Конъюгаты, полученные из комплексов металлов и олигонуклеотидов, средства, содержащие конъюгаты, их использование в радиодиагностике, а также способ их получения

Конъюгаты, полученные из комплексов металлов и олигонуклеотидов, средства, содержащие конъюгаты, их использование в радиодиагностике, а также способ их получения

Реферат

 

Изобретение относится к биохимии, в частности к химически модифицированным олигонуклеотидным конъгатам, которые содержат комплексообразующий агент или комплекс, который связан соединяющим компонентом с олигонуклеотидами. Олигонуклеотиды модифицированы, что препятствует или, по крайней мере, существенно ингибирует деградацию встречающимися в природе нуклеазами. Олигонуклеотидный радикал может связываться специфически с высоким связывающим сродством со структурами-мишенями и тем самым может производить специфическое терапевтическое и диагностическое действие посредством связанного комплексообразующего агента или комплекса. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств для диагностики патологичеких состояний, например опухолевых заболеваний. 4 с. и 13 з.п. ф-лы, 3 ил.

Это изобретение относится к конъюгатам олигонуклеотидов, которые содержат комплексообразующий агент или комплекс. Эти конъюгаты используют в областях диагностики и лечения.

Визуальная диагностика достигла большого прогресса за последние десятилетия и продолжает непрерывно развиваться. Сегодня возможно сделать видимой сосудистую систему, большинство органов и многие ткани в живом организме без особого вмешательства. Во многих случаях диагностику заболевания проводят по изменениям формы, размера и положения анатомических структур в теле. Такие анатомические данные о состоянии внутренних органов тела можно получить с помощью рентгеновской техники, ультразвуковой диагностики и магнитной резонансной томографии. Эффективность каждой из упомянутых техник может быть повышена путем использования фармацевтических средств для повышения естественного контраста тканей и жидкостей тела на получающейся картине. Фармацевтические средства, о которых идет речь, вводят в полости тела или инъецируют в кровеносные сосуды с целью контрастного изменения полостей или сосудов. Кроме того, они распространяются с помощью кровотока в организме и могут изменять видимость органов и тканей. В исключительных случаях, такие вещества связываются с определенными структурами в теле, и/или активно транспортируются, и/или экскретируются (выделяются) последними. Таким путем, в индивидуальных случаях функции могут быть также сделаны видимыми и могут быть использованы для диагностики заболеваний.

В противоположность этому, ядерная диагностика основана на веществах, которые могут сами по себе делаться видимыми. В этом случае радиоактивные изотопы, которые излучают радиацию в большом диапазоне, вводят в организм. Распространение этих веществ в организме можно проследить с помощью подходящих детекторов. Преимущество ядерного медицинского способа заключается в высокой эффективности при низкой дозе посылающих сигнал радиоактивных веществ, обозначаемых как радиофармацевтические средства.

Если используют изотопы, которые выделяют - или -излучение или другие токсичные продукты разложения, эффективные в ткани, то радиофармацевтические средства могут быть также использованы для терапевтических целей, например для деструкции опухолей. Такого же эффекта можно достигнуть тем, что неопасные изотопы или вещества вводят в организм и превращают только там путем, например, облучения нейтронами или рентгеновскими лучами, ультразвуком или радиоволнами в терапевтически эффективную форму.

Общая проблема заключается в диагностике и локализации патологических изменений за имеющееся в распоряжении время, при котором нет ясных изменений формы, строения и кровообращения в органах и тканях, о которых идет речь. Такая диагностика и постоянное наблюдение имеет важное значение, например, в случае опухолевых заболеваний, включая поиск метастаз, оценку дефицита снабжения тканей кислородом и в случае некоторых инфекций и также метаболических заболеваний.

В настоящее время имеющиеся терапевтические и визуализирующие диагностические методы значительно зависят от доступности фармацевтических препаратов, которые аккумулируются в местах патологических нарушений, которые невозможно определить другим путем.

Контрастными средами, коммерчески доступными в данное время, преимущественно являются так называемые неспецифические препараты. Они пассивно распространяются в пространствах, в которые их вводят, например, путем инъекции.

В прошлом были идентифицированы многие вещества и классы веществ, которые могут проявлять специфичность или, как можно предположить, имеют специфичность в отношении их распространения в живом организме. Таким примерами, помимо антител, пектинов, являются все типы рецепторсвязанных веществ, клетки, мембраны и компоненты мембран, нуклеиновые кислоты, природные метаболиты и их производные, а также большое количество фармацевтических веществ. Пептиды изучались и также подлежат исследованию с особым вниманием.

