Способ лечения аутоиммунных заболеваний с использованием интерферонов типа i

Способ лечения аутоиммунных заболеваний с использованием интерферонов типа i

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии и неврологии, и касается лечения аутоиммунных заболеваний. Для этого лечение включает стадию перорального введения интерферонов первого типа, причем каждое введение осуществляют в дозе от 50 до 25000 МЕ/кг. В этой связи предлагают лечить рассеянный склероз для снижения тяжести или частоты рецидивов, а также уменьшать аутоиммунное воспаление и ингибировать приступ аутоиммунного заболевания. Способ, в отличие от известного парентерального введения интерферонов, представляется удобным в использовании, эффективным и может применяться длительные сроки, насколько необходимо для лечения. 4 с. и 10 з.п. ф-лы, 10 ил.

Настоящее изобретение относится к области неврологии, иммунологии и химии протеинов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым способам лечения аутоиммунных заболеваний с использованием интерферонов первого типа.

Острый экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит /EAE/ представляет собой воспалительный аутоиммунный процесс в центральной нервной системе, опосредованный T клетками, который напоминает такое заболевание человека, как рассеянный склероз. CR-EAE, хронический воспалительный аутоиммунный процесс центральной нервной системы, который напоминает рассеянный склероз человека /MS/ как в патологических, так и в клинических проявлениях, предоставляет модель для оценки вмешательств с целью изменения течения аутоиммунного заболевания человека. Миелиновый основной протеин /MBP/ представляет собой важный нейроантиген в патогенезе этого заболевания. CR-EAE у SJL/J мышей можно адаптивно переносить после внутривенной инъекции MBP пептида 89-100 специфической T-клеточной линии. Совместное культивирование MBP пептида 91-103 специфических T клеток с химически связанным пептидом придает T клеткам устойчивость к MBP при CR-EAE у SJL/J мышей.

Парентеральное, например, четырехкратное введение природного крысиного интерферона /10⁵ ед./ частично подавляет острый EAE у самцов крыс Льюиса и ингибирует пассивный гиперострый локализованный EAE при введении в тот же день, что и инокуляция иммуногена. Другие парэнтерально вводимые питокины, такие как TGF-, могут ослабить клиническую картину заболевания и воспаления в мозгу и спинном мозгу при EAE. Парентерально вводимый природный IFN- человека может понизить функции T клеток и выработку антител, зависимую от T клеток у людей. При пероральном введении природный IFN- человека может предотвращать экспериментальное развитие вирусных и паразитических инфекций у животных. Острый EAE предоставляет модель для демонстрации способности перорально вводимых иммуноактивных веществ влиять на течение аутоиммунного заболевания IFN- человека, представляет собой иммуноактивный протеин, который можно перорально вводить в низких дозах при лечении вирусных заболеваний у животных. IFN- человека другой интерферон первого типа усиливает функции супрессорных клеток ин витро при прогрессивном MS, а крысиный IFN- уменьшает степень тяжести симптомов у крыс с EAE. Учитывая иммунорегуляторные и противовирусные свойства интерферонов типа 1, их реакции и продуцирование были оценены в случае аутоиммунных заболеваний. Неактивные ревматоидные артриты характеризуются усиленной /2'-5// олигоаденилатсинтетазой /OAS/, которую легко определить, измеряя активность интерферона типа 1 в лейкоцитах переферической крови, вторичных к IFN-/ стимулам; активные ревматоидные артриты демонстрируют значительно пониженное продуцирование IFN-/ по сравнению с нормальными донорами. Такие другие аутоиммунные заболевания, как псориаз и атопические дерматиты, также демонстрируют уменьшение продуцирования интерферона. Лимфоциты периферической крови у пациентов с МS демонстрируют аналогичное неэффективное продуцирование интерферона типа 1 в ответ на вирусные или митогенные стимулы, параллельное с тяжестью заболевания. У больных рассеянным склерозом наблюдается также дефицит активности природных клеток-киллеров [NK], что коррелируется с тяжестью заболевания и может быть нормализовано за счет лечения IFN-.

Известные ненормальности в продуцировании или реакциях интерферона типа 1 при аутоиммунных заболеваниях побудили провести несколько небольших пилотных исследований с использованием интерферонов типа 1 в качестве терапевтических агентов для MS. В этих исследованиях использовали систематическое введение интерферона типа 1 в дозах 1 млн. ед. или более ежедневно без заметного клинического улучшения. Исследования парентерального введения IFN- при рассеянном склерозе с чередованием рецидивов и ремиссий позволяет предположить, что введение 1,6-8 млн. ед. IFN- подкожно трижды в неделю может уменьшить рецидивы на 40-50% и уменьшить воспаление мозга, о чем свидетельствуют серии MBI /изображения, полученные с помощью магнитного резонанса.

Известные способы лечения испытывают недостаток эффективных средств для лечения аутоиммунных заболеваний за счет перорального введения таких цитокинов, как интерфероны первого типа. Настоящее изобретение восполняет эту настоятельную потребность.

Целью настоящего изобретения является демонстрация того, что пероральное введение интерферона типа 1 ингибирует пролиферацию сенсибилизированных антигенов, подавляет клинические проявления рецидивов и уменьшает воспаление за счет изменения цитокинов в мышином CR-EAE.

Другой целью настоящего изобретения является иллюстрация действий интерферонов первого типа при пероральном введении до и после иммунизации GP-MBP при остром EAE.

Другой целью изобретения является подавление клинических проявлений приступов аутоиммунного заболевания, уменьшение патологических осложнений и ингибирование воспалительных питокинов при таких заболеваниях за счет перорального введения модификаторов биологических реакций, таких как интерфероны первого типа.

Целью настоящего изобретения является также демонстрация действия перорального введения крысиного IFN-/ на клинические проявления, гистологию и IFN- секрецию при экспериментальных аллергических невритах на ин виво модели острой воспалительной демиелинирующей радикулоневропатии или синдроме Гийена-Барре /Guillain - Barre'/.

В одном из вариантов настоящего изобретения предложен способ лечения аутоиммунных заболеваний у животных, который включает стадию перорального введения этим животным интерферона типа 1.

В другом варианте изобретения предложен способ снижения тяжести или частоты рецидивов рассеянного склероза у людей, который включает стадию перорального введения интерферона типа 1 указанному пациенту.

В еще одном варианте настоящего изобретения предложен способ уменьшения воспалений, связанных с аутоиммунным заболеванием у животных, который включает стадию перорального введения интерферона первого типа указанному животному.

И, наконец, в еще одном варианте настоящего изобретения предложен способ ингибирования приступов аутоиммунного заболевания, включающий стадию перорального введения указанному животному интерферона первого типа.

Другие аспекты, особенности и преимущества изобретения будут очевидны из следующего описания представленных предпочтительных вариантов изобретения, приводимых с целью раскрытия изобретения.

С целью разъяснения вышеперечисленных особенностей, преимуществ и целей настоящего изобретения, а также других, которые выяснятся в дальнейшем, а также с целью более детального разъяснения, более конкретные описания изобретения, кратко суммированного ранее, можно осуществить со ссылками на некоторые варианты изобретения, которые иллюстрируются в прилагаемых чертежах. Эти чертежи составляют часть описания. Однако следует отметить, что прилагаемые чертежи иллюстрируют лишь предпочтительные варианты изобретения и поэтому их не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения.

Фиг. 1 демонстрирует, что пероральное введение мышиного природного IFN-/ подавляет клинический рецидив при мышином CR-EAE. Двум группам по шесть животных инокулируют, а после первого приступа дают либо имитацию IFN, либо по 100 ед. мышиного природного IFN-/ трижды в неделю в течение 7 недель. Представлен один из двух представительных примеров. SEM/ср. квадратичная ошибка/ составляет менее 10%.

Фиг. 2 демонстрирует, что пероральное введение 5000 ед. крысиного IFN-/ ингибирует клиническое проявление при остром EAE. Четырем группам крыс Льюиса /по 6 в каждой/ вводят имитацию IFN 1000, 3000 или 5000 ед. IFN-/ каждой крысе в течение 7 дней, предшествующих иммунизации /-7/ и в течение последующих 21 дня /+14/. Результаты выражены как средний клинический показатель для каждой группы в каждый день заболевания после инокуляции SEM. Приводится один из представительных примеров. Данные для случаев введения 1000 и 3000 ед. не показаны, ^xp менее 0,02 между имитатором интерферона и 5000 ед. IFN-/ введенных животным.

Фиг. 3 демонстрирует, что пероральное введение hrIFN- крысам с острым EAE задерживает приступ, снижает тяжесть его, и скорость возврата клинического приступа. Трем группам по семь крыс Льюиса инокулируют MBP и CFA в 0 день и перорально вводят PBS 1000 ед. или 5000 ед. hrIFN- ежедневно, начиная с семи дней до иммунизации /-7/ и в течение 14 дней после иммунизации /+14/. Величины представляют экспериментальные клинические показатели при аллергическом неврите для каждой из групп по 7 животных SEM. Представлен один из двух представительных примеров.

Фиг. 4 демонстрирует, что пероральное введение hrIFN- крысам с острым EAE снижает кумулятивную клиническую тяжесть острых клинических приступов при аллергических невритах. Три группы по семь крыс Льюиса обрабатывают, как представлено на фиг. 3. Приведенные величины соответствуют кумулятивным клиническим показателям при аллергических невритах для каждой группы из 7 животных с 10 до 16 дня после инокуляции. ^xp менее 0.001, 5000 ед. IFN- против как для 1000 ед. IFN-, так и для PBS контроля.

Фиг. 5 демонстрирует, что пероральное введение 5000 ед. hrIFN- снижает количество воспалительных центров в спинном мозге по сравнению с контрольной группой и группой, которой вводят 1000 ед. интерферона. После умерщвления спинной мозг животных, представленных на фиг. 3, обрабатывают в соответствии с описанием в разделе методики. Результаты выражены как количество воспалительных центров для спинного мозга SEM. Представлен один из представительных примеров. ^xp менее 0,04, 5000 ед. IFN против 1000 ед. IFN или PBS контрольной группы.

Фиг. 6 демонстрирует, что пероральное введение 5000 ед. hrIFN- без подкожного введения снижает тяжесть клинических приступов. Трем группам крыс Льюиса по 6 в группе инокулируют MBP и CFA на 0 день, и без обработки вводят 5000 или инъектируют подкожно 5000 ед. hrIFN- ежедневно, начиная с семи дней до иммунизации /-7/ и в течение последующих 21 дня. /+14/. Величины представляют ежедневные клинические показатели экспериментальных аллергических невритов для каждой группы из 6 животных SEM. Представлен один из двух представительных примеров.

Фиг. 7 демонстрирует, что пероральное введение hrIFN- крысам с острым EAE снижает кумулятивную клиническую тяжесть острых клинических приступов при экспериментальных аллергических невритах. Три группы по шесть крыс Льюиса в каждой обрабатывают, как показано на фиг. 6. Величины представляют кумулятивные клинические показатели при экспериментальных аллергических невритах для каждой группы из 6 животных с 10 до 16 дня после инокуляции. ^xp менее 0,005, для животных, которым вводили, по сравнению с необработанными/ подкожно введенными обработанными животными.

Фиг. 8 демонстрирует, что пероральное введение 5000 ед. hrIFN- снижает число воспалительных центров в спинном мозге по сравнению с контрольной группой. После умерщвления спинной мозг животных, представленных на фиг. 6, обрабатывают, как описано ранее, и проводят независимую оценку для центров воспаления одним наблюдателем, которому не известен способ обработки. Результаты выражены как число воспалительных центров на спинной мозг SEM. Представлен один из двух представительных примеров. ^xp менее 0,04, 5000 ед. IFN введено перорально против 5000 ед., введенных подкожно.

Фиг. 9A и 9B демонстрируют, что пероральное введение крысиного интерферона -/ снижает клинические проявления заболевания у крыс с экспериментальными аллергическими невритами. Крысам Льюиса вводят либо 5000 ед. IFN-/ /интерферон/, либо моск-IFN /имитация/, начиная с 7 дней до иммунизации бычьим миелином периферических нервов. Клинический показатель оказывается значительно выше у моск(имитатор)- IFN крыс/ н = 11/, нежели у IFN-/ крыс /н=11/. В моск-IFN группе оказывается больше крыс, которые достигают клинического показателя 4 или выше, нежели в группе, которой вводили IFN-/ /моск-IFN 7 из 11 против IFN-/ 4 из 11 крыс/. /Фиг. 9A/ и соответственно больше крыс, которые теряют 25% или более веса тела /моск-IFN 4 из 11 против IFN-/ 2 из 11 крыс/ /фиг. 9B/.

Фиг. 10 демонстрирует, что пероральное введение крысиного интерферона -/ уменьшает воспаление и IFN- продуцирование при экспериментальном аллергическом неврите, Крысам Льюиса вводят перорально либо 5000 ед. IFN-/ либо моск-IFN, начиная с 7 дней до иммунизации бычьим миелином периферических нервов до момента умерщвления. Иммуноцитохимическое исследование люмбосакральных нервных корешков с использованием ED1 антител /1:1000/ и IFN- антител /1:10/ на 13 день после иммунизации во время приступа клинического заболевания показывает меньше ED1 позитивных макрофагов /фиг. 10A, 2B/ у IFN-/ обработанных крыс по сравнению со значениями у моск-IFN обработанных крыс /фиг. 10B, 10E/. Наряду со сниженным количеством ED1 позитивных макрофагов наблюдается уменьшение IFN- экспрессии у крыс, обработанных IFN-/ фиг. 100/ по сравнению с крысами, обработанными моск-IFN /фиг. 10F/. Bar = 20 микрон.

В способе настоящего изобретения модификация заболевания и ингибирование продуцирования воспалительных цитокинов, индуцированные за счет перорального введения цитокинов при EAE, предоставляет удобные, эффективные и длительного срока способы лечения аутоиммунных заболеваний, вызванных неизвестным антигеном у людей, в частности рассеянного склероза.

Настоящее изобретение направлено на способ лечения аутоиммунных заболеваний у животных, который включает стадию перорального введения интерферона типа 1 указанным животным. Обычно интерферон, который можно использовать в способе настоящего изобретения, является либо альфа-интерфероном, либо бета-интерфероном. Интерферон первого типа может быть получен из любого источника. Предпочтительно выбирать интерферон из группы, состоящей из человеческого рекомбинантного интерферона, крысиного интерферона и мышиного интерферона.

Обычно интерферон первого типа, вводимый в соответствии со способами настоящего изобретения, следует вводить в дозах, которые эффективно ингибируют приступ или рецидивы и т.д. аутоиммунных заболеваний. Так например, интерферон можно вводить в дозах от около 50 ME/кг до около 25000 ME/кг.

Способ настоящего изобретения можно использовать для любых животных с аутоиммунными заболеваниями. Более предпочтительно использовать способ настоящего изобретения для лечения людей.

Способами настоящего изобретения можно лечить широкий круг аутоиммунных заболеваний. Представительные примеры аутоиммунных заболеваний включают рассеянный склероз, ревматоидные артриты, сахарный диабет, псориаз, органоспецифические аутоиммунные заболевания, хроническую воспалительную демиелинизирующую полирадикулоневропатию и синдром Гийена-Барре.

Настоящее изобретение направлено также на способ уменьшения тяжести или частоты наступления рецидивов рассеянного склероза у людей, который включает стадию перорального введения указанному пациенту интерферона типа 1. Более того, настоящее изобретение направлено также на способ ингибирования приступов аутоиммунного заболевания, который включает стадию перорального введения указанному пациенту интерферона первого типа.

Нижеследующие примеры приведены с целью иллюстрации различных вариантов настоящего изобретения, и настоящее изобретение никоим образом не следует ограничивать экспериментальным аллергическим невритом.

Пример 1 Индуцирование экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита Хронически рецидивирующую форму EAE индуцируют у 7-10 недельных самок мышей SJL/J по способу Brown and McFarlin, Lab.Invest. /1981/ 45:278-284, модифицированному Miller et al., J.Immunol. /1987/ 138:3776-3784. Короче, каждой мыши подкожно вводят в выбритый правый бок 0,3 мл эмульсии, содержащей 1 мг сингенного мышиного гомогената спинного мозга /MSCH/ в 0,15 мл фосфатного буферированного физиологического раствора и 0,03 мг Mycobacterium tuberculoses homines H37Ra /MT/ [Difeo Labs. Detroit M1/ в 0,15 мл неполного адьюванта Фреунда /IFA/. Через семь дней мышам вводят аналогичную инъекцию в левый бок. Начальные клинические признаки заболевания наблюдаются между 13 и 25 днем после иммунизации. Клиническую тяжесть повторяющихся приступов оценивает наблюдатель /вслепую/: 0 = нет признаков заболевания, 1 = минимальная или умеренная слабость задних конечностей; 2 = умеренная слабость задних конечностей или умеренная атаксия; 3 = умеренная до сильной слабость задних конечностей; 4 = сильная слабость задних конечностей до умеренной атаксии; 5 = параплегия при более чем умеренной слабости четырех конечностей; 6 = параплегия при сильной слабости четырех конечностей или сильная атаксия. Животных оценивают вслепую в течение 6-8 недель и кумулятивный еженедельный показатель рассчитывают, усредняя три показателя в неделю /понедельник, среда, пятница/ для каждой группы животных.

Пример 2 Пероральное введение цитокина После начала приступа животным перорально вводят варьирующиеся дозы /1-100 ед./ мышиного природного IFN-/ /Цитоимунный мышиный IFN-/ 4,010⁵ IRU /мл, Lee Biomolecular Research, Inc., San Diego, CA/, или имитатор мышиного IFN-/ /Цитоиммунный менее 2 IRU/мл, Lee Biomolecular Research, Inc., Diego, CA/ полученный идентично IFN-/ за исключением того, что культуры индуцируют имитатором//, используя 2,5 см шприцы с иглами 20 gauge ball point/ Thomas Seientific, Swedesboro NJ/ трижды в неделю /понедельник, среда, пятница/ в течение 6-9 недель. Имитацию интерферона используют в качестве контроля, так как термоденатурированный IFN может сохранять некоторую иммунологическую активность.

Пример 3 Получение основного миелинового протеина морских свинок /GР-МВР/ 20 г спинного мозга морских свинок добавляют к 4,7 мл метанола при -20^oC и гомогенизируют в тканевом гомогенизаторе. Добавляют 9,4 мл хлороформа при -20^oC, гомогенизируют в течение еще 2 минут и перемешивают в течение 60 минут при комнатной температуре; затем еще 60 минут при 4^oC. Полученный материал фильтруют через сложенную вдвое стерильную марлю, через охлажденную воронку Бюхнера и фильтровальную бумагу N 1 Ватман. Тканевую лепешку промывают 20 мл ацетона при -20^oC, и снова суспендируют в 40 мл холодной ddH₂O; затем перемешивают в течение 30 минут при 4^oC, фильтруют второй раз и снова суспендируют в 10 мл холодной ddH₂O. Суспензию обрабатывают ультразвуком для облегчения образования суспензии осадка в ddH₂O; pH суспензии ткань/H₂O доводят до pH 3 за счет 1н. HCl, и перемешивают в течение ночи при 4^oC. После перемешивания в течение ночи pH доводят до 3 и вращают при 10000 g в течение 15 минут при 4^oC. Надосадочную жидкость фильтруют через бумагу N 1 Ватман и жидкий фильтрат сохраняют. pH полученного фильтрата доводят до 9 за счет 10 н. NaOH и перемешивают в течение 60 минут при 4^oC; затем вращают при 10000 g в течение 15 минут при 4^oC. Определяют объем надосадочной жидкости и добавляют сульфат аммония до конечной концентрации 27,7 г/100 мл; надосадочную жидкость перемешивают на холоде в течение 30 минут, а затем вращают при 10000 g в течение 15 минут при 4^oC и снова суспендируют в 1 мл ddH₂O. Повторно суспендированный осадок диализуют в низкомолекулярной /6-8000 MB/ трубке для диализа против ddH₂O. Концентрацию протеина определяют на A₂₈₀ с помощью УФ спектроскопии. Для проверки чистоты препарата миелинового основного протеина приготавливают 7-20% SOS-PACE градиентный гель и окрашивают 0,3 М CuCl₂. Чистота препарата миелинового основного протеина морской свинки /GP-MBP/ продемонстрирована полосой 18 кД.

Пример 4 Препарат клетки лимфатического узла и селезенки Животных умерщвляют через 6-8 недель после начала перорального введения, и удаляют дренирующие паховые узлы и клетки селезенки, и суспензии отдельных клеток получают, протирая через сито из нержавеющей стали с диаметром ячеек 90 меш. Осуществляют лизис эритроцитов в клеточной суспензии селезенки с 2 мл АСК раствора, добавленного к осадку и реакции дают возможность протекать в течение 5 минут при комнатной температуре.

Пример 5 Пролиферация T клеток ин витро Спустя семь дней после клинического рецидива, мышей умерщвляют, дренирующие паховые лимфатические узлы извлекают и культивируют ин витро для определения антиген-специфических T клеточных пролиферативных реакций. Стимуляцию антигеном осуществляют, используя в качестве антигена либо 0 либо 100 мкг/мл /GP-MBP или MT/ и митогенную стимуляцию Con A при 2,5 мкг/мл за счет инкубирования клеток лимфатических узлов при 210 клеток/ячейку в RPM1 /Gibco, Grand Island, NY/, дополненном 10% сывороткой плода теленка /FCS/ Whittaker Bioproducts Walkersville MD/, 1% пируватом натрия /Gibco, Crand, Island, NY /, 1% глутамина "Gibcol/, 1% пенициллин/стрептомицина и 50 мкл 2-меркаптоэтанола). Пластины инкубируют при 5% содержании CO₂ и увлажнении при 37^oC в течение 4 дней. В этот момент клетки обрабатывают 2 мкКи титрированного [³H] dTd и собирают спустя 18 часов с помощью автоматизированного сборника. Захват [³Н] dTd определяют с помощью сцинтилляционного счетчика /жидкостного/ Бекмана. Культивирование ведут в трех параллельных опытах, и полученные результаты выражают как CPM.

Пример 6 Гистология После умерщвления извлекают спинной мозг и иммерсионно фиксируют в 10% нейтральном буферированном формалине минимум в течение двух недель. После фиксации мозг рассекают в горизонтальной плоскости с интервалами примерно 3 мм и обрабатывают парафином. Парафиновые блоки рассекают на 6-8 микрон и поэтапные секции окрашивают гематоксилином и зозином и Luxol-fast blue /PAS/ гематоксилином, и исследуют в оптическом микроскопе. Секции мозга оценивают независимо для определения центров воспаления /слепым методом/, без информации о характере обработки животного до умерщвления. Образцы спинного мозга для каждого животного подготавливают идентичным образом, и определяют количество центров воспаления на секцию / более 20 воспалительных клеток/ в паренхиме.

Пример 7 Анализ цитокинов Клетки селезенки животных, обработанных имитацией или 100 ед. мышиного IFN-/ культивируют с Con A /2,5 мкг/мл/ при 1 10⁶ клеток/мл в 75 см² склянках для культуры тканей в течение 48 часов во влажном инкубаторе с 5% CO₂/95% воздуха при 37^oC. Надосадочную жидкость собирают через 24 и 48 часов после Con A активации, и после центрифугирования замораживают при -70^oC. Содержание интерлейкинов определяют, используя твердофазный ELISA анализ. Анти-IL-2, анти-IL-10 или антиIFN-/Phar Mingen San Diego, CA/ инкубируют на поливиниловых микротитровальных пластинах с 96 ячейками в 0,01М карбонатном буфере /pH 9,6/ в течение ночи при 4^oC. Пластины блокируют 3% BSA в фосфатном буферированном физиологическом растворе в течение 3 часов, 100 мкл надосадочных жидкостей добавляют в различных разбавлениях, которые оттитрованы для линейного участка кривой поглощение/концентрация с трехкратным повторением и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. После того, как пластины пять раз промывают фосфатным буферированным физиологическим раствором Твина /0,05%/, в течение 60 минут добавляют 100 мкл коньюгированных с переоксидазой интерлейкиновых моноклональных антител /с эпитопными детерминантами, отличными от первого антитела, которое было использовано для покрытия поливиниловой пластины/, в концентрации 1:1000. Затем добавляют О-фенилендиаминдигидрохлорид, и поглощение определяют при 450 нм. Получают стандартные кривые для различных количеств различных интерлейкино. Статистический анализ осуществляют, используя т-тест Стьюдента.

Пример 8 Пероральное введение мышиных интерферонов перового типа подавляет клинические признаки заболевания, воспаления и ингибирует пролиферацию, связанную с MBP Пероральное введение 1-10 единиц IFN первого типа оказывает иммунологический эффект, но оказывается неадекватным при давлении клинических рецидивов. Поэтому две группы по шесть иммунизованных SJL/J мышей обрабатывали имитатором IFN или 100 ед. мышиного природного IFN-/ трижды в неделю, начиная с 30 дня после выздоровления после первого приступа. Групповые клинические показатели после первого приступа заметно не отличались для различных групп. Клинические рецидивы наблюдались примерно через 40 дней после инокуляции. Клинические показатели демонстрируют значительные различия в их наступлении для группы, которой перорально вводили имитатор IFN по сравнению с группой, которой, вводили 100 ед. мышиного природного IFN-/ менее 0,03, см. фиг. 1/. Два основных рецидива в группе с имитацией IFN происходят в течение семи недель, причем наблюдается усиленный неврологический дефицит. У группы, которой вводили перорально природный мышиный IFN-/ наблюдался замедленный единичный приступ без остаточного неврологического дефицита. Пероральное введение мышиного природного IFN-/ уменьшает тяжесть и снижает групповой показатель между начальным приступом и рецидивом.

Con A активация клеток дренирующих паховых лимфатических узлов оказывается ингибированной у животных, которым вводили перорально имитацию IFN по сравнению с животными, которым вводили 100 ед. мышиного природного IFN-//88222 срм 1910 по сравнению с 38095 срм 3160/. Клетки лимфатических узлов животных, которым вводили имитацию IFN, тестированные с МВР, вырабатывают интенсивную пролиферативную реакцию, но эта реакция существенно ингибируется у животных, которым вводили мышиный природный IFN-/ /14052 срм 842 против 448 срм 50/.

Для определения того, существует ли ингибирование на другой сенсибилизированный антиген, исследуют антиген-специфическую пролиферацию дренирующих паховых лимфатических узлов на второй сенсибилизированный антиген, Mycobacterium tuberculoses homines /MT/, компонент MSCH иноклюма. Клетки лимфатических узлов животных, которым вводили имитацию IFN, вырабатывают интенсивную пролиферативную реакцию на МТ, но эта реакция существенно снижена у животных, которым вводили мышиный природный IFN-/ /52401 срм 857 против 5214 срм 808/.

Животных исследовали также гистологически через 65 дней после иммунизации. Оказалось, что наблюдается заметно меньше воспалительных центров у группы, которой вводили IFN /0,5 0,1/ по сравнению с контрольной группой, которой вводили имитацию IFN /1,8 1,1/р менее 0,05/. Таким образом, мышиные природные интерфероны первого типа при пероральном введении могут подавлять клинические проявления заболевания, уменьшать воспаления и ингибировать пролиферацию в ответ на MBP и MT.

Пример 9 Подавление рецидивов при пероральном введении IFN-/ коррелируется со снижением IFN- секреции Интенсивность заболевания EAE ассоциируется с IFN- секрецией после Con A стимуляции клеток селезенки. Поэтому объединенные клетки селезенки стимулируют /как для животных, перорально обработанных имитатором IFN /н=5/, так и для перорально обработанных 100 ед. /н= 5/ мышиного IFN-/ Con A /2,5 мкг/мл/ при 110⁶ клеток/мл в течение двух дней, и надосадочные жидкости анализируют в твердофазном ELISA/IL-2, IL-10, IFN- . Пероральное введение IFN-/ последовательно снижает IFN- медиатор воспаления /эксп. 1, имитатор, селезенка 2500 нг/мл 300 против 100 ед., селезенка ^x1100 нг/мл 200; эксп. N 2, имитатор селезенки 2180 нг/мл 100 ед., селезенки против 247 ^x143 нг/мл 13, ^xp менее 0,001 по сравнению с контролем-имитацией IFN/. Наблюдается также снижение IL-2, фактора роста T клеток и увеличение продуцирования IL-10, хотя эти изменения не достигают статистической значимости.

Настоящее изобретение иллюстрирует, что пероральное введение интерферонов первого типа может модифицировать биологическую реакцию CP-EAE при введении после того, как животное выздоравливает после первого приступа. При введении в адекватных дозах, пероральное введение интерферонов типа 1 подавляет клинические рецидивы, снижает воспаления и ингибирует пролиферацию активированных клеток из дренирующих паховых лимфатических узлов, природных участков для высокой частоты активированных T клеток при подкожном введении антигена. Таким образом, интерфероны типа 1 оказываются активными при пероральном способе введения со значительными иммунологическими эффектами в подверженных воздействию иммунных участках. Пероральное введение IFN последовательно снижает Con A индуцированную IFN- секрецию в клетках селезенки. Подавление пролиферации для MBP может происходить даже после промежутка времени 6 недель после инокуляции и спустя 4 недели после начального клинического приступа. Таким образом, пероральное введение цитокинов без защитной матрицы для предотвращения переваривания протеина в ротоглотке и остальной части алиментарного канала способно ингибировать пролиферацию для сенсибилизированных ранее антигенов.

Ослабление установившейся или новой иммунной реакции является важным терапевтическим моментом. Пероральное введение миелиновых антигенов животных может улучшить клиническое течение CR-EAE у крыс и морских свинок и уменьшить патологические изменения на миленовые антигены у CR-EAE. Пероральное введение миелиновых протеинов может понизить тяжесть приступов у мужчин DR2-MS пациентов и частоту MBP специфических клеточных линий у обработанных миелином индивидуумов. Однако в наблюдениях за пациентами и в опытах на животных наблюдается лишь частичное подавление клинических или патологических заболеваний, что дает возможность предположить, что пероральное введение других иммуноактивных веществ может превосходить миелиновые антигены.

Иммуномодуляторный механизм перорального введения интерферона первого типа неизвестен. Модуляторные эффекты Co A активированных лимфоцитов на митогенные реакции клеток нормальных респондеров могут быть аннулированы за счет добавления античеловеческий лейкоцит IFN сыворотки ин витро; это может предотвратить продуцирование ингибирующих факторов, индуцируемых IFN-, например, растворимого супрессора иммунных реакций /SIRS/ и полученного из макрофагов супрессорного фактора . После такой мутагенной стимуляции могут потребоваться периферализованные T клетки для продуцирования интерферона. Однако пероральное введение низких доз IFN- мышaм не приводит к детектиуемым уровням IFN- в крови, в противоположность с внутрибрюшинным введением, его действие не может быть блокировано циркулирующими анти-IFN антителами. Нейтропенический эффект перорально введенного IFN можно заменить инъекцией клеток крови, но не сыворотки, животным-реципиентам. Анализ мРНК цитокинов CNS при EAE предполагает, что IL-2, IL-6 и IFN- повышены при остром заболевании, но в процессе стабилизации симптомов количество этих цитокинов уменьшается при одновременном повышении уровней IL-10, которые могут регулировать Th 1 клетки. Поэтому IFN типа 1 могут быть иммуномодуляторные молекулы, которые индуцируют супрессорные факторы, такие как IL-10, ингибируя реакцию на иммунизованные антигены, такие как MBP и MT.

Итак, пероральное введение таких модификаторов биологических реакций, как интерфероны первого типа, представляющие потенциально нетоксичные, удобные и непрерывные средства, ингибирующие иммунную реакционноспособность. Модификаторы биологических реакций, вводимые перорально, обеспечивают дополнительные средства для лечения аутоиммунных заболеваний.

Пример 10 Индуцирование острого экспериментального аутоиммунного энцифаломиелита. EAE индуцируют у 8-10 недельных самок крыс Льюиса /Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN/, используя эмульсию, содержащую равные части миелинового основного протеина в PBS и п