Конъюгаты полимиксина

Конъюгаты полимиксина

Реферат

 

Изобретение может быть использовано в фармации и медицине для приготовления препаратов, используемых при терапии синдрома системной воспалительной реакции и септическом шоке. Водорастворимый конъюгат или его соль содержит полимиксин В или его соль и декстран. Он имеет антиэнтотоксиновую активность выше, чем исходного полимиксина В. При этом отношение IC₅₀ полимиксина В к IC₅₀ его конъюгата больше, чем 1,0. Заявлен способ получения конъюгата. Полимиксин В или его соль подвергают взаимодействию с декстраном в водной среде рН от 9,3 до 10. Температура от 30 до 35°С. Заявлена фармкомпозиция, содержащая заявленный водорастворимый конъюгат. Конъюгат обладает более высокой антиэндотоксиновой активностью, способ - лучшей воспроизводимостью. Активность конъюгата составляет 125% или более от активности природного полимиксина В. 3 с. и 10 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к способу получения водорастворимых конъюгатов (или их солей) полимиксина B (PMB) или их солей и декстрана путем взаимодействия полимиксина B или его соли с декстраном в водной среде при pH от примерно 9,3 до примерно 10, предпочтительно от примерно 9,5 до примерно 9,7, и температуре от около 30^oC до около 35^oC, предпочтительно около 32^oC. Предпочтительный вариант способа включает в себя взаимодействие сульфата полимиксина B с окисленным декстраном при температуре около 32^oC с ковалентным присоединением молекулы полимиксина B к декстрану через аминную связь. Улучшенные конъюгаты (или их соли), полученные с помощью способа настоящего изобретения, легко и стойко воспроизводимы и показывают значительно улучшенные фармакологические свойства, такие как более сильное действие и антиэндотоксиновая активность, которая больше, чем антиэндотоксиновая активность неконъюгированного полимиксина B.

Изобретение также включает водорастворимые конъюгаты (или их соли), содержащие полимиксин B или его соль и декстран, причем конъюгаты (или их соли) обладают большей антиэндотоксиновой активностью, чем антиэндотоксиновая активность неконъюгированного полимиксина B.

Потребность медицины в эффективной терапии при синдроме системной воспалительной реакции (SIRS) и септическом шоке широко признана, а база пациентов велика. Она составляет более чем 100000 критических случаев SIRS/сепсиса в развитых странах, требующих интенсивной терапии, и почти 1 миллион пациентов с высоким риском сепсиса, которые могли бы получить пользу от профилактики.

На основании исследований большой группы людей и животных эндотоксин признан как главный инициатор/первичный передатчик в патогенезе SIRS/сепсиса, и, таким образом, дано четкое научное объяснение для антиэндотоксинового подхода к сепсису. Эндотоксины или липополисахариды являются структурными молекулами клеточных стенок грамотрицательной бактерии. Будучи введенными в кровоток, они могут мешать регулированию температуры тела и вызывать жар. Они обладают также токсическим действием, ведущим к сердечным, легочным и почечным нарушениям. Связанные с эндотоксином заболевания являются основной причиной смерти среди пациентов в блоках интенсивной терапии.

Уникальной среди антибиотиков является способность PMB нейтрализовать эндотоксин, которая достигается путем связывания с участком липида A молекулы эндотоксина. PMB из Bacillus polymyxa (B.aerosporus) является высокозаряженным амфифильным циклическим пептидолипидом. Он также полезен в борьбе с различными грибковыми инфекциями, особенно теми, которые возникают у индивидов, подверженных риску заболевания иммунной системы. Однако PMB обладает некоторыми свойствами, которые делают его не столь идеальным антибиотиком. Во-первых, у него короткий период полураспада в организме, требующий повторных доз, чтобы быть эффективным. Во-вторых, при прохождении через почки он может вызвать обширное повреждение. В-третьих, при высоких дозах он обладает нейротоксическими свойствами, которые вызывают респираторный паралич.

Ранее исследователи конъюгировали PMB с неподвижными или фиксированными молекулами, например с сефарозой (Sepharose) [Issekutz, J. Immunol. Methods, 61(1983), 275-281]. Эти конъюгаты, полезные в методиках очистки, не пригодны для терапевтического использования in vivo.

Один подход для достижения фармакологической активности, повышенной длительности или уменьшенной токсичности для организма заключался в присоединении лекарств к макромолекулам большой молекулярной массы, таким как декстран, полиэтиленгликоль или поливинилпирролидин. Попытки в этом направлении полимерного конъюгирования, однако, имели только ограниченный успех. Например, конъюгированная форма новокаинамида (противоаритмическое лекарство) было менее активно и показывало более короткий период полураспада, чем нативный новокаинамид [Schact et al., Ann N.Y., Acad. Sci. 416 (1985), 199-211]. Аналогично, простагландиновый аналог B245, связанный с носителем, был менее эффективен (на несколько порядков), чем нативная молекула [Bamford et al., Bioch. Biophys. Acta 886 (1986). 109-118]. Снижения в силе биологического действия были описаны также для конъюгированных форм калликреина, апротинина, брадикинина [Odya et al., Biochem. Pharmacol. 27 (1978), 173-179], противоопухолевых лекарств донорубицина [Hurwitz et al., J. AppI. Biochem. 2 (1980), 25-35] , и митомицина C [Takakura et al., Cancer Res. 44 (1984), 2505-2510]. Конъюгированные энзимы также претерпевают снижение биологической активности вследствие стерического несоответствия и пониженной доступности субстрата [Blomhoff et al. , Biochem. Biophys. Acta 757 (1983), 202-208; Marshall et al., J. Biol. Chem. 251(4) [1976], 1081-1087; R.L. Foster, Experimentia 31(7) [1975] , 772-773: Wileman et al., J. Pharm. Pharmacol. 35 (1983). 762-765]. Существуют, однако, примеры улучшений периода полураспада в кровотоке после конъюгации [Wileman, ранее; Kaneo, Chem. Pharm. Bull. 37 (1) [1989], 218-220].

Было бы желательно разработать форму PBM, которая оставалась бы в кровотоке дольше и/или не имела бы нейро- или нефротоксичности при терапевтических дозах. Описаны [USP 5177059 и его аналоги в других странах, такие как EP 428486] конъюгаты полимиксина B с полисахаридами, такими как декстран или гидроксиэтилкрахмал, протеинами, такими как альбумин, и полимерами, такими как поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и поливиниловый спирт. Этот патент конкретно описывает способ химического конъюгирования полимиксина B с декстраном взаимодействием материалов при комнатной температуре (т.е. около 25^oC или меньше) и pH 8,5-9,0. Конъюгаты, описанные в этом патенте, являются менее токсичными, чем неконъюгированный полимиксин B и обладают антиэндотоксиновой активностью, которая является не явно выраженной, однако оказывается меньшей или равной активности неконъюгированного полимиксина B.

Способ настоящего изобретения представляет собой усовершенствование способа, описанного в этом патенте, и обеспечивает конъюгаты (или их соли) полимиксина B или его соли и декстрана, которые обладают неожиданно улучшенными свойствами по сравнению с известными конъюгатами PMB/декстран, в частности более высокой антиэндотоксиновой активностью, чем неконъюгированный полимиксин B, большей эффективностью, лучшей воспроизводимостью и лучшими фармакологическими свойствами. Особенно неожиданным является то, что новые конъюгаты PMB/декстран (или их соли) настоящего изобретения обладают стойко и воспроизводимо более высокой антиэндотоксиновой активностью, чем неконъюгированный PMB. В то время как молекулярная основа для этого неожиданного нового свойства не совсем понятна, вероятно, что в реакционных условиях, которые применяются в настоящем изобретении для получения конъюгатов, изменение pH меняет распределение протонов на основных боковых цепях. При более высоких значениях pH одна или несколько аминогрупп боковой цепи могут стать более доступными для присоединения к декстрану через восстановительное аминирование. Так как каждая аминогруппа боковой цепи будет обладать характерным pKa, более высокий pH будет освобождать каждый раз тот же самый амин. Если этот амин дает особенно благоприятное присоединение (с точки зрения силы действия конъюгата), то возникает более хорошая форма конъюгата, потому что такой специфический путь присоединения вкладывает больше в общую структуру. Эта структура придает конъюгатам стойко воспроизводимым способом уровень активности, который выше уровня активности природного PMB, например 125% или более от активности природного PMB.

Настоящее изобретение включает в себя усовершенствованный способ получения водорастворимого конъюгата (или его соли) полимиксина B и декстрана, который полезен при лечении грибковых и бактериальных инфекций и профилактики заболевания, вызываемого бактериальным эндотоксином. Конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения водорастворимого конъюгата полимиксин B/декстран (или его соли), который заключается во взаимодействии полимиксина B или его соли с декстраном в водной среде при pH от примерно 9,3 до примерно 10 и температуре от примерно 30^oC до примерно 35^oC. PMB представляет собой антибиотический пептид и признанный фармацевтический агент с умеренной антибиотической активностью. Он клинически использовался в течение свыше 40 лет для местного и парентерального применений. Развитие бактериальной стойкости к PMB очень редко. PMB связывает эндотоксин со сродством около 10^-6 М и может нейтрализовать биологические воздействия эндотоксина от всех клинически значимых грамотрицательных бактерий в большом числе моделей in vitro и in vivo. In vitro его использовали в качестве стандарта для нейтрализации эндотоксина. Кроме того, in vivo PMB защищает против патологии бактериального сепсиса во многих животных моделях, таких как ацидоз и гипотензия при энтеробактериальных инфекциях, и летальность, обусловленная грамотрицательным сепсисом у собак, кроликов, крыс и мышей. Он также имеет потенциал в профилактике сепсиса у людей, как например у пациентов с ожогами.

PMB, используемый для получения конъюгата настоящего изобретения, коммерчески доступен. PMB может быть получен ферментацией polymyxa (Prazmowski) Migula. PMB состоит из смеси нескольких родственных декапептидов. В этом изобретении пригоден PMB или его фармацевтически приемлемая соль (такая как сульфат полимиксина B и тому подобное).

Декстран, используемый в способе настоящего изобретения, может быть любым из традиционных фармацевтически приемлемых декстранов. Предпочтительно, когда декстран является химически модифицированным для ковалентного связывания с пептидами, например, является окисленным окислителем, например периодатом натрия. Декстран должен предпочтительно иметь средневесовую молекулярную массу от примерно 25000 до примерно 500000; более предпочтительно от примерно 50000 до примерно 200000; более предпочтительно от примерно 63000 до примерно 76000. Молекулярная масса может быть определена, например, гель проникающей хроматографией высокого разрешения. Наиболее предпочтительный декстран получают ферментацией Leuconostoc mesenteroides (NRRL B-512). Он включает в себя единицы глюкозы, которые являются [1-6]-связанными в длинной боковой цепи с приблизительно 5% [1-3] ответвлением. Из боковых цепей около 85% имеет от 1 до 2 единиц глюкозы, а остальные 15% в среднем 33 единицы.

Общая методика получения конъюгатов PMB и декстрана в водной среде описана в USP 5177059 и она применима к настоящему изобретению. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения частично окисленный декстран получают взаимодействием с окислителем, таким как периодат натрия (NaIO₄). Эта обработка приводит к образованию альдегидов через окислительное расщепление соседних диолов на мономерах глюкозы. Под воздействием PMB или его соли на частично окисленный декстран образуются Шиффовы основания. Получение конъюгатов в рамках настоящего изобретения требует тщательного регулирования pH от примерно 9,3 до примерно 10, предпочтительно от примерно 9,5 до примерно 10, более предпочтительно от примерно 9,5 до примерно 9,7, во время взаимодействия PMB и декстрана, особенно на стадии образования Шиффова основания. pH предпочтительно поддерживают с использованием боратного буфера, в особенности буфера, содержащего тетраборат натрия. При этом температуру водной среды во время взаимодействия ПМВ или его соли и декстрана поддерживают от примерно 30^oC до примерно 35^oC, более предпочтительно примерно 32^oC. Последующее введение боргидрида натрия (NaBH₄) восстанавливает Шиффовы основания и остающиеся альдегиды и обеспечивает стабильные, ковалентные связи, предпочтительно через одну или более аминных связей, между PMB и декстраном. Конъюгат предпочтительно очищают ультрафильтрацией, например с использованием мембраны, отсекающей молекулярную массу 10000, чтобы удалить остаточный PMB, неорганические побочные продукты (например бораты) и потенциальные низкомолекулярные продукты расщепления. Перед очисткой pH водной среды предпочтительно доводят до от примерно 5 до примерно 7.

Предпочтительное воплощение способа настоящего изобретения, таким образом, включает в себя: а) получают частично окисленный декстран взаимодействием декстрана с периодатом натрия; б) подвергают взаимодействию полимиксин B или его соль с полученным частично окисленным декстраном в водной среде при pH от примерно 9,3 до примерно 10 и температуре от примерно 30^oC до примерно 35^oC; d) добавляют боргидрид натрия к полученной водной среде; и г) очищают полученный конъюгат полимиксин B/декстран.

Изобретение также включает в себя водорастворимые конъюгаты (или их фармацевтически приемлемые соли) полимиксина B или его фармацевтически приемлемой соли и декстрана, причем эти конъюгаты имеют более высокую антиэндотоксиновую активность, чем антиэндотоксиновая активность неконъюгированного полимиксина B, для использования при профилактике или исцеляющем лечении синдрома системной воспалительной реакции и септического шока. Оно также включает в себя такие конъюгаты (и их фармацевтически приемлемые соли), получаемые способом, как определено выше, и такие конъюгаты (и их фармацевтически приемлемые соли), когда бы ни полученные способом, как описано выше: фармацевтические композиции, содержащие водорастворимый конъюгат (или его фармацевтически приемлемую соль) полимиксина B или его фармацевтически приемлемой соли и декстрана, как определено выше, совместно с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем; и применение этих конъюгатов (или их фармацевтически приемлемых солей) при получении медикамента для использования при профилактике и исцеляющем лечении синдрома системной воспалительной реакции и септического шока.

В способе настоящего изобретения, а также в конъюгатах, полученных посредством этого способа, молекулярное отношение PMB или его соли к декстрану составляет от примерно 1: 15 до примерно 200:1; более предпочтительно от примерно 1:2 до примерно 1:5; наиболее предпочтительно примерно 1,5:5.

Соль полимиксина B предпочтительно является фармацевтически приемлемой солью PMB. Конъюгат следует рассматривать как водорастворимый, если он имеет растворимость в воде при 20^oC около 25 мг/мл или более; предпочтительно около 50 мг/мл или более; более предпочтительно около 60 мг/мл или более; наиболее предпочтительно около 65 мг/мл или более при 20^oC.

Конъюгаты PMB/декстран (или их соли), получаемые по настоящему изобретению, могут быть использованы способом, сообразным с использованием самого PMB, а именно, они могут быть использованы либо самостоятельно, например как антибиотик для бактериальных или грибковых инфекций, либо в комбинации с другими бактерицидными и/или противовоспалительными препаратами. Их можно вводить в любой из форм, в которых обычно вводят нативный PMB, например внутримышечно, внутривенно, внутриоболочечно, подкожно или местно. Так, составы для внутримышечных инъекций обычно содержат эффективное количество конъюгата PMB/декстран (или его фармацевтически приемлемой соли) в стерильной воде, физиологическом растворе или примерно 1%-ном новокаинHCl. Внутривенные составы обычно содержат эффективное количество конъюгата в 15% декстрозе и стерильной воде. Внутриоболочечные составы, как правило, включают эффективное количество конъюгата в физиологическом растворе. Для местного офтальмологического применения эффективное количество может быть смешано с водой или физиологическим раствором, и возможно глицерином, и сульфатом меди для глазных капель, или оно может быть сделано в виде мази или суспензии. Кремы для местного применения, особенно для обожженной поверхности, обычно содержат эффективное количество конъюгата PMB/декстран (или его фармацевтически приемлемой соли) на базе неактивных ингредиентов, таких как жидкий вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, полиоксипропилен и эмульгирующий воск.

Очищенные конъюгаты PMB/декстран (или их фармацевтически приемлемые соли) настоящего изобретения по существу нетоксичны. Количество конъюгата настоящего изобретения, которое следует использовать, может быть определено в расчете на количество нативного PMB, которое обычно прописали бы конкретному пациенту с учетом таких факторов как патсостояние и возраст и вес пациента, а также активность конкретного используемого конъюгата. Благодаря повышенной эффективной активности конъюгата его пониженной токсичности и его увеличенной длительности действия, дозу можно сократить наполовину или больше по сравнению с нативным PMB.

Молекулярная масса конъюгатов настоящего изобретения может быть определена, например, с использованием жидкостной хроматографии исключения высокого разрешения (SEC-HPLC, TSK-GEL G4000 PWx1, элюируемой 40 мМ фосфатного буфера при pH 4,4, детектируемой малоугловым лазерным рассеянием) по отношению к декстрановому стандарту, имеющему средневесовую молекулярную массу (MW) 79800. Конъюгаты настоящего изобретения предпочтительно имеют средневесовую молекулярную массу (MW) от примерно 55000 до примерно 80000; более предпочтительно от примерно 60000 до примерно 80000: наиболее предпочтительно от примерно 63000 до примерно 76000.

Усовершенствованные конъюгаты настоящего изобретения имеют лучшую воспроизводимость по сравнению с конъюгатами, известными из уровня техники, и имеют более высокую антиэндотоксиновую активность, чем антиэндотоксиновая активность неконъюгированного полимиксина B. Конъюгаты настоящего изобретения имеют улучшенную антиэндотоксиновую активность, а именно, отношение неконъюгированного полимиксина B к конъюгатов изобретения больше, чем 1,0; предпочтительно больше, чем 1,25 или 1,3; более предпочтительно больше, чем примерно 1,4. Здесь означает концентрацию полимиксина B, как измерено с помощью анализа c карбоцианиновым красителем, которая аннулирует 50% сдвиг оптической плотности карбоцианинового красителя при 450 нм в присутствии 0,05 мг эндотоксина из E.coli. Здесь активность (%) определяют как следует ниже: Анализ с карбоцианиновым красителем представляет собой биохимический анализ in vitro, применяемый для измерения антиэндотоксиновых свойств полимиксина B и конъюгатов настоящего изобретения. Этот анализ представляет собой модифицикацию из предыдущих сообщений [Ogava и Kanoh, Microbiol. Immunol. 28 (1984), 1313-1323: Zey и Jackson, Applied Microbiol. 26 (1973), 129-133] , и он оптимизирован для использования в микротитровальных планшетах. В этом анализе конъюгат или неконъюгированный PMB (положительный стандарт) конкурирует с карбоцианиновым красителем (небольшое катионное соединение, которое меняет спектрофотометрическую оптическую плотность при связывании с эндотоксином) за эндотоксин.

Приготовление реагентов для карбоцианинового анализа проводят следующим образом: 1) готовят 0,15 М раствор ацетата натрия и 0,15 М раствор уксусной кислоты. Оба объединяют (40,2 мл 0,15 М ацетата натрия и 159,8 мл 0,15 М уксусной кислоты) с получением 0,03 М ацетатного буфера; 2) 8,0 мг карбоцианинового красителя растворяют в 12,5 мл этилового спирта. Это все разбавляют 37,5 мл ацетатного буфера. В результате получают конечный раствор красителя при 160 мкг/мл в 25% этаноле. Его держат на льду в темноте и перемешивают в течение по меньшей мере 30 мин; 3) серийные разведения PMB или каждого конъюгата приготавливают в 40 мМ фосфатном буфере (pH 7,4). Каждое разведение в шесть раз больше, чем его конечная концентрация тестирования; 4) после разрушения ультразвуком, эндотоксин E. coli 0111:B₄ разбавляют до 0,5 мг/мл 0,9% физиологическим раствором из заранее приготовленной, замороженной основной концентрации 1,0 мг/мл 0,9% физиологического раствора.

Устанавливают планшеты и проводят анализ с добавлением сначала образцов или буфера в колодцы микротитрационного планшета следующим образом: а) контрольный: 100 мкл физиологического раствора и 50 мкл 40 мМ фосфатного буфера (pH 7,4) в трех экземплярах; б) положительный стандарт: 100 мкл эндотоксина и 50 мкл 40 мМ фосфатного буфера (pH 7,4) в трех экземплярах; в) образцы PMB: 100 мкл эндотоксина и 50 мкл образцов PMB, в трех экземплярах; г) отрицательные стандарты: 100 мкл физиологического раствора и 50 мкл образцов конъюгата, в трех экземплярах; д) экспериментальный: 100 мкл эндотоксина и 50 мкл образцов конъюгата, в трех экземплярах.

Планшеты вращают в течение нескольких минут. В каждый колодец добавляют 150 мкл красителя, планшет заворачивают в фольгу и держат на льду и в темноте в течение 60 мин. Колодцы смешивают с помощью многоканальной пипетки и считывают немедленно при 450 нм с помощью планшет-ридера. Производят расчеты Рида-Менча для оценки IC₅₀.

Изобретение иллюстрируется следующими неограничивающими примерами. Все температуры указаны в градусах Цельсия.

Пример 1 А) Окисление декстрана В четырехгорлую 5-литровую круглодонную колбу загружают 2,31 л воды для инъекций и 150 г декстрана. Смесь перемешивают при 21-24^oC при приблизительно 140 об. /мин, чтобы растворить. Добавляют раствор 3,9 г периодата натрия в 60 мл воды для инъекций (слабо экзотермично, около 1^oC). Воронку для добавляемого раствора смывают 30 мл воды для инъекций. Полученную смесь выдерживают при 21-24^oC в течение 1 ч. Этот раствор фильтруют в вакууме через мембранный ацетатцеллюлозный фильтр Корнинга (Corning, 0,22 мкм, 90 мм мембрана) и нагревают до 30-32^oC и поддерживают при этой температуре.

Б) Получение раствора сульфат полимиксина B/боратный буфер Получение начинают за 45 мин до окончания окисления декстрана, фильтрования и нагревания, как указано выше в А). В 12-литровую 4-горлую круглодонную колбу загружают 3,00 л боратного буфера с pH 9,7 и доводят температуру буфера до 32^oC. Затем добавляют 45 г сульфата полимиксина B, и полученную суспензию перемешивают при 32^oC в течение 45 мин. Измеряют pH смеси (первоначально 9,4) и доводят до pH 9,7 при 32^oC добавлением 30 мл 5н NaOH.

Боратный буфер готовят следующим образом: в прогретую 5-литровую круглодонную колбу загружают 114,3 г десятиводного тетрабората натрия и 2,906 л (2,90 кг) воды для инъекций. Раствор нагревают до 32^oC и pH доводят до 9,7 (первоначально 9,3) добавлением 97 мл 5н NaOH. Раствор фильтруют в вакууме через стерильный мембранный ацетатцеллюлозный фильтр Корнинга (Corning, 0,22 мкм, 90 мм мембрана) и хранят.

В) Взаимодействие сульфата полимиксина B с окисленным декстраном Предварительно нагретый (30-32^oC) раствор окисленного декстрана (из стадии А) добавляют так быстро как можно к перемешиваемой смеси сульфата полимиксина B в боратном буфере при 32^oC (из стадии В). После того как добавление закончено, измеряют pH смеси (первоначально 9,5) и доводят до pH 9,7 добавлением 18 мл 5н NaOH. Смесь перемешивают при 32^oC в течение 1 ч. К этой гетерогенной смеси добавляют раствор 3,6 г боргидрида натрия в 50 мл воды для инъекций. Эту смесь перемешивают при 32^oC в течение 2 ч. К смеси добавляют другой свежеприготовленный раствор 3,6 г боргидрида натрия в 50 мл воды для инъекций. Смесь перемешивают в течение 2 ч при 32^oC. К этой смеси добавляют раствор 3,6 г боргидрида натрия в 50 мл воды. Нагревание прекращают и реакционной смеси дают возможность остыть до комнатной температуры, перемешивая в течение 14 ч. Измеряют pH реакционной смеси (10,0) и доводят pH до 5,7 добавлением 1,27 мл 1н HCl. Полученную смесь перемешивают в течение 10 мин после подкисления и фильтруют в вакууме через стерильный 0,22 мкм ацетатцеллюлозный мембранный фильтр Корнинга с получением 6,81 г раствора конъюгата полимиксин B/декстран, который оставляют для очистки.

Г) Очистка ультрафильтрацией Раствор конъюгата полимиксин B/декстран (из стадии В) очищают, используя предварительно обработанные Amicon CH2PRS блоки для ультрафильтрации с мембранными картриджами S1Y10. Очищенный продукт удаляют из фильтрационного блока и хранят замороженным при -25^oC.

Анализ полученного конъюгата показал, что этот продукт имеет следующие характеристики: активность = 124,7% содержание декстрана = 65,37 мг/мл общее содержание полимиксина B = 2,47 мг/мл содержание свободного полимиксина B = 0,65% отношение PMB/декстран = 37,71 мг PMB/г декстрана.

