Способ культивирования, фибробласт, способ отделения клеток

Способ культивирования, фибробласт, способ отделения клеток

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выращивания культур гемопоэтических клеток. Культивирование стволовых клеток человека осуществляют ex vivo в жидкой культуральной среде с заменой среды со скоростью 50-100% ежедневного замещения при плотности клеток 110⁴-110⁷ на 1 мл среды. Культивирование проводят в присутствии факторов роста и/или трансформированных стромальных клеток, секретирующих фактор роста. Дополнительно в среду культивирования добавляют вектор переноса гена, обеспечивающий получение стабильной генетической трансформации. Для отделения неопластических клеток от нормальных на гемопоэтические клетки, объединенные со стромальными клетками, воздействуют потоком жидкости, создающим сдвиговое напряжение, равное или более 1,0 дин/см². Изобретение позволяет оптимизировать выращивание стволовых клеток и клеток-предшественников. 3 с. и 18 з.п. ф-лы, 8 табл., 5 ил.

Настоящее изобретение относится к методам, биореакторам и композициям для культивирования и трансформации клеток млекопитающих в культуральной среде, в частности для выращивания и трансформации культур гемопоэтических клеток.

Все форменные элементы крови у здорового взрослого человека, в том числе эритроциты, лейкоциты, тромбоциты и лимфоциты, вырабатываются в костном мозге как клетки-предшественники при дифференцировке. Эти клетки в свою очередь продуцируются из очень зрелых клеток, называемых недифференцированными клетками-предшественниками, которые, как показывает анализ, продуцируют колонии зрелых гемоцитов в 1-3-недельных культурах в полутвердой среде, например метилцеллюлозе или агаре. Указанные клетки-предшественники по существу происходят из класса клеток-предшественников, называемых стволовыми клетками. Стволовые клетки обладают способностью при делении как к самоподдержанию, так и самодифференцировке в недифференцированных клетках-предшественниках. Таким образом, стволовые клетки при делении продуцируют как клетки эмбриобласта, так и несколько более дифференцированные клетки-предшественники. Кроме продуцирования гемоцитов стволовые клетки могут также повышать выход остеобластов и остеокластов и, возможно, клеток других тканей. В данном описании раскрываются методы и композиции, которые впервые позволяют осуществлять успешное культивирование in vitro гемоцитобластов, приводя к их пролиферации и дифференцировке в клетках-предшественниках и более зрелых гемоцитах.

В конце 1970-x годов были получены суспензионные культуры клеток для выращивания in vitro гемопоэтических клеток костного мозга. Эти культуры обладают большой эффективностью как при исследованиях процесса кроветворения здоровых и лейкозных клеток, так и в экспериментах по пересадке костного мозга, например для ретровирусного переноса генов. Указанные культуры позволили детально изучить гемопоэз у мышей и полностью понять их систему кроветворения. Более того, проведенные исследования позволили осуществить ретровирусный перенос генов в культивируемые клетки костного мозга мышей. В результате этого стало возможным получение меченых мышиных гемопоэтических клеток, поддерживающих существование многоядерной стволовой клетки, и изучение различных генов в процессе лейкемогенеза.

И хотя стало возможным осуществлять перенос ретровирусных генов в культивируемые мышиные остеоциты, однако такой перенос был еще возможен в клетки костного мозга человека, поскольку до настоящего времени культуры декстеровского типа (долгоживущие культуры клеток костного мозга) ограничены как продолжительностью их жизни, так и их способностью обеспечивать выживаемость стволовых клеток и продуцировать клетки-предшественники в течение всего срока жизни.

Суспензионные культуры клеток костного мозга человека, как установлено на первоначальном этапе, имеют ограниченный потенциал кроветворения, в результате чего снижается выход клеток-предшественников и зрелых гемоцитов, причем синтез клеток прекращается к 6-8-й неделе. Последующие модификации первоначально полученной суспензионной культуры привели лишь к улучшению методов культивирования. Решение указанной проблемы имеет такое огромное значение, которое невозможно оценить, поскольку это позволило бы, например, реплицировать стволовые клетки человека и клетки-предшественники для трансплантации костного мозга и защиты от воздействия химиопрепаратов, выбирать и проводить различные манипуляции с такими клетками, то есть использовать для генного переноса и синтезировать зрелые гемоциты человека для трансфузионной терапии.

В результате исследований гемопоэза и культивирования клеток костного мозга установлено, что внутри адгезивных слоев в качестве центральных элементов клеточной стромы выступают фибробласты и эндоциты. Указанные клетки как создают активные центры связывания для роста гемопоэтических клеток, так и их можно индуцировать для секреции гемопоэтических факторов роста, стимулирующих пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников. К указанным гемопоэтическим факторам роста относятся гранулоцит-колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцит-макрофар-колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и интерлейкин-6 (IL-6).

Культивирование человеческих остеоцитов на таких адгезивных слоях in vitro, однако, не дало обнадеживающих результатов. В отличие от аналогичных культур родственных видов, например как землеройки и тупайи, суспензионные культуры остеоцитов человека не способны обеспечить продуцирование значительного количества как не связанных с субстратом гемопоэтических клеток-предшественников, так и клоногенных клеток-предшественников в течение 6-8 недель. И хотя из литературы известно о непрерывно продуцирующих культурах в течение 3-5 месяцев, нигде не сообщается о культуральных средах, которые обеспечивают стабильный непрерывный синтез клеток-предшественников из стволовых клеток в течение более 4-6 недель.

Более того, внеклеточный синтез и продуцирование клеток-предшественников в течение даже такой непродолжительной жизни указанных культур обычно снижались настолько, чтобы понять, что эти культуры вообще не обеспечивают выживаемость или пролиферацию стволовых клеток. К тому же неактивированные клетки стромы костного мозга, исследуемые в изолированном состоянии, секретируют незначительное количество, если его вообще можно определить, гемопоэтических факторов роста (HGF).

Отсутствие стабильного синтеза клеток-предшественников и зрелых клеток крови в указанных культурах дало убедительное основание считать, что они не способны обеспечить поддержку для непрерывной регенерации и увеличения продукции стволовых клеток. Исходя из этого было выдвинуто предположение о том, что указанные культуры либо не содержат критического стимулятора (стимуляторов) стволовых клеток и/или содержат новый их ингибитор (ингибиторы). Но одновременно с объяснением неудачи в выявлении культур гемопоэтических факторов роста и неиндуцируемых стромальных клеток была выдвинута нулевая гипотеза, объединившая неудачу по выявлению HGF и относительные недостатки суспензионных культур человеческих остеоцитов, о том, что такие системы непрерывного культивирования, используемые in vitro, не обеспечивают полного восстановления гемопоэза исходных клеток стромы костного мозга in vivo.

Увеличение объема стволовых клеток и клеток-предшественников для трансплантации костного мозга является потенциальной областью использования долгоживущих культур человеческих остеоцитов. В настоящее время используют аутологичную и аллогенную трансплантацию костного мозга человека в качестве методов лечения таких болезней, как лейкемия, лимфома, и других угрожающих жизни системных заболеваний. Однако для проведения такой терапии необходимо наличие большого количества донорского костного мозга, которое обеспечивало бы требуемое количество клеток для успешного их приживления.

Культура, обеспечивающая увеличениe объема продукции стволовых клеток и клеток-прогениторов, снижает потребность взятия большого количества донорского костного мозга и позволяет брать небольшое количество клеток костного мозга, а затем увеличивать количество стволовых клеток и клеток-прогениторов in vitro перед введением их реципиенту. Известно также, что небольшое количество стволовых клеток и клеток-предшественников циркулирует в системе кровообращения. Если такие клетки можно было бы собрать электрофоретическими методами и увеличить их объем, тогда стало бы возможным получение необходимого количества стволовых клеток и клеток-предшественников для трансплантации из периферической крови, и отпала бы необходимость взятия донорского костного мозга.

При трансплантации костного мозга необходимо введение примерно 1х10 - 2х10 мононуклеарных клеток костного мозга на 1 кг веса больного для их приживления. Для получения такого количества клеток необходимо взять донорского костного мозга в количестве примерно 70 мл мозга на 70 кг веса донора. И хотя 70 мл составляет небольшую долю костного мозга у доноров, процедура ее взятия требует значительных затрат времени и восполнения большой кровопотери в процессе ее проведения. Если продукцию стволовых клеток и клеток-предшественников можно было бы увеличить в 10 раз, то эта процедура значительно сократилась бы и, возможно, была бы сведена только к забору таких клеток из периферической крови с последующим размножением их in vitro.

Увеличение продукции клеток-предшественников также пригодно в качестве заместительной поддерживающей терапии к химиотерапии и представляет собой другой аспект применения долгоживущих клеточных культур костного мозга человека. Дилемма, с которой сталкиваются врачи-онкологи, заключается в том, что большинство химиотерапевтических препаратов, применяемых для разрушения раковых клеток, оказываeт губительное воздействие на все клетки, проходящие через цикл клеточного деления. Костный мозг является одной из самых производительных тканей в организме и, следовательно, часто относится к органу, который в первую очередь подвергается разрушению при воздействии химиотерапевтических препаратов. Это приводит к быстрому нарушению процесса кроветворения при лечении химиотерапевтическими препаратами, и поэтому необходимо прервать курс для восстановления гeмопоэза, прежде чем продолжить такое лечение. Может потребоваться месяц и даже более, чтобы покоящиеся стволовые клетки смогли поднять до требуемого уровня количество лейкоцитов, чтобы возобновить курс химиотерапии, в течение которого неоднократно происходит снижение количества эритроцитов. К несчастью, хотя лейкоциты восстанавливаются только в промежутках между курсами химиотерапии, у раковых клеток имеется время для их роста, и возможно повысить их резистентность к химиопрепаратам вследствие их природной избирательной способности.

Для сокращения промежутков между проводимыми курсами химиотерапии большое количество клеток-предшественников и незрелых клеток крови могло бы нормализовать состояние больного. Это оказало бы влияние на значительное уменьшение промежутков времени, когда у больного отмечается низкий показатель форменных элементов крови, что позволило бы быстрее возобновить курс химиотерапии. Чем продолжительнее курс химиотерапии и короче промежутки между приемами химиотерапевтических препаратов, тем больше вероятность успешного излечения ракового заболевания. Гемопоэтические клетки, необходимые для увеличения продукции клеток-предшественников можно получить либо путем взятия донорского костного мозга, либо сбором клеток из периферической крови. Харвестеры костных клеток обеспечивают сбор примерно 4x10 гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единиц (CFU-GM) клеток-предшественников. При электрофорезе 5 л периферической крови обычно собирают примерно 10 CFG-GM, хотя это количество можно повысить до 10 предварительным введением донору GM-CSF-фактора. Для быстрой нормализации состояния больного необходимо вливание примерно 1x10 - 5x10 CFU-GM, что примерно в 100-1000 раз больше количества, которое получают рутинной процедурой взятия костного мозга у донора или сбором клеток из периферической крови. Таким образом, увеличение продукции клеток из донорского костного мозга или их сбора из периферической крови для повышения количества CFU-GM на 2-3 порядка оказывает значительное влияние на использование и лечение раковых болезней химиопрепаратами.

Генная терапия относится к самой быстро развивающейся области медицины, и лечебный потенциал которой также трудно оценить. Генные методы терапии имеют множество потенциальныx применений при лечении заболеваний (см., например, Boggs, Int. J. All Cloning (1990), 8:80-96, Kohn и др., Cancer Invest. (1989), 7 (2):179-192, Lehn. Bone Marrow Transp. (1990), 5:287-293 и Verma, Scientific Amer., (1990), стр. 68-34. Генетически трансформированные стволовые клетки человека обладают широким диапазоном потенциальных применений в клинической медицине в качестве лекарственных средств генной терапии.

Однако имеется несколько проблем, которые необходимо преодолеть для успешного проведения генной терапии. Первая проблема заключается в обеспечении возможности введения требуемого лечебного гена в заданные клетки. Во-вторых, указанный ген должен быть соответствующим образом экспрессирован в клетке-мишени, в результате чего обеспечиваeтся требуемая концентрация генного продукта. И, наконец, продуцируемые РНК или белок должны быть надлежащим образом процессированы клеткой-мишенью, чтобы обеспечить их функциональную активность, то есть чтобы генная терапия оказывала влияние на клиническую картину лечения заболевания. В таблице 1 приведенo несколько методов инсерции гена в человеческие клетки in vitro.

Также во многих лабораториях находятся в стадии разработки другие такие методы, например как гомологичная рекомбинация. Исследования в области генной терапии проводились в течение нескольких лет на нескольких видах клеток in vitro, затем продолжены на животных, и, наконец, недавно вступили в первую стадию клинической проверки на человеке.

Система кроветворения является идеальным материалом в качестве системы доставки генного продукта в генной терапии. Гемопоэтические клетки легко доступны посредством вытяжки костного мозга или с помощью сбора мононуклеарных клеток из периферической крови. Сразу же после осуществления генетической инсерции in vitro обработанные клетки можно повторно ввести внутривенным вливанием, после чего генетически трансформированные клетки возвращаются на свое место и продолжают расти в костном мозге. Поскольку зрелые клетки крови циркулируют по всему организму, генетические модифицированные клетки могут доставлять специфический генный продукт к любой ткани-мишени.

Наиболее важное значение имеет то, что ткань органов кроветворения содержит стволовые клетки, которые обладают огромным потенциалом (возможно неограниченным) к самовосстановлению. Под этим имеется в виду то, что если обеспечена стабильная трансдукция генетического материала в такие стволовые клетки, то при реинфузии гемопоэтической ткани эти модифицированные стволовые клетки способны к разрастанию и репопуляции в мозговой ткани вместе с клетками, обеспечивающими экспрессию нового гена. Это приводит к долговременной, возможно в течение всего цикла их жизни, доставке требуемого генного продукта. Аналогично этому успешный стабильный генный перенос в стволовые клетки, расположенные в других органах, или эмбриональные стволовые клетки также приводит к непрерывной долговременной доставке генного продукта.

Генная терапия при использовании гемопоэтических стволовых клеток имеет широкий диапазон применений как для лечения заболеваний, специфических к системе кроветворения, так и системных болезней других органов. B рамках гемопоэтической системы генную терапию стволовыми клетками можно применять для лечения как наследственных, так и приобретенных заболеваний. Так, например, состояния, связанные с дефицитом гемоглобина, в частности альфа- и бета-талассемия, можно лечить путем интродукции гена, кодирующего глобин альфа- или бета-цепи в комбинации с регуляторными последовательностями, которые передают эритроцитам высокое тканеспецифичное сродство (см. Grosvell и др. , Cell, (1987), 51:975-986). Аналогичным образом можно корректировать серповидно-клеточную анемию путем генетической инсерции гена фетального глобина в гемопоэтические стволовые клетки, так как регулируемая экспрессия высоких концентраций эмбрионального гемоглобина достаточна для предупреждения выработки серповидно-клеточных эритроцитов несмотря на копрезентацию гемоглобина серповидных клеток (см. Sunshine и др., J. Molec. Biol. (1979), 133:435).

Генетическое нарушение нейрофилов, обусловленное недостаточной функциональной активностью белков, например как недостаточность лимфоцитективирующей детерминанты (LAD) или хронический гранулематоз (CGD), можно успешно лечить путем генетической инсерции гена, кодирующего дефектный или потерянный ген, в комбинации с регуляторными ДНК-последовательностями, передающими высокую степень тканеспецифической экспрессии в гемопоэтические стволовые клетки (см. Wilson и др., Science (1990), 248:1413-1416). Наследственные болезни, в том числе тромбопатию, например как ангиогемофилия, можно лечить инсерцией гена, кодирующего например, фактор Биллебранда в комбинации с последовательностями, регулирующими его экспрессию и секрецию.

Особенно очевидна пригодность генной терапии на основе гемопоэтических стволовых клеток для замены врожденно дефектных генов при лечении лимфоцит-опосредованных иммунодефицитных комплексов, например как ярко выраженных иммунодефицитных состояний, обусловленных недостатком аденозиндезаминазы. Ретровирусная генная терапия циркулирующих T-клеток в комбинации с геном, кодирующим аденозиндезаминазу, как установлено, эффективнa для уменьшения клинической картины у пациентов с иммунной недостаточностью, однако эти эффекты носят только временный характер, поскольку трансфектированные T-лимфоциты имеют ограниченный период жизни in vivo (см. Kasid и др., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) (1990), 37:473-477, или Culver и др., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) (1991), 38:3155-3159). Если указанный ген можно было бы успешно переносить в такие гемопоэтические стволовые клетки, то любая T-клетка, продуцированная из этих стволовых клеток, содержала бы и экспрессировала ген аденозиндезаминазы. Таким образом, ввиду того, что трансфектированные стволовые клетки обладают способностью к выживанию и быстрому размножению в течение всей жизни больного, T-клеточно-опосредованную недостаточность ADA обычно лечат методом поддерживающей терапии путем переноса гена в стволовую клетку (см. Wilson и др., Proc. Natl. Acad. Sci., (USA) (1990), 87:439-443).

Кроме врожденных нарушений ферментативных процессов системы кроветворения, метод генной терапии на основе стволовых клеток можно было бы использовать для защиты эмбриональных клеток и их клеток-предшественников от токсичного воздействия экзогенных факторов, например вирусов и химиотерапии. Так, например, установлено, что перенос гена ДНК-последовательности, кодирующей сайт связывания антигенреактивных T-лимфоцитов (TAR) трансактивирующего фактора TAT ВИЧ, обеспечивает защиту T-клеток от распространяющейся ВИЧ-инфекции (см. Sullenger и др., Cell, (1990), 63:601-608). Стабильная трансдукция указанных последовательностей в гемопоэтические стволовые клетки ведет к агрегации T-клеток, продуцированных из этих стволовых клеток, которые относительно или абсолютно резистенты к распространению ВИЧ-инфекции.

Аналогичным образом успешная трансфекция генов, кодирующих ген устойчивости к комбинированным препаратам (MDR), в гемопоэтические стволовые клетки костного мозга, которые относительно резистентны к эффектам противоракового химиотерапевтического лечения. После проведения аутологичной трансплантации костного мозга на основе таких генетически трансформированных клеток больные смогут легче переносить терапию химиопрепаратами, от воздействия которых защищали стволовые клетки вследствие глубокого угнетения функции костного мозга, которую вызывают эти противораковые препараты. В результате этого больные смогут принимать более эффективные дозировки противораковых химиопрепаратов с меньшей их токсичностью.

Каждый может легко понять, что генная терапия на основе кроветворных стволовых клеток также пригодна для лечения приобретенных болезней системы кроветворения, например, лейкемии, лимфомы и апластической анемии. Сразу же после установления генетической природы указанных болезней введение генного продукта, который либо устраняет причину патологии гена в клетке, либо непосредственно сам ген (возможно сплайсингом или заменой самого гена), обеспечивает коррекцию отклонения от нормы.

На более широком уровне, однако, генную терапию на основе гемопоэтических стволовых клеток можно также использовать для лечения болезней, не относящихся к системе кроветворения. Генный перенос ДНК-последовательностей, несущих лекарственные растворимые белки, может привести к получению зрелых клеток крови, которые непрерывно секретируют требуемое количество лечебных молекул. Так, например, этот метод можно также использовать для лечения, например, сахарного диабета путем введения ДНК-последовательностей инсулина в комбинации с регуляторными ДНК-последовательностями, обеспечивающими надлежащую экспрессию трансфектированного гена инсулина, возможно в ответ на повышение содержания сахара в плазме крови. Системную гипертензию можно лечить путем генетической инсерции стволовых клеток с ДНК-последовательностями, кодирующими секреторные пептиды, которые действуют в качестве конкурентного ингибитора относительно ангиотензин-конвертазы, кальциевых канальцев сосудистой сети ровной мышцы или адренорецепторов. Болезнь Альцгеймера, по всей вероятности, можно лечить путем генетической инсерции в стволовые клетки ДНК-последовательностей, кодирующих ферменты, разрушающие амилоидные бляшки в центральной нервной системе.

Таким образом, известно множество применений генной терапии, в частности введение генного продукта в стволовые клетки (см. выше Boggs и др., Kohn и др. , и/или Verma и др.). И, конечно, имеется множество случаев некоторого прогресса в обеспечении переноса лечебного гена в дифференцированные стволовые клетки человека, как описано, например, в случае T-лимфоцитов (см., Kalsd и др., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) (1990), 37:473-477, и Culver и др., Proc. Nar. Acad. Sci. (USA) (1991), 88:3155-3159).

К несчастью, до создания настоящего изобретения обеспечение стабильного переноса генов в человеческие стволовые клетки было неуспешным. Хотя несколько групп исследователей продемонстрировали возможность реализации ретровирус-опосредованного переноса генов в человеческие гемопоэтические клетки, была неудачной попытка трансфекции примитивных элементов кроветворных стволовых клеток человека. Результаты таких исследований резко отличаются от экспериментов, проводимых на мышах, которые показали возможность осуществления ретровирус-опосредованного переноса генов в гемопоэтические стволовые клетки человека (см. Wilson и др., Pro. Nat. Acad. Sci. (USA) (1990), 87:439-443).

Основная трудность для успешного проведения генной терапии на основе гемопоэтических стволовых клеток человека заключалась в невозможности обеспечить вставку генов в человеческие гемоциты в условиях деления и пролиферации стволовых клеток. Для успешной устойчивой инсерции гена в клетку-мишень необходимо, чтобы такая клетка-мишень прошла по крайней мере один цикл клеточного деления. Таким образом, если стволовые клетки не делятся в присутствии целевого генетического продукта, то этот продукт вводится нестабильно в такие стволовые клетки. Перед созданием настоящего изобретения отсутствовала какая-либо система, которая поддерживала бы ex vivo деление и пролиферацию человеческой стволовой клетки и позволила бы осуществить успешную генетическую трансформацию таких стволовых клеток.

В объем литературы, релевантной настоящему описанию изобретения, входит также патент США N 4721096, в котором раскрыта 3-мерная система, включающая стромальные клетки для роста гемоцитов. См. также противопоставленные в данном описании источники Glanville и др., Nature (1981), 292: 267-269 - описывает генный продукт мышиного металлотионеина; Wong и др., Science (1985), 228: 810-815 описывает человеческий фактор GM-CSF; Lemischka и др., Cell (1986), 45:817-927 описывает ретровирус-опосредованный перенос гена в качестве маркера гемопоэтических стволовых клеток и методику слежения развития указанных клеток после их трансплантации; Yang и др., Cell (1986), 47: 3-10 описывает получение человеческого интерлейкина-3; Chen и др., Mol. Cell. Biol. (1987). 7: 2745-2752 описывает трансформацию клеток млекопитающих плазмидной ДНК; Greaves и др., Cell (1989), 58: 979-986 описывает человеческий ген CD2; Civin и др., J. Immunol. (1984), 133:1576 раскрывает антиген CD34; Martin и др., Cell (1990), 63: 20-211 описывает человеческий S-CSF; Forrester и др., J. Cell Science (1984), 70: 93-110 описывает проточную камеру для параллельного иммунноэлектрофореза; Coulembel и др., J. Clin. Invest., (1986), 75: 961 описывает дефицит CML клеток в статических культурах.

С учетом вышеизложенного имеется большая потребность разработки методов и композиций для ex vivo репликации и стабильной генетической трансформации человеческих стволовых клеток и оптимизации культур человеческих гемопоэтических клеток-предшественников, особенно в свете огромных потенциальных возможностей увеличения выхода стволовых клеток и клеток-предшественников, а также расширения возможностей генной терапии, которую обеспечивают указанные системы. К несчастью, до настоящего времени попытки решения указанных проблем не оправдали надежд.

Раскрытие сущности изобретения В соответствии с вышеизложенным целью настоящего изобретения является создание новых методов, в том числе культуральных условий и реакторов, для ex vivo репликации и стабильной генетической трансформации человеческих стволовых клеток.

Другой целью настоящего изобретения является создание новых методов, в том числе культуральных условий и реакторов, для оптимизации (I) культур человеческих гемопоэтических клеток-предшественников и (II) стабильно генетически трансформированных человеческих гемопоэтических клеток-предшественников.

Настоящее изобретение основано на результатах проведенных автором исследований, в ходе которых разработаны новые методы, в том числе культуральные условия и реакторы, для ex vivo репликации и стабильной генетической трансформации человеческих стволовых клеток и/или для оптимизации культур человеческих гемопоэтических клеток-предшественников. В основе указанных методов лежит культивирование человеческих стволовых клеток и/или человеческие гемопоэтические клетки-предшественники в жидкой культуральной среде, которую заменяют, предпочтительно перфузированную, либо непрерывно, либо периодически при расходе 1 мл среды на 1 мл культуры через примерно от 24 до 48 ч с последующим удалением метаболитов и восполнением дефицита питательных веществ, одновременно поддерживая физиологически приемлемое состояние указанной культуры. В особенно предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения одновременно с заменой вышеуказанной среды прибавляют к указанной культуральной среде гемопоэтические факторы роста.

В ходе создания настоящего изобретения авторы неожиданно установили, что возрастание интенсивности обмена в указанной среде, которую используют в соответствии с настоящим изобретением, с факультативным добавлением гемопоэтических факторов роста в быстро изменяющейся культуральной среде (1) обеспечивает жизнеспособность культур, в которых происходит разрастание человеческих стволовых клеток в течение продолжительного промежутка времени - порядка 5 месяцев, (2) обеспечивает поддержку культурам, в которых происходит генерация человеческих гемопоэтических клеток-предшественников путем деления и дифференцировки человеческих стволовых клеток в течение продолжительного промежутка времени порядка - 5 месяцев и (3) стимулирует повышенный обмен веществ человеческих стромальных клеток и высвобождение из них GM-CSF фактора, в том числе из клеток стромы человеческого костного мозга. Настоящее изобретение позволяет впервые обеспечить выживаемость человеческих стволовых клеток и их пролиферацию в культуре.

Настоящее изобретение также предлагает систему ex vivo, которая обеспечивает непрерывную пролиферацию человеческих стволовых клеток, что позволяет успешно ввести генетический продукт в человеческие стволовые клетки, приводя тем самым к получению стабильно генетически трансформированных человеческих стволовых клеток. Этот вариант осуществления предлагаемого изобретения можно использовать для переноса любого генетического материала, который можно ввести как методом генетической инженерии в рекомбинантный ретровирус, так и любым вектором генного переноса, для которого необходимо клеточное деление. Генетически трансформированные стволовые клетки человека, полученные в соответствии с предлагаемым методом можно использовать для лечения широкого спектра вышеназванных болезней.

Настоящее изобретение предлагает также способы для повышения эффективности переноса генетического материала в человеческие гемопоэтические клетки-предшественники в сочетании с методами, обеспечивающими стабильную генетическую трансформацию человеческих стволовых клеток и/или человеческих гемопоэтических клеток-предшественников.

Настоящее изобретение также предлагает биореакторы и составы, которые обеспечивают эффективную пролиферацию человеческих клеток в культуре, особенно клеток на ранних стадиях их созревания, включая стволовые клетки. В указанных методах используют клетки стромы, трансформированных стандартными методиками, которые обеспечивают постоянное или индуцируемое продуцирование факторов роста, причем указанные клетки изолированы для возможности более легкого выделения гемопоэтических клеток. Обеспечивая непрерывную перфузию и рециклинг соответствующих клеток, можно значительно повысить плотность распределения жизнеспособных гемопоэтических клеток и их выход. В биореакторе в качестве исходного материала используют белковый носитель для стромальных клеток. Эта белковая мембрана или другие подложки обеспечивают отделение стромальных и гемопоэтических клеток.

Краткое описание чертежей.

На фиг. 1 показан схематический вид перфузионной камеры.

На фиг. 2 показаны схематический вид и технологическая схема прохождения перфузата.

На фиг. 3А показан схематический вид проточной камеры для измерения напряжения сдвига при разделении клеток.

На фиг. 3В показана боковая проекция проточной камеры по фиг. 3А.

На фиг. 3С показан графический профиль сдвигового напряжения гемопоэтических клеток.

На фиг. 4А и 4В показаны горизонтальная и боковая проекции проточной камеры для выращивания и отделения гемопоэтических клеток.

На фиг. 5А и 5В показан перспективный вид проточной камеры, где последовательно удаляют подложки для возможности непрерывного выращивания стромальных клеток.

Предпочтительный пример осуществления изобретения.

Преимущества настоящего изобретения можно наблюдать при его использовании применительно к любой стандартной системе жидких культур человеческих стволовых и/или клеток-предшественников, например как установленовленная в гемопоэтической клеточной культуре (культурах). При использовании методики с быстрой заменой культуральной среды, которую применяют согласно изобретению в комбинации с необязательным прибавлением к ней факторов роста гемопоэтических клеток, авторы неожиданно обнаружили, что это позволяет создавать стандартные системы суспензионных культур человеческих гемопоэтических клеток, которые включают культуры, действующие в присутствии или отсутствии сыворотки или плазмы крови животного, включая лошадиную, бычью, фетальную телячью или человеческую сыворотки.