В патенте США N 4707352 рассматривается специальный способ маркировки комплексообразующих молекул радиоактивными изотопами, но не описаны приемлемые комплексообразующие агенты для связывания ионов металла.

В ЕР-A-0 285057 раскрываются конъюгаты - нуклеотидкомплексообразующий агент, которые не пригодны из-за in vivo нестабильности используемых нуклеотидов в качестве in vivo диагностических или терапевтических средств и которые, кроме того, с трудом удовлетворяют другим требованиям совместимости и фармакокинетики.

Во многих патентах США, таких как, например, патент США 4707440, речь идет о модифицированных полимерах, которые имеют определенную химическую группу. Полимеры могут представлять собой полинуклеотиды и олигонуклеотиды, но они ни стабилизированы против деградации встречающимися в природе нуклеазами, ни отобраны специальным способом, для этого их специфически связывают с высоким связующим сродством со структурами-мишенями. Конкретные варианты воплощения этих детектируемых молекул упоминаются в патентах США N 4843122 и 4943523. Индивидуальный нуклеотид, модифицированный таким путем, заявлен в патенте США N 4952685. Использование этих средств в способах визуализации раскрывается в патенте США 4849208.

Целью данного изобретения является получение специфически связывающихся диагностических средств для обнаружения структур-мишеней, с помощью которых, например, становится возможным визуализация органов, тканей и их патологических изменений in vitro и in vivo.

Найдено, что эта цель может быть достигнута при помощи конъюгатов нуклеотидов, которые помимо олигонуклеотидного радикала имеют комплексообразующий агент, связанный непосредственно или с помощью связующего компонента и чей олигонуклеотидный радикал модифицирован так, чтобы предотвратить или, по крайней мере, значительно ингибировать деградацию встречающимися в природе нуклеазами.

Целью изобретения являются: 1. Конъюгаты олигонуклеотидов, состоящие из олигонуклеотидного радикала N и n заместителей (B-K), в которых В обозначает непосредственную связь или соединяющий компонент с олигонуклеотидным радикалом, и К означает комплексообразующий агент, или комплекс радиоактивных изотопов металла, или стабильных изотопов, которые - превращаются в радиоактивные изотопы при помощи внешнего облучения, - превращают внешнее облучение в облучение различного качества, различного энергетического содержания и/или различной длины волны, элементов под атомными номерами 5, 21-29, 31, 39, 42-44, 49, 57-83 или 85, при этом олигонуклеотидный радикал N представляет модификацию, которая предотвращает или, по крайней мере, значительно ингибирует деградацию имеющимися в природе нуклеазами.

2. В предпочтительном варианте воплощения конъюгаты олигонуклеотидов данного изобретения имеют общую формулу (I) H-(B-K)_n (I) в которой N представляет олигонуклеотид с высоким связующим сродством, который специфически связывается со структурами- мишенями и имеет модификации, которые значительно понижают деградацию встречающимися в природе нуклеазами, B есть химическая связь или соединяющий компонент, который обеспечивает связь между N и К, K есть комплексообразующий лиганд, который может содержать посылающий сигнал или терапевтически активный элемент, n - целое число от 1 до 10.

3. Соединение по п.п. 1 или 2, в котором N представляет олигонуклеотид с от 5 до 200 нуклеотидами, в котором а) 2'-положение сахаридного звена, независимо одно от другого, занято следующими группами: группа OR, в которой R означает алкильный радикал с 1 до 20 углеродными атомами, который произвольно содержит вплоть до 2 гидроксильных групп и который произвольно прерывается 1-5 кислородными атомами, атом водорода, гидроксильная группа, атом фтора, аминовый радикал, аминовая группа, и гидроксильные группы, присутствующие в концевых положениях 3' и 5', независимо одна от другой, произвольно этерифицированы радикалом R и/или b) фосфодиэфиры, которые необязательно используются в качестве межнуклеотидной связи, независимо друг от друга, замещены фосфортиоатами, фосфордитиоатами и/или алкилфосфонатами, предпочтительно метил фосфонатом, и/или с) концевые радикалы в 3'- и 5'-положениях связаны внутримолекулярно один с другим при помощи межнуклеотидной связи, как описано в b) и/или d) он содержит межнуклеотидную связь, как описано в b), которая связывает 3'-3'- или 5'-5'-положение и/или е) он содержит фосфодиэфирную связь, описанную в b), которая соединяет, подобно сложноэфирной, два тимидина при помощи C₂-C₂₀ гидроксиалкильного радикала соответственно в 3-положении или соединяет аналогично замещенный тимидиновый радикал, подобно сложноэфирной, с гидроксильной группой другого сахара в 2'-, или 3'-, или 5'-положении и/или f) концевые радикалы в 3'- и 5'-положениях содержат межнуклеотидные связи, произвольно модифицированные, как описано в b).

4. Соединение по п. 3, в котором олигонуклеотид N включает от 15 до 100 нуклеотидов.

5. Соединение по п.п. 1-4, в котором N является олигонуклеотидом с высоким связующим сродством, который специфически связывается со структурами-мишенями с высоким связующим сродством и который может быть получен тем, что смесь олигонуклеотидов, содержащую статистические последовательности, вводят вместе со структурой-мишенью, и некоторые олигонуклеотиды проявляют повышенное сродство к структуре-мишени относительно смеси олигонуклеотидов, последний отделяют от остатка олигонуклеотидной смеси, затем олигонуклеотиды с повышенным сродством к структуре-мишени амплифицируют, чтобы получить смесь олигонуклеотидов, которая имеет большое количество олигонуклеотидов, которые связываются на структурах-мишенях.

6. Соединения, описанные в п.п. 1-5, в которых N есть олигонуклеотид с высоким связующим сродством, который специфически связывается со структурами-мишенями, и которые могут быть получены тем, что а) сначала путем химического синтеза получают ДНК цепь, так что на 3'-конце эта ДНК цепь содержит определенную последовательность, которая комплементарна промотору для РНК-полимеразы и в то же самое время комплементарна праймеру полимеразно-цепьевой реакции (PCR), и так, что эта ДНК цепь содержит определенную последовательность на 5'-конце, которая комплементарна праймерной последовательности для полимеразно-цепьевой реакции, и последовательность между данными определенными последовательностями содержит статистическую последовательность, b) ДНК цепь транскрибируют в комплементарную РНК цепь с помощью РНК-полимеразы, и нуклеотиды предлагаются полимеразе, которые модифицированы в 2-положении рибозного звена, с) РНК олигонуклеотиды, полученные таким путем, вводят вместе со структурой-мишенью, с которой олигонуклеотид должен быть специфически связан, и тем, что d) те олигонуклеотиды, которые связаны со структурой-мишенью, отделяют сначала вместе со структурой-мишенью от несвязывающихся нуклеотидов, и затем связанные нуклеотиды снова отделяют от структуры-мишени, и тем, что е) эти структура-мишень-специфические РНК олигонуклеотиды подвергают транскрибированию с помощью обратной транскриптазы в комплементарную ДНК цепь, и тем, что f) эти ДНК цепи амплифицируют полимеразно-цепной реакцией с использованием определенных праймерных последовательностей, и тем, что g) ДНК олигонуклеотиды, амплифированные таким путем, затем подвергают транскрибированию снова с помощью РНК-полимеразы и модифицированных нуклеотидов в РНК-олигонуклеогиды, и тем, что h) вышеупомянутые стадии отбора c) -g) произвольно повторяют до тех пор, пока олигонуклеотиды, которые отличаются высоким связывающим сродством к структуре-мишени, не будут достаточно отобраны, и тогда последовательности полученного таким путем олигонуклеотила произвольно могут быть способными к определению.

7. Соединение по п. 6, в котором структуру-мишень выбирают среди макромолекул, тканевых структур высших организмов, таких как животные или люди, органы или части органов животного или человека, клетки, опухолевые клетки или опухоли.

8. Соединение по п.п. 1-7, в котором соединяющий компонент(ы) В связан (связаны) а) с 4'-концом олигонуклеотидного радикала N, уменьшенном в 4'-положении на CH₂-ОН группу и/или b) с 3'-концом олигонуклеотидного радикала N, уменьшенном в 3'-положении на атом водорода и/или c) с фосфодиэфирным мостиком(ами), уменьшенным на ОН группу(ы), каждый между двумя нуклеотидами и/или d) с 1 до 10 нуклеоснованием(ями), которое(ые) уменьшено на атом водорода, соответственно, в 5-, 8-положении(ях) и/или на аминогруппу(ы) в 2-, 4- и 6-положении(ях).

