Способ получения соединения для уничтожения насекомых или клещей (варианты), инсектицидная и противоклещевая композиция, способ уничтожения насекомых или клещей, штамм saccharopolyspora spinosa, используемый для получения соединения для уничтожения насекомых или клещей

Способ получения соединения для уничтожения насекомых или клещей (варианты), инсектицидная и противоклещевая композиция, способ уничтожения насекомых или клещей, штамм saccharopolyspora spinosa, используемый для получения соединения для уничтожения насекомых или клещей

Реферат

 

Изобретение относится к получению новых инсектицидных средств микробиологическим синтезом. Способ получения соединения для уничтожения насекомых или клещей предусматривает культивирование одного из штаммов Saccharopolyspora spinosa NRRL 18 719, NRRL 18 720 или 18 823 в подходящей питательной среде в глубинных условиях при аэрации с последующим выделением индивидуальных соединений. На основе полученного соединения создана композиция, содержащая активное вещество и носитель. С помощью полученных соединений и композиций уничтожают насекомых или клещей путем обработки их мест обитания. 8 с. и 8 з.п. ф-лы, 13 табл.

Настоящее изобретение относится к новым соединениям продукта ферментации А83543.

У вредных насекомых быстро развивается стойкость к синтетическим инсектицидам, в том числе и к более новым инсектицидам класса пиретроидов /см. Pickett /1988/, Chem. Britain, 137/. Таким образом, в настоящее время существует потребность в новых инсектицидах.

Недавно был открыт продукт ферментации А83543, семейство близких соединений, продуцируемых штаммами Saccharopolyspora spinosa, и было установлено, что они обладают исключительно высокой инсектицидной активностью. А83543 и каждое из этих соединений полезны при уничтожении клещей и насекомых, в частности видов родов Lepidoptera и Diptera. Под соединениями А83543 подразумеваются природные соединения, состоящие из 5,6,5-трициклической кольцевой системы, сконденсированной с 12-членным микроскопическим лактоном, нейтральным сахаром и амино сахаром /см. Kirst и др. /1991/, Tetrahedron Letters, т. 32:4839/. Семейство природных А83543-соединений включает родовое соединение, предложенное в Европейской патентной заявке EPO N 0375316 и имеющее следующую общую формулу: в которой R¹ является H или группой, выбранной из или а R², R⁴, R³, R⁵ и R⁶ являются водородом или метилом; или их соли присоединения кислот (кислотно аддитивные), когда R¹ отличен от водорода.

Было установлено, что продукт ферментации А83543 содержит отдельные соединения A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543J и их различные псевдоагликоны (см. Европейскую патентную публикацию N 0375316). Структуры этих отдельных соединений приведены ниже.

или в которой R¹, R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶ для каждого соединения имеют следующие значения (см. структуры соединений А83543 в конце описания) Настоящее изобретение направлено на соединение формулы I в которой R⁷, R⁸, R⁹ и R¹⁰ по отдельности каждый имеют следующий смысл (см. таблицу 1а).

Настоящее изобретение, кроме того, направлено на инсектицидные и противоклещевые композиции и способы уменьшения популяций насекомых и клещей с использованием Соединений 1-8, которые являются соединениями формулы I, в которой R⁷ отличен от водорода.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ получения Соединений 1-7, новых натуральных компонент продукта ферментации А83543, который содержит культивирование штаммов S. spinosa или их мутантов, способных продуцировать Соединения 1-7, в соответствующей культурной среде при условиях погруженной аэробной ферментации до тех пор, пока не будет получено извлекаемое количество любого из Соединений 1-7. Соединения 1-7 могут быть выделены и очищены так, как это будет описано ниже.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением предлагается биологически очищенная культура недавно открытых штаммов S. sponosa NRRL 18719 /A83543.6/, NRRL 18720 /A83543.7/ и NRRL 18823 /A83543.9/.

Химические структуры Соединений 1-7 определяли при помощи спектрометрических методов, включая спектроскопию ядерного магнитного резонанса /ЯМР/ и ультрафиолетовую спектроскопию /УФ/, и при помощи сравнения с известными соединениями А83543 /см. Kirst и др. /1991/, см. выше/. В последующих абзацах описаны физические и спектральные свойства Соединений 1-7: A83543L: A83543L имеет следующие характеристики.

Молекулярная масса: 731 Эмпирическая формула: C₄₁H₆₅NO₁₀ УФ /EtOH/: 244 нм / = 10,362/ MC /FAB/: /M+H/m/Z 732 В таблице 1 суммированы спектральные данные ¹H и ¹³C-ядерного магнитного резонанса /ЯМР/ для A83543L /в d₆-ацетоне/.

A83543M: A83543M имеет следующие характеристики.

Молекулярная масса: 703 Эмпирическая формула: C₃₉H₆₁NO₁₀ УФ /EtOH/: 244 нм / = 10,240/ MC /FAB/: /M+H/ m/Z 704 В таблице II суммированы спектральные данные ¹H и ¹²C-ядерного магнитного резонанса /ЯМР/ для A83543M /в d₆-ацетоне/ A83543N: A83543N имеет следующие характеристики.

Молекулярная масса: 717 Эмпирическая формула: C₄₀H₆₃NO₁₀ УФ /EtOH/: 244 нм / = 10,446/ MC /FAB/: /M+H/ m/Z 718 В таблице III суммированы спектральные данные ¹H и ¹³C-ядерного магнитного резонанса /ЯМР/ для A83543N /в d₆-ацетоне/.

A83543Q: A83543Q имеет следующие характеристики.

Молекулярная масса: 731 Эмпирическая формула: C₄₁H₆₅NO₁₀ УФ /EtOH/: 244 нм / = 10,492/ MC /FAB/: /M+H/ m/Z 732 В таблице IV суммированы спектральные данные ¹H и ¹³C-ядерного магнитного резонанса /ЯМР/ для A83543Q /в d₆-ацетоне/.

A83543R: A83543R имеет следующие характеристики.

Молекулярная масса: 703 Эмпирическая формула: C₃₉H₆₁NO₁₀ УФ /EtOH/: 245 нм / = 10,991/ MC /FAB/: /M+H/ m/Z 704 В таблице V суммированы спектральные данные ¹H и ¹³C-ядерного магнитного резонанса /ЯМР/ для A83543R /в d₆-ацетоне/.

A83543S: A83543S имеет следующие характеристики.

Молекулярная масса: 703 Эмпирическая формула: C₃₉H₆₁NO₁₀ УФ /EtOH/: 244 нм / = 9,697/ MC /FAB/: /M+H/ m/Z 704 В таблице VI суммированы спектральные данные ¹H и ¹³C-ядерного магнитного резонанса /ЯМР/ для A83543S /в d₆-ацетоне/.

A83543T: A83543T имеет следующие характеристики.

Молекулярная масса: 703 Эмпирическая формула: C₃₉H₆₁NO₁₀ УФ /EtOH/: 245 нм / = 13,082/ MC /FAB/: /M+H/ m/Z 704 В таблице VII суммированы спектральные данные ¹H и ¹³C-ядерного магнитного резонанса /ЯМР/ /в d₆-ацетоне/.

Еще один аспект настоящего изобретения состоит в химическом деметилировании натурального фактора A83543D, чтобы получить N-диметил A83543D. Аналогичным образом A83543M и A83543N могут быть получены из A83543J и A83543L.

N-деметиловые производные получают при помощи взаимодействия натурального фактора в присутствии от одного до тринадцати эквивалентов йода и подходящего основания, такого как ацетат натрия. Эту реакцию осуществляют в полярном органическом растворителе, таком как метанол, или в смеси полярного органического растворителя и воды, такой как водный раствор метанола. Эту реакцию в предпочтительном варианте осуществляют при температуре от 30 до 90^oC в течение от 2 до 6 часов при pH от 8 до 10.

N-деметил A83543D: N-деметил A83543D имеет следующие характеристики: УФ /EtOH/: 244 нм / = = 9400/.

В таблице VIII суммированы спектральные данные для ¹H-, ¹³C-ядерного магнитного резонанса /ЯМР/ для N-деметил A83543D /в ацетоне-d₆/.

Соединения 1-8 могут взаимодействовать с образованием различных присоединений солей кислот. К представителям соответствующих солей относятся такие соли, которые образуются в результате стандартных реакций как с органическими, так и неорганическими кислотами, такими как, например, хлористо-водородная, фосфорная, уксусная, янтарная, серная, лимонная, молочная, малеиновая, фумаровая, холевая, слизевая, памоиновая, глютаминовая, камфорная, глютаровая, гликолевая, фталиевая, винная, муравьиная, лауриновая, стеариновая, силициловая, метан/моно/сульфокислота, бензол/моно/сульфокислота, сорбиновая, пикриновая, бензойная, коричная и т.п. кислоты. Эти кислоты используют, например, при отделении и очистке Соединений 1-8. Кроме того, некоторые из форм солей могут иметь более высокую растворимость в воде. Эти соли получают с использованием стандартных приемов для получения солей.

Кроме того, настоящее изобретение направлено на получение псевдоагликонов в результате взаимодействия натуральных компонент с кислотой, чтобы удалить амино сахар. К соответствующим кислотам относятся хлористо-водородная и серная кислоты, в предпочтительном варианте - серная кислота. Эту реакцию в предпочтительном варианте осуществляют в полярном органическом растворителе, смеси полярного органического растворителя и воды. К соответствующим органическим растворителям относятся метанол, ТГФ, ацетонитрил и диоксан. Предпочтительными растворителями для такой трансформации являются смеси метанола и воды. Эту реакцию можно осуществлять при температуре от примерно 25^oC до примерно 95^oC, в предпочтительном варианте при температуре 80^oC.

Псевдоагликоны настоящего изобретения получают при помощи следующей реакционной схемы: Схема A A83543J ---> Соединение 9 ---> Соединение 13 ---> Соединение 17 A83543Psa A2 ---> A83543AgA A83543L ---> Соединение 10 ---> Соединение 14 ---> Соединение 18 A83543PsaD2 ---> A83543AgD A83543M ---> Соединение 11 ---> Соединение 15 ---> Соединение 19 A83543PsaB2 ---> A83543Aga A83543N ---> Соединение 12 ---> Соединение 16 ---> Соединение 20 A83543PsaN2 ---> A83543AgD Поэтому в соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предлагается способ получения A83543AgA, A83543AgD, A83543AgE или A83543AgF, который содержит /a/ гидролиз A83543A, A83543B, A83543C, A83543G, A83543H, A83543J, A83543PsaA1, A83543PsaA2, A83543PsaH1, A83543PsaJ1, A83543PsaB2 или A83543PsaC2, чтобы получить A83543Aga; или /b/ гидролиз A83543PsaD2 или A83543PsaN2, чтобы получить A83543AgD; или /c/ гидролиз A83543E или A83543PsaE1, чтобы получить A83543AgE; или /d/ гидролиз A83543F или A83543PsaF1, чтобы получить A83543AgF.

Псевдоагликаны используют в качестве исходных материалов для получения новых A83543-соединений, например псевдоагликоны могут быть гликозилированы в гидроксильной группе, где содержался амино сахар. Такое гликозилирование может быть осуществлено при помощи либо химического синтеза, либо микробного биопревращения. Более конкретно, A83543PsaL1 может быть биопревращен в A83543L и A83543N при помощи культивирования любого из известных штаммов, продуцирующих A83543, в присутствии A83543PsaL1.

Соединение 1-7, натуральные A83543-компоненты в общем случае получают при помощи культивирования продуцирующих A83543 штаммов семейства S. spinosa при погруженных аэробных условиях в целевой культурной среде до тех пор, пока не будет получено извлекаемое количество натурального фактора. Соединения 1-7 могут быть выделены с использованием различных приемов изоляции и очистки, которые известны в этой области техники.

Для удобства при обсуждении, которое следует ниже, два известных продуцирующих A83543A, штамма обозначаются следующим образом: A83543.I и A83543.3 /см. EPO N 0375316/; как обсуждалось ниже, эти штаммы использовали для получения новых штаммов. Два новых штамма, продуцирующих A83543J, обозначаются как A83543.6 и A83543.7; компоненты A83543L, A83543M и A83543N получают при помощи A83543.6 и A83543.7. Наконец, новый продуцирующий A83543Q штамм обозначают через A83543.9; компонент A83543Q, A83543R, A83543S и AZ83543T получали из A83543.9. Культуры A83543.1, A83543.4, A83543.6, A83543.7 и A83543.9 были сданы на хранение и они составляют часть собрания технических культур Среднезападного Регионального Исследовательского Центра, Службы Сельскохозяйственных Исследований, Департамента Сельского Хозяйства Соединенных Штатов, из которого они могут быть получены при ссылке на следующие шифры хранения: NRRL N - Штамм N 18395 - A83543.1 18538 - A83543.4 18719 - A83543.6 18720 - A83543.7 18823 - A83543.9 Культуру A83543.1 получали в результате химической мутации культуры A83543, которую выделяли из образцов почвы, собранных на Виргинских островах /см. Mertz и Yao /1990/, Int'l J. of Systematic Bacteriology, т. 40:34/. Культуры A83543.4 и A83543.6 получали из культуры A83543.1 при помощи химически индуцированного мутагенеза с использованием N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина. Культуры A83543.7 и A83543.9 получали из A83543.4 при помощи химически индуцированного мутагенеза с использованием N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина. Приводимые ниже данные показывают, что эти различные изоляты все являются штаммами S.spinosa и обладают очень небольшими культурными, морфологическими или биохимическими различиями. За исключением различий при продуцировании A83543-компонент эти изоляты очень похожы на родительскую культуру.

Культурные характеристики Культуры A83543.1, A83543.4, A83543.6, A83543.7 и A83543.9 выращивали в двенадцати агаровых плоских средах и сравнивали по росту, обращению цвета, продуцированию воздушной гифы, цвету массы спор и продуцированию растворимого пигмента. Никаких существенных различий не было отмечено ни в одной из используемых сред. Эти культуры хорошо росли как в комплексной, так и синтетической солевой средах. Воздушные гифы получали в большинстве используемых сред. Цвет воздушной массы был в большинстве случаев белым, а обратная сторона была от желтой до желто-коричневой. Никаких различий в пигментации не было отмечено, однако в некоторые среды высвобождался растворимый коричневый пигмент. Приведенные культуральные характеристики являются теми же, что и характеристики, содержащиеся в первоначальном таксономическом описании A83543.1 /см. Mertz и Yao /1990/, см. выше/.

Морфологические характеристики Никаких существенных различий не было отмечено ни на одном из сравниваемых штаммов. Четко сформированные воздушные гифы, которые разбиты на длинные цепочки спор, расположенных в форме серпа и незамкнутых петель, содержались на большинстве сред. Были отмечены также спирали, но они были короткими и неполными. Общая морфология напоминает rectusflexi-bilis. Воздушные гифы каждого из штаммов имели характерный, напоминающий шарики, внешний вид с многочисленными "пробелами" в цепи спор. Это свойство подтверждало, что пучок спор заключал цепочку спор, что является характерным свойством семейства Saccharopolyspora.

Физиологические характеристики Сравнивали анализы на жирные кислоты для каждого из штаммов. Клетки выращивали в течение 96 часов при 28^oC в соевом бульоне триптиказы /фирма Difco Laboratories Detroit, M1/. Метиловые сложные эфиры жирных кислот анализировали при помощи газожидкостной хроматографии с использованием управляемой компьютером системы газожидкостной хроматографии модели 5898А /фирма Hewlett-Rackard Co., Пало Альто, КА/ /см. Miller и Berger, "Bacterial Identification by Gas Chromotopraphy of Whole Cell Fatty Acids", Hewlett-Packard Application Note 228-41.

Эти результаты приведены в таблице IX/.

Анализ на основные компоненты является ветвью многовариантной статистики, которая имеет дело с внутренними взаимосвязями совокупности переменных. В этом анализе самое значительное расхождение в исходных данных или результатах испытаний выражается в форме основных компонент /см. Alderson, "The Application and Relevance of Nonheirarchic Methods in Bacterial Texonomy" в Computer-Assisted Bact, Systematies, 227,1985/. При этом можно построить график, характеризующий разброс или изменчивость. Взаимосвязи могут быть получены при помощи исследования отклонения и тем самым можно охарактеризовать микробную популяцию. Двумерный график основной компоненты на основании анализа на жирные кислоты штаммов A83543.1, A83543.4, A83543.6, A83543.7 и A83543.9 представлены на чертеже 1. Эти значения относятся к степеням разделения между рассматриваемыми штаммами. Различия между штаммами представляют штаммовые различия.

Как и в случае с другими организациями, характеристики продуцирующих A83543A, продуцирующих A83543J и продуцирующих A83543Q штаммов подвергаются отклонениям. Таким образом, мутанты этих штаммов могут быть получены при помощи физических и химических методов, известных каждому специалисту в этой области техники. Например, другие штаммы могут быть получены при помощи обработки химическими агентами, такими как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин.

Еще один аспект настоящего изобретения состоит в продуцировании Соединений 1-3 при помощи культивирования продуцирующего A83543 штамма S. Spinosa, выбранного из группы, состоящей из NRRL 18719 и MRRL 18720, или их продуцирующего A83543J мутанта, в соответствующей культуральной среде. "Продуцирующий A83543J мутант" является натуральным или индуцированным мутантом, полученным из NRRL 18719 или NRRL 18720 S. spinosa, который способен продуцировать извлекаемые количества A83543J /а также A83543L, A83543M или A83543N/. Аналогичным образом, Соединения 4-7 получают при помощи культивирования штамма NRRL 18823 S. spinosa и его мутанта, продуцирующего A83543Q, в соответствующей культуральной среде. "Продуцирующим A83543Q мутантом" является штамм, получаемый из NRRL 18823 S. spinosa, который способен продуцировать извлекаемые количества A83543Q /а также A83543R, A83543S или A83543T/. Штамм NRRL 18823 продуцирует A83543-компоненты, содержащие -3,4-ди-O-метилрамнозу. Биосинтетический механизм для метилирования 2-окси группы рамнозы нарушается в этом новом штамме.

После продуцирования Соединения 1-7 могут быть выделены из культуральной среды с использованием различных приемов изоляции и очистки, которые хорошо известны каждому специалисту в этой области техники. С целью экономичности процесса продуцирования, обеспечения оптимального выхода и упрощения изоляции продукта предпочтительными являются несколько культурных сред. Например, предпочтительным источником углерода в промышленных процессах ферментации являются глюкоза и метил олеат, хотя можно также использовать рибозу, ксилозу, фруктозу, галактозу, маннозу, маннит, растворимый крахмал, картофельный декстрин, масла, такие как соевое масло и т.п.. Предпочтительными источниками азота являются цветы хлопка, пептонизированное молоко и крутой кукурузный ликер, хотя можно также использовать рыбную муку, переваренную муку соевых бобов, экстракт дрожжей, гидролизованный ферментом казеин, мясной экстракт и т.п. Среди питательных неорганических солей, которые могут быть включены в культурную среду, можно упомянуть известные растворимые соли, способные давать ионы цинка, натрия, магния, кальция, аммония, хлорида, карбоната, сульфата, нитрата и т.п. В культурную среду необходимо также включить важные следовые элементы, необходимые для роста и размножения организма. Такие следовые элементы в общем случае появляются в качестве примесей в других компонентах среды в количествах, достаточных для того, чтобы обеспечить рост организма.

В общем случае, если возникают проблемы с пенообразованием, в большие количества среды для ферментации можно добавить небольшие количества /т.е. 0,2 мл/л/ противопенного агента, такого как полипропилен гликоль. Однако в случае культур, продуцирующих A83543, известные противопенные агенты ингибируют продуцирование A83543. Образование пены можно контролировать при помощи включения в среду соевого масла или ПЛУРОНИКА Л-101 /PLURONIC-101, фирма BASF, Парсиппани, НДж/ в концентрации 1-3%. Если пенообразование продолжается, то можно добавить еще масла.

Для получения существенных количеств натуральных факторов предпочтительна погруженная аэробная ферментация в перемешиваемых биореакторах; однако небольшие количества натуральных факторов могут быть получены при помощи культивирования в колбе на вибраторе. Ввиду запаздывания по времени при продуцировании, которое в общем случае связано с прививкой больших биореакторов спорами организма, в предпочтительном варианте используют вегетативную прививку. Вегетативную прививку получают при помощи прививки небольшого объема культурной среды из сырьевой культуры, которая хранится в жидком азоте с тем, чтобы получить свежую, активно растущую культуру этого организма. Затем вегетативную прививку переносят в биореактор более значительного размера. Средой для вегетативной прививки может быть та же среда, что используется для ферментаций более значительного размера, но можно также использовать другие среды.

Соединения 1-3 получают при помощи продуцирующего A83543J штамма, а соединения 4-7 получают при помощи продуцирующего A83543Q штамма, когда выращивание осуществляется при температурах в области от примерно 24^oC до примерно 33^oC. Оптимальные температуры для продуцирования содержатся в области примерно 28-30^oC.

Как известно, в процессах погруженного аэробного культивирования в сосуд под давлением подают стерильный воздух в нижнюю часть сосуда, при этом одновременно среду перемешивают с использованием известной турбинной мешалки. В общем случае скорость аэрации и скорость перемешивания должны быть достаточными для того, чтобы поддержать уровень растворенного кислорода в области 80% или выше насыщенным воздухом, в предпочтительном варианте выше 70% при давлении внутри сосуда примерно 0,34 атмосферы.

За продуцированием Соединений 1-7 можно следить в процессе ферментации при помощи анализа экстрактов бульона. Предпочтительной процедурой для наблюдения за продуцированием является анализ экстрактов бульона с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии /ВЭЖХ/. Соответствующие системы для анализа описаны в примерах 1 и 7.

После продуцирования в колбах на вибраторе или в реакторах смешения Соединения 1-7 могут быть выделены из среды для ферментации известными в этой области техники приемами. Соединения, получаемые при ферментации продуцирующих A83543J или продуцирующих A83543Q штаммов, содержатся как в мицелии, так и в бульоне. Соединения 1-7 являются липофильными; если при ферментации используют значительное количество масла, экстрагирование всего бульона является более эффективным. Если используют лишь небольшие количества масла, основная доля Соединений 1-7 содержится в мицелии. В этом случае более эффективное выделение Соединений 1-7 осуществляется при помощи начальной фильтрации среды с тем, чтобы отделить бульон от массы мицелия /биомассы/.

Соединения 1-7 могут быть выделены из биомассы при помощи самых разнообразных приемов. Например, подходящий прием включает промывку отделенной биомассы водой, чтобы удалить остатки бульона, смешение биомассы с полярным растворителем, в котором Соединения 1-7 растворимы, например, метанолом или ацетоном, отделение и концентрирование растворителя, экстрагирование концентрата неполярным растворителем и/или адсорбирование его на адсорбенте, обращенно-фазовом силикагеле, таком как обращенно-фазовая смола C₈ или C₁₈, или высокопористом полимере, таком как HP-20 или HP-20SS /фирма Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Япония/. Активный материал элюируют из адсорбента соответствующим растворителем, таким как, например, смеси ацетонитрил: метанол, возможно содержание небольших количеств ТГФ.

Предпочтительный прием для выделения Соединений 1-7 из биомассы включает добавление равного объема ацетона в весь объем бульона, фильтрацию смеси на керамическом фильтре, чтобы удалить биомассу, и экстрагирование фильтрата этилацетатом. Экстракт этил ацетата концентрируют под вакуумом, чтобы удалить ацетон, а водный слой отделяют от органического слоя. Раствор этил ацетата затем концентрируют под вакуумом, а концентрат экстрагируют разбавленной водой кислотой /pH 3/. Затем Соединения 1-7 подвергают очистке при помощи хроматографии, как это было описано.

Более предпочтительный прием для выделения Соединений 1-7 из биомассы включает добавление равного объема ацетона в полный объем бульона, фильтрацию смеси на керамическом фильтре, чтобы удалить биомассу, и обеспечение pH фильтрата на уровне от примерно pH 9 до примерно pH 13. Этот раствор наносят на HP-20SS /фирма Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd., Япония/ и колонну промывают смесью метанола, ацетонитрила и воды /1:1:2/. Любое из Соединений 1-7 может быть элюировано смесью 95:5 метанола/ ацетонитрила /1:1/ и выводного 0,1% раствора ацетата аммония /pH 8,1/. Фракции, содержащие Соединения 1-7, соединяют и подвергают лиофилизации. Соединения 1-7 могут быть затем подвергнуты очистке с использованием хроматографии, как это уже было описано.

В качестве альтернативы, твердые частицы культуры, включающие компоненты среды и мицелий, могут быть использованы без экстрагирования или отделения, но в предпочтительном варианте после удаления воды в качестве источника Соединений 1-7. Например, после продуцирования Соединений 1-7 весь бульон ферментации можно высушить при помощи лиофилизации в сушке типа барабана или при помощи азеотропной дистилляции и сушки. Высушенный бульон затем можно использовать непосредственно с загружаемым сырьем или включая его в формы для распыления или порошки.

Соединения 1-8 способны ингибировать насекомых или клещей. Термин "ингибирование насекомых или клещей" относится к уменьшению числа живых насекомых или клещей или к уменьшению числа жизнеспособных яиц насекомых или клещей. В общем случае используют Соединения 1-8 в количестве от примерно 1 до 1000 долей на миллион /или от 0,01 до 1 кг/а/.

Более конкретно, Соединения 1-8 обладают активностью против "походных червей" свеклы и совки, которые являются членами отряда насекомых Lepidoptera. Другими известными представителями этого отряда являются южные "походные черви", плодожорка яблонная, совка, моль платяная, огневка амбарная южная, листовертки, совка хлопковая, мотылек кукурузный, мермитиды, совкани, розовый коробочный червь, мешочница поденкоподобная, коконопряд кольчатый американский, луговые мотыльки и осенние "походные черви".

Соединения 1-8 обладают также активностью против цикадки, которая является представителем отряда насекомых Homoptera. К другим представителям этого отряда относятся тля хлопковая, дельфациды, медяница грушевая, медяница яблонная, червецы, белокрылка, пенница, а также несколько других, специфических относительно хозяина, видов тли.

Кроме того, Соединения 1-8 обладают активностью против стабильных мух, падальных мух и москитов. которые являются членами отряда насекомых Diptera. Другими типичным представителем этого отряда является обычная комнатная муха.

Соединения 1-8 обладают также активностью против клещика паутинного двупятнистого, который является членом отряда насекомых Acarina. Другими известными представителями этого отряда являются клещ чесоточный, клещ конский, железница овечья, клещ кровососущий птичий, клещ изменчивый, железница собачья.

Соединения 1-8 используют в соответствии со способом подавления популяции насекомых или клещей, который содержит применение к месту обитания насекомых или клещей эффективного, подавляющего насекомых или клещей количества по крайней мере одного соединения, выбранного из Соединений 1-8. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на способ подавления восприимчивых насекомых отряда Lepidoptera, который содержит применение к растению эффективного, подавляющего насекомых количества по крайней мере одного соединения, выбранного из Соединений 1-8 в соответствии с настоящим изобретением. Еще один предпочтительный вариант настоящего изобретения направлен на способ подавления жалящих мух отряда Diptera на животных, который содержит применение эффективного, подавляющего паразитов количества по крайней мере одного соединения, выбранного из Соединений 1-8, к животному стоматическим, парентеральным или местным способом. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ подавления восприимчивого насекомого отряда Homoptera, который содержит применение к растению эффективного, подавляющего насекомых количества по крайней мере одного соединения, выбранного из Соединений 1-8. Еще один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения направлен на способ подавления клещей отряда Acarina, который содержит применение к месту обитания клещей подавляющего клещей количества по крайней мере одного соединения, выбранного из Соединений 1-8.

Испытания с Клещами/Насекомыми Соединения 1-8 испытывали на противоклещевую и инсектицидную активность в соответствии со следующим испытанием на клещах/насекомых. Каждое испытываемое соединение подготавливали при помощи растворения соединения в смеси ацетон-спирт /1: 1/, содержащей 23 г ТОКСИМУЛА P /TOXIMUL R, смесь сульфоната/неионного эмульгатора/ и 13 г ТОКСИМУЛА С /смеси сульфоната/неионного эмульгатора/ на литр. Затем эти смеси разбавляли водой, чтобы получить указанные концентрации.

Клещиков паутинных двупятнистых и тлю хлопковую помещали на семядоли тыквы и давали возможность размножится на обеих поверхностях листа. Затем эти листья опрыскивали 5 мл испытываемых растворов, используя распыляющий опрыскиватель Devilbiss при давлении 10 фунтов/кв. дюйм/ 0,7 кг/см²/. Обе поверхности листьев опрыскивали до тех пор, пока с них не начнет стекать, а затем сушат в течение часа. После стандартных периодов выдерживания подсчитывали процент гибели. Испытание на других насекомых осуществляли с использованием таких же форм и процедур подсчета. Полученные результаты приведены в конце описания в таблице X. В ней использованы следующие сокращения и соответствующие им русские и латинские названия.

ALH - Цикадка астровая - Macrosteles fascifrons BAW - Походные черви - Spodoptera exiqua CA - Тля хлопковая - Aphis gossypii Glover CBW - Совка хлопковая - Heliothis zea GECR - Таракан рыжий - Blattella germanica NEM - Нематода корневая - Meliiodyne spp.

SAW - Южные походные черви - Spodoptera eridinia SCRW - Блошка длинноусая южная - Diabrotica undecimpunctata howardi TBW - Совка - Heliothis virescens TSSM - Клещик паутинный двупятнистый - Tetranychus urticae Соединение 8 /N-диметил-A83543D/ также испытывали, и было установлено, что оно активно против SAW, SCRW и TSSM.

Соединения 1-8 оценивали с использованием следующего испытания, чтобы определить ЛД₅₀ против только что вылупившейся совки /Heliothis Virescens/. Чашку Петри /100 мм х 20 мм/ переворачивали и крышку покрывали фильтровальной бумагой качества # 1. Только что вылупившиеся личинки помещали в каждую чашку и пипеткой на насекомых наносили 1 мл испытываемого раствора. Затем дно чашки Петри помещали на крышку, чтобы закрыть личинки. Спустя 1 час после обработки в каждую чашку добавляли небольшую порцию диеты Heliothis /Модифицированный шламм, фирма South land Products Lake Village, AR/. Через 24 и 48 часов подсчитывали процент гибели. Испытание осуществляли в трех экземплярах.

Результаты приведены в таблице XI.

Соединения 1-8, являющиеся предметом настоящего изобретения, применяют в форме композиций, которые содержат подавляющее насекомых или клещей количество любого одного из Соединений 1-8 в приемлемом с фитологической точки зрения инертным носителе. Любое одно из Соединений 1-8 может содержать в виде одного соединения, смеси двух или более соединений, смеси по крайней мере одного соединения, выбранного из соединений 1-8, или смеси по крайней мере одного соединения, выбранного из Соединений 1-8 вместе с высушенной порцией среды для ферментации, в которой оно было получено.

Композиции получают в соответствии с процедурами и формулами, которые известны в агорохимической науке, но которые являются новыми и важными вследствие присутствия одного или нескольких соединений настоящего изобретения. Эти композиции являются либо концентрированными формами, которые диспергируют в воде при применении, или дустом, или гранулированными формами, которые применяют без последующей обработки.

Дисперсии, в которых соединение или неочищенный высушенный материал применяют, наиболее часто являются водными суспензиями или эмульсиями, полученными из концентрированных форм соединений или неочищенного материала, такими как растворимые в воде, суспендируемые в воде или эмульгируемые формы, которые являются либо твердыми /известные как смачиваемые порошки/, либо жидкими /известные как эмульгируемые концентраты или водные суспензии/.

Смачиваемые порошки, которые могут быть приготовлены в форме диспергируемых в воде гранул, содержат хорошо перемешанную смесь активного соединения, инертного носителя и поверхностно-активного агента. Концентрация активного соединения в общем случае составляет от примерно 1% до примерно 90% по массе. Инертный носитель в общем случае выбирают среди аттапульгитных глин, монтмориллонитных глин, диатомовой земли или очищенных силикатов.

Эффективные поверхностно-активные агенты, составляющие от примерно 0,5% до примерно 10% от смачиваемого порошка, можно найти среди сульфонированных лигнинов, конденсированных нафталин-сульфонатов, нафталин-сульфонатов, алкилбензолсульфонатов, алкилсульфатов и неионных поверхностно-активных агентов, таких как аддукты окиси этилена алкилфенолов.

Эмульгируемые концентраты соединений содержат соединение в известной концентрации, такой как от примерно 50 до примерно 500 грамм на литр жидкости /что эквивалентно от примерно 10% до примерно 50%/, растворенного в инертном носителе, который является либо смешивающимся с водой растворителем, либо смесью не смешивающегося с водой органического растворителя и эмульгаторов. Используемые органические растворители включают ароматические растворители, в частности ксилолы и нефтяные фракции, в частности кипящие при высокой температуре нафталиновые и олефиновые фракции нефти, такие как тяжелый лигроин или ароматическая нафта. Можно также использовать другие органические растворители, такие как терпеновые растворители, включая производные канифоли, алифатические кетоны, такие как циклогексанон и сложные спирты, такие как 2-этоксиэтанол. Соответствующие эмульгаторы для эмульгируемых концентратов выбирают из известных неионовых поверхностно-активных агентов, таких как те, что были упомянуты выше.

Водные суспензии включают суспензии не растворимых в воде соединений настоящего изобретения, диспергированных в водном носителе в концентрации в области от примерно 5 до примерно 50 массовых %. Эти суспензии получают при помощи тонкого измельчения этого соединения и энергичного его перемешивания в носителе, состоящем из воды и поверхностно-активных агентов, выбранных из тех, что были упомянутые выше. Можно также добавить инертные ингредиенты, такие как неорганические соли и синтетические или натуральные смолы, чтобы увеличить плотность и вязкость водного носителя. Часто наиболее эффективно измельчить и смешать соединение одновременно при помощи получения водной смеси и ее гомогенизации в устройстве, таком как песчаная мельница, шаровая мельница или гомогенизатор плунжерного типа.

Соединения 1-8 можно также применять в форме гранулированных композиций, которые особенно эффективны при применении к почве. Гранулированные композиции в общем случае содержат от примерно 0,5 до примерно 10 массовых% по крайней мере одного из Соединений 1-8, диспергированного в инертном носителе, который состоит целиком или в основном из глины или аналогичного дешевого материала. Такие композиции в общем случае получают при помощи растворения соединения в соответствующем растворителе и применения его к гранулированному носителю, который был предварительно получен в форме соответствующих частиц размером от примерно 0,5 до 3 мм. Таким композициям можно также придать форму при помощи приготовления теста или пасты из носителя, сушки комбинированной смеси активного ингредиента в тесте или пасте и измельчения высушенной композиции, чтобы получить целевой размер частиц гранул.

Дусты, содержащие соединение, получают при помощи тщательного перемешивания в порошкообразной форме с соответствующим сельскохозяйственным носителем в форме дуста, таким как каолин, измельченная вулканическая порода и т. п. Дусты могут также содержать от примерно 1% до примерно 10% по крайней мере одного соединения, выбранного из Соединений 1-8.

Можно также в случае, когда это необходимо по какой-либо причине, применить соединение в форме раствора в соответствующем органическом растворителе, в общем случае в легком нефтяном масле, таком как инсектицидное масло, которое широко используют в агрохимии.

Инсектициды и противоклещевые препараты в общем случае применяют в форме дисперсии активного ингредиента в жидком носителе. Наиболее широко используемым носителем является вода.

Соединения 1-8 могут быть также применены в форме аэрозольной композиции. В таких композициях активное соединение растворяют в инертном носителе, которым является создающая давление распыляющая смесь. Аэрозольную композицию упаковывают в контейнер, из которого смесь выбрасывается через распыляющий клапан. Распыляющая смесь состоит либо из галоидуглеродов, кипящих при никой температуре, которые могут быть смешаны с органическими растворителями, либо из водной суспензии, находящейс