Перенаправление клеточного иммунитета посредством химерных рецепторов

Перенаправление клеточного иммунитета посредством химерных рецепторов

Реферат

 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Описывается способ направления клеточного ответа у млекопитающих путем экспрессии в клетке млекопитающего двух химерных рецепторов, которые запускают специфическое распознавание и разрушение инифицирующего агента, клетки, инифицированной инфицирующим агентом, опухолевой или раковой клетки, или аутоиммуногенерированной клетки. Один из экспрессируемых химерных рецепторов включает внеклеточный белок, который способен к специфическому распознаванию и связыванию клетки-мишени или агента, инифицирующего мишень, и внутриклеточную или трансмембранную часть, которая способна к передаче сигнала на терапевтическую клетку для разрушения связанной с рецептором клетки-мишени или связанного с рецептором агента, инифицирующего мишень. Второй химерный рецептор включает внеклеточную часть, которая способна к специфическому распознаванию и связыванию клетки-мишени или агента, инифицирующего клетку, и внутриклеточную часть, которая является производной от CD28. Описываются также пары применимых химерных рецепторов, клетки, которые экспрессируют химерные рецепторы, и ДНК, кодирующего химерные рецепторы. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств против опухолевых и инфекционных заболеваний. 7 с. и 23 з.п.ф-лы, 19 ил.

Изобретение относится к функциональным химерам рецептора T-клетки, F_c рецептора или рецептора В клетки, которые способны к перенаправлению функции иммунной системы. Более конкретно, оно относится к регуляции лимфоцитов, макрофагов, природных киллерных клеток или гранулоцитов путем экспрессии в указанных клетках химер, которые заставляют клетки отвечать на мишени, распознаваемые химерами. Изобретение относится также к функциональным химерам рецептора T клеток, F_c рецептора или рецептора В клетки, которые способны к направлению терапевтических клеток на специфическое распознавание и разрушение как клеток, инфицированных специфическим инфицирующим агентом, самого инфицирующего агента, опухолевой клетки, так и аутоиммунно-генерированной клетки. Более конкретно, изобретение относится к продукции химер рецептора T клетки, F_c рецептора или рецептора В клетки, способных к специфическому распознаванию и лизису клеток, экспрессирующих белки оболочки ВИЧ. Таким образом, изобретение описывает лечение заболеваний, таких как СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита), который вызывается вирусом ВИЧ.

Распознавание T клеткой антигена при помощи рецептора T клетки является основой в ряду иммунологического феномена. T клетки направляют то, что называется опосредованным клеточным иммунитетом. Это включает разрушение клетками иммунной системы чужеродных тканей или инфицированных клеток. Существует разнообразие T клеток, включая "хелперные" и "супрессорные" клетки, которые моделируют иммунный ответ, цитотоксические (или "киллерные") клетки, которые могут непосредственно убивать аномальные клетки.

T клетка, которая распознает и связывает уникальный антиген, проявляемый на поверхности другой клетки, становится активированной; она может затем размножиться и, если она является цитотоксической клеткой, она может убивать связанную клетку.

Аутоиммунное заболевание характеризуется продукцией как антител, которые реагируют с тканью хозяина, так и иммунных эффекторных T клеток, которые являются аутореактивными. В некоторых случаях аутоантитела могут появляться в результате обычного T- и B-клеточного ответа, активированные посредством чужеродных веществ или организмов, которые содержат антигены, которые имеют перекрестную реакцию с близкими соединениями в тканях организма. Примерами клинически родственных аутоантител являются антитела против рецепторов ацетилхолина при миастении гревис; и анти-ДНК, анти-эритроцитарные, и анти-тромбоцитарные антитела при системной эритроматозной волчанке.