9. Соединение по п.п. 8a) или 8b), в котором B имеет общую формулу X-Y-Z¹, который по X стороне связан с комплексообразующим агентом или комплексом и по Z стороне связан с олигонуклеотидом, в котором X обозначает, непосредственную связь, -NH или -S группу, Y обозначает неразветвленную-цепную, разветвленную-цепную, насыщенную или ненасыщенную C₁-C₂₀ алкиленовую цепь, которая произвольно содержит 1-2 циклогексилен, 1-5 имино, 1-3 фенилен, 1-3 фениленимино, 1-3 фениленокси, 1-3 гидроксифенилен, 1-5 амидо, 1-2 гидразидо, 1-5 карбонил, 1-5 этиленокси, уреидо, тиоуреидо, 1-2 карбоксиалкилимино, 1-2 сложно-эфирные группы, 1-3 группы Ar, в которых Ar обозначает насыщенное или ненасыщенное 5- или 6-членное кольцо, которое произвольно содержит 1-2 гетероатома, выбранные из азота, кислорода и серы и/или 1-2 карбонильные группы; 1-10 атомов кислорода, 1-5 атомов азота и/или 1-5 атомов серы, и/или произвольно замещена 1-5 гидрокси, 1-2 меркапто, 1-5 оксо, 1-5 тиоксо, 1-3 карбокси, 1-5 карбокси-C₁-C₄ алкильными, 1-5 сложноэфирными, 1-3 амино, 1-3 гиlрокси-C₁-C₄ алкильными, 1-3 C₁- C₇ алкоксигруппами, и Z¹ обозначает -CONH-CH₂-4', -NH-CO-4', -O-P(O)R'-NH-CH₂-4', -O-P(O)R'-O-CH₂-4', -O-P(S)R'-O-3', или -O-P(O)R'-O-3', где 4' или 3' указывают на связь с концевым сахаридным звеном(ями) и R' обозначает О^-, S^-, C₁-C₆ алкильную или NR²R³ группу, причем R² и R³ обозначают водород и C₁-C₄ алкильные радикалы.

В качестве циклических структур (Ar) особенно пригодными являются циклические насыщенные или ненасыщенные алкилены с 3 до 6, особенно 5 или 6 C атомами, которые произвольно содержат гетероатомы, такие как N, S или O. В качестве примеров могут быть упомянуты: циклопентилен-, пирролилен-, фуранилен-, тиофенилен-, имидазолилен-, тиазолилен-, пиразолилен-, пирролидилен-, пиридилен-, пиримидилен-, малеинимидилен- и фталимидиленовые группы.

10. Соединение по п. 8c), в котором B имеет общую формулу X-Y-Z², который связан по X стороне с комплексообразующим агентом или комплексом и по Z стороне с олигонуклеотидом, в котором Z², в мостике, связывающем два соседних сахаридных звена, обозначает группу - NH₂-, -O- или -S-, и X, Y и R² имеют значения, указанные в пункте 9.

В качестве радикала Y, соединяющего компоненты Z¹-Y-X (согласно п. 9) или Z²-Y-X (согласно п. 10), можно упомянуть в качестве примеров радикалы - (CH₂)₆-NH-CS-NH-C₆H₄-CH(CH₂CO₂H)- CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-, - (CH₂)₆-NH-CS-NH-C₆H₄-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CO-CH₂-, -(CH₂)₆-NH-CO-CH₂-CH₂-, -(CH₂)₂-, -(CH₂)₆-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₂-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₆-, -(CH₂)₂-NH-CO-, -(CH₂)₆-NH-CO-, -(CH₂)₆-S-(CH₂)-NH-CO, -(CH₂)₆-S-(CH₂)₆-NH-CO-, 11. Соединение по п. 8d), в котором B имеет общую формулу X-Y-Z³, в которой Z³ обозначает -NH группу или непосредственную связь с нуклеоснованием и X и Y имеют значение, указанное в п. 9.

В качестве примеров можно упомянуть радикалы -CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-, -NH-CO-CH₂-CO-NH-CH₂-CH(OH)-CH₂-, -CO-NH-CH₂-CH₂-NH-, -CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-, -CH₂-S-CH₂-CH₂-, -(CH₂)₄-S-CH₂-CH₂-NH-, -CO-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-, -CO-CH₂-S-(CH₂)₆-NH-, -CH= CH-CO-NH-CH₂-CH₂-NH-, -CH= CH-CH₂-NH-, -CC-CH₂-NH- or -CO-CH₂-CH₂-NH-CH₂-CH₂-NH-.

В качестве связывающих мест в случае пуриновых оснований особенно пригодно 8-положение, а в случае пиримидиновых оснований особенно пригодно 5-положение. В этом случае, чисто формально, атом водорода соответствующего основания замещен радикалом B-K. Но связь может осуществляться, кроме того, с помощью аминогрупп, необязательно содержащихся в 2-, 4- или 6- положении, так, например, при помощи 2-аминогруппы в гуанине, с помощью, 6-аминогруппы в аденине или с помощью 4-аминогруппы в цитозине. В этом случае, атом водорода соответствующей аминогруппы, соответственно, замещен радикалом B-K.

