Вакцинная композиция против репродуктивного и респираторного синдрома свиней (prrs) и способ ее получения, способ иммунизации свиней

Вакцинная композиция против репродуктивного и респираторного синдрома свиней (prrs) и способ ее получения, способ иммунизации свиней

Реферат

 

Представлена авирулентная вакцина против репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS), которая эффективно иммунизирует свиней от этого заболевания, вместе со способом размножения вирусного возбудителя in vitro и способом аттенуирования вируса для вакцинного препарата. Использование вакцины позволяет избежать больших потерь в племенных стадах свиней и влиять на их репродуктивность. 3 с. и 11 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл.

Предпосылки создания изобретения 1. Область изобретения Данное изобретение имеет отношение к области иммунологии и вирусологии и, более конкретно к вакцине, получаемой из патогенного вирусного штамма. Более конкретно, патогенная форма вируса модифицируется или ослабляется до авирулентной формы методами получения вакцин для использования против опустошительного нового заболевания свиней.

2. Описание прототипа Новое заболевание свиней, называемое по-разному, "таинственным заболеванием свиней", "синдромом респираторного заболевания и бесплодия свиней", "заболеванием "синие уши", или "репродуктивным и респираторным синдромом свиней" (PRRS), является причиной больших потерь в племенных стадах свиней в США и Канаде. Сходное заболевание появилось также во многих странах Европы. Заболевание проявляется в двух формах, причем одна является причиной отсутствия репродуктивной способности, а другая дает респираторное заболевание у молодых свиней. Форма заболевания с поражением репродуктивной системы описана Keffaber, K. K., "Reproductive Failure of Unknown Etiology", American Association of Swine Practitioners Newsletter, 1:109 (1989).

Наиболее выраженными клиническими симптомами формы заболевания с поражением репродуктивной системы являются спонтанные аборты на поздних сроках, преждевременный опорос (частота которого может быть такой высокой, как 20-30% от всех рождений) и рождение мумифицированных плодов, мертвых или болезненных поросят. Такие клинические симптомы обычно наблюдаются в группах со сроком беременности 4-16 недель или даже больше. Мертворожденные плоды в пораженном помете часто находятся на ранних стадиях мумификации, о чем свидетельствует изменение цвета кожи на желтовато-коричневый и постмортальный аутолиз. Также иногда наблюдаются уродства с куполообразной формой головы у плодов. Инфекция у свиноматок может пройти незамеченной или может проявляться в виде ухудшения общего состояния, продолжающегося несколько дней. Например, свиноматки могут отказываться от корма, и у них температура тела может быть выше или ниже нормальной. На стадии опороса у свиноматок может появляться депрессия, летаргия, гипертермия и случающаяся время от времени рвота. В некоторых пораженных группах до 75% всех поросят может быть потеряно. Экономические последствия этого заболевания, соответственно, ужасающи.

При респираторной форме заболевания проявляются клинические симптомы, которые наиболее выражены у поросят 3-8-недельного возраста, но как сообщается, встречаются у свиней всех возрастов в инфицированных группах. Заболевшие поросята растут медленно, имеют огрубевший волосяной покров, страдают дыхательной недостаточностью ("одышка", тяжелое дыхание) и наблюдается их повышенная гибель (до примерно 80% гибели до отъема).

Данные, полученные при предварительных исследованиях больших и микроскопических повреждений у поросят, пораженных респираторной формой заболевания, наводят на мысль, что микроскопические повреждения в легких являются важным клиническим признаком этого заболевания. Несмотря на выраженные симптомы респираторного заболевания, легкие, в которых по-видимому нет осложнения в виде вторичной бактериальной инфекции, или совершенно нормальны, или имеют легкое, диффузное изменение окраски поверхности легких на бронзово-серую. Тем не менее, микроскопическое исследование ткани легких больных PRRS поросят выявляет характерную картину интерстициальной пневмонии, по Collins J. Е. et al., "Respiratory Disease in Swine Herd Experiencing a Reproductive Failure Syndrom", Proceedings Minnesota Swine Conference for Veterinarians, p. 254, St. Paul, MN (September 10-18, 1990).

Соответственно, существует реальная потребность в этой области ветеринарии в эффективной вакцине, которая сможет исключить или по крайней мере облегчить последствия PRRS.

Краткое изложение изобретения Данное изобретение разрешает проблемы, изложенные выше, путем получения вакцины, которая эффективно снижает или предупреждает заболеваемость, вызываемую вирусом PRRS у свиней.

Вообще говоря, изобретение включает биологически чистую или чистую по вирусу культуру вируса PRRS вместе со всеми его мутантами и способы получения и использования этих вирионов. Вирус дикого типа способен вызывать PRRS у свиней, но модифицированные формы вируса или непатогенные его мутанты дают эффективную вакцину от этого заболевания. Вакцина предпочтительно включает живой модифицированный или аттенуированный вирус и фармацевтически эффективное вещество-носитель. Модифицированный вирус предпочтительно размножают и сохраняют в линии клеток почки человекообразной обезьяны, и эта линия клеток является, предпочтительно, МА-104, которая является клетками почек африканской зеленой мартышки, пропассированными двадцать и более раз.

Патогенный вирусный возбудитель был выделен из гомогената ткани инфицированной свиньи, и его патогенность подтверждена путем вызова заболевания PRRS у многих поросят и беременных свиноматок. Выделенный вирусный возбудитель был помещен на хранение 18 июля 1991 г. в Американскую коллекцию типовых культур в Роквилле, штат Мэриленд под номером поступления ATCC-VR2332. Этот вирусный возбудитель является негемагглютинирующим оболочечным РНК-вирусом.

Вирус дикого типа предпочтительно модифицируют до по существу авирулентной формы путем посева вируса на полный или частичный слой клеток обезьяны в присутствии сыворотки в подходящей для роста среде, инкубации засеянного слоя клеток при температуре от примерно 35^oC до примерно 37^oC до тех пор, пока не будет наблюдаться цитопатический эффект, и повторного пассирования вируса в линии клеток обезьян на поддерживающей среде в присутствии сыворотки и в соответствующих условиях для пассирования.

Вакцина включает вещество-носитель, такой как сахарозный желатиновый стабилизатор, который смешивают с живым модифицированным вирусом, полученным, как описано выше. Вакцина, предпочтительно, используется для предупреждения PRRS путем иммунизации свиней с помощью местного пути (на поверхность слизистой) и парентерального пути вакцинации. Иммунизированные свиньи обычно остаются без признаков заболевания после заражения вирусом дикого типа.

Вакцина может быть получена в количествах промышленного масштаба с помощью процесса, включающего стадии получения размножающихся культур линии обезьяньих клеток, получения продукционных культур путем инфицирования размножающихся культур аттенуированным вирусом, сбора продукционных культур, стабилизации и лиофилизации вируса.

На чертеже представлена схематическая диаграмма процесса для применения при производстве в промышленно значимых количествах вакцины PRRS.

Детальное описание предпочтительного осуществления Следующие неограничивающие примеры представляют методы и материалы для использования при практическом осуществлении данного изобретения.

Пример 1 Выделение, идентификация и аттенуация вируса PRRS и получение модифицированной живой вакцины A. Выделение и идентификация Гомогенат ткани был получен от поросят из групп, инфицированных PRRS. Этот гомогенат постоянно воспроизводил респираторную форму PRRS и форму с поражением репродуктивной системы при интраназальном заражении у гнотобиотных поросят и беременных свиноматок. Гнотобиотные поросята, зараженные таким образом или нефильтрованным или профильтрованным (0,45, 0,22 или 0,1 мкм) инфицирующим материалом, теряли аппетит, и у них развивались микроскопические повреждения в легких, наблюдаемые в группах животных, пораженных PRRS. Тот же самый инфицирующий материал также вызывал репродуктивную несостоятельность, идентичную наблюдаемой в группах животных, инфицированных PRRS.

Гомогенаты тканей, из которых был выделен вирус, включали ткань легкого (группа 1) и объединенные ткани мозга, селезенки, печени и почек (группа 2), полученные от инфицированных поросят из инфицированной PRRS группы животных. Отдельные группы гомогенатов центрифугировали отдельно при 4000 x g в течение 25 минут. Полученный супернатант собирали и фильтровали, используя стерильный шприцевой 0,45 микронный фильтр. Профильтрованные супернатанты затем объединяли. Один мл объединенного супернатанта использовали в качестве заражающего материала для инфицирования каждой из соответствующих клеточных линий, которые описаны ниже.

Профильтрованный супернатант добавляли в среду для роста, содержащую клеточную линию, которая описана ниже, модифицированную среду Игла ("МСИ") от JRH Biosciences, и гентамицин в концентрации примерно 100 мкг на мл.

Было проведено два испытания для каждой линии клеток с использованием 75 мл пластиковых сосудов. В испытании номер 1 профильтрованный супернатант засевали в два сосуда, в каждом из которых имелся полный слой клеток каждой из клеточных линий, перечисленных ниже. Дополнительно в первый сосуд добавляли примерно 2,3 мг трипсина. Все остальные условия были такими же, что и для каждого сосуда с культурой.

В испытании номер 2 материал гомогената объединенных тканей засевали в сосуды, содержащие те же самые клеточные линии, которые использованы в испытании номер 1; однако слои клеток были слитными только на 20-40% во время посева. Среда дополнительно содержала примерно 10% фетальной телячьей сыворотки, которая не присутствовала в среде из испытания 1. Инфицирующий материал опять вводили в количестве примерно 1 мл, и культуры инкубировали при примерно 34^oC в течение примерно семи дней.

Все сосуды инкубировали в течение примерно семи дней при примерно 34^oC. Результаты регистрировали по истечении примерно семи дней. После замораживания и оттаивания отбирали образец для второго пассажа на той же самой клеточной линии. Остальной материал замораживали в жидком азоте и хранили при примерно -60^oC. Результаты обоих испытаний, номер 1 и номер 2, суммированы в таблице 1.

Отсутствие цитопатического эффекта (ЦПЭ) наблюдалось в испытании номер 1 у любых оцениваемых линий клеток. В испытании номер 2, однако, небольшие группы клеток МА-104 начинали набухать и образовывать "слабые места" в монослое по краю сосуда. Жидкость из сосуда удаляли и помещали в новый сосуд с клетками МА-104 (опять с 20-40% слитности клеточного слоя) и затем соответственно пассировали третий раз. И этот очевидный ЦПЭ становился сильнее при каждом пассаже. При 3 пассаже вирулентность сохранялась. Материал после этого пассажа поместили на хранение в Американскую коллекцию типовых культур в Роквилле, Мэриленд под N поступления ATCC-VR2332.

Вирус ATCC-VR2332 постоянно вызывает клиническую симптоматику PRRS, повреждения в легких у гнотобиотных свиней и давал положительные результаты по ИМФ. Таким образом, вирус ATCC-VR2332 может представлять неидентифицированный род Togaviridae. Вирус ATCC-VR2332 кроме того не является известным патогеном свиней, так как специфические антисыворотки к нескольким обычным вирусным патогенам свиней были неспособны или нейтрализовать вирус, или выявить антигены в инфицированных клетках.

Вирус ATCC-VR2332 является негемагглютинирующим оболочечным РНК-вирусом. Вирус ATCC-VR2332 растет в непрерывно поддерживаемой клеточной линии, конкретно, MA-104 и других клеточных линиях от человекообразных обезьян. Вирус ATCC-VR2332 растет до высоких титров (10⁷ TCID₅₀/1 мл) на коммерческой клеточной линии MA-104.

Вирус ATCC-VR2332 имеет липидную оболочку, на что указывает потеря инфекционности после обработки хлороформом. Липидная оболочка может быть также визуализована в виде полупрозрачного кольца, окружающего пустые частицы при электронной микроскопии. Морфология вируса ATCC-VR2332 не является характерной при прямой электронной микроскопии (ПЭМ) и должно быть чрезвычайно трудно идентифицировать его в препаратах, содержащих остатки клеток. Морфология частиц ATCC-VR2332, очищенных в градиенте плотности и средний диаметр частиц, равный 62 нм, очень сходны с показателями вирионов артериита лошадей и лактодегидрогеназными вирусами.

Вирус лошадиного артериита, как сообщалось, имеет размер частиц в интервале 50-73 нм, который сходен с размером в 48-84 нм вируса ATCC-VR2332. У некоторых частиц ATCC-VR2332 наблюдалась 30-35 нм сердцевина, что похоже на нуклеокапсидные ядра, описанные для вируса лошадиного артериита. Таким образом, морфологически ATCC-VR2332 имеет наиболее близкое сходство с группой вирусов артериита.

Присутствие в ATCC-VR2332 РНК-генома подтверждено способностью этого вируса продолжать репликацию в присутствии 5-бром-2-дезоксиуридина и митомицина C, которые, как известно, подавляют репликацию ДНК и одного семейства РНК-вирусов (Retroviridae), но не подавляет другие РНК-вирусы. Тем не менее предварительная классификация вируса ATCC-VR2332 как РНК-вируса находится в согласии с тем наблюдением, что этот вирус реплицируется в цитоплазме клетки, на что указывает присутствие вирусных антигенов, обнаруживаемое с помощью ИМФ. К тому же, актиномицин D, который мешает ДНК-зависимой транзиции РНК, не оказывает воздействия на репликацию вируса ATCC-VR2332. Эти результаты показывают, что вирус ATCC-VR2332 не нуждается в ядерных функциях для репликации.

В заключение, размер, морфология, наличие РНК генома и другие биологические свойства дают основание предварительно отнести вирус ATCC-VR2332 к семейству Togaviridae. ATCC-VR2332, однако, не может быть отнесен к какому-либо известному роду этого семейства. Хотя морфологически вирус ATCC-VR2332 очень похож на артеривирусы, вирус не должен быть отнесен к определенному роду, до тех пор пока не будет получена дополнительная информация о строении РНК и белка.

Б. Аттенуация Собранный VR2332 после 3 пассажа подвергали двум дополнительным пассажам, описанным подробно ниже, и собранное после 5 пассажа посылали в другую лабораторию для очистки. В частности, вирионы ATCC-VR2332 были идентифицированы после очистки в градиентах CsCI (центрифугируемых при 200000 x g) после экстракции 1,1,2-трихлортрифторэтаном. Очищенные вирионы метили иммуно-золотым набором с использованием конъюгата анти-ATCC-VR2332 гипериммунной сыворотки и золота. Уровень плотности, на котором удерживался слой вирионов ATCC-VR2332 в градиенте CsCI составлял 1,18-1,19 г/л. Сахарозный градиент постоянно приводил к потере титра вируса и от него отказались как от неподходящего градиента для очистки.

Очищенный материал, полученный после 5 пассажа, затем подвергали дополнительным 65 пассажам, как описано подробно ниже. Материал, собранный после 70-го пассажа, аттенуировали и назвали основной посевной культурой. Эту основную культуру для посева поместили на хранение в Американскую коллекцию типовых культур под номером поступления ATCC-VR2495. И наконец, проводили дополнительно еще 5 пассажей для получения ATCC-VR2332, пассажа 75 (могли бы проводиться и дополнительные пассажи, если желательно).

Пассажи 4-75 вируса ATCC-VR2332 проводили в готовой культуре ткани-хозяина коммерчески доступной клеточной линии MA-104 зеленых мартышек. Эту стандартную культуру ткани получали следующим образом. Готовили среду для роста, которая включала минимальную поддерживающую среду Игла ("MEM") от JRH Biosciences (каталог # 200-2041) и 10% фетальной телячьей сыворотки от JRH Biosciences. Примерно 1 мл посевного материала ATCC-VR2332 добавляли в бутыль объемом 75 см³, содержащую 50 мл этой ростовой среды. Бутыль выдерживали в течение примерно 7 дней и инкубировали при температуре в интервале от примерно 35^oC до примерно 37^oC.

Бутыли с готовой культурой ткани получали путем размножения полученной инкубированной культуры, которую разделяли следующим образом. Ростовую среду, которая имела объем, равный примерно 50 мл, декантировали. Клеточный слой удаляли путем добавления 10 мл трипсина-версена IX и инкубации при 37^oC в течение 5-10 минут. Затем клетки удаляли из бутыли и центрифугировали при 270 x g в течение 5-10 минут. Супернатант декантировали, а осадок повторно суспендировали в 5-10 мл среды MEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, как и перед этим. Клетки помещали в 200 мл ростовой среды, которую потом распределяли на четыре 75 мл бутыли по 50 мл на бутыль, тем самым достигая разделения 1:4.

Полученные культуры сохраняли при температуре в интервале 35-37^oC до использования. После 3-4 дней инкубации в бутылях развивался полный покрывающий слой клеток, и они были готовы для использования.

Вирус PRRS ATCC-VR2332 размножался в непрерывных культурах клеточной линии MA-104, которые получали, как описано выше. Показатель pH культуральной среды доводили до 7,2, и культуры инкубировали при температуре в интервале от примерно 35-37^oC. Вирусом заражали клетки MA-104 путем добавления примерно 1 мл замороженного посевного материала из предшествующего пассажа в жидкую ростовую среду. Вирусу давали абсорбироваться на клетках в течение 24 часов.

Ростовую среду декантировали через 24 часа после заражения вирусом ATCC-VR2332 и колбу снова заполняли 50 мл поддерживающей среды с заменой 4% содержания фетальной телячьей сыворотки на 10% фетальной телячьей сыворотки в ростовой среде. Поддерживающая среда имела pH, равный 7,6. После этой замены ростовой среды культуру инкубировали при температуре в интервале 35-37^oC. Вирусу давали размножиться до тех пор, пока 50-60% слоя клеток MA-104 в культуре не будут разрушены вирусом. Образец затем замораживали в жидком азоте и подготавливали для пассажа в другой сосуд с клетками MA-104.

Продемонстрирована также перекрестная реактивность пассажей 3-70. Вирус PRRS VR2332 из 3 пассажа использовали для иммунизации свиней, кроликов и коз для получения антисыворотки PRRS. Сыворотку использовали для нейтрализации вируса PRRS на пассажах разного уровня с 3 по 70 пассаж. Кроме того, было получено два моноклональных антитела (SDOW-12 и SDOW-17) с использованием лимфоцитов селезенки от мышей, иммунизированных вирусом PRRS VR2332. Моноклональные антитела, как было показано, реагируют со всеми штаммами PRRS, выделенными в США и Европе к декабрю 1992 г. Моноклональные антитела использовали для идентификации или обнаружения вируса PRRS в пассажах 3-70.

C. Получение модифицированной живой вакцины Было получено два вакцинных препарата, включающих, соответственно, основную посевную культуру (полученную из пассажа 70 ATCC-VR2332) и полученное после пассажа 75 ATCC VR-2332. Вирус основной посевной культуры и вирус пассажа 75 были по существу авирулентными, т.е. вакцины при введении свиньям или другим млекопитающим, восприимчивый к контакту с PRRS, не вызывали клинических симптомов заболевания PRRS, но были способны индуцировать иммунный ответ, который создавал иммунитет у животных к патогенным формам вируса PRRS. Вакцину получали общепринятыми способами. Перед лиофилизацией добавляли стандартные стабилизаторы и носители.

Пример 2 Испытание вирусного штамма in vivo Вирулентный материал, полученный после третьего пассажа вируса ATCC-VR2332 из примера 1 использовали для заражения двух трехдневных гнотобиотных поросят. Обоих поросят заражали интраназально, одного - 1 мл, а другого - 2 мл. Поросята находились под клиническим наблюдением в течение семи дней, затем их забивали и делали вскрытие.

Образцы тканей от каждого поросенка собирали для гистопатологического исследования и для выделения вирусного возбудителя. Данные гистопатологии подтвердили, что поражения в легких у инфицированных поросят были идентичными поражениям легких у поросят, которые, как известно, имеются при PRRS. Образцы ткани обрабатывали, как в примере 1, и затем культивировали на 20-40% и 100% монослое клеточной линии MA-104 с добавлением фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Вирусный возбудитель снова выделяли.

Вирусный материал, собранный после третьего пассажа, использовали также для заражения свиноматок, чтобы подтвердить, что действие заболевания на репродуктивную сферу может быть воспроизведено и подтверждено. Многородящих свиноматок заражали интраназально примерно на 93 день беременности. Свиноматки давали пометы с 50% мертворожденных поросят (8/13 и 6/14 мертворожденных/живых) на 112 и 114 день беременности, соответственно. Семь из мертворожденных поросят были частично мумифицированы, и поросята, рожденные живыми, были слабыми и не могли энергично сосать. Вирусный возбудитель был выделен из тканей мертворожденных поросят тем же способом, что и в примере 1. Вирусный возбудитель был выделен в трех группах с подтвержденным заболеванием PRRS. В тех же самых группах были определены титры антител к возбудителю ATCC-VR2332.

Пример 3 Цель этого исследования состояла в определении минимальной защищающей дозы вируса PRRS (VR2332, пассаж 75), выбранной для использования в качестве модифицированной живой вакцины. Это было выполнено путем анализа степени, с которой две выбранные дозы вакцины (4,0 0,5 log/дозу и 2,0 0,5 log/дозу) были способны регулировать начало ненормальных состояний после заражения вирулентным штаммом вируса PRRS (VR2332, пассаж 3, 3,5 0,5 log/дозу) и сравнения вакцинированных зараженных поросят с невакцинированными зараженными и незараженными (нормальными) поросятами. Модифицированная живая вакцина была получена с использованием 75 пассажа вируса, как объяснялось ранее.

Для использования в эксперименте было отобрано шестьдесят два серонегативных поросенка с фермы-поставщика и они были распределены на четыре группы, обозначенные 1, 2, 3 и 4. Двадцать один поросенок в группе 1 были провакцинированы 2 мл вакцины от PRRS L-4 внутримышечно (4,0 log/дозу). Двадцать один поросенок в группе 2 были провакцинированы 20 мл вакцины против PRRS L-2 (2,0 log/дозу). Десять поросят в группе 3 и десять поросят в группе 4 не вакцинировались. Поросят из контрольных групп 3 и 4 помещали в отдельные строения, чтобы застраховать от возможности заражения вирусом. Группы 1, 2 и 3 заражали 2,0 мл вирусного материала PRRS VR2332 после 3 пассажа интраназально на 28 день испытания. Поросят из группы 4 не заражали. За поросятами из четырех изучаемых групп наблюдали и регулярно производили контроль в течение 31-дневного срока до заражения и 21-дневного срока после заражения. Показателями, использованными для оценки результатов исследования, были клинические симптомы, вес тела, температура тела (ректальная), число лейкоцитов, выделение вируса и серология. Эффективность вакцины демонстрировалась по снижению числа дней, когда у поросят наблюдалась виремия, по предотвращению лейкопении и лихорадки и по сохранению нормальной скорости роста после заражения.

Температуру тела (ректальную) измеряли до и после вакцинации. Средняя температура для группы 1 повышалась на 2-ой день после вакцинации (ДПВ) и на 3-ий ДПВ, тогда как для группы 2 она повышалась на 3-ий ДПВ. Продолжительность повышения температуры для каждой из двух групп была короткой, 2 дня для группы 1 и 1 день для группы 2.

Ни у одной из вакцинированных групп не наблюдалось падения числа лейкоцитов после вакцинации. Предшествующие исследования показали, что контакт с вирулентным штаммом вируса PRRS вызвал бы лейкопению в пределах 72 часов после заражения.

Результаты измерения увеличения веса в течение периода после вакцинации показали, что лечение не оказывало неблагоприятного воздействия на жизнедеятельность вакцинированных поросят. В течение 29 дней после вакцинации увеличение веса в каждой из вакцинированных групп не было значительно различным по уровню достоверности, равному 0,05, от увеличения веса в группах 3 и 4.

Клинические наблюдения показали небольшие отклонения от нормы по большинству категорий, за исключением состояния ноздрей и испражнений. Сравнение оценок испражнений в вакцинированных группах с оценками в объединенных контрольных группах (группах 3 и 4) с использованием двустороннего t-критерия не выявило значительного различия при уровне достоверности 0,05. Значение p при сравнении группы 1 и объединенных контрольных групп было равно 0,47, тогда как при сравнении группы 2 и объединенной контрольной группы было равно 0,87. Сравнение показателей состояния ноздрей у группы 1 и объединенной контрольной группы имело значение p, равное 0,41. Только два из 21 поросенка в группе 2, как наблюдалось, имели клинические показатели для ноздрей. Анализ по t-критерию для полной индивидуальной клинической оценки групп 1 и 2 с результатами для объединенной контрольной группы показал значения p, равные 0,53 и 0,74, соответственно. Это сравнение показало отсутствие различия между результатами для животных, получающих вакцину при любом уровне дозы и для невакцинированных контрольных.

Результаты выделения вируса из крови показали, что 100% животных (21 из 21) из группы 1 стали положительными, тогда как в группе 2 было 90% (19 из 21) положительных результатов для обследованных животных. В течение периода после вакцинации результаты для контрольных групп 3 и 4 оставались отрицательными. Результаты ИПТ (иммунопероксидазного теста) исследования давало сходную картину в том, что 100% группы 1 становилось серологически положительными, как и 90% группы 2. Обе группы оставались отрицательными на сывороточные нейтрализующие антитела в течение 21 ДПВ. Нейтрализующие антитела были обнаружены в обоих группах на 29 ДПВ (0 ДПЗ - день после заражения, см. результаты после заражения). Контрольные группы оставались серологически отрицательными по обоим методам испытания до времени заражения.

Анализ наблюдений после вакцинации показывает, что по-видимому нет побочных инфекций в результате вакцинации любой дозой вакцины, использованной при изучении. Однако более высокая дозировка создает серологическую конверсию у всех (21 из 21) поросят, тогда как более низшая доза создает серологическую конверсию у 19 из 21 поросят или у 90%.

После заражения вирулентным вирусом PRRS клинические параметры, которые контролировали у вакцинированных и невакцинированных испытуемых групп, дали данные о защите с помощью двух испытанных доз вакцины. Результаты испытания на виремию дали ясное свидетельство благотворного действия вакцины. У невакцинированной группы (группа 3) наблюдалась виремия в 100% случаев на 3 ДПЗ, 5 ДПЗ и 7 ДПЗ, тогда как частота виремии в те же дни наблюдения в группе 1 (3,65 log/дозу) и группе 2 (1,85 log/дозу) составляла 15,5 и 10% и 30%, 20% и 15%, соответственно. А также, вирус не был выделен из образцов крови в группе 1 после 9 ДПЗ и в группе 2 после 13 ДПЗ, тогда как у 30% из группы 3 результаты были еще положительными на 19 ДПЗ.

Результаты контроля температуры тела (ректальной) также свидетельствовали об эффективности вакцин. В течение 21-дневного периода наблюдения средняя температура в группе 3 превышала 40^oC (104^oF) в течение 5 дней. Средняя температура в группах 2 и 3 не превышала 40^oC (104^oF). Кроме того, средняя температура в группе 3 превышала 40,4^oC (104,5^oF) в течение 2 дней, на 2 и 6 ДПЗ.

После заражения результаты подсчета лейкоцитов показали, что в группе 3 наблюдалась лейкопения, для которой наблюдалось 16% снижение, происходившее на 5 ДПЗ. Ни в одной из вакцинированных групп не наблюдалось снижение более 6% в течение всего периода наблюдения.

Контроль повышения веса в разных группах лечения в течение 21 дня после заражения, показал, что вакцинация дозой любого из двух уровней сохраняла нормальную скорость повышения веса. В двух вакцинированных группах, 1 и 2, наблюдался средний процент повышения веса, равный 74 и 73, соответственно. В группе 4, нормальных контрольных животных, среднее увеличение веса составило 75%. Напротив, средний процент набору веса в группе 3, невакцинированных зараженных контрольных животных, составлял 69%. Это значительно отличалось от групп 1, 2 и 4 с p=0,009 при применении двустороннего t-критерия и уровня достоверности 0,05.

Хотя результаты клинических испытаний не могут быть столь определенными в демонстрации эффективности, они все же иллюстрируют преимущества вакцин. После заражения в группах 1, 2 и 3 показано значительное увеличение числа случаев симптомов со стороны респираторной системы. Средние суточные индивидуальные оценки для животных в группах 1, 2 и 3 были равны 0,39, 0,64 и 0,53, соответственно. Это показывает преимущества более высокой дозы (3,65 log/дозу) над более низкой дозой (1,85 log/дозу) и над случаями без вакцинации. Хотя наблюдения за характером испражнений после заражения были впечатляющими, они незначительно отличались (при использовании уровня достоверности 0,05) от наблюдений после вакцинации и перед заражением. Таким образом, в этом эксперименте заражение вирулентным вирусом PRRS по-видимому не оказывало действия на низшие отделы желудочно-кишечного тракта. В целом, остальные клинические наблюдения не выявляют значительных изменений в результате заражения. Что касается показателей в отношении ноздрей и рта в группе 1, один поросенок имел 25% показателя состояния ноздрей во всей группе, а у другой поросенок имел 94% группового показателя по категории состояния рта. Подобным же образом в группе 2 один поросенок имел 22% группового показателя по состоянию ноздрей, а другой поросенок имел 43% группового показателя для рта. В общих чертах частота клинических наблюдений после заражения для этих двух показателей незначительно отличалась от наблюдений после вакцинации. Подобные заключения могут быть сделаны по этим двум клиническим параметрам и для группы 3. Группа 4 оставалась относительно нормальной по всем показателям для организма.

В конце периода наблюдения всех поросят забивали и легкие обследовали макроскопически на признаки патологического поражения. У шестидесяти процентов (6 из 10) животных из группы 3 проявлялось заметное поражение. Для сравнения, 10% из группы 1 и 19% из группы 2, по-видимому, имели заметное поражение. При сравнении с группой 4, нормальные контрольные, 80% из группы 1, 81% - из группы 2 и 30% - из группы 3, как было описано, по наблюдениям не имели различий.

Производилось выделение вируса из ткани легких. Из ткани легких поросят из группы 1 вирус не был выделен. Один образец из материала от 21 поросенка из группы 2 дал положительный результат на вирус. Вирус был выделен из трех из десяти образцов от 3 группы поросят и ни из одного от группы 4.

Заключение, сделанное по этим результатам, состоит в том, что оба уровня дозировки (3,65 log/2,0 мл дозы и 1,85 log/2,0 мл дозы) вакцины из модифицированного живого вируса PRRS, содержащей пассаж 75 VR2332, были эффективны против респираторного заболевания у 3-5 недельных поросят, которых заражали на 29 ДПВ вирулентным вирусом PRRS.

Это исследование показало, что предпочтительная минимальная защищающая доза составляет 3,65 log/2,0 мл дозы. По некоторым параметрам, использованным для оценки эффективности доз вакцины, таким как виремия, клинические признаки респираторного заболевания, патологическое поражение легких и выделение вируса из ткани легких, те животные, которые вакцинировались более высокой дозой, были лучше защищены. К тому же у 21 из 21 поросенка, вакцинированных 3,65 log/дозу наблюдалась сероконверсия к 21 ДПВ. Для сравнения, только у 19 из 21 поросенка, вакцинированных более низкой дозой, наблюдалась сероконверсия к 29 ДПВ (0 ДПЗ).

Пример 4 В этом примере исследовали продолжительность иммунитета при использовании модифицированной живой вакцины из пассажа 75 PRRS, описанной в примерах 1 и 3. Откормочный поросенок в норме достигает убойного веса в возрасте шести месяцев. В этом примере поросят вакцинировали в возрасте примерно 1 месяца (4-5 недельном возрасте) и затем заражали на 110 день после вакцинации. Продолжительность этого иммунитета должна затем охватывать большую часть ожидаемого жизненного срока нормальных откормочных поросят.

Было получено шестьдесят два серонегативных на PRRS поросенка и распределяли их на четыре экспериментальных группы, обозначенных 1, 2, 3 и 4. Двадцать одного поросенка из группы 1 вакцинировали 2,0 мл вакцины из пассажа 75 PRRS-МЖВ, содержащими 3,32 log на дозу. Десять поросят из группы 3 и группы 4 не вакцинировались и были помещены в отдельные строения, чтобы сохранить серонегативный статус. В конце исследования, описанного в примере 3, поросят группы 2 из этого примера удалили из исследования и забили, так как было сделано заключение, что минимальная защищающая доза составляла 3,68 log, а не 1,87 log на дозу. Группы 1 и 3 заражали интраназально на 110 день после вакцинации (ДПВ) с использованием 3 пассажа вируса VR-2332 (3,9 log/мл). Поросят из группы 4 не заражали. За поросятами осуществлялся контроль в течение 21 дня после заражения (ДПЗ) по клиническим симптомам, изменению веса тела, температуре тела (ректальной), числу лейкоцитов, виремии и серологии. Защитный иммунитет на 110 день после вакцинации был продемонстрирован по отсутствию виремии, предотвращению лейкопении и лихорадки и улучшенному набору веса по сравнению с зараженными невакцинированными поросятами.

После вакцинации проводили контроль вакцинированных поросят на любые побочные реакции на вакцину. Параметры, которые контролировали, включали температуру тела (ректальную), число лейкоцитов, набор веса, клинические симптомы, серологию и виремию.

Температуру тела (ректальную) контролировали ежедневно с -1 ДПВ по +4 ДПВ. Анализ средних значений для группы не показал значительного повышения температуры в группах, получавших лечение, в результате вакцинации. У вакцинированных поросят из группы 1 наблюдалось максимальное повышение температуры, равное 0,1^oC (0,2^oF) по сравнению со средними значениями до вакцинации.

Число лейкоцитов контролировали в разные моменты времени до и после введения вакцин. В группе 1 наблюдалось 14% снижение по сравнению со средними числами до вакцинации на 4 ДПВ. Все остальное снижение числа лейкоцитов в группе 1, оставалось менее 9%. В остальных группах (3 и 4) не наблюдалось какого-либо снижения числа лейкоцитов более 11% в течение периода наблюдения после вакцинации.

Результаты набора веса с 0 ДПВ по 28 ДПВ были противоречивыми в том, что изменение веса в группе 1 значительно отличалось от показателей в группе 4 (p= 0,02). Для этого различия не существовало объяснения, так как по всем другим параметрам, которые контролировали, не показано больших различий между группой 1 и группой 4.

Статистический анализ клинических результатов не выявил различий между вакцинированными группами и невакцинированными контрольными группами. Хотя результаты по дефекациям имели наибольшую частоту, не было значительного различия между группой 1 и группами 3 и 4, p=0,7 5; p=0,5 9; соответственно. Подобным же образом клинические результаты по состоянию ноздрей не были значимыми. Сравнение между группой 1 и группой 3 давало значения p более 0,8. Значение p для сравнения между группой 1 и группой 4 было равно 0,02, причем в группе 4 было более высокое число случаев. Не показано значительной степени проявления ни одного из других клинических параметров.

Серологические результаты после вакцинации показали, что эта доза вакцины успешно иммунизировала лечившихся животных. На 14 ДПВ в группе 1 было 48% положительных испытуемых по ИПТ-исследованию. Через семь дней, на 21 ДПВ 100% испытанных животных в лечившейся группе были положительными по ИПТ. Группа 1 оставалась отрицательной на сывороточные нейтрализующие (CH) антитела до 28 ДПВ. Все поросята в группе 1 оставались серологически позитивными по обоим исследованиям до времени заражения на 110 ДПВ. Поросята из групп 3 и 4 оставались серологически негативными в течение всего периода после вакцинации.

Результаты выделения вируса после вакцинации показали, что 100% лечившейся группы было успешно заражено. Это подтверждается серологическими данными, описанными выше. Обе контрольные группы, 3 и 4, оставались негативными в течение периода наблюдения после вакцинации.

Наблюдения после вакцинации показывают, что лечение не дает каких-либо значительных нежелательных эффектов у лечившихся животных, а контрольные животные оставались свободными от вируса PRRS.

После заражения вирулентным вирусом PRRS контролировали различные клинические параметры, чтобы оценить преимущества лечения вакциной. Вакцинированную группу (группа 1) сравнивали с невакцинированной зараженной группой (группа 3) и невакцинированной незараженной группой (группой 4).

Серологические результаты, полученные после заражения