Лечение сахарного диабета типа ii агонистами амилина

Лечение сахарного диабета типа ii агонистами амилина

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, и касается лечения сахарного диабета II типа. Для этого больному, не принимающему инсулин, вводят агонист амилина в дозе, снижающей глюкозу в крови пациента. Предпочтительно лечить больных, имеющих HbAlc около 8% или выше. Способ позволяет заметно снижать уровень глюкозы в крови без инсулина. 2 c. и 10 з.п. ф-лы, 7 табл., 1 ил.

Изобретение относится к медицине, а конкретнее, к агонистам амилина и способам лечения сахарного диабета типа II введением агониста амилина.

Предпосылки к созданию изобретения Публикации и другие материалы, включая патенты и патентные заявки, использованные для пояснения описания, приведены здесь как ссылки.

Амилин Амилин представляет собой белковый гормон из 37 аминокислот. Он выделен, очищен и химически охарактеризован как главный компонент амилоидных осадков в панкреатических островках людей, больных диабетом типа II (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:8628-8632 (1987)). Молекула амилина имеет две важные пост-трансляционные модификации: C-конец амидирован, а остатки цистеина в положениях 2 и 7 связаны поперечной связью с образованием N-концевой петли. Амилин является объектом патентной заявки Великобритании N 8709871, поданной 27.04.1987, и соответствующего патента США N 5367052, выданного 22.11.1994.

Амилин является членом семейства родственных пептидов, которое включает в себя CGRP и кальцитонин (Rink et al., Trends Pharmacol. Sci. 14:113-118 (1993)). Амилин первоначально синтезируется в панкреатических бета-клетках и секретируется в ответ на питательный стимул, такой как глюкоза и аргинин. Moore et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 179:1-9 (1991): Kanatsuka et al. , FEBS Lett, 259: 199-201 (1989); Ogawa et al., J. Clin. Invest. 85: 973-976 (1990); Gedulin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 180: 782-789 (1991).

Сообщалось, что у нормальных людей уровни амилина после голодания от 1 до 10 пМ, а уровни после приема пищи от 5 до 20 пМ (например, Hartter et al. , Diabetologia 34: 52-54 (1991); Sanke et al., Diabetologia 34: 129-132 (1991)); Koda et al. The Lancet 339:1179-1180 (1992)). У тучных инсулинрезистентных индивидуумов, однако, уровни амилина после приема пищи могут становиться более высокими, достигая приблизительно 50 пМ, например. Для сравнения, у здоровых людей величины инсулина после голодания и после приема пищи - 20-50 пМ и 100-300 пМ, соответственно, с возможностью 3-4-кратного превышения уровней у инсулинрезистентных людей. При диабете типа I, при котором бета-клетки разрушаются, уровни амилина находятся на уровне обнаружения или ниже и не повышаются в ответ на глюкозу (Koda et al,. The Lancet 339: 1179-1180 (1992)). У нормальных мышей и крыс зарегистрированы базовые уровни амилина 30-100 пМ, в то время как для некоторых инсулинрезистентных диабетических линий грызунов при измерении были получены величины до 600 пМ (например, Huang et al., Hypertension 19: I-101-I-109 (1991)): Gill et al. Life Sciences 48: 703-710 (1991).

Первым обнаруженным действием амилина было уменьшение стимулируемого инсулином включения глюкозы в гликоген в скелетной мышце крысы (Leighton et al. Nature 335: 632-635 (1988)); мышца была сделана "инсулинрезистентной". Последующая работа с soleus (изолированной) мышцей крысы ex vivo и in vitro показала, что амилин снижает активность гликоген-синтазы, промотирует превращение гликоген-фосфорилазы из неактивной b-формы в активную a-форму, промотирует сетевую потерю гликогена (в присутствии или в отсутствие инсулина), повышает уровни глюкоза-6-фосфата и может увеличить выход лактата (см., например, Deems et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 181: 116-120 (1991)); Young et al., FEBS Letts. 281: 149-151 (1991)).

Вероятно, что амилин действует через рецепторы, присутствующие в мембранах плазмы. Beaumont et al., Mol. Pharmacol. 44: 493-497 (1993). Рецепторы амилина и их применение в различных способах отбора и анализа соединений агонистов и антагонистов амилина описаны в патенте США N 5264372, выданном 23.11.1993.

Биологические воздействия амилина, относящиеся к энергетическому обмену, обсуждаются в Young et al., J. Cell. Biochem. 555: 12-18 (1994). Несмотря на то, что отмечается влияние амилина на энергетический обмен в печени in vivo, нет полного соответствия с тем, какие воздействия амилина обнаруживаются в изолированных гепатоцитах или в печени, поддерживаемой перфузией. Доступные данные не подтверждают представление о том, что амилин промотирует печеночный гликогенолиз, т.е. он не действует подобно глюкагону (e.g., Stephens, et al, . Diabetes 40: 395-400 (1991)); Gomez-Foix et al., Biochem J. 276: 607-610 (1991)). Предполагается, что амилин может воздействовать на печень, ускоряя превращение лактата в гликоген и увеличивая количество глюкозы, способной к высвобождению глюкагоном (см. Roden et al., Diabetologia 35: 116 - 120 (1992)). Таким образом, амилин мог бы действовать как анаболический партнер инсулина в печени в противоположность его катаболическому действию в мышце.

В жировых клетках, в противоположность его действию в мышце, амилин не оказывает заметного воздействия на стимулируемое инсулином усвоение глюкозы, включение глюкозы в продуцирование триглицерида и CO₂ (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 7763-7766 (1988)) стимулируемый эпинефрином липолиз или ингибируемый инсулином липолиз (Lupien and Young, Diabetes Nutrition and Metabolism - Clinical and Experimental, Vol. 6 (1), стр. 13-18 (1993)). Амилин, таким образом, создает ткань-специфические эффекты с непосредственным действием на скелетную мускулатуру, заметным непрямым (через подачу субстрата) и возможным непосредственным воздействиями на печень, в то время как адипоциты кажутся "слепыми" к присутствию или отсутствию амилина. Ни о каких непосредственных воздействиях амилина на ткань почек не сообщалось.

Были сообщения о том, что амилин может оказывать заметное воздействие на секрецию инсулина. В выделенных островках (Ohsawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:961-967 (1989)), в поджелудочной железе, поддерживаемой перфузией (Silvestre et al., Reg. Pept. 31:23-31 (1991)) и на интактных крысах (Young et al. , Mol. Cell. Endocrinol. 84: R1-R5 (1992)), различные эксперименты показывают, что амилин понижающе регулирует секрецию инсулина. Эксперименты на поджелудочной железе, поддерживаемой перфузией, указывают на избирательную понижающую регуляцию (даун-регуляцию) секреторного ответа на глюкозу с подавлением ответа на аргинин. Другие исследователи, однако, оказались неспособными обнаружить воздействия амилина на изолированные бета-клетки, на изолированные островки или на животное в целом (см. Broderick et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 177: 932-938 (1991) и приводимые в этой работе ссылки).

Впечатляющим эффектом амилина у крыс при фармакологических дозах in vivo является стимуляция резкого увеличения лактата в плазме, с последующим увеличением глюкозы в плазме (Young et al. , FEBS Letts. 281: 149-151 (1991)). Очевидно, что повышенное содержание лактата обеспечивает субстрат для образования глюкозы и что действия амилина могут происходить независимо от изменений по инсулину или глюкагону. В экспериментах "зажима глюкозы" вливания амилина вызывают "инсулиновую резистентность" как путем уменьшения периферического удаления глюкозы, так и путем ограничения опосредуемого инсулином подавления печеночного выброса глюкозы (е. g., Frontoni et al. Diabetes 40: 568-573 (1991)); Koopmans et al., Diabetologia 34: 218-224 (1991)).

Показано, что агонисты амилина могут замедлять опорожнение желудка (Young et al., Diabetologia (June 1995, in press), и, вероятно, вносить свой вклад в способность уменьшать гипергликемию после приема пищи (Moyses and Kolterman, Druqs of the Future (May 1995). Способы снижения двигательной функции желудка и замедления опорожнения желудка, предусматривающие введение агониста амилина (включая амилин), являются предметом патентной заявки США, порядковый номер 08/118381 от 7 сентября 1993, и патентной заявки США, порядковый номер 08/302069 от 7 сентября 1994 (и соответствующей заявки РСТ, номер публикации WO 95/07098, опубликованной 16 марта 1995).

К неметаболическим действиям амилина относятся сосудорасширяющие эффекты, которые могут быть опосредованы взаимодействием с CGRP сосудистыми рецепторами. (Brain et al., Eur. J. Pharmacol. 183:2221 (1990). Сообщалось также, что амилин заметно повышает активность ренина плазмы у интактных крыс, когда его вводят подкожно способом, который исключает любое нарушение кровяного давления. Способы лечения антагонистами амилина расстройств, относящихся к ренину, описаны в патенте США N 5376638, выданном 27.12.1994.

Впрыскиваемый в мозг амилин способен подавлять потребление пищи (e.g. Chance et al, Brain Res. 539:352-354 (1991)), в действии принимают участие CGRP и кальцитонин. Эффективные концентрации для клеток, посредством которых осуществляется это действие, неизвестны. Отмечалось также, что амилин оказывает воздействия как на изолированные остеокласты, где он вызывает состояние покоя клеток, так и in vivo, где он способен снижать кальций в плазме на 20% у крыс, кроликов и людей с болезнью Педжета (см., e.g., Zaidi et al., J. Bone Mineral Res. 5 (Suppl. 2) 576 (1990). Как видно из доступных данных, амилин в 10-30 раз менее сильный, чем кальцитонин человека для этих воздействий. Интересно, было отмечено, что амилин проявляет себя в усилении продуцирования цАМФ (циклического аденозинмонофосфата) остеокластами, но не повышает цитозольного Ca²⁺, в то время как кальцитонин делает и то, и другое (Alam et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 134-139 (1991)). Предполагается, хотя и не утверждается, что кальцитонин может действовать посредством двух типов рецепторов и что амилин может взаимодействовать только с одним из них.

Сахарный диабет Сахарный диабет является серьезным метаболическим заболеванием, которое определяется наличием хронически повышенных уровней глюкозы в крови. Классическими симптомами сахарного диабета у взрослых являются повышенное выделение мочи, патологически повышенная жажда, кетонурия, быстрое снижение веса наряду с повышенными уровнями глюкозы в плазме. Нормальные концентрации глюкозы в плазме при голодании менее 115 миллиграмм на децилитр. У больных диабетом выявлены концентрации при голодании выше 140 миллиграмм на децилитр. В основном, сахарный диабет развивается в ответ на повреждение бета-клеток поджелудочной железы. Это повреждение может быть следствием первичного сахарного диабета, при котором бета-клетки разрушаются аутоиммунной системой, или как вторичный диабетический ответ на другие первичные заболевания, такие как панкреатическая болезнь, иные гормональные аномальности, чем недостаточность действия инсулина, лекарственная или химическая стимуляция, аномальности инсулинового рецептора, генетические синдромы или другие. Первичный сахарный диабет может быть классифицирован как диабет типа I (называемый также инсулинзависимым сахарным диабетом IDDM) и диабет типа II (называемый также инсулиннезависимым сахарным диабетом или NIDDM).

Диабет типа I (юношеский или инсулинзависимый) - это хорошо известное состояние гормональной недостаточности, при котором панкреатические бета-клетки оказываются разрушенными собственными механизмами иммунной защиты организма. Пациенты с сахарным диабетом типа I имеют низкую секреторную способность эндогенного инсулина или не имеют ее. У этих пациентов развивается экстремальная гипергликемия. Диабет типа I был летальным до введения инсулинзаместительной терапии около 70 лет назад - вначале с использованием инсулинов из животных источников, а позднее с использованием инсулина человека, полученного технологией рекомбинантной ДНК. Как обсуждалось выше, теперь очевидно, что разрушение бета-клеток при диабете типа I ведет к комбинированной недостаточности двух гормонов, инсулина и амилина. Когда панкреатические клетки разрушаются, утрачивается способность к секреции инсулина и амилина. У больных диабетом типа I отмечены уровни амилина, которые либо не поддаются определению, либо находятся на уровне ниже предела обнаружения и которые не способны повышаться в ответ на введение глюкозы. Koda, The Lancet 339:1179 (1992).

Природа повреждения панкреатических бета-клеток при диабете типа II неясна. В отличие от панкреатических бета-клеток у диабетиков типа I, бета-клетки диабетиков типа II сохраняют способность синтезировать и секретировать инсулин и амилин.

Диабет типа II характеризуется резистентностью к инсулину, т. е. нарушением нормальной метаболической реакции периферических тканей на действие инсулина. Другими словами, резистентность к инсулину является состоянием, когда циркулирующий инсулин вызывает сниженный по сравнению с нормой биологический отклик. В клинических терминах, резистентность к инсулину присутствует, когда нормальный или повышенные уровни глюкозы в крови упорно сохраняются вопреки нормальному или повышенному уровню инсулина. Гипергликемия, связанная с диабетом типа II, может быть иногда возвращена к прежнему состоянию или может быть облегчена диетой или потерей веса, достаточной для восстановления чувствительности периферических тканей к инсулину. Действительно, сахарный диабет типа II часто характеризуется гипергликемией при наличии более высоких, чем нормальный, уровней инсулина в плазме. Прогрессирование сахарного диабета типа II сопровождается повышенными концентрациями глюкозы в крови и связано с относительным снижением скорости индуцируемой глюкозой секреции инсулина. Так, например, на поздней стадии сахарного диабета типа II может быть недостаточность инсулина.

Главной целью лечения всех форм сахарного диабета является снижение концентраций глюкозы в крови до величин настолько близких к нормальной, насколько возможно, и тем самым сведение к минимуму как коротких, так и продолжительных осложнений болезни. Tchobroutsky, Diabetologia 15: 143-152 (1978). Связь между продолжительностью гипергликемии у диабетиков и последующими продолжительными осложнениями была также подтверждена недавно завершенным Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) (Исследованием борьбы с диабетом и осложнениями), предпринятым Национальными Институтами Здоровья (Natianal Institutes of Health). Исследовательская группа Diabetes Control and Complications Trial, N. Eng. J. Med. 329:977 (1993). DCCT проводилось в течение 10-летнего периода в 29 клинических центрах в Соединенных Штатах и Канаде и показало, что снижение средних концентраций глюкозы в крови у диабетиков типа I снижает осложнения рецепторов. Развитие ретинопатии было снижено на 76%, прогрессирование ретинопатии на 54%, и было достигнуто облегчение показателей почечной болезни (протеинурии, альбуминурии). Развитие значительных нефропатических изменений также было уменьшено.

Лечение диабета типа I требует необходимого введения замещающих доз инсулина, вводимого парентерально. При сочетании правильной диеты с контролем глюкозы в собственной крови большинство диабетиков типа I может достигнуть определенного уровня ограничения глюкозы в крови.

В противоположность диабету типа I, лечение диабета типа II часто не требует применения инсулина. Назначение терапии при диабете типа II обычно предусматривает испытание диетической терапии и изменения стиля жизни обычно в течение 6-12 недель на первом этапе. К особенностям диабетической диеты относятся адекватное, но не избыточное потребление общего количества калорий, с регулярным приемом пищи, ограничением содержания насыщенного жира, сопутствующим увеличением содержания полиненасыщенных жирных кислот и увеличенным потреблением диетического волокна. Изменения стиля жизни включают в себя обеспечение регулярных упражнений как с целью ограничения веса, так и для снижения степени резистентности к инсулину. Если после адекватного испытания диеты и изменений стиля жизни гипергликемия при голодании упорно продолжается, тогда может быть поставлен диагноз "неблагоприятный исход главной диеты", и потребуется либо опробование оральной гипогликемической терапии или непосредственное назначение инсулиновой терапии, для того чтобы добиться органичения уровня глюкозы в крови и, тем, самым, свести к минимуму осложнения болезни. Диабетики типа II, которые потерпели неудачу в лечении диетой и снижением веса, могут реагировать на терапию оральными гипогликемическими средствами, такими как сульфонилкарбамиды или бигуанидины. Инсулиновую терапию, однако, применяют для лечения других пациентов с диабетом типа II, особенно тех, которые испытали недостаточность первичной диеты и не страдают ожирением, или тех, которые испытали и недостаточность первичной диеты и вторичную недостаточность оральных гипогликемических средств.

Применение агонистов амилина при лечении сахарного диабета описано в патентах США N 5124314 и N 5175145. Избыточное действие амилина имитирует ключевые характерные признаки диабета типа II, и амилиновая блокада была предложена как новая терапевтическая стратегия. Патент США N 5266561, выданный 30 ноября 1993, и патент США N 5281581, выданный 25 января 1994, раскрывают лечение диабета типа II и резистентности к инсулину с применением антагонистов амилина.

Ранее сообщалось, что вливание агониста амилина, ^25,28,29Pro-h-амилина, снижает возникающие после еды концентрации глюкозы у диабетиков типа I. Moyses & Kolterman, Drugs of Future (Май 1995). При едином слепом перекрестном исследовании на 6 субъектах мужского пола с диабетом типа I было выявлено, что 2-часовое вливание агониста амилина, ^25,28,29Pro-h-амилина, со скоростью 150 мкг/ч заметно уменьшает возникающую после еды гипергликемию после потребления смешанной пищи. Этот эффект был подтвержден вторым исследованием, при котором применяли скорость вливания 50 мкг/ч в течение 5 часов для 9 субъектов с диабетом типа 1. Питательную провокационную пробу вводили либо перорально (в форме пищевого продукта Sustacal (зарегистрированный товарный знак)), либо как внутривенную глюкозную нагрузку из 300 мг/кг. Введение ^25,28,29Pro-h-амилина явно приводило к заметному снижению возникающего после еды отклонения глюкозы после перорального введения продукта Sustacal, но не после внутривенного введения глюкозы, что согласуется с эффектом замедления опорожнения желудка и, таким образом, замедлением желудочно-кишечной абсорбции питательных веществ. В дальнейшем двойном слепом методе исследования с плацебо-контролем самоинъецируемый ^25,28,29Pro-h-амилин, вводимый перед едой трижды в день, также приводил к снижению отклонения глюкозы после пробного приема пищи. Пациенты продолжали их обычный инсулиновый режим. В третьем исследовании статистически заметный эффект наблюдался с дозой 30 мкг агониста амилина.

Краткое описание изобретения Мы обнаружили неожиданно, что не принимающих инсулин пациентов с диабетом типа II можно лечить введением агониста амилина, с тем чтобы снизить концентрации глюкозы у них в крови. Мы также обнаружили, что лечение не принимающих инсулин пациентов с диабетом типа II агонистом амилина особенно полезно для тех пациентов, которые имеют показатель HbAlc выше нормы.

В одном аспекте, настоящее изобретение направлено на способ лечения не принимающего инсулин субъекта с диабетом типа II, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества агониста амилина. Понятие "не принимающий инсулина субъект с диабетом типа II" обозначает субъекта, который имеет сахарный диабет типа II, но проходит курс лечения диабета без применения инсулина, например путем сочетания диеты, упражнений, изменения образа жизни или применения пероральных гипогликемических средств, таких как бигуаниды и сульфонилкарбамиды. Способности и знания специалиста в этой области позволяют хорошо поставить диагноз для пациентов, пораженных диабетом типа II. Например, индивидуумы в возрасте старше 35, которые имеют симптомы полидипсии, полиурии, полифагии (с потерей веса или без), которые сочетаются с повышенными концентрациями глюкозы в плазме, и без кетоацидоза в анамнезе, в основном, считаются имеющими диагноз сахарный диабет типа II. Наличие ожирения, положительный семейный анамнез в отношении диабета типа II и нормальный или повышенный уровень инсулина в плазме после голодания и концентрации C-пептида являются дополнительными признаками большинства пациентов с сахарным диабетом типа II. Под "терапевтически эффективным количеством" следует понимать количество, в одной или нескольких дозах, которое благоприятно снижает концентрации глюкозы в плазме у субъекта, пораженного сахарным диабетом типа II.

В предпочтительном воплощении, настоящее изобретение направлено на способ лечения не принимающего инсулин субъекта с диабетом типа II, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества агониста амилина, когда субъект имеет показатель HbAlc выше верхнего предела показателей HbAlc для нормальных субъектов. HbAlc представляет собой пост-трансляционную модификацию гемоглобина, которая появляется при неферментативном процессе, в результате которого глюкоза связывается с гемоглобином A, и обычно отражает среднюю концентрацию глюкозы в плазме за предшествующие 120 суток, среднюю продолжительность жизни эритроцита. Под верхним пределом нормального показателя HbAlc подразумевается верхний предел диапазона для нормальных субъектов, не страдающих диабетом, который должен быть от около 6,0% до около 7,5%. В другом предпочтительном воплощении изобретения, субъект имеет показатель HbAlc по меньшей мере около 8%.

В другом аспекте, настоящее изобретение направлено на способ снижения глюкозы в крови у не принимающего инсулин субъекта с диабетом типа II путем введения указанному субъекту снижающего глюкозу в крови количества агониста амилина. Снижающее глюкозу количество агониста амилина предпочтительно должно быть в пределах приблизительно между 0,05-10 мкг/кг/день, более предпочтительно - между 0,05-6 мкг/кг/день, а еще лучше - между 1,0-4 мкг/кг/день. Например, эффективное снижающее глюкозу в крови количество ^25,28,29Pro-h-амилина (AC137) должно, в основном, изменяться приблизительно от 0,05 мкг/кг/день до 10 мкг/кг/день, преимущественно - от 0,1 мкг/кг/день до 6 мкг/кг/день. Доза примерно от 1,0 мкг/кг/день до 4,0 мкг/кг/день является предпочтительной. В предпочтительном воплощении изобретения, субъект имеет показатель HbAlc выше верхнего предела нормального диапазона показателей HbAlc для нормальных субъектов. В других предпочтительных воплощениях настоящего изобретения, субъект имеет показатель HbAlc по меньшей мере около 8%.

В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения, агонист амилина выбирают из группы, содержащей ^25,28,29Pro-h-амилин (АС137), s-кальцитонин и h-амилин. Особенно предпочтительным является ^25,28,29Pro-h-амилин (AC137).

Введение агонистов амилина может быть осуществлено различными путями: подкожно, внутримышечно, назально или чрескожно.

Далее изобретение будет описано со ссылкой на прилагаемый чертеж, на котором показано соответствие между вызываемым AC137 снижением возникающей после еды гипергликемии и состоянием HbAlc у принимающих инсулин и не принимающих инсулин пациентов. Пациенты упорядочены по категориям по уровням HbAlc. Корреляция (г²⁾ была 0,56 для не принимающих инсулин пациентов, 0,10 для принимающих инсулин пациентов и 0,33 для всех пациентов вместе.

Подробное описание изобретения Агенты-агонисты амилина могут быть идентифицированы по активности в связывании рецептора и тестами на soleus мышце, описанными ниже. Агонистическая амилину активность соединений может быть также оценена по способности вызывать гиперкальциемию и/или гипергликемию у млекопитающих или снижать возникающие после еды уровни глюкозы в плазме, как здесь описано.

Номенклатура различных соединений-агонистов амилина, применимых в настоящем изобретении, может быть использована для обозначения как пептида, на последовательности которого они основаны, так и модификаций, произведенных в какой-либо основной пептидной амилиновой последовательности, такой как амилин человека. Аминокислота с надписанным перед ней числом обозначает, что названная аминокислота замещает аминокислоту, нормально присутствующую в аминокислотном положении надписи в основной аминокислотной последовательности. Например, "¹⁸Arg^25,28Pro-h-амилин" относится к пептиду, основанному на последовательности "h-амилина" или "амилина человека", имеющего следующие замещения: Arg, замещающий His в положении 18, Pro, замещающий Ala в положении 25, и Pro, замещающий Ser в положении 28. Термин "дез-¹Lys-h-амилин" относится к пептиду, основанному на последовательности амилина человека с утраченной первой или N-концевой аминокислотой.

Предпочтительные соединения-агонисты амилина, дез-¹Lys-h -амилин, ²⁸Pro-h-амилин,^25,28,29Pro-h-амилин,¹⁸Arg^25,28Pro-h-амилинидeз-¹Lуs¹⁸Arg^25,28Pro-h-aмилин, все обнаруживают активность амилина in vivo у испытуемых животных, вызывая повышенное содержание молочной кислоты в крови. В дополнение к имеющимся активностям, характерным для амилина, некоторые предпочтительные соединения, как было обнаружено, обладают более желательными характеристиками растворимости и стабильности по сравнению с амилином человека. К таким предпочтительным соединениям относятся ²⁵Pro²⁶Val^28,29Pro-h-амилин, ^25,28,29Pro-h-амилин (также обозначенный здесь как "АС-0137") и ¹⁸Arg^25,28Pro-h-амилин.

В способах настоящего изобретения используются агонисты амилина, включая амилин или аналоги агониста амилина, например, аналоги агониста рецептора амилина, такие как: ⁸Arg^25,28Pro-h-амилин, дeз-¹Lуs¹⁸Arg^25,28Pro-h-aмилин, ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-амилин, дeз-¹Lуs¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-aмилин, ^25,28,29Pro-h-амилин, дез-¹Lys^25,28,29Pro-h-амилин и ²⁵Pro²⁶Val^25,28Pro-h-амилин. Примерами других подходящих аналогов агониста амилина являются: ²³Leu²⁵Pro²⁶Val^28,29Pro-h-амилин, ²³Leu²⁵Pro²⁶Val²⁸Pro-h-амилин, дез-¹Lys²³Leu²⁵Pro²⁶Val²⁸Pro-h- -амилин, ¹⁸Arg²³Leu²⁵Pro²⁶Val²⁸Pro-h- амилин, ¹⁸Arg²³Leu^25,28,29Pro-h-амилин, ¹⁸Arg²³Leu^25,28Pro-h-амилин, ¹⁷Ile²³Leu^25,28,29Pro-h-амилин, ¹⁷Ile^25,28,29Pro-h-амилин, дез-¹Lys¹⁷Ile²³Leu^25,28,29Pro-h-амилин, ¹⁷Ile¹⁸Arg²³Leu-h-амилин, ¹⁷Ile¹⁸Arg²³Leu²⁶Val²⁹Pro-h-амилин, ¹⁷Ile¹⁸Arg²³Leu²⁵Pro²⁶Val^28,29 Pro-h-амилин, ¹³Thr²¹His²³Leu²⁶Ala²⁸Leu²⁹ Pro³¹Asp-h-амилин, ¹³Thr²¹His²³Leu²⁶Ala²⁹ Pro³¹Asp-h-амилин, дез-¹Lys¹³Thr²¹His²³Leu²⁶ Ala²⁸Pro³¹Asp-h-амилин, ¹³Trp¹⁸Arg²¹His²³Leu²⁶Ala²⁹ Pro³¹Asp-h-амилин ¹³Trp¹⁸Arg²¹His²³Leu^28,29 Pro³¹Asp-h-амилин и ¹³Thr¹⁸Arg²¹His²³Leu²⁵ Pro²⁶Ala^28,29Pro³¹Asp-h-амилин.

Кроме того, дополнительные агонисты амилина, включая аналоги агониста амилина, описаны и способы получения и применения агонистов амилина установлены и совместно защищены в патентной заявке США, "Novel Amylin Agonist Peptides and Uses Therefor", поданной 30.05.1995 и соответствующей заявке PCT N WO 93/10146, опубликованной 27 мая 1993, сообщения о которых приведены здесь в качестве ссылки. Эти агонисты пригодны для уменьшения концентраций глюкозы в крови у субъекта с диабетом типа II, не принимающего инсулин.

Активность агонистов амилина может быть оценена с помощью некоторых биологических тестов, описанных здесь. Тест связывания рецептора может идентифицировать кандидатов как агонистов, так и антагонистов амилина и может быть использован для оценки связывания, в то время как испытание на soleus мышце может быть применено для того, чтобы установить различие между агонистами и антагонистами. Преимущественно, соединения-агонисты обнаруживают активность в тесте связывания рецептора порядка от менее чем примерно 1 до 5 нМ, предпочтительно менее чем примерно 1 нМ, более предпочтительно - менее чем около 50 пМ. При испытании на soleus мышце эти соединения преимущественно показывают величины EC₅₀ порядка от менее чем 1 до 10 микромолярных.

Тест связывания рецептора описан в патенте США N 5264372, выданном 23 ноября 1993, содержание которого приводится здесь ссылкой. Тест связывания рецептора является конкурентно-связывающим анализом, который измеряет способность соединений специфически связываться со связанными с мембраной амилиновыми рецепторами. Предпочтительным источником мембранных препаратов, используемых в этом анализе, является базальная фронтальная часть мозга, которая содержит мембраны из прилегающих к ядрам и окружающих участков. Соединения испытывают на связывание с такими рецепторными препаратами конкурентно с ¹²⁵I Bolton Hunter крысиным амилином. Конкурентные кривые, на которых количество связей (В) представлено как функция логарифма концентрации лиганда, анализируют компьютером, используя анализы нелинейной регрессией к логистическому уравнению 4-параметра (Inplot program; GraphPAD Software, San Diego, California) или ALLFIT program of DeLean et. al. (ALLFIT, Version 2.7 (NIH, Bethesda, MD 20892)). Munson, P. and Rodbard, D., Anal. Biochem. 107: 220-239 (1980).

Испытания биологической активности агонистов амилина, включая препараты аналога агониста амилина, на soleus мышце проводят с использованием ранее описанных способов (Leighton, В. and Cooper, G.J.S., Nature, 335:632-635 (1988); Cooper, G. J. S. , et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7763-7766 (1988)). В общем, активность агониста амилина оценивают измерением ингибирования стимулируемого инсулином синтеза гликогена в soleus мышце. Активность антагониста амилина оценивают измерением возобновления стимулируемого инсулином синтеза гликогена в присутствии 100 нМ крысиного амилина и антагониста амилина. Концентрации пептида, растворенного в буферах без носителя, определяют количественным аминокислотным анализом, как здесь описано. Способность соединений действовать как агонисты в этом испытании определяют измерением EC₅₀ величин. Стандартные ошибки определяют подгонкой сигмоидальных кривых зависимости "доза-эффект" с использованием логистического уравнения 4-параметра (De Lean, A., Munson, P.J., Guardabasso, V. and Rodbard, D. (1988) ALLFIT, Version 2.7, National Institute of Child Health and Human Development, N. I.H. Bethesda, ND, 1 diskette). Некоторое количество агонистов амилина охарактеризовано с использованием таких биологических анализов. Соединения, ¹⁸Arg^25,28Pro-b-амилин, дез-¹Lys¹⁸Arg^25,28Pro-h-амилин, ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-амилин, дез-¹Lys¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-амилин, ^25,28,29Pro-h-амилин, дeз-¹Lуs^25,28,29Pro-h-амилин и ²⁵Pro²⁶Val^25,28Pro-h-амилин, все оказались способными конкурировать с амилином в тесте связывания рецептора. Эти соединения имеют незначительную антагонистическую активность, как определено испытанием на soleus мышце, и показали себя способными действовать как агонисты амилина.

Воздействия амилинов или агонистов амилина на двигательную функцию желудка могут быть идентифицированы, оценены или подобраны для использования способов, описанных в патентной заявке США N 08/118381, поданной 7.09.1993, и патентной заявке США N 08/302069, поданной 7.09.1994 (соответствующих заявке PCT, публикации N WO 95/07098, сообщение о которых приведено здесь ссылкой, или других известных или эквивалентных способов определения двигательной функции желудка. Один из таких способов для использования при идентификации или оценке способности соединения замедлять двигательную функцию желудка предусматривает (а) сведение вместе тестируемой пробы и тест-системы, указанная тестируемая проба содержит одно или несколько тестируемых соединений, а указанная тест-система содержит систему для оценки двигательной функции желудка, указанная система характеризуется тем, что она обнаруживает, например, повышенное содержание глюкозы в плазме в ответ на введение в указанную систему глюкозы или пищи, и (б) качественное или количественное определение увеличения глюкозы в плазме в указанной системе. Положительный и/или отрицательный контроли могут быть применены, как обычно. Необязательно, заданное количество антагониста амилина (например, ^8-32кальцитонина лососевых) может быть добавлено к тест-системе.

Агонисты амилина, такие как описаны выше, получают с использованием стандартной технологии твердофазного синтеза пептида и, предпочтительно, автоматического или полуавтоматического устройства для синтеза. Обычно аминокислоту с защитной альфа-N-карбамоильной группой и аминокислоту, прикрепленную к растущей пептидной цепи на полимере, связывают при комнатной температуре в инертном растворителе, таком как диметилформамид, N-метилпирролидон или метиленхлорид, в присутствии связывающих веществ, таких как дициклогексилкарбодиимид и 1-гидроксибензотриазол, в присутствии основания, такого как диизопропилэтиламин. Защитную альфа-N-карбамоильную группу удаляют из полученного комплекса пептид-полимер с использованием такого реагента, как трифторуксусная кислота или пиперидин, и повторяют реакцию сочетания со следующей желательной N-защищенной аминокислотой, чтобы присоединить ее к пептидной цепи. Подходящие N-защитные группы хорошо известны, из них предпочтительны трет-бутилоксикарбонил (tBoc) и флуоренилметоксикарбонил (Fmoc).

Растворители, производные аминокислот и полимер 4-метил- бензгидриламина, используемые в устройстве для синтеза пептида, приобретены у Applied Biosystems Inc. (Foster city, CA), если нет другого указания. Аминокислоты с защищенной боковой цепью приобретены у Applied Biosystems, Inc. и представляют собой следующие: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg (Pmc), Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(Brz), Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(Clz), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc- His(Trt), Fmoc-Asn(Trt) и Fmoc-Gln(Trt). Boc-His(BOM) приобретена у Aphlied Biosystems, Inc. или Bachem Inc. (Torrance, CA). Анизол, метилсульфид, фенол, этандитиол и тиоанизол получены от Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wl). Air Products and Cheicals (Allentown, PA) поставляют HF. Простой этиловый эфир, уксусная кислота и метанол приобретены у Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).

Твердофазный синтез пептида проводят с помощью автоматического устройства для синтеза пептида (Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster city, CA) с использованием NMP/HOBt (Option 1) системы и Tboc или Fmoc химии (см. Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, Version 1.3В July 1, 1988, section 6, pp. 49-70, Applied Biosystems, Inc., Foster city, CA) с блокированием. Комплексы Вос-пептид-полимер расщепляют HF (-5^oC - 0^oC, 1 час). Пептид извлекают из полимера, чередуя воду и уксусную кислоту, а фильтраты лиофилизуют. Комплексы Fmoc-пептид-полимер расщепляют в соответствии со стандартными способами (Introduction to Cleavane Techniques, Applied biosystems, Inc., 1990, pp. 6-12). Некоторые пептиды также конструируют с использованием Advanced Chem Tech Synthesizer (Model MPS 350, Louisville, Kentucky). Пептиды очищают методом RP-HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) (препаративной и аналитической) с использованием Waters Delta Prep 3000 системы. C4, C8 или C18 препаративную колонну (10 мк, 2,2 x 25 см; Vydac, Hesperia, CA) используют для выделения пептидов, а чистоту определяют, используя C4, C8 или C18 аналитическую колонну (5 мк, 0,46 х 25 см; Vydac). Растворители (A = 0,1 TFA/вода and В-0,1% TFA/CH₃CN) вводят в аналитическую колонну при скорости потока 1,0 мл/мин, а в препаративную колонну при 15 мл/мин. Аминокислотные анализы проводят на Waters Pico Tag системе, а обрабатывают результаты с использованием программы Maxima. Пептиды гидролизуют кислотным гидролизом в паровой фазе (115^oC, 20-24 ч). Гидролизаты дериватизируют и анализируют стандартными способами (Cohen, S.A., Meys, М. , & Tarrin, T.L. (1989), The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, pp. 11-52, Millipore Corporation, Milford, MA). Анализ путем бомбардировки быстрыми атомами проводят с помощью M-Scan, Incorporated (West Chester, PA). Калибрование по массе проводят с использованием йодида цезия или йодида цезия/глицерина. Анализ методом плазменной десорбционной ионизации с быстрым временем детекции проводят на Applied Biosystems BIO-Ion 20 масс-спектрометре.

Пептидные соединения, применимые в заявленных способах, также получают с использованием методики рекомбинантной ДНК известными способами. См., например, Sambrook et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor (1989).

Указанные выше соединения образуют соли с различными неорганическими и органическими кислотами и основаниями. К таким солям относятся соли, полученные, например, с такими органическими и неорганическими кислотами, как HCl, HBr, H₂SO₄, H₃PO₄, трифторуксусная кислота, уксусная кислота, муравьиная кислота, метансульфоновая кислота, толуолсульфоновая кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота и камфорсульфоновая кислота. К солям, полученным с основаниями, относятся соли аммония, соли щелочных металлов, например соли натрия и калия, и соли щелочноземельных металлов, например соли кальция и магния. Предпочтительны соли ацетат, гидрохлорид и трифторацетат. Соли могут быть получены обычными приемами, такими как реакция свободной формы кислоты или основания продукта с одним или несколькими эквивалентами выбранного основания или кислоты в растворителе или в среде, в которой соль является нерастворимой, или в таком растворителе, как вода, который затем удаляют в вакууме или сушкой вымораживанием, или обменом ионов существующей соли на другой ион на подходящей ионообменной смоле.

Композиции, применимые в настоящем изобретении, для удобства могут быть получены в форме препаратов, пригодных для парентерального (включая внутри