ВИЧ и иммунопатогенез В 1984 г. было показано, что ВИЧ является этиологическим агентом СПИДа. С того времени определение СПИДа было пересмотрено несколько раз по отношению к критерию, который должен быть включен в диагноз. Однако, несмотря на разброс диагностических параметров, простое общее определение представляет СПИД как инфекцию ВИЧ и последующее развитие стойких конституциональных симптомов и определяемых СПИДом заболеваний, таких как вторичные инфекции, новообразования и неврологическое заболевание. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12^th ed., McGraw Hill (1991).

ВИЧ является ретровирусом человека группы лентивирусов. Четыре различных ретровируса человека принадлежат к двум различным группам: HTLV-1, HTLV-2 и вирусам иммунодефицита ВИЧ-1, ВИЧ-2. Первые являются трансформирующими вирусами, тогда как вторые являются цитопатическими вирусами.

ВИЧ-1 идентифицирован как наиболее распространенная причина СПИДа во всем мире. Гомология последовательности между ВИЧ-2 и ВИЧ-1 составляет около 40%, при этом ВИЧ-2 более близок к некоторым членам группы вирусов иммунодефицита обезьян (BИО= SlV). См. , Curran et al., Science 329: 1357-1359 (1985); Weiss et al., Nature 324: 572-575 (1986).

ВИЧ имеет обычные ретровирусные гены (env, gag и pol), а также шесть дополнительных генов, участвующих в репликации и других биологических активностях вируса. Как ранее установлено, общим проявлением СПИДа является выраженная иммуносупрессия, преимущественно опосредованного клеточного иммунитета. Это подавление иммунитета приводит к различным сопутствующим заболеваниям, в частности, к некоторым инфекционным заболеваниям и новообразованиям.

Было показано, что основной причиной иммунного поражения при СПИДе является количественный и качественный дефицит у субъекта тимусных (T) лимфоцитов популяции T4. Эта популяция клеток фенотипически определяется по наличию на поверхности молекулы CD4, которая, как было показано, является клеточным рецептором для ВИЧ. Dalgieish et al., Nature 312: 763 (1984). Хотя T4 клетка является основным клеточным типом, инфицируемым ВИЧ, по существу любая клетка человека, которая экспрессирует молекулу CD4 на своей поверхности, способна к связыванию и инфицированию ВИЧ.

По традиции CD⁺ T клеткам приписывают роль хелперов/индукторов, отмечая их функцию в проведении активирующего сигнала к B клеткам, или индукции T лимфоцитов, несущих реципрокный CD8 маркер, для превращения в цитотоксические/супрессорные клетки. Reinherz and Schlossman, Cell 19: 821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68: 5-42 (1982).

ВИЧ связывается специфически и с высоким сродством через последовательность аминокислот в вирусной оболочке (gp120) с частью VI области молекулы CD4, расположенной около N-конца. После связывания вирус сливается с мембраной клетки-мишени и интернализуется. Будучи интернализованным, вирус использует фермент обратную транскриптазу для транскрипции своей геномной РНК в ДНК, которая интегрируется в клеточную ДНК, где она существует в течение жизни клетки в виде "провируса".

Провирус может сохраняться латентным или быть активированным для транскрипции мРНК и геномной РНК, ведущей к синтезу белка, сборке, образованию нового вириона и проникновения вируса через клеточную поверхность. Хотя точный механизм, посредством которого вирус индуцирует гибель клетки не установлен, предполагается, что основным механизмом является массивный выход вируса через клеточную поверхность, приводя к разрушению плазматической мембраны и вызывая нарушение осмотического равновесия.

В течение инфекции организм хозяина вырабатывает антитела против вирусных белков, включая основные гликопротеины оболочки gp120 и gp41. Вопреки гуморальному иммунитету заболевание прогрессирует, приводя к летальному подавлению иммунитета, характеризующемуся многочисленными сопутствующими инфекциями, паразитарными заболеваниями, слабоумием и смертью. Неспособность антивирусных антител хозяина остановить развитие заболевания представляется одним из наиболее вызывающих беспокойство и тревогу аспектов инфекции, предсказательно слабыми для попыток вакцинации, основанