Борьба с нематодами с помощью ингибиторов протеиназ

Борьба с нематодами с помощью ингибиторов протеиназ

Реферат

 

Изобретение относится к борьбе с насекомыми-вредителями, в частности с нематодами. Для снижения способности к размножению растительных паразитических нематод используют растение, в котором экспрессируется белок ингибитора трипсина коровьего гороха (СрTi) или белок ингибитора протеиназы цистеина, полученные из кукурузы или риса. Из белков ингибиторов может быть использован изоингибитор fIV или оризацистатин I или II. Способ может быть использован для защиты таких культур, как соя, сахарная свекла, картофель, зерновые культуры, табак, хлопок, масличный рапс и другие против нематод Heterodera glycines, Heterodera shachtii, Meloidоgyne javanica. 2 с. и 8 з. п. ф-лы, 8 ил., 8 табл.

Изобретение относится к борьбе с насекомыми-вредителями. В частности, изобретение относится к защите растений от нематод-паразитов.

Большинство растительных нематод-паразитов имеет длину менее 2 мм и развиваются из яиц, проходя три или четыре ювенильные стадии стадии (J1-J3 или J4) прежде чем достигнуть имагинальной стадии; при этом, продолжительность жизненного цикла нематод составляет от нескольких недель до нескольких месяцев. В природе существуют эктопаразиты и эндопаразиты, причем, большинство видов поражает корни растения. За очень небольшими исключениями, нематоды, для проникновения через клеточные стенки растения, используют полный стилет, с помощью которого они отсасывают содержимое клетки. Миграция нематод в растения происходит путем проникновения вовнутрь клетки через перфорированные клеточные стенки, либо путем продвижения между клетками. Некоторые эндопаразиты проникают в растения на небольшие расстояния до стадии питания, тогда как другие продвигаются постепенно вглубь растения, либо оседают на месте в расчете на последующий рост растения-хозяина, обеспечивая тем самым свое распространение внутри растения.

Некоторые виды нематод, включая такие экономические важные виды, как корневая и яванская галловая нематоды, вызывают значительные изменения в клетках растений, способствуя тем самым поддержанию сердиментарных (т.е. прикрепленных) самок. Эти особи растут примерно в течение нескольких недель, достигая высокой степени плодовитости (1000x).

Галловые нематоды (в основном, Heterodera и Globodera spp) являются главными вредителями многих сельскохозяйственных культур. Heterodera glycines являются главным патогеном сои культурной, возделываемой в США с экономическим эффектом, достигающим примерно US $ 500-1000 М в год. Heterodera shachti (свекловичная нематода) является главным врагом фермеров, возделывающих сахарную свеклу в европейских странах и в некоторых регионах США, а Heterodera avenae (злаковая нематода) поражает почти все ценные зерновые культуры, произрастающие по большей части на почвах аридной зоны, например, в некоторых регионах Австралии. Картофельные нематоды Globodera rostochiensis и G. pallida распространены на многих площадях, отведенных под возделывание картофеля. Причиняемые этими вредителями убытки сельскому хозяйству Великобритании как непосредственным разрушающим воздействием, так и опосредованным влиянием на урожай составляет Z 10 - 50 М в год.

Яванская галловая нематода (Meloidagyne spp) обитает в тропических и субтропических почвах, но имеется несколько видов патогенов, принадлежащих к этому классу нематод, которые распространены во всем мире. Таких видов достаточно много, однако, за ущерб, наносимый культурным растениям, ответственны лишь пять видов нематод; причем убыток, наносимый сельскому хозяйству паразитом вида M.incognita, составляет примерно 66% от всех экономических потерь, вызываемых этими патогенами. Для широкого ряда культурных растений в главных географических регионах тропиков, общие потери в урожаях культурных растений составляют 11 - 25%.

В настоящее время для борьбы с вредителями используются сельскохозяйственные меры борьбы с вредителями, химическая борьба, а также борьба с вредителями путем замены поражаемых растений резистентными, причем часто эти меры используются в сочетании друг с другом. Однако, проблема разработки усовершенствованного способа борьбы с нематодами в настоящее время особенно актуальна, поскольку большинство имеющихся нематоцидов, в основном, приемлемы для широкого использования.

Например, карбамат (алдикарб) и продукты его распада являются высоко токсичными для млекопитающих, загрязняют грунтовые воды в США, и вероятно, в других регионах, где широко используется этот пестицид. Сельскохозяйственные меры борьбы с вредителями несут в себе скрытые потери, что неприемлемо для фермеров, специализирующихся на выращивании определенных культур, либо высокорентабельных культур. Резистентные сорта также являются не всегда приемлемыми, и часто наиболее восприимчивые к поражениям патогенами сорта превосходят по своей урожайности резистентные сорта, а поэтому использование резистентных сортов опять же несет в себе скрытые потери, даже если растения не поражаются нематодами. Неадекватность вышеуказанных способов борьбы с вредителями вынуждает исследователей продолжать поиск более эффективных средств борьбы с нематодами.

Галловые нематоды с обычной плотностью заселения вызывают замедление роста растений с корневой системой, занимающей небольшой объем почвы, делая их чахлыми и низкорослыми. Пораженные растения обнаруживают симптомы минеральной недостаточности в листьях и легко увядают. Потери в урожаях зависят от тяжести поражения, т.е. степени превышения его пределов толерантности, и могут составлять для некоторых видов свыше 50%.

Галловая яванская нематода, помимо основных симптомов, описанных для галловых нематод, вызывает часто значительное галлообразование, сопровождающееся увеличением восприимчивости растения к вторичным патогенам.

Некоторые нематоды являются переносчиками небольшого ряда растительных вирусов (например, вирусы NEPO, переносимые Xiphinema, Longidorus, и некоторые вирусы TOAPA, переносимые Trichodorus). Например, Xiphinema spp переносит вирус GFLV на виноград. Кроме того, нематоды вместе с грибками переносятся определенными насекомыми-переносчиками и вызывают некоторые серьезные болезни растений, такие, как вертициллез сосны и нематодоз кокосовой пальмы. В некоторых районах Австралии нематода переносит Corynebаcterium на семенную шапку плевела, в результате чего он становится в высокой степени токсичным для пасущихся овец. Такая связь с бактериями и грибками, в частности, с Fusarium spp. сообщает Meloidogyne spp особый экономический статус. Благоприятное клубнеобразование бобовых культур Rhizobium spp может также подавляться соевой и гороховой нематодами.

Совершенно очевидно, что получение культурных растений, резистентных к нематодам, является важной задачей для исследователей. В отношении нематод, резистентность определяется успехом или неудачей в репродуцировании на данном виде растений-хозяев. За доминантный, полудоминантный и рецессивный механизм исследования ответственны от 1 до 3 растительных гена. Гипотеза "ген для гена" применима для некоторых случаев, когда типично доминантному R-гену резистентности противодействует рецессивный V-ген вирулентности нематод. Два примера резистентности, вводимой селекционерами, заключается в следующем.

Что касается вида Globodera, то эту популяцию картофельных нематод, распространенных в Европе, можно разделить на 5 форм G.rostochensis (RO 1-5) и три формы G. pallida (Ra 1-3). Эти типы патогенов определяются как формы одного вида, которые отличаются своей репродуктивной способностью на растениях-хозяевах, которые, как известно, экспрессируют гены резистентности. HI - ген, несущий резистентность к Globodera rostochiensis Ro 1 и Ro 4, является достаточно качественным и находит широкое коммерческое использование. В Великобритании, cv. Mаris Piper экспрессирует HI и является высококачественным резистентным сортом. К сожалению, широкое использование в Англии этого сорта коррелирует с возрастающим преобладанием по всей стране G.pallida, к которой этот сорт является полностью восприимчивым.

Что касается Meloidogyne spp., то этот вид имеет морфологически аналогичные формы с различной способностью размножаться на хозяйских растениях. Для дифференциации 4 видов M.incognita использовали стандартные растения табака (cv NC95) и хлопчатника (cv Deltaphne), два вида M.arenaria дифференцировали с использованием арахиса (cv Florrunner). Один единственный доминантный ген в табаке cv NC95 сообщал резистентность к видам 1 и 3 M.incognita, но возделывание этого сорта в США повышало превалирование других галловых нематод, в частности M.arenaria. Большинство источников резистентности были эффективными лишь для одного какого-либо вида галловых нематод, за одним лишь исключением, а именно: ген LMi от Lycopersicum peruvanium, сообщал резистентность ко многим видам нематод, кроме M.halpa. Другим ограничением генов резистентности, идентифицированных в томатах, бобах и сладком картофеле, является их температурная зависимость, которая делает их неэффективными в тех местах, где температура почвы превышает 28^oC.

В соответствии с вышеуказанным, необходимость получения более резистентных к нематодам коммерчески ценных культур становится более очевидной. Новая резистентность, сообщаемая растению, должна быть более продолжительной, поскольку нематоды не имеют большого потомства за сезон культивирования, и важные изменения патотипов происходят в результате селекции существующих до этого на полях форм, а не в результате мутации после внедрения сорта. Этот последний процесс не так легко осуществляется для нематод. Например, в противоположность широко распространенной устойчивости к инсектицидам у тлей и других насекомых, полевой устойчивости к нематодам не наблюдается.

Было обнаружено, что ингибиторы протеиназы, включая ингибиторы трипсина, являются сильными противонематодными агентами, а поэтому, обработка нематод и/или очагов их обитания ингибиторами протеиназы может служить защитой растений от поражения нематодами; например, растения, трансформированные геном или другой ДНК, кодирующей ингибитор трипсина, являются резистентными к нематодам.

В первом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу борьбы с паразитами растений - нематодами, который заключается в обработке нематод или мест их обитания ингибитором протеиназы. Для того чтобы нематоды могли поглощать ингибитор, он должен соответствовать данной протеиназе.

Во втором своем варианте, настоящее изобретение относится к использованию ингибитора протеиназы в качестве средства против растительных нематод.

Для генерирования ингибитора протеиназы в местах обитания нематод, предпочтительно использовать технику рекомбинантных ДНК. Подходящим способом достижения вышеуказанной цели является генетическая трансформация растения, при этом, предпочтительно, чтобы растение, которое является восприимчивым к поражению нематодами, само экспрессировало ингибитор протеиназы.

В третьем своем варианте, настоящее изобретение относится к способу сообщения растению резистентности к нематодам, который заключается в модифицировании или трансформации растения в целях сообщения этому растению способности экспрессировать ингибитор протеиназы. При этом, следует отметить, что сообщаемая растению резистентность не обязательно должна быть полной, однако, она должна быть достаточной для получения нужного агрономического или экономического эффекта. Борьба с нематодами может быть ограничена борьбой с самками нематод, как будет показано ниже.

Подробное описание жизненного цикла и патогенности картофельных нематод приводится в специальной литературе (Agrios I.N. (1988) "Plant Pathology", 3rd. Ed. Academic Press San Diego, стр. 803 и Jones F.I.W. и Jones M. (1974) "Pests of Field Crops", 3rd. Ed. Arnold, London). На второй личиночной стадии J2, картофельная нематода Globodera pallida мигрирует с поверхности корня вовнутрь клетки через клеточную стенку, протыкая ее своим стоматостилетом. После того, как организм достигнет эндодермы, он выбирает исходную клетку для питания, внедряется в нее, после чего клетка увеличивается в объеме, вовлекая другие клетки в синцитий, которой постепенно принимает характер системы переноса клеток примерно через 7 дней после инвазии. Эти организмы питаются из синцития, который поддерживается на протяжении всего периода питания нематоды. Животные, которые становятся самцами, питаются в течение двух стадий (J2 и J3), а животные - самки, кроме того, питаются в стадии (J4) и во взрослой стадии. Размер тела самки в 100 раз превышает размеры тела самцов, и от питания самок в значительной степени зависит патология галловых нематод. Сорт Maris Piper обладает резистентностью к Globodera rostochiensis (лишь патогены типа Ro 1 и Ro 4), и эта резистентность выражается неспособностью синцития развиваться после первых нескольких дней взаимодействия нематоды с клеткой. Самцы могут развиваться на таких растениях, а самки не способны развиваться на этих растениях, вследствие чего патогенность нематод значительно снижается. Поэтому целью сообщаемой новой резистентности является либо предупреждение, либо ограничение развития самок нематод.

В своем четвертом варианте, настоящее изобретение относится к использованию гена или другой ДНК, кодирующей ингибитор протеиназы, для получения трансгенного растения, обладающего резистентностью к нематодам.

Субстратная специфичность протеиназ, происходящих от различных источников, может варьироваться, критериев ее оценки не существует. Эти ферменты действуют посредством четырех различных каталитических механизмов, что позволяет их отнести к четырем различным классам, а именно: сериновые, цестеиновые, аспарагиновые и металлопротеиназы. Сериновые протеиназы представляют широко распространенный класс, отличающийся большим разнообразием; цистеиновые протеиназы также являются широко распространенным классом и обнаруживаются в бактериях, эукариотических микроорганизмах, растениях и животных. Металлопротеиназы также широко распространены, однако, класс аспарагиновых протеиназ является более ограниченным и обнаруживается, в основном, в эукариотах.

Существует широкий ряд ингибиторов протеиназ, многие из которых являются специфичными к одному классу протеиназ. Например, 1, 10 - фенантролин является хелатообразующим агентом, действующим как обычный ингибитор металлопротеиназы, не удаляя при этом кальций, который необходим для активности многих ферментов, включая некоторые другие протеиназы. Особый интерес представляют также ингибиторы протеиназы, которые будучи протеинами, должны быть субстратами, а не ингибиторами этих ферментов. Многие из этих ингибиторов являются запасными белками семян, которые аккумулируются в процессе развития семян, и могут представлять один из наиболее обильных белков в зрелых семенах. В настоящее время известными семействами ингибиторов протеиназы (PI) являются: семейства Bowman-Birk Kunitz, картофеля 1, картофеля 2, тыквы, подсемейство зерновых, семейства Ragi 1 - 2, кукурузы 22 кДа и семейство цистатина. Предпочтительным ингибитором протеиназы, используемым в настоящем изобретении, является семейство Bowman-Birk; другие подходящие ингибиторы принадлежат к семействам кукурузы 22 кДа и цистатину.

Семейство цистатина включает в себя орцицистатин I и II, которые происходят из риса. Другой член этого семейства происходит из кукурузы и отличается от ингибитора кукурузы 22 кДа. Ингибитор, происходящий из кукурузы 22 кДа, является бифункциональным ингибитором трипсина и - амилазы, а также обладает противогрибковой активностью.

Семейство Bowman-Birk включает в себя ингибиторы протеиназы, выделенные из Vigna unguiculata (коровий горох). Ингибиторы трипсина коровьего гороха (Cp Tis) представляют собой небольшие полипептиды из около 80 аминокислот и являются двухконцевыми ингибиторами сериновой протеиназы. Были получены последовательности белка и кДНК CpTis (EP-A-0272144, Hilder и др.) (1989) "Protein and kDNA seguences of Bowman-Birk protease inhibitor from cowpea (Vigna unguiculata walp) "Plant Molecular Biology 13 701-710 and Hilder и др. (1987) Nature 300, 160-163). В этих работах сообщается, что изменение CpTi уровней в семенах коровьего гороха может коррелировать с полевой резистентностью к жукам Callosorbuch maculatus. Кроме того, введение Cp Ti в искусственную среду ингибирует развитие Heliothis, spodoptera, Diabrotica и Fribolium. При этом, также сообщается, что его употребление человеком вместе с пищей не приносило какого-либо вреда, а пища, приготовленная из этого коровьего гороха и скормленная крысам, не оказывала влияния на их рост. Кассета, включающая в себя промотор 35 CaMV и последовательность, кодирующую зрелый ингибитор CpTi, была введена в растение табака посредством Agrobacterium facien - опосредованной трансформации. При этом, наблюдалась коррекция между уровнем экспрессии CpTi и выживанием Heliothis vriescens, а также уровнем поражения растений личинками этих насекомых (Hilder и др. (1987) Nature, 300, 160-163; EP-A-0272144).

Существует много примеров, когда меры, предпринимаемые для защиты растений от насекомых-вредителей, не имели практического значения для защиты растения от нематод. Не имеется также данных относительно общей корреляции между природными генами резистентности к насекомым и нематодам. Никогда не наблюдалось случаев, где гены резистентности против картофельной нематоды (например, HI в Maris Piper) сообщали резистентность против жесткокрылых, например, колорадских жуков, или ген томата Mi, сообщающий резистентность против некоторых форм Meloidogyne spp., имел какое-либо значение для резистентности против насекомых. Кроме того, многие широко используемые инсектициды, такие, как хлороорганические соединения, органофосфаты и синтетические пиретроиды, не являются эффективными для нематод. Исключение составляет оксимкарбамат (алдикарб), но он имеет очень широкий спектр активности против ацетилхолинэстеразы и является также очень токсичным для млекопитающих.

Насекомые обнаруживают значительное различие в отношении своих протеиназ. Например, трипсин и химотрипсин- подобные ферменты обнаруживаются у саранчи и пчел, тогда как тиоловые протеиназы преобладают в пищеварительных процессах долгоносика Callosobrinchus maculatis. Кроме того, протеиназы насекомых требуют оптимальных pH, и ингибиторы, например, такие, как ингибитор трипсина сои, будут ингибировать протеиназы одних насекомых и не будут ингибировать протеиназы других насекомых. Поэтому эффективность CpTi против некоторых насекомых не может служить надежным показателем его эффективности против других насекомых. При этом, нет каких-либо оснований ожидать apriori, что нематоды имеют протеиназы, аналогичные протеиназам насекомых. В этом отношении нематоды отличаются от насекомых.

Можно ожидать корреляцию между проглатываемой пищей и пищеварительными ферментами. Существует большое различие в способах питания жалящих жесткокрылах насекомых, таких как амбрамный долгоносик Callosobruchus maculatis, и питающиеся флоэмой полужесткокрылые насекомые, такие как тля. Эти насекомые также вносят изменения в растения, однако, они не образуют синцитиллярных клеток, как это делают нематоды. По сравнению с травоядными жуками, галловые нематоды отличаются от них по своему механизму питания даже больше, чем тли. Из этого следует, что изучение насекомых, к сожалению, не дает надежной информации о питании нематод.

Имеющаяся информация о протеиназах нематод также слишком недостаточна, чтобы моно было с уверенностью утверждать, что CpTi или другой трипсин или даже ингибитор протеиназы оказывает влияние на пищеварительные процессы. Многие работы исследователей, посвященные организмам-паразитам, были направлены на ферменты, секретируемые инфицирующими личинками, и поэтому они скорее рассматривают инвазию хозяйских тканей, а не питание этих насекомых. В случае Ascaris suum было установлено, что инфицирующая личинка содержит сериновые протеиназы, но при этом предполагается, что в пищеварении взрослых особей участвуют тиоловые и карбоксильные протеиназы. Присутствующие ферменты являются стадие-специфическими и тесно связаны со специфическими требованиями паразитизма. Отсюда можно заключить, что любой ингибитор протеиназы, такой, как CpTi, должен оказывать воздействие на растительные нематоды, на что указывают исследования, проведенные на различных видах паразитов.

Аналогично, свободноживущие нематоды являются бактериядными, и ферменты, необходимые для переваривания их пищи, могут сильно отличаться от ферментов растительных паразитов. Действительно, в некоторых ранних работах, посвященных растительным паразитам, делается предположение, что они имеют протеиназы с более низкой или значительно более низкой активностью, чем свободно живущие нематоды, исследованные одновременно с растительными нематодами.

Из указанных выше исследований, показавших, что CpTi является эффективным ингибитором против насекомых и что нематоды обычно уничтожаются совсем другими механизмами, очевидно, что антинематодная активность ингибиторов протеиназы не может быть предсказана на основании их инсектицидной активности трипсиновых ингибиторов, описанных, например, в EP-A-0272144. Причина этого вероятно заключается в том, что указывается в EP-A-0272144 на стр. 3 (строка 58) - стр. 4 (строка 2), именно резистентность к насекомым трансгенного растения значительно увеличивается, если растение было генетически трансформировано таким образом, что оно получило способность экспрессировать ингибитор трипсина по всему растению.

Для использования в настоящем изобретении могут оказываться предпочтительными ингибиторы цистеиновых протеиназ, поскольку имеются свидетельства (представленные в Примерах), что по крайней мере некоторые из мажорных протеиназ нематод являются цистеиновыми протеиназами.

Предпочтительными ингибиторами протеиназы настоящего изобретения является ингибитор трипсина, в частности ингибитор трипсина (CpTi) коровьего гороха, однако, в некоторых случаях могут оказаться более предпочтительными ингибиторы трипсина или других протеиназ, происходящих, например, от других бобовых культур. Cp Ti может быть предпочтительно идентичным натуральному Cp Ti в одной из своих аллельных форм, но это необязательно. Например, модификации в аминокислотной последовательности могут не оказывать неблагоприятного действия на активность фермента, или даже наоборот, могут улучшить эту активность. В основном, можно сказать, что ингибитор протеиназы, используемый в настоящем изобретении, будет обладать свойствами, аналогичными свойствам натурального ингибитора протеиназы, и гомологией, достаточной для полноправного члена протеиназного семейства, такого, как Cp Ti - семейства, в соответствии с имеющимися научными критериями. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая Cp Ti, может обладать достаточной гомологией, для гибридизации с нуклеиновой кислотой, кодирующей натуральный Cp Ti в жестких условиях гибридизации. Примерам таких жестких условий может служить использование солевого раствора приблизительно 0,9 М при температуре от 35^oC до 65^oC. Нуклеиновая кислота, используемая в настоящем изобретении, может, кроме того, удовлетворять вышеуказанным критериям, но для вырождения генетического кода. При необходимости, гликозилирование может присутствовать или отсутствовать.

Ингибиторы трипсина типа Bowman-Birk и коровьего гороха кодируются семейством умеренно повторяющихся генов, которые экспрессируются в семядолях коровьего гороха в виде четырех ингибиторов, которые могут быть разделены с помощью ионообменной хроматографии. Все эти четыре изо-ингибитора (fI, fII, fIII и fIV) имеют аналогичную трипсин-ингибирующую активность, измеряемую in vitro - анализом активации фермента. Главным изо-ингибитором коровьего гороха является fIV. Гены, кодирующие указанные изо-ингибиторы, обладают гомологией, достаточной для перекрестной гибридизации с кДНК - зондами полного Cp Ti в 0,45 М NaCl, 0,045 M Na-цитрата (3 xssC) при 68^oC. Примеры первичной последовательности изо-ингибитора fIV (определенной с помощью секвенирования белка (Sammour (1985), PhD Thesis, University of Durham) или предсказанной в результате секвенирования кДНК Cp Ti представлены на фиг. 1 EP-A-0272144.

Трансгенные растения, обладающие резистентностью к нематодам, сообщаемой в результате экспрессии трансгена ингибитора трипсина или другого фермента, могут быть получены в соответствии с описанием, представленным в EP-A-0272144 (которое вводится в настоящее описание посредством ссылки в той степени, насколько это допускается законом). Вкратце, этот способ получения трансгенных растений включает в себя следующие стадии: 1. Выделение полиаденилированой РНК; 2. Получение кДНК для клонирования; 3. Синтез кДНК; 4. Синтез второй цепи; 5. Обработка концов-дц-ДНК для клонирования; 4. Клонирование в хозяина (например, E.Coli) с использованием вектора, такого, как плазмида (например, pBR 322 или pU C19); 7. Скренинг рекомбинантов на Cp Ti (или дугой ингибитор) - кодирующую последовательность; 8. Перенос клонированных Cp Ti - кодирующих последовательностей в вектор экспрессии (например, Agrobacterium BIN); 9. Перенос в организм хозяина для трансгенеза (например, Agrobacterium tumefaciens) и 10. Инфицирование растения хозяином.

Следует отметить, что необязательно точно следовать указанным стадиям. Например, для синтеза ингибитор-кодирующей ДНК может быть использована химическая техника синтеза ДНК. Модификации могут быть введены либо на стадии de-novo - синтеза, либо путем сайт-направленного мутагенеза, осуществляемого на уже имеющейся последовательности.

Аналогично, может быть использован соответствующий вектор экспрессии. Выбор подходящего вектора экспрессии может зависеть от присутствия в нем промотора, под контролем которого будет происходить экспрессия ингибитора. При этом может быть желательной нерегулируемая или индуцибельная экспрессия. Другой фактор, влияющий на выбор, заключается в том, что может быть предпочтительным, чтобы экспрессия происходила по всему растению, либо локализовалась в какой-либо его части, причем на практике, предпочтительными будут, вероятно, корне- или другие тканеспецифические промоторы. Для трансгенеза могут быть использованы и другие методы, например, конструирование последовательности, кодирующей соответствующий промотор, а в некоторых случаях может быть предпочтительным метод "микровыстреливания".

Настоящее изобретение может быть использовано для борьбы с некоторыми видами нематод, включая яванскую галловую нематоду и другие галловые нематоды. Примерами галловых нематод являются нематоды рода Heterodera и Globodera. В этот род входят такие виды, как H. glycines, H. shachtii (свекловичная нематода). H., аvenae (галловая нематода зерновых) и картофельные нематоды G. rostochiensis и G. pallida. Яванские галловые нематоды принадлежат к роду Mеloidogyne, в частности к видам M. javanica, M. halpa, M. arenaria и M. incоgnita. Другими важными в промышленном отношении нематодами являются нематоды рода Xiphinema, в частности, Xindex и X. Italiae (которая переносит на виноград вирус короткоузлия виноградной лозы (GFLV). X. americanum, которая имеет большое экономическое значение в США и в других регионах мира, и X. diversicaudatum (которая переносит на растения малины и другие растения вирус арибис-мозаики, на зерновые растения вирус мозаики костера, и на малину, розу, смородину черную и другие растения вирус кольцевой пятнистости земляники, и нематоды-паразиты рода Pratylenchus, в частности P. penetrans, P. brаnchurus и p. geae (которая связана с поражениями кукурузы), P. , coffeae, P. grachyurus и другие (кофе), P. coffeae и P. goodeyi (бананы), P. branchyurus (ананас посевной), P. geae и P. branchyurus (рис), P. branchyurus и P. geae eae (овощные культуры) и P. thornei (пшеница).

Следует отметить, что Pratylenchus spp. имеет широкий круг хозяев и не ассоциируется с каким-либо одним конкретным культурным растением. Padopholus similis аналогичны членам рода Pratylenchus и является даже более важным вредителем для бананов.

Нематоды-паразиты, такие, как нематоды рода Pratylenchus, проникают в корни и питаются, продвигаясь по корням и нанося сильные разрушения окружающим клеткам. Периодически, эти организмы могут покидать корни и внедряться в другие ткани, продолжая пожирать содержимое клеток и размножаться. Термин "свободноживущие" иногда используют в отношении нематод, таких, как Xiphinema, которые никогда не проникают в растение, но питаются из почвы путем протыкания растительных клеток своими стилетами. То есть, в растение проникают только их стилеты, а поэтому, фактически, эти вредители являются эктопаразитами, однако, тем не менее, настоящее изобретение также является эффективным в борьбе против этих вредителей.

Ингибитор может быть использован для защиты против более чем одной имеющей экономическое значение нематоды, поражающей культурное растение. Например, Meloidogyne и Heterodera glycines являются главными вредителями оси культурной, Meloidogyne и Pratylenchus являются главными вредителями для кукурузы, а Heterodera shachtii, Longidorus, Trichodorus и Paratrichodorus для сахарной свеклы.

Галловая нематода (такая, как Globodera или Heterodera) проникает с поверхности корня вовнутрь клетки, и разрушая клетку, обеспечивает себе исходное питание. Нематода Pratylenchus ведет себя аналогичным образом, поскольку она также проникает в клетку. Разница заключается только в том, что Pratylenchus питается от каждой клетки до того, как она проникает в нее. Если протеиназы участвуют в процессе миграции, то следует ожидать, что эти ферменты являются сходными. Аналогично, галловые нематоды при их начальном питании, перед тем, как модифицировать клетку, вытягивают из нее содержимое для своего питания. Если при таком экстракорпоральном пищеварении используются протеиназы, то они должны быть аналогичными протеиназам Pratylenchus.

Белки являются главным питанием для указанных паразитов, поскольку сами они неспособны синтезировать нужные аминокислоты. Протеиназы используются этими организмами для расщепления белков на более мелкие молекулы (пептиды), которые усваиваются ими как часть их пищи. Поэтому нематоды, питающиеся на растениях, должны обладать протеиназами, способными расщеплять белки, имеющиеся в растениях. Иначе говоря, природа этих протеиназ должна зависеть от конкретных аминокислот, имеющихся в растительных клетках и отвечающих потребностям пожирающих их организмов. Очевидно, нет таких нематод, которые бы не могли использовать имеющийся белок с помощью своих протеиназ. Поскольку многие нематоды могут поражать одинаковые растения, например, картофель является хозяином для Globodera нескольких видов Meloidogyne и Pratylenchus, то имеются все основания предполагать, что эти виды имеют одинаковые протеиназы. Поэтому, ингибиторы должны быть подходящими для ингибирования переваривания белков протеиназами способом, описанным в настоящем изобретении.

Для борьбы против конкретных видов нематод или против ряда различных нематод могут быть использованы комбинации различных ингибиторов. Этот принцип наилучшим образом может быть проиллюстрирован при рассмотрении картофельной нематоды (PCN). На второй ювенильной стадии PCN, а также для взрослой самки PCN, важную роль играет активность цистеиновой протеиназы, как в условиях кислотного pH, так и в условиях pH, близкого к нейтральному значению. Вероятно, что металлопротеиназы играют важную роль на второй ювенильной стадии при нейтральном pH, а для самок при кислотных значениях pH. Поэтому комбинация ингибиторов для этих обеих групп должна быть эффективной против начального развития на второй ювенильной стадии, а также против последующего развития самки. Ингибиторы карбоксипептидазы, происходящие из клубней картофеля и его листьев, являются характерными примерами ингибиторов металлопротеиназы.

Кроме того, как было показано выше, настоящее изобретение предусматривает использование двух (или более) ингибиторов для борьбы против двух различных нематод, которые могут поражать одни и те же культурные растения, но которые обладают до некоторой степени различными протеиназами. Например, Meloidogyne spp. и H. glycine обе поражают сою культурную, а Globodera и Meloidogyne spp. обе поражают картофель.

