Способ подавления вич-инфицированных клеток млекопитающего и белковый рекомбинантный рецептор для его осуществления

Способ подавления вич-инфицированных клеток млекопитающего и белковый рекомбинантный рецептор для его осуществления

Реферат

 

Изобретение относится к области генной инженерии. Предложенный способ включает введение млекопитающему эффективного количества терапевтических клеток, экспрессирующих связанный с мембраной белковый рекомбинантный рецептор, включающий в себя внеклеточную часть, которая включает в себя фрагмент CD4, который обладает способностью специфически узнавать и связывать ВИЧ-инфицированную клетку, но который не опосредует ВИЧ-инфицирование. Кроме того, описан белковый рекомбинантный рецептор, который также способен специфично распознавать и связывать ВИЧ-инфицированную клетку, но который не опосредует ВИЧ-инфекцию. Изобретение позволяет управлять клеточным иммунным ответом, направленным против ВИЧ-инфицированной клетки млекопитающего. 2 с. и 9 з.п. ф-лы, 28 ил., 1 табл.

Изобретение относится к рецепторам, которые включают в себя фрагменты CD4, которые связывают ВИЧ, но не делают клетки хозяина восприимчивыми к ВИЧ-инфекции. Таким образом, настоящим изобретением создано новое и эффективное лечебное средство против ВИЧ.

Распознавание антигена T-клетками с помощью T-клеточного рецептора лежит в основе многочисленных иммунологических явлений. T-клетки управляют тем, что называют клеточно-опосредованным иммунитетом. Он включает в себя механизм уничтожения чужеродных тканей или инфицированных клеток с помощью клеток иммунной системы. Существуют разновидности T-клеток, включающие "хелперные" и "супрессорные" клетки, которые модулируют иммунный ответ, и цитотоксические (или "киллерные") клетки, которые непосредственно могут уничтожать аномальные клетки.

T-клетка, которая узнает и связывает соответствующий антиген, обнаруживаемый на поверхности другой клетки, становится активированной; она может затем размножиться и если она представляет собой цитотоксическую клетку, то она уничтожит присоединенную клетку.

ВИЧ и иммунопатогенез В 1984 г. было установлено, что ВИЧ является этиологическим фактором СПИД. С тех пор определение СПИД неоднократно меняли много раз в соответствии с применяемым диагностическим критерием. Однако, несмотря на колебания диагностических параметров, очевидным общим действующим началом является ВИЧ-инфекция с последующим развитием персистентных конституциональных симптомов и заболеваний, определяющих СПИД, таких как вторичные инфекции, новообразования и неврологические заболевания.

Основы терапии Харрисона, 12-е изд. McGraw Hill (1991).

ВИЧ представляет собой человеческий ретровирус из группы лентивирусов. Четыре распознаваемые человеческие ретровирусы относятся к двум различным группам: T-лимфотропные (или лейкозные) ретровирусы человека. HTLV-1 и HTLV-2, и вирусы иммунодефицита человека, HIV-1 и HIV-2. Первая группа представлена трансформирующими вирусами, тогда как вторая группа представлена цитопатическими вирусами.

ВИЧ-4 идентифицировали в качестве наиболее распространенной причины во всем мире, вызывающей заболевание СПИД. Гомология последовательности между ВИЧ-2 и ВИЧ-1 составляет около 40% ВИЧ-2, который более близок к группе вирусов иммунодефицита человекообразных обезьян (SIV). Curran et al., Nature 324:572-575 (1986).

ВИЧ-2 представлен обычными ретровирусными генами (env, gag и pol), а также шестью другими генами, участвующими в репликации и других биологических функций вируса. Как указано выше, общим знаменателем СПИД является глубокая иммуносупрессия, приводящая к появлению разнообразных заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, в частности инфекционных и опухолевых.

Основную причину нарушения иммунитета при СПИД рассматривают как количественную и качественную недостаточность популяции T4-клеток, лимфоцитов производимых тимусом (Т). Эту группу клеток фенотипически выявляют по наличию поверхностных молекул CD4, которые являются клеточными рецепторами для ВИЧ. Dalgleich et al., Nature 312:763 (1984). Хотя T4-клетка представляет собой главный тип клетки, инфицируемой ВИЧ, фактически любая человеческая клетка, которая экспрессирует молекулу CD4 на своей поверхности, способна связываться и подвергаться инфицированию ВИЧ.

Традиционно молекулам CD4 T-клеток приписывают роль хелперов/индукторов, указывающей их функцию в обеспечении активированного сигнала для T-клеток или индуцирующей образование T-лимфоцитов, несущих аналогичный CD8-маркер для становления цитотоксических/супрессорных клеток. Reinherz and Schlossman, Cell 19:821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol, rev. 68:5-42 (1982).

ВИЧ специфически связывается и с высоким сродством, в результате аминокислотного удлинения вирусной оболочки (gp120), с участком области VI молекулы CD4, локализованной вблизи ее N-конца. После связывания вирус сливается с мембраной клетки-мишени и интернализуется. Сразу после интернализации он использует фермент обратную транскриптазу для транскрибирования своей геномной РНК с ДНК, которая интегрирована в клеточную ДНК и где она существует в течение жизни клетки в качестве "провируса".

Провирус может оставаться латентным или активироваться, транскрибируя мРНК или геномную РНК, приводя к синтезу белка, сборке, образованию новых вирусных частиц и отделению вируса от клеточной поверхности. Хотя точный механизм, по которому вирус вызывает гибель клетки, не установлен, очевидно, что главный механизм представляет собой массовое отделение вирусных частиц от клеточной поверхности, приводящее к разрушению цитоплазматической мембраны и нарушению осморегуляции.

Во время инфекции организм хозяина вырабатывает антитела против вирусных белков, в том числе основных оболочечных гликопротеинов gp120 и gp41. Несмотря на этот гуморальный иммунитет, заболевание прогрессирует, приводя к летальной иммуносупрессии, характеризующейся множественными условно-патогенными инфекциями, паразитемии, деменции и смерти. Недостаток антивирусных антител хозяина, препятствующих развитию заболевания, является одним из наиболее мучительных и тревожных аспектов инфекции, и предвещает малую эффективность усилий вакцинирования традиционными способами.

Два фактора могут влиять на эффективность гуморального ответа при вирусном иммунодефиците. Во-первых, подобно другим РНК-вирусам (и в частности, подобно ретровирусам) иммунодефицитные вирусы проявляют высокую мутационную скорость в ответ на иммунный надзор хозяина. Во-вторых, оболочечные гликопротеины сами по себе являются сильно гликозилированными молекулами, представляющие несколько эпитопов, обладающие высоким сродством для связывания антител. Недостаточная антигенная мишень, которую представляет вирусная оболочка, оставляет хозяину мало возможности для ограничения вирусной инфекции путем образования специфических антител.

Клетки, инфицированные ВИЧ, экспрессируют на своей поверхности гликопротеин gp120, gp120 опосредует события слияния между CD4-клетками путем реакции, подобной той, с помощью которой вирус внедряется в непораженную клетку, приводя к образованию короткоживущих многоядерных гигантских клеток. Образование синцития зависит от непосредственного взаимодействия оболочечного гликопротеина gp120 с белком CD4. Dalgleish et al., см. выше; Klatzman et al., Nature 312:763 (1984); McDougal et al., Science 231:382 (1986); Sodroski et al., Nature 322:470 (1986); Lifson et al., Nature 323:725 (1986); Sodroski et al., Nature 321:412 (1986).

Доказательством того, что связывание CD4-gp120 несет ответственность за вирусную инфекцию клеток, несущих CD4-антиген, включает в себя обнаружение специфического комплекса, который образуется между gp120 и CD4 (McDougal et al. , см. выше). Другие исследователи показали, что клеточные линии, не инфицированные ВИЧ, превращались в инфицированные клеточные линии после трансфекции и экспрессии у человека гена CD4 кДНК. Maddon et al., Cell 46:333-348 (1986).

Терапевтические программы, основанные на растворимом CD4, в качестве пассивного агента для подавления вирусной адсорбции и межклеточной передачи, опосредованной синцитием, были предложены и успешно продемонстрированы ин витро целым рядом групп (Deen et al., Nature 331:82-84 (1988); Fisher et al. , Nature 331:76-78 (1988); Hussey et al., Nature 331:78-81 (1988); Smith et al. , Science 238: 1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988); a впоследствии создали слитые CD4-иммуноглобулиновые белки с удлиненным временем полужизни и умеренной биологической активностью (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Byrn et al. , Nature 344:667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347-353 (1990). Хотя конъюгаты CD4-иммунотоксин или слитые белки проявляют сильную цитотоксичность к инфицированным клеткам ин витро (Chaudhary et al., Nature 335: 369-372 (1988);Till et al., Science 242: 1166-1168 (1988), латентное состояние синдрома иммунодефицита делает маловероятным, чтобы какая-либо однократная терапия будет эффективной в ликвидации вирусного поражения, а антигенность чужеродных слитых белков, по-видимому, ограничит их переносимость при лечениях повторяющимися дозами. Испытания, проведенные на обезьянах, пораженных SIV, показали, что растворимый CD4 при введении животным без отчетливой CD4-цитопении может снизить титр SIV и улучшить ин витро уровень миелоидного потенциала (Watanabe et al., Nature 337:267-270 (1989). Однако индуцированное повторное вирусное проявление наблюдали после прерванного лечения, свидетельствующее, что пожизненный прием CD4, по-видимому, необходим для предупреждения прогрессивного истощения иммунной системы.

T-клетки и Fc-рецепторы Клеточная поверхность экспрессирует самую обильную форму антигенного рецептора T-клеток (TCR), требующего коэкспрессии не менее 6 различных полипептидных цепей (Weiss et al. , J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984); Orloffhashi et al., Nature 516:606-609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem. 263: 8528-8556 (1988); Sussman et al., Cell 52:85-95 (1988), /-антиген, связывающий цепи, три полипептида CD3-комплекса, и s. Если какая-либо цепь отсутствует, устойчивая экспрессия остающихся членов комплекса не происходит. s представляет собой ограничивающий полипептид для поверхностной экспрессии полного комплекса (Sussman et al., Cell 52:85-95 (1988)) и предположительно опосредует фракцию, запускающую программы клеточной активации, с помощью рецептора узнающего лиганд (Weissman et al., EMBO J. 8:3651-5656 (1989); Frank et al., Science 249:174-177 (1990)). Гомодимер типа 1 с мол. массой 32 кДа, s (зета), закрепленный в мембране, имеет 9 внеклеточных остатков домена, не имеющего участков для N-присоединенного добавочного гликана, и 112 остатков (мышь) или 113 остатков (человек) внутриклеточного домена (Weissmaim et al., Science 238:1018-1020 (1988); Weissman et al., Proc. Natl. , Acad. Sci. UCA 85:9709-9713 (1988)). Изоформа s, названная (эта) (Baniyash et al., J.Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988); Orloff et al., J.Biol. Chem. 264:14812-14817 (1989), который возникла из альтернативного пути сплайсинга мРНК (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UCA 87:3319-3255 (1990)), представлена в клетках, экспрессирующих антигенный рецептор, в сниженном количестве. Считают, что гетеродимеры s- опосредуют образование инозитфосфатов, также как и инициированную рецептором запрограммированную гибель клетки, названную апоптозом (Mercep et al., Science 242:571-574 (1988); Mercep et al., Science 246:1162-1165 (1989).

Подобно s и , (гамма)-цепь, ассоциированная с Fc-рецептором, экспрессирует на клеточной поверхности комплексы с дополнительными полипептидами, некоторые из них опосредует узнавание лиганда, а другие обладают неопределенной функцией, -цепь поддерживает гомодимерную структуру и общую организацию, очень сходную с той, которая образована s-цепью и является компонентом высокоаффинного рецептора IgE тучных/базофильных клеток, Fc RI, который состоит, как миниум, из трех разных полипептидных цепей (Blank et al. , Nature 337: 187-189 (1989); Ra et al., Nature 241:752-754 (1989), и одного низкоаффинного рецептора IgE, представленного у мышей FcyRII (Ra et al. , J. Biol. Chem. 264:15323-15527 (1989), а у человека - CD17-субтипом, экспрессируемого макрофагами и природными клетками-киллерами, CD16_ТМ (трансмембранные молекулы CD16) (Lanier et al., Nature 342:803-805 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UCA 87:2274-2278 (1990) и полипептидом с неизвестной функцией (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. UCA 87: 2274-2278 (1990)). В недавней публикации сообщали, что -цепь экспрессируется мышиной линией T-клеток, CTL, в которой она образует гомодимеры, также как и гетеродимеры -s и - (Orloff et al., Nature 347:189-191 (1990).