Оказывается, что при температуре реакции 32^oC и pH 9,5 полученный продукт реакции имеет активность, которая составляет около 125% от активности неконъюгированного PMB.

Пример 2 Повторяют способ примера 1 и получают конъюгат полимиксин B/декстран, имеющий следующие характеристики: активность = 125,8% содержание декстрана = 65,30 мг/мл общее содержание полимиксина B = 2,49 мг/мл содержание свободного полимиксина B = 0,67% отношение PMB/декстран = 38,06 мг PMB/г декстрана Снова, при реакционной температуре 32^oC и pH 9,5 полученный конъюгат имеет около 126% активности по сравнению с неконъюгированным PMB.

Пример 3 Конъюгаты полимиксин B/декстран получают в соответствии со способом примера 1 (кроме как указано) для определения влияния температуры реакции PMB с декстраном при pH 9,7. Полезную нагрузку (мг PMB/г декстрана), среднюю (мкг/мл) и активность (%) определяют. Результаты представлены в табл. 1.

Из примера 3 очевидно, что когда температуру реакции понижают до 10^oC при pH 9,7 полученный продукт имеет пониженную активность.

Пример 4 Конъюгаты полимиксин B/декстран получают в соответствии со способом примера 1 (кроме как указано), чтобы определить влияние pH взаимодействия PMB с декстраном. Полезную нагрузку (мг PMB/г декстрана), среднее значение (мкл/мл) и активность (%) определяют как в примере 3. Результаты представлены в табл. 2.

Данные в табл. 2 показывают, что снижение температуры реакции до 32^oC при pH между 9,5 и 9,7 еще дает возможность получения конъюгата, имеющего активность, которая выше активности несвязанного PMB (примеры 4м, 4о и 4п), в то время как дальнейшее увеличение pH до pH 10, не особенно выгодно (пример 4р).

Пример 5 Конъюгаты полимиксин B/декстран получают как в примере 1 (кроме как указано) и измеряют их антиэндотоксиновая активность. Результаты представлены ниже в табл. 3.

Результаты табл. 3 далее подтверждают, что оптимальные условия создаются при температуре реакции примерно 32^oC и pH от примерно 9,5 до примерно 10, предпочтительно от примерно 9,5 до примерно 9,7.

Вообще, данные в примерах 1-5 показывают, таким образом, что использование температуры реакции от примерно 30^oC до примерно 35^oC, предпочтительно около 32^oC, и pH от примерно 9,3 до примерно 10, предпочтительно от примерно 9,5 до примерно 9,7, в результате дает улучшенные конъюгаты настоящего изобретения.

Формула изобретения

1. Способ получения водорастворимого конъюгата (или его соли) полимиксина В или его соли и декстрана, при котором полимиксин В или его соль подвергают взаимодействию с декстраном в водной среде при pH от 9,3 до 10 и температуре от 30 до 35^oC.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что pH составляет от примерно 9,5 до примерно 9,7.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что температура составляет примерно 32^oC.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что соль полимиксина В представляет собой сульфат полимиксина В.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что молекулярное отношение полимиксина В или его соли к декстрану составляет от примерно 1:15 до примерно 200: 1.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что декстран имеет средневесовую молекулярную массу от примерно 63000 до примерно 76000.

7. Способ по п.1 отличающийся тем, что используют частично окисленный декстран.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что pH поддерживают с использованием боратного буфера.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что боратный буфер содержит тетраборат натрия.

10. Способ по п.1, который включает в себя последующее взаимодействие с боргидридом натрия.

11. Способ по п. 1, для получения водорастворимого конъюгата (или его соли) полимиксина В или его соли и декстрана, при котором: а) получают частично окисленный декстран взаимодействием декстрана с периодатом натрия; б) подвергают взаимодействию полимиксин В или его соль с полученным частично окисленным декстраном в водной среде при pH от 9,3 до 10 и температуре от 30 до 35^oC; в) добавляют боргидрид натрия к полученной водной смеси; и г) очищают полученный конъюгат.

12. Водорастворимый конъюгат (или его фармацевтически приемлемая соль) полимиксина В или его фармацевтически приемлемой соли и декстрана, полученный способом по п.1 или 11.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая водорастворимый конъюгат (или его фармацевтически приемлемую соль) полимиксина В или его фармацевтически приемлемой соли и декстрана, как определено в п.12, совместно с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3