Многие культурные растения могут быть защищены способом настоящего изобретения, а поэтому они являются кандидатами для их генетического трансформирования в целях сообщения им способности экспрессировать один или несколько трансгенных генов, кодирующих ингибиторы протеиназы. В принципе, любое культурное или какое-либо другое растение, подверженное поражению нематодами, независимо от того являются ли эти нематоды корневыми или галловыми, могут быть защищены способами настоящего изобретения. Иллюстративными, но не ограничивающими примерами таких растений являются виноград, табак, томат, хлопчатник, масличный рапс и другие культуры, такие, как соя культурная, сахарная свекла, зерновые и картофель. Средствами настоящего изобретения могут быть также защищены декоративные растения. Настоящее изобретение относится к трансгенным растениям per se, которые в своей естественной форме подвергаются поражению нематодами, но не подвергаются в значительной степени поражению насекомыми. Предпочтительные отличительные особенности трансгенных растений настоящего изобретения приводятся в настоящем описании для разных вариантов изобретения.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение. Эти примеры сопровождаются чертежами, где: На фиг. 1 представлена схематически структура гена Т-ДНК от p ROK-Cp Ti + 5.

На фиг. 2 показан рост Globodera pallida на трансгенных картофельных растениях, который представлен как временная зависимость объема тела от времени после введения в корни растения паразитов на ювенильных стадиях. Растения либо экспрессировали (заштрихованные кружочки), либо не экспрессировали (незаштрихованные кружочки) ген лектина гороха. Объем нематод из растений, экспрессирующих лектин гороха, составлял 70% и 85% по сравнению с контрольными через 12 и 16 дней, соответственно. Величины объемов выражены в натуральных логарифмах и показывают экспоненциальный суточный рост на 23,9% в день в течение 2-12 дней для нематод на контрольных растениях.

На фиг. 3 показан рост Globodera pallida на трансгенных картофельных растениях, который представлен как изменение объема тела со времени после введения в корни растения инфективных ювенильных особей. Растения либо экспрессировали (заштрихованные кружочки), либо не экспрессировали (незаштрихованные кружочки) ингибитор трипсина коровьего гороха (Cp Ti). Объем нематод из растений, экспрессируюих Cp Ti, был значительно меньше, чем для контрольных растений через 12 дней. Величины объемов даны в натуральных логарифмах и показывают экспоненциальный суточный рост на 21,3% в день через 2-12 дней для нематод на контрольных растениях.

На фиг. 4 показан объем тела на стадиях развития Globodera pallida, присутствующей на картофельных растениях 12 дней после введения в корни растения инфективных ювенильных особей. Растения либо экспрессировали (+), либо не экспрессировали (-) ингибитор трипсина коровьего гороха (Cp Ti). Величины объемов даны в натуральных логарифмах, а пол незрелых особей определяли на предзрелой стадии (J4). Объемы незрелых особей на предзрелой стадии и самок на Cp Ti - растениях составляла 39% и 54% для самок и самцов соответственно.

На фиг. 5 показано соотношение каждого пола Globorera pallida на картофельных растениях 12-24 дней после введения инфективных ювенильных особей в корни растения. Растения либо экспрессировали (заштрихованные символы), либо не экспрессировали (незаштрихованные символы) ген лектина гороха; (самцы представлены квадратами, а самки - кружочками).

На фиг. 6 представлена круговая диаграмма, где показаны процентные содержания каждого пола Globodera Pallida на трансгенных растениях картофеля 12 дней после введения в корни растения. Растения либо экспрессировали (правая диаграмма), либо не экспрессировали (левая диаграмма) ингибитор трипсина коровьего гороха. Результаты были получены на основе наблюдений свыше 120 нематод для каждой обработки. Особи, которые были слишком незрелыми для определения пола, обозначены (J).

На фиг. 7, которая относится к примеру 4, показано, что уровень экспрессии Cp Ti - экспрессирующих растений составляет около 1% от полного белка.

На фиг. 8, которая относится к примеру 5, проиллюстрирован ингибирующий эффект различных концентраций ингибитора протеиназы, происходящего от кукурузы.

Примеры Пример 1 Получение трансгенных растений картофеля Трансгенный картофель получали следующим образом: Конструирование гена Ca MV-35S-CpTi; Ген Cp Ti был получен из плазмиды pUSSR c 3/2 (Hilder и др. (1987), Nature 33, 160-163 и EP-A-0272144). Cp Ti - кодирующая последовательность (240 п.о.) содержалась внутри 550 п.о. Alul-Scal - рестрикцион