Fc-рецепторы опосредуют фагоцитоз иммунными комплексами, трансцитозом и антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) (Ravetch and Kinet et al. , Annu. Rev. lmmunol. 9:547-492 (1991); Unkeless et al., Annu. Rev. Immunol. 6:251-281 (1988); и Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). В последнее время показали, что одна из мышиных низкоаффинных изоформ Fc-рецептора, FcRylllBI, опосредует интернализацию мишеней, покрытых Ig, в ямках покрытых клатрином, а другой низкоаффинный рецептор, FcRylllA, опосредует ADCC через ассоциацию с одним или большим числом членов небольшого семейства "пусковых молекул" (Miettinen et al., Cell. 58:317-327 (1989); и Hunziber и Melllman, J. Cell Biol. 109:3291-3302 (1989)). Эти пусковые молекулы, s-цепь T-клеточного рецептора (TCR), -цепь TCR, и - цепь Fc-рецептора взаимодействуют с лигандом, узнающим домены рецепторов отличающихся иммунных систем и может автономно инициировать программы клеточного эффектора, в том числе цитолиз с последующей агрегацией (Samelson et al., Cell 43:223-231 (1985); Weissman et al., Science 239:1018- 1020 (1988); Jin et al., Proc. Natl. Acad. UCA 87: 3319-3323 (1990); Blank et al., Nature 337:187-189 (1989); Lanier et al., Nature 342:803-805 (1989); Kurosaki и Pavetch, Nature 343: 805-807 (1989); Hibbs et al., Science 246:1608-1611 (1989); Anderson et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. UCA 87:2274-2278 (1990); и Irving и Weiss, Cell 64:891-901 (1991).

Однако при проведении параллелей между низкоаффинными семействами Fc-рецептора мыши и человека становится очевидным, что изоформы FcRyllA и C человека не дублируют мышиные. Это отчасти потому, что их функцию еще не определили.

Поскольку гуморальные факторы, основанные только на CD4, могут иметь ограниченное применение in vivo, в предварительном исследовании зондировали возможность усиления клеточного иммунитета к ВИЧ. Идентифицировали препараты химерных белков (в которых внеклеточный доммен CD4 слили с трансмембранным и/или внутриклеточным доменами T-клеточного рецептора, Fc-рецептор lgG, или элементами, преобразующими сигнал рецептора B-клеток (U.S.S.N. 07/847566 и 07/665961, включенные в настоящее описание путем ссылки). Цитолитические T-клетки, экспрессирующие химеры, которые включают в себя внеклеточный домен CD4, проявляют сильную, независимую от МНС, способность уничтожать клеточные мишени, экспрессирующие оболочечные белки ВИЧ. Очень важным и новым компонентом этого способа явилась идентификация одиночного рецептора T-клетки, Fc-рецептора и цепей рецептора B-клетки, которые достаточно агрегированы, чтобы инициировать клеточный ответ. Одно из самых ценных достижений этого способа состоит в том, что создали химеры между CD4 и s, , или , которые непосредственно разрушают T-лимфоциты при их узнавании и уничтожают клетки, экспрессирующие гликопротеин gp120 ВИЧ (U. S.S.N. 07/847566 и 07/665961, включенные в настоящее описание путем ссылки).

Краткое изложение существа изобретения В соответствии с основной целью в настоящем изобретении отведено важнейшее место способу управления клеточным иммунным ответом, направленным против ВИЧ-инфицированной клетки млекопитающего. Данный способ включает в себя введение млекопитающему эффективного количества терапевтических клеток, а именно терапевтических клеток, экспрессирующих связанный с мембраной белковый химерный рецептор, включающий в себя (а) внеклеточную часть, которая включает в себя фрагмент CD4, который обладает способностью специфически узнавать и связывать ВИЧ-инфицированную клетку, но который не опосредует ВИЧ-инфицирование и (б) внутриклеточную часть, которая обладает способностью сигнализировать терапевтической клетке о необходимости уничтожить связанную с рецептором ВИЧ-инфицированную клетку.

В соответствии с целью, родственной этой, настоящее изобретение относится к клетке, которая экспрессирует связанный с мембраной белковый химерный рецептор, который включает в себя (а) внеклеточную часть, которая включает в себя фрагмент CD4, который обладает способностью специфически узнавать и связывать ВИЧ-инфицированную клетку, но который не опосредует ВИЧ-инфицирование и (б) внутриклеточную часть, которая обладает способностью сигнализировать терапевтической клетке о необходимости уничтожить связанную с рецептором ВИЧ-инфицированную клетку.

В соответствии со второй целью настоящее изобретение относится к способу воздействия на ВИЧ у млекопитающего, включающего в себя введение млекопитающему эффективного количества терапевтических клеток, а именно терапевтических клеток, экспрессирующих связанный с мембраной белковый химерный рецептор, включающий в себя внеклеточную часть, которая включает в себя фрагмент CD4, который обладает способностью специфически узнавать и связывать ВИЧ-инфицированную клетку, но который не опосредует ВИЧ-инфицирование.

В соответствии с целью, родственной этой, настоящее изобретение относится к клетке, которая экспрессирует связанный с мембраной белковый химерный рецептор, включающий в себя внеклеточную часть, которая включает в себя фрагмент CD4, который обладает способностью специфически узнавать и связывать ВИЧ-инфицированную клетку, но который не опосредует ВИЧ-инфицирование.

В предпочтительных вариантах осуществления основной и второй целей CD4-фрагмент представляет собой фрагмент последовательности аминокислот 1-394 молекулы CD4 или фрагмент последовательности аминокислот 1-200 молекулы CD4; данный CD4-фрагмент отделили от внутриклеточной части с помощью CD7-трансмембранного домена, представленного на фиг. 26 или с помощью шарнира, CH2- и CH3-доменов молекулы lgGI человека, представленной на фиг.25: а CD4-фрагмент отделили от терапевтической клетки расстоянием не менее 48 ангстрем (и предпочтительно - расстоянием не менее 72 ангстрем). В предпочтительных вариантах осуществления первой цели внутриклеточная часть представляет собой часть, преобразующую сигнал рецепторного белка T-клетки (к примеру, s), рецепторного белка B-клетки, или Fc-рецепторного белка; а терапевтические клетки выбраны из группы, состоящей из: (а) T-лимфоциты; (b) цитотоксические T-лимфоциты; (с) природные клетки-киллеры; (d) нейтрофилы; (е) гранулоциты; (f) макрофаги; (g) тучные клетки; и (i) эмбриональные стволовые клетки (ES).

В соответствии с другими целями, родственными этой, настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей химерный рецептор настоящего изобретения; и вектору, включающему в себя ДНК этого химерного рецептора.

Несмотря на то, что специфичным вариантом осуществления настоящего изобретения является химера между молекулами CD4 и zeta, любые рецепторные цепи, имеющие сходную с этими молекулами функцию, например, в гранулоцитах или B-лимфоцитах, могли бы использоваться для целей, раскрытых здесь. Отличительные признаки необходимой пусковой молекулы иммунной клетки включают в себя способность экспрессироваться автономно (т.е. в виде одиночной цепи), способность к слиянию с внеклеточной частью домена CD так, чтобы полученная химера присутствовала на поверхности терапевтической клетки, и способность к инициированию программ клеточного эффектора для вторичной агрегации при встрече с лигандом мишени.

В настоящее время большинство традиционных способов доставки химер к клеткам иммунной системы осуществляют посредством некоторых форм генетической терапии. Однако воспроизведение клеток иммунной системы с химерными рецепторами путем смешивания клеток с соответствующим растворенным очищенным химерным белком также будет приводить к образованию популяции биоинженерных клеток, способной отвечать на ВИЧ-инфицированные мишени. В терапевтических целях применили подобный способ, например, для интродуцирования CD4-молекулы в эритроциты. В этом случае популяция биоинженерных клеток не обладала способностью к самовоспроизведению.

Настоящее изобретение относится к функциональным и упрощенным химерам между CD-4 и фрагментами и T-клеточным рецептором, B-клеточным рецептором и субъединицами Fc-рецептора, которые обладают способностью управлять иммунными клетками для узнавания и лизиса ВИЧ-инфицированных клеток. Данный способ по управлению клеточным ответом у млекопитающих включает в себя введение эффективного количества терапевтических клеток (например, цитотоксических T-лимфоцитов) в организм млекопитающего, поскольку клетки способны разпознать и уничтожить ВИЧ-инфицированную клетку.

Настоящее изобретение включает в себя химерные рецепторные белки, которые направляют цитотоксические T-лимфоциты к ВИЧ-инфицированным клеткам для их узнавания и лизиса, клетки хозяина, трансформированные вектором, включающие в себя химерные рецепторы, и антитела к химерным рецепторам.

Эти и другие не ограничиваемые настоящим изобретением варианты осуществления настоящего изобретения будут понятны специалистам из нижеследующего подробного описания настоящего изобретения.

В нижеследующем детальном описании приведены ссылки на различные методики, известные специалистам в области молекулярной биологии и иммунологии. Публикации и другие изложенные материалы относительно таких известных методик, на которые ссылаются, включены в настоящее описание путем ссылки, приводимой в полном объеме.

Стандартные рабочие ссылки, излагающие технологию рекомбинантной ДНК, изложены в настоящем описании по Watson et al., Молекулярная биология гена, том I и II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); DarnelI et al., Молекулярная биология клетки. Scientific American Books, Inc., publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin, Гены II, John Wiley & Sons, publishers. Неw York, N.Y. (1985); Old et al., Принципы работы с генами: Введение в генетическую инженерию, 2nd ed., University of California Press, publisher, Berkely, CA (1981); Maniatis et al., Молекулярное клонирование: Руководство для лабораторных работ, 2nd ed. Cold Spring Harbol Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989); Ausubel et al., Современные методы в молекулярной биологии, Wiley Press, New York:, NY (1989).

ТЕРМИНОЛОГИЯ Под "клонированием" подразумевают использование ин витро методов рекомбинации для внедрения отдельного гена или иной последовательности ДНК в молекулу вектора.

Под "кДНК" подразумевают комплементарную или копийную ДНК, полученную с матрицы РНК, в результате деятельности РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратная транскриптаза). Следовательно, "клон кДНК" означает последовательность двуцепочечной ДНК, комплементарную соответствующей молекуле РНК, представленную в клонирующем векторе.

Под "библиотекой кДНК" подразумевают коллекцию молекул рекомбинантной ДНК, содержащих вставки кДНК, которые включают в себя ДНК-копии мРНК, экспрессированную клеткой в период создания библиотеки кДНК. Такую кДНК можно приготовить с помощью методов, известным специалистам, описанным например у Ausubel et al. (см. выше) и у Maniatis et al. (см. выше). Вообще сначала выделяют РНК из клеток организма, из генома которого намерены проклонировать отдельный ген. Для цели настоящего изобретения предпочтительными являются линии лимфоцитарных клеток млекопитающего, в частности человека. В настоящее время предпочтительным вектором для этой цели является вирус коровьей оспы, штамм WR.

Под "вектором" подразумевают молекулу ДНК, выделенную, например, из плазмиды, бактериофага, или из вируса млекопитающего или насекомого, в которую можно вставить или проклонировать фрагменты ДНК. Вектор будет содержать один или больше уникальных сайтов рестрикции и может обладать способностью автономно реплицироваться в организме определенного хозяина или таком организме-посреднике, в котором клонируемая последовательность может репродуцироваться. Следовательно, под "экспрессионным вектором ДНК" подразумевают любой автономный элемент, способный управлять синтезом рекомбинантного пептида. Такие экспрессионные векторы ДНК включают в себя бактериальные плазмиды и фаги, а также плазмиды и вирусы млекопитающих и насекомых.

Под "практически чистым" подразумевают соединение, например, белок, полипептид или антитело, которое практически свободно от компонентов, естественно его сопровождающих. Вообще соединение является практически чистым, когда не менее 60%, более предпочтительно не менее 75%, и наиболее предпочтительно не менее 90% от общего объема в образце является соответствующим соединением. Степень очистки можно измерить любым подходящим способом, например, хроматографией на колонке, электрофорезом в полиакриламидном геле или HPLC-анализом. В контексте нуклеиновой кислоты термин "практически чистый" означает последовательность нуклеиновой кислоты, сегмент или фрагмент, которые непосредственно не контактируют с (т.е. не связаны ковалентно с) обоими кодирующими последовательностями, с которыми она непосредственно соприкасается (т.е. одна по 5'-концу, а другая по 3'-концу) в естественно встречаемом геноме организма, из которого выделили ДНК настоящего изобретения.

"Фрагмент" молекулы, как, например, любая из последовательностей кДНК настоящего изобретения, означает, что он относится к любому подклассу молекул нуклеотидного контига. "Аналог" молекулы означает, что он относится к неприродной молекуле, практически сходной с любой исходной молекулой или ее фрагментом. Указанная молекула является "практически сходной" с другой молекулой, если последовательность аминокислот обоих молекул является практической одной и той же. В частности "практически сходная" аминокислотная последовательность является той, которая проявляет не менее 50%, предпочтительно 85%, и наиболее предпочтительно 95% идентичности аминокислотной последовательности с естественной или референсной аминокислотной последовательностью и/или которая отличается от естественной или референсной последовательности лишь по консервативным аминокислотным заменам. Практически сходные аминокислотные молекулы обладают сходной биологической активностью. В том смысле как здесь используется, указанная молекула является "химически производной" другой молекулы, когда она содержит химически отличающиеся составные части отдельной молекулы. Такие составные части могут улучшить растворимость, абсорбцию, биологическое время полужизни молекулы и пр. Составные части могут альтернативно уменьшать токсичность молекулы, элиминировать или ослаблять любой нежелательный побочный эффект молекулы и т.п. Составные части, способные опосредовать такие эффекты, раскрыты, например, в фармацевтических науках Ремингтона, 16th ed., Mack Publishihg Co., Easton, P.A. (1980).

"Функциональное производное" гена химерного рецептора настоящего изобретения означает включение "фрагментов" или "аналогов" гена, которые являются "практически сходными" по нуклеотидной последовательности. "Практически сходная" нуклеиновая кислота кодирует практически сходные аминокислотные последовательности (как указано выше) и может также включать в себя любую последовательность нуклеиновой кислоты, способную гибридизировать с естественной или тест-последовательностью при соответствующих условиях гибридизации (см. , например, Ausubel et al., Современные методы в молекулярной биологии, Wiley Press, New York, NY (1989) для соответствующих жестких условий гибридизации).

"Практически сходный" химерный рецептор обладает сходной активностью с T-клеточным, B-клеточным или Fc-химерным рецептором "дикого типа". Наиболее предпочтительно, когда производное обладает 90%, более предпочтительно 70% и предпочтительно 40% активности химерного рецептора дикого типа. Активность производного функционального химерного рецептора включает в себя специфическое связывание (что касается его внеклеточной CD4-части) с ВИЧ-инфицированной клеткой и, в конечном итоге, уничтожении этой клетки; кроме того, химерный рецептор не делает клетку, несущую рецептор, восприимчивой к ВИЧ-инфицированию. Активность химерного рецептора можно проанализировать, используя, например, любой из методов, представленных здесь.

Последовательность ДНК, кодирующая химерный CD4-рецептор настоящего изобретения, или его функциональные производные, можно рекомбинировать с векторной ДНК в соответствии с традиционными методами, включающие тупление или наращивание концов для лигирования, расщепление ферментом рестрикции для получения соответствующих концов, достраивание липких концов надлежащим образом, обработку щелочной фосфатазой, чтобы избежать нежелательного соединения, и лигирование с помощью подходящих лигаз. Методики для таких манипуляций раскрыты у Maniatis et al. (см. выше) и хорошо известны специалистам в этой области.

Молекула нуклеиновой кислоты, такая как ДНК, как указано, "способна экспрессировать" полипептид, если она содержит нуклеотидные последовательности, содержащие информацию о регуляции транскрипции и трансляции, то такие последовательности "операбельно сцеплены" с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют полипептид. Операбельное сцепление представляет собой сцепление, при котором регуляторные последовательности ДНК и экспрессируемая последовательность ДНК соединены таким образом, чтобы экспрессировать ген. Точная природа регуляторных областей, необходимых для генной экспрессии, может варьировать от организма к организму, но она всегда включает в себя область промотора, которая у прокариот содержит и промоторную последовательность (которая управляет инициацией транскрипции РНК), и последовательности ДНК, транскрибирование которых с РНК является сигналом инициации белкового синтеза. Такие области обычно включают 5'-некодирующие последовательности, вовлеченные в инициацию транскрипции и трансляции, и представлены TATA-боксом, кэппинг-последовательностью, CAAT-последовательностью и им подобными.

При необходимости с помощью вышеописанных методов можно получить соединение 3'-некодирующей области с последовательностью гена, кодирующего белок. Эту область можно использовать для регуляторных последовательностей, терминирующих ее транскрипцию с последовательностями, регулирующими терминирование транскрипции для ее терминирования и полиаденилирования. Таким образом, использованием 3'-области, естественно соприкасающейся с последовательностью ДНК, кодирующей белок, можно создать сигналы, терминирующие транскрипцию. Когда сигналы, терминирующие транскрипцию, функционируют неудовлетворительно в экспрессирующей клетке-хозяине, тогда функциональную 3'-область клетки-хозяина можно заменить.

Две ДНК последовательности (такие как последовательность области промотора и последовательность, кодирующую химерный CD4-рецептор), как указано, являются операбельно сцепленными, если характер сцепления между двумя последовательностями 1) не приводит к интродукции мутации в рамке считывания, 2) не подавляет способность последовательности области промотора управлять транскрипцией последовательности гена химерного рецептора или 3) не подавляет способность последовательности гена химерного рецептора быть транскрибированным с помощью последовательности области промотора. Область промотора будет операбельно сцеплена с последовательностью ДНК, если промотор способен усилить транскрипцию этой последовательности ДНК. Таким образом, при экспрессии белка необходимо, чтобы соответствующий хозяин узнавал сигналы транскрипции и трансляции.

Настоящее изобретение охватывает экспрессию белка химерного CD4-рецептора (или его функциональное производное) и в прокариотических, и в эукариотических клетках, но предпочтительно относится к экспрессии эукариотических клеток (и прежде всего к человеческим лимфтоцитам).

В соответствии с настоящим изобретением антитела можно приготовить любым имеющимся способом. Например, клетки, экспрессирующие белок химерного CD4-рецептора, или его функциональное производное, можно ввести животному с целью вызвать образование сыворотки, содержащей поликлональные антитела, которые способны связывать химеру.

В предпочтительном варианте осуществления способа антитела, в соответствии с настоящим изобретением, являются моноклональными антителами. Такие моноклональные антитела можно приготовить, применяя гибридомную технологию (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al. , B: Моноклональные антитела и T-клеточные гибридомы, Elsevier, N.Y. pp. 565-684 (1981)). В основном такие методики предусматривают иимунизацию животного антигеном химерного CD4-рецептора. Полученные от таких животных спленоциты экстрагируют и подвергают слиянию с подходящей миеломной клеточной линией. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любую миеломную клеточную линию. После слияния полученные гибридомные клетки селективно поддерживаются на HAT-среде и затем клонируют методом лимитирующего разведения, как описано у Wands et al., (Castroenterology 80:225-232 (1981)). Полученные в результате такой селекции гибридомные клетки анализируют затем для идентификации клонов, которые секретируют антитела, способные связывать химеру.

В соответствии с настоящим изобретением антитела могут также быть поликлональными или, предпочтительно, регионспецифичными поликлональными антителами.

В соответствии с настоящим изобретением антитела к химерному CD4-рецептору можно использовать для контроля за количеством химерного рецептора (или клеток, несущих химерный рецептор) у пациента. Такие антитела хорошо подходят для использования в стандартных иммунодиагностических методах, известных в данной области, включая такие иммунометрические или "сэндвич"-методы в виде прямого сэндвич-анализа, обратного сэндвич-анализа и их сочетания. Эти антитела можно использовать в ряду любых комбинаций, выбранных специалистами, во избежание чрезмерного экспериментирования для осуществления иммуноанализа приемлемой специфичности, чувствительности и точности.

Ссылки на основные работы, формулирующие главные принципы иммунологии, включают Roitt, Основы иммунологии, 6th ed., Blackwell Scientific. Publications, publisher, Oxford (1988); Kimbal, Введение в иммунологию, 2nd ed., Macmillan Publishing Co. , publisher, New York (1986); Roitt et al., Иммунология, Gower Medical Publishing Ltd., publisher, London, (1985); Campbell, Техника работы с моноклональными антителами, у Burdon et al., eds., Техника лабораторных работ в биохимии и молекулярной биологии, том 13, Elsevier, publisher, Amsterdam (1984); Klein, Иммунология: The science of Self-Nonself Discimination, John Wiley & Sons, publisher. New York (1982) и Kennet et al. , Моноклональные антитела. Гибридома: новые подходы в биологических исследованиях, Plenum Press, publisher, New York (1980).

Под "детектированием" подразумевают наличие или отсутствие вещества или определяемое количество вещества. Поэтому данный термин относится к материалам, препаратам и способам настоящего изобретения, касающихся качественного и количественного определений.

Антитела и практически чистый антиген настоящего изобретения идеально подходит для создания набора. Такой набор может включать в себя переносной модуль для упаковки тесно расположенных одного или больше контейнеров, например в виде флаконов, тюбиков и т.п., каждый из указанных контейнеров включает в себя отдельные элементы, используемые в анализе.

Типы анализов, которые можно оформить в виде набора, многочисленны и представлены, например, конкурентным и неконкурентным анализом. Типичные примеры анализов, в которых можно использовать антитела настоящего изобретения: радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА), твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA) и иммунометрические или "сэндвич"-иммуноанализы.

Под термином "иммунометрический анализ" или "сэндвич"-иммуноанализ подразумевают сочетание сэндвич-методов, прямой сэндвич-метод и обратный сэндвич-метод. Эти термины хорошо понятны специалистам данной области. Специалистам также понятно, что в соответствии с настоящим изобретением антитела пригодны для других вариантов и форм анализа, известных в настоящее время, или которые могут быть усовершенствованы в будущем. Подразумевают, что эти термины используются в рамках настоящего изобретения.

Под термином "специфически узнает и связывает" подразумевают, что антитело узнает и связывает полипептиды химерного рецептора, но практически не распознает и не связывает другие неродственные молекулы в образце, например, биологическом образце.

Под термином "терапевтическая клетка" подразумевают клетку, которая трансформирована химерным CD4-рецептором данного изобретения так, что она способна узнавать и уничтожать ВИЧ-инфицированную клетку; предпочтите