной последовательности, могут быть модифицированы путями, известными в данной области, соответствующими намечаемому использованию.

Аналогично последовательность полипептида или аминокислот, "производных" от соответствующей последовательности нуклеиновых кислот, например последовательности, представленные на фиг. 1-32, или от генома вируса гепатита C, относится к полипептиду, имеющему последовательность аминокислот, идентичную последовательности полипептида, закодированного в последовательности или в ее части, при этом часть содержит по меньшей мере 3-5 аминокислот, и более предпочтительно по меньшей мере 8-10 аминокислот, и еще более предпочтительно по меньшей мере 11-15 аминокислот, или который иммунологически тождественен полипептиду, закодированному в последовательности.

Рекомбинантный или производный полипептид не обязательно является транслированным от известной последовательности нуклеиновых кислот, например последовательностей, представленных на фиг. 1-26, или от генома вируса гепатита C: он может быть получен и иным образом, например химическим синтезом, или экспрессией рекомбинантной экспрессионной системы, или выделением из мутированного вируса гепатита C.

Термин "рекомбинантный полинуклеотид", использованный в описании, имеет в виду полинуклеотид геномного, полусинтетического, синтетического происхождения или происходящий от кольцевой ДНК, и благодаря своему происхождению и обработке: (1) не связан со всем или с частью полинуклеотида, с которым он связан в природе или в форме банка данных; и/или (2) присоединен к полинуклеотиду иначе, чем полинуклеотид, с которым он связан в природе.

Термин "полинуклеотид", использованный в описании, относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины как рибонуклеотидам, так и к дезоксирибонуклеотидам. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Таким образом, этот термин включает двунитчатую и однонитчатую ДНК, а также двунитчатую и однонитчатую РНК. Он также включает модифицированные, например метилированием и/или покрытием, и немодифицированные формы полинуклеотида.

Использованный в описании термин "вируса гепатита C, содержащий последовательность, соответствующую кольцевой ДНК", означает, что вирус гепатита C содержит полинуклеотидную последовательность, которая гомологична или комплементарна последова