Суспензионные культуры человеческих гемопоэтических клеток, которые пригодны для использования согласно настоящему изобретению, можно приготовить при плотности распределения клеток от 10⁴ до 10⁹ клеток на 1 мл культуры при использовании стандартных общеизвестных компонентов для получения питательных сред, например как среда Дульбекко, модифицированная по методу Исков (IMDM), модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM), минимальная незаменимая среда (MEM), среда RPMI 1640, среда Альфа или МcCoy's среда, которые можно использовать в комбинации с сывороточным альбумином, холестеролом и/или лецитином, селеном и неорганическими солями. Как указывалось ранее, к указанным культурам можно прибавлять кортикостероиды, например гидрокортизон при концентрации 10^-4 - 10^-7 М, или другие кортикостероиды в такой же дозировке, например кортизон, дексаметазон или солюмедрол. Культивирование обычно проводят при pH, приближающейся к pH организма, то есть в интервале от 6,9 до 7,4. Культуральную среду обычно выдерживают в кислородсодержащей атмосфере, включающей от 4 до 20 об.%, предпочтительно от 6 до 8 об.% кислорода.

При использовании таких стандартных методов выращивания используемую клеточную массу можно восполнить до требуемого размера, например до 10³-кратного количества или даже более либо за счет содержания стволовых клеток, либо за счет гемопоэтических клеток-предшественников. Для обеспечения такого обогащения можно использовать общеизвестные методы в соответствии либо с методами избирательной отрицательной реакции, либо избирательной положительной реакции. Так, например, для избирательной отрицательной реакции зрелые клетки удаляют при использовании методов иммуноанализа, например, введением меток в не содержащие стволовых клеток или клеток-предшественников пулы при использовании микропланшета с мышиными античеловеческими моноклональными антителами с последующим удалением покрытых мышиными антителами клеток при адгезии их на пластиковых чашках, покрытых кроличьим-антимышиным Ig (см. , например, Amerson и др., J. Clin. Invest. (1985), 76: 1286-1230).

В основе предлагаемого изобретения лежит фундаментальное изменение условий культивирования суспендированных человеческих клеток костного мозга при использовании любого из вышеуказанных условий поддержания культуры, быстрое восполнение питательной среды. В соответствии со стандартной методикой культивирования предлагаемого изобретения необходимо осуществлять замену питательной среды и сыворотки каждую неделю, то есть либо проводить полную их замену еженедельно, либо половину среды и половину сыворотки два раза в неделю. В соответствии с предлагаемым изобретением питательную среду указанной культуры заменяют предпочтительно в виде перфузата, либо непрерывно либо периодически, при расходе примерно 1 мл среды на 1 мл культуры в течение примерно от 24 до 48 ч, причем плотность культивируемых клеток составляет от 2x10 до 1x10 клеток на 1 мл среды. Для обеспечения плотности распределения клеток от примерно 1x10 до 2x10 клеток на 1 мл при восполнении можно использовать такое же самое количество питательной среды. Для увеличения плотности клеток более 10 клеток на мл необходимо увеличить расход заменяемой среды пропорционально, чтобы обеспечить расход среды и сыворотки на постоянном уровне в расчете 1 кл. в единицу времени.

Восполнение питательной среды в соответствии с предлагаемым изобретением можно осуществлять любым методом, который обеспечивает ее восстановление, например путем взятия аликвоты отработанной культуральной среды и заменой ее свежей аликвотой. Указанную аликвоту можно прибавлять самотеком либо с помощью насоса или других подходящих для этого средств. Поток среды может поступать в любом направлении или можно использовать множество потоков, подаваемых из различных направлений в зависимости от конфигурации и носителя культуры. Предпочтительно, чтобы свежая питательная среда поступала так, чтобы обеспечивался ее контакт со всей клеточной массой. В наиболее предпочтительном варианте питательную среду прибавляют к культуре подобно процессу кровообращения, происходящему in vivo, то е