12. Соединения по одному из предшествующих п.п., в которых комплекс металла в качестве визуализирующего элемента содержит радиоактивный изотоп, выбранный из элементов меди, висмута, технеция, рения или индия.

13. Изобретение, кроме того, включает способ обнаружения структуры-мишени, в котором одно или более из соединений по одному из предшествующих п. п. вносят вместе in vivo или in vitro с образцом, подлежащим исследованию, и который основан на сигнале, с помощью которого определяют, присутствует ли в образце структура-мишень, на которой олигонуклеотид связан специфически и с высоким связывающим родством, а также 14. Способ неинвазивной диагностики заболеваний, в котором одно или более из соединений по одному из п.п. 1-12 вносят вместе со структурой-мишенью, подлежащей исследованию in vivo, и основанном на сигнале, с помощью которого определяют, присутствует ли в организме, подлежащем изучению, структура-мишень, с которой олигонуклеотид специфически связан.

15. Целью изобретения также является использование соединения по п.п. 1-12 в радиодиагностике и/или в радиотерапии, а также 16. Диагностический набор для in vivo или in vitro определения структур-мишеней, и этот диагностический набор содержит, по крайней мере, одно соединение по одному из п.п. 1-12.

17. Соединение по одному из п.п. 1-4, в котором N представляет собой не встречающийся в природе олигонуклеотидный лиганд, имеющий специфическое связывающее сродство к молекуле-мишени, причем такая молекула-мишень имеет трехмерную химическую структуру, другую, чем полинуклеотид, которая связывается с указанным олигонуклеотидным лигандом посредством механизма, который преимущественно зависит от спаривания оснований Уотсона-Крика (Watson/Crick) или от тройного спирального связывания, где указанный олигонуклеотидный лиганд не является нуклеиновой кислотой, имеющей известную физиологическую функцию, будучи связанным с молекулой-мишенью.

Если предлагаемые конъюгаты должны быть использованы в качестве диагностического агента, то комплексообразующий агент (ы) содержит (содержат) визуализирующий радиоактивный изотоп элементов с атомными номерами 21, 26-27, 29, 31, 43 или 49, предпочтительно 43 или 49. Если предлагаемые конъюгаты должны быть использованы в качестве терапевтического агента, то помимо вышеупомянутых элементов, также подходят изотопы элементов с атомными номерами 5, 22-25, 28, 42, 44, 57-83 и 85. Вне радиоактивных вышеупомянутых элементов особенно пригодными в области лечения являются стабильные изотопы, которые a) превращаются с помощью внешнего облучения в радиоактивные изотопы, b) превращают внешнее облучение в облучение различного качества, различного энергетического содержания и/или различной длины волны.

Число визуализирующих или терапевтически эффективных заместителей B-K, связанных с олигонуклеотидным радикалом, с одной стороны, ограничивается величиной олигонуклеотида, но оно не бывает выше 10. Согласно изобретению предпочтителен один или два заместителя B-K.

В принципе величина олигонуклеотидного радикала N не ограничена. Для данного изобретения олигонуклеотиды с 5 до 600 нуклеотидов являются пригодными к употреблению, особенно предпочтительны олигонуклеотиды с 15 до 100 нуклеотидами.

Олигонуклеотиды, годные к употреблению, согласно изобретению являются стабилизированными против деградации нуклеазами, встречающимися in vivo.

Немодифицированные олигонуклеотиды или полинуклеотиды расщепляются in vivo эндонуклеазами и эксонуклеазами. Реакция деградации в РНК ряде начинается с активации 2-гидроксигруппы. Другими катаболитическими ферментами являются, например, рибозимы, которые расщепляют фосфодиэфирную связь RNS (смотри Science 261, 709 (1993)). In vivo стабильность RNS производных можно увеличить частичным или полным замещением 2-гидроксильной группы другими заместителями. Такими заместителями являются, например, алкоксигруппы, особенно метоксигруппа (смотри, например, Chem. Pharm. Bull. 13, 1273 (1965), Biochemistry 10, 2581 (1971), атом водорода, атом фтора (смотри, например, Can. J. Chem. 46, 1131 (1986) или аминогруппа (смотри, например, J. Org. Chem. 42, 714 (1977). Некоторые из этих заместителей, а также другие могут быть введены в 2'-положение, используя способы, раскрываемые в заявке на патент США Сер. N 08/264029, поданной 22 июня 1994. Другие возможности для стабилизации межнуклеотидной связи заключаются в замещении одного или двух атомов кислорода в фосфодиэфирном мостике при образовании фосфотиоатов (Trends Biochem. Sci. 14, 97 (1989)) или фофсфородитиоатов (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 591 (1993) и Nucleic Acids Res. 12, 9095 (1984)) и в использовании алкилфосфонатов вместо фосфодиэфиров (Ann. Rep. N.Y. Acad. Sci. 507, 220 (1988)).

Стабилизация может быть достигнута, когда гидроксильные группы в 2'-положении рибозных звеньев, независимо друг от друга, модифицированы. Такую модификацию можно обеспечить замещением этой гидроксильной группы OR группой, атомом галоида, особенно атомом фтора, атомом водорода или аминовым радикалом, особенно аминогруппой. Радикал R алкоксигруппы обозначает в этом случае неразветвленный-цепной или разветвленный-цепной алкильный радикал с 1-20^oC атомами, такой как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, трет-бутил, пентил или гексил или циклический незамещенный или замещенный алкильный радикал с 4-20^oC атомами, такой как циклопентил или циклогексил, которые произвольно содержат 1-2 гидроксигруппы, и произвольно прерываются 1-5 атомами кислорода. Стабилизация также повышается, так как присутствующие гидроксильные группы в 3'- и 5'-положениях произвольно этерифицированы.

Другая (возможность стабилизации) стабилизация полинуклеотида достигается тем, что фосфодиэфиры, подлежащие использованию в качестве межнуклеотидной связи, замещают частично или полностью, и независимо друг от друга, фосфоротиоатами, фосфородитиоатами или алкилфосфонатами, особенно предпочтительно низшими алкилфосфонатами, такими как, например, метилфосфонат. Эти межнуклеотидные связи могут быть также связаны с концевыми радикалами в 3'- и 5'-положениях или же также могут соединять 3'-3'- или 5'-5'-положения. Фосфодиэфирная связь делает возможным дополнительное связывание гидроксиалкильными радикалами, которые присутствуют при азотных или углеродных атомах нуклеоснований, так, например, два тимидина могут быть связаны гидроксиалкильными цепями, присутствующими в 3 положении, или два пуриновых основания радикалами, присутствующими в 8-положениях. Связывание может также происходить с гидроксильными группами в 2'-, или 3'-, или 5'-положении.

Модифицированные межнуклеотидные связи могут необязательно иметь место предпочтительно на концах полинуклеотида, и они особенно предпочтительно связывают с тимидином.

Согласно данному изобретению используемые олигонуклеотидные радикалы N не ограничиваются специфическими олигонуклеотидными последовательностями. Но предпочтительными являются те олигонуклеотиды, которые специфически связываются с высоким связывающим сродством со структурами-мишенями, за исключением нуклеиновой кислоты.

Способ идентификации подходящих олигонуклеотидов, которые требуются в качестве исходных веществ для конъюгатов предлагаемого изобретения, описан в патенте США 5270163. Этот способ, названный SELEX, может быть использован для того, чтобы получить лиганд нуклеиновой кислоты для любой требуемой молекулы-мишени.

SELEX способ включает отбор из смеси кандидатов-олигонуклеотидов и ступенчатые итерации связывания, разделения и амплификации, используя одну и ту же общую схему отбора для того, чтобы достичь фактически требуемого критерия связывающего сродства и селективности. Исходя из смеси нуклеиновых кислот, предпочтительно включающей сегмент статистической последовательности, SELEX способ включает стадии контактирования смеси с мишенью в условиях, благоприятных для связывания, разделения несвязанных нуклеиновых кислот от тех нуклеиновых кислот, которые специфически связались с молекулами-мишенями, диссоциации комплексов нуклеиновая кислота-мишень, амплификации нуклеиновых кислот, диссоциированных из комплексов нуклеиновая кислота-мишень, с получением лигандобогащенной смеси нуклеиновых кислот, затем повторная итерация стадий связывания, разделения, диссоциации и амплификации с таким количеством циклов, сколько требуется для того, чтобы получить высоко специфические лиганды с высоким сродством нуклеиновой кислоты к молекуле-мишени.

Основной SELEX способ был модифицирован, чтобы достичь ряда конкретных целей. Например, заявка на патент США сер. N 07/960093, поданная 14 октября 1992, раскрывает использование SELEX в конъюгации при электрофорезе в геле для отбора молекул нуклеиновой кислоты со специфическими структурными характеристиками, такую как изогнутая ДНК. Заявка на патент США Сер. N 08/123935, поданная 17 сентября 1993, раскрывает способ на основе SELEX для селекции лиганлов нуклеиновой кислоты, содержащих фотореакционно-способные группы, способные к связыванию и/или фотосшиванию с молекулой-мишенью и/или способных фотоинактивироваться молекулой-мишенью. Заявка на патент США Сер. N 08/134028, поданная 7 октября 1993, раскрывает способ идентификации высокоспецифических лигандов нуклеиновой кислоты, способных различать близко-родственные молекулы, получивший название Couter-SELEX. Заявка на патент США Сер. N 08/143564, поданная 25 октября 1993, раскрывает способ на основе SELEX, который обеспечивает достаточно высокое разделение между олигонуклеотидами, имеющими высокое и низкое сродство к молекулам-мишеням. Заявка на патент США Сер. N 07/964624, поданная 21 октября 1992, раскрывает способы получения улучшенных лигандов нуклеиновой кислоты после проведения SELEX. Заявка на патент США Сер. N 08/400440, поданная 8 марта 1995, раскрывает способы ковалентного связывания лиганда с его мишенью.

SELEX способ охватывает идентификацию лигандов нуклеиновой кислоты с высоким сродством, содержащих модифицированные нуклеотиды, придающие улучшенные характеристики лиганду, такие как повышенная in vivo стабильность или улучшенные характеристики доставки. К примерам таких модификаций относятся химические замещения на рибозном заместителе, и/или фосфатном, и/или основном заместителях. SELEX- идентифицированные лиганды нуклеиновой кислоты, содержащие модифицированные нуклеотиды, раскрываются в заявке на патент США Сер. N 08/117991, поданной 8 сентября 1993, которая описывает олигонуклеотиды, содержащие производные нуклеотида, химически модифицированные в 5- и 2'-положениях пиримидинов. В заявке на патент США Сер. N 08/134028, указано выше, раскрываются высокоспецифичные лиганды нуклеиновой кислоты, содержащие один или более нуклеотидов, модифицированных 2'-амино (2-NH₂), 2-фторо (2'-F), и/или 2'-O-метилом (2'-OMe). В заявке на патент США Сер. N 08/264029, поданной 22 июня 1994, раскрываются олигонуклеотиды, содержащие различные 2-модифицированные пиримидины.

SELEX способ включает в себя объединение отобранных олигонуклеотидов с другими отобранными олигонуклеотидами и неолигонуклеотидными функциональными единицами, описанными в заявках на патент США Сер. N 08/284063, поданной 2 августа 1994, и Сер. N 08/234997, поданной 28 апреля 1994 соответственно. Эти заявки допускают комбинацию широкого ряда форм и других свойств, и эффективных свойств амплификации и репликации, олигонуклеотидов с желательными свойствами других молекул.

В своей наиболее главной форме SELEX способ может быть охарактеризован следующими стадиями: 1) Получают смесь нуклеиновых кислот различной последовательности. Смесь обычно включает области фиксированных последовательностей (т.е. каждый из представителей смеси содержит одни и те же последовательности в одном и том же месте расположения) и области статистических последовательностей. Области фиксированных последовательностей выбирают либо: (a) чтобы помогать в стадиях амплификации, описанных ниже, (b) чтобы имитировать известную последовательность, которая связывается с мишенью, либо увеличить концентрацию данного структурного расположения (порядка чередования) нуклеиновых кислот в смеси. Статистические последовательности могут быть статистическими полностью (то есть вероятность нахождения основания в любой позиции составляет одну четвертую) или только частично статистическими (например, вероятность нахождения основания в любой позиции может быть выбрана на любом уровне между 0 и 100 процентами).

2) Смесь контактирует с выбранной мишенью при условиях, благоприятных для связывания между мишенью и представителями смеси. В этих обстоятельствах взаимодействие между мишенью и нуклеиновыми кислотами смеси-кандидата можно рассматривать как образование пар нуклеиновая кислота-мишень между мишенью и теми нуклеиновыми кислотами, которые имеют самое сильное сродство к мишени.

3) Нуклеиновые кислоты с самым сильным сродством к мишени отделяют от нуклеиновых кислот с меньшим сродством к мишени. Из-за того что в смеси-кандидате существует лишь чрезвычайно малое число последовательностей (и возможно только одна молекула нуклеиновой кислоты), соответствующих нуклеиновым кислотам с самым высоким сродством, обычно желательно установить критерии разделения такие, что существенное количество нуклеиновых кислот в смеси-кандидате (приблизительно 5-50%) сохраняется во время разделения.

4) Эти нуклеиновые кислоты, отобранные во время разделения, как имеющие относительно более высокое сродство к мишени, затем амплифицируют, создавая новую смесь, которая обогащена нуклеиновыми кислотами, имеющими относительно более высокое сродство к мишени.

5) Повторяя стадии разделения и амплификации, указанные выше, заново образованная смесь содержит меньше и меньше последовательностей, и средняя степень сродства нуклеиновых кислот к мишени обычно увеличивается. Наконец, SELEX способом получают смесь, содержащую одну или небольшое число нуклеиновых кислот, представляющих те нуклеиновые кислоты из исходной смеси, которые имеют наивысшее сродство к молекуле-мишени.

SELEX патенты и заявки на патент описывают и тщательно разрабатывают этот способ в деталях. Здесь же изложены мишени, которые могут быть использованы; способы разделения нуклеиновых кислот в смеси-кандидате и способы увеличения разделенных нуклеиновых кислот, чтобы генерировать обогащенную смесь-кандидат. SELEX патенты и заявки на патент, кроме того, описывают лиганды, получаемые с рядом видов мишеней, включая как белковые мишени, где белок является белком, связывающим нуклеиновую кислоту, так и белковые мишени, где белок не является белком, связывающим нуклеиновую кислоту. Поэтому SELEX способ может быть использован для того, чтобы обеспечить высокоаффинные лиганды молекулы-мишени.

Молекулы-мишени являются предпочтительно белками, но могут также включать, среди других, карбогидраты, пептидогликаны и ряд небольших молекул. Как и в случае белковых антител, антитела нуклеиновых кислот (олигонуклеотидные лиганды) могут быть применены для торпедирования биологических структур, таких как поверхности клеток или вирусы, посредством специфического взаимодействия с молекулой, которая является неотъемлемой частью той биологической структуры. Олигонуклеотидные лиганды выгодны тем, что они не ограничены собственной толерантностью, как обычные антитела. Кроме того, антитела нуклеиновых кислот не требуют животных и клеточных культур для синтеза или получения, поскольку SELEX есть полностью in vitro способ. Известно, нуклеиновые кислоты могут связываться с комплементарными последовательностями нуклеиновых кислот. Это свойство нуклеиновых кислот широко используют для определения, подсчета и выделения молекул нуклеиновых кислот. Таким образом, способы данного изобретения, как полагают, не включают эти хорошо известные способности к связыванию между нуклеиновыми кислотами. В частности, способы данного изобретения, относящиеся к использованию антител нуклеиновых кислот, не включают известные связывающие сродства между молекулами нуклеиновых кислот. Известно, что ряд белков функционирует путем связывания с нуклеиновыми последовательностями, такие как регуляторные белки, которые связываются с нуклеиновыми последовательностями оператора. Такая способность некоторых нуклеиновых кислот, связывающих белки, связываться с их природными сайтами, например, применена для определения, подсчета, изоляции и очистки таких белков. Способы данного изобретения, относящиеся к использованию олигонуклеотидных лигандов, как полагают, не включают известное связывающее сродство между белками, связывающими нуклеиновую кислоту, и последовательностями нуклеиновых кислот, с которыми они, как известно, связываются. Однако, используя SELEX, могут быть разработаны новые, не встречающиеся в природе последовательности, которые связываются с теми же белками, связывающими нуклеиновые кислоты. В частности, олигонуклеотидные лиганды данного изобретения связываются с такими молекулами-мишенями, которые включают (содержат) трехмерную химическую структуру, другую чем полинуклеотид, которая связывается с указанным олигонуклеотидным лигандом через механизм, который преимущественно зависит от спаривания оснований Уотсон-Крика или образования тройной спирали, где указанный олигонуклеотидный лиганд не является нуклеиновой кислотой, имеющей известную физиологическую функцию будучи связанной молекулой-мишенью.

Следует иметь в виду, что SELEX позволяет очень быстро определять последовательности нуклеиновых кислот, которые могут связываться с белком и, таким образом, может быть легко использован для определения структуры неизвестного оператора и последовательностей связующего сайта, и эти последовательности затем могут быть применены для описываемых здесь применений. SELEX, таким образом, представляет собой общий способ использования молекул нуклеиновой кислоты для определения, подсчета, изоляции и очистки белков, которые, как известно, не связывают нуклеиновые кислоты. Кроме того, некоторые антитела нуклеиновых кислот, выделяемые с помощью SELEX, могут также применяться для воздействия на функцию, например ингибировать, усиливать или активировать функцию конкретных молекул-мишеней или структур. В частности, антитела нуклеиновых кислот могут применяться для ингибирования, усиления или активации функции белков.

Олигонуклеотиды, используемые в конъюгатах согласно изобретению, получают в предпочтительном варианте воплощения согласно описанному ниже способу.

Так, подходящие олигонуклеотиды могут быть получены тем, что смесь олигонуклеотидов, содержащую статистические последовательности, вносят вместе со структурой-мишенью, и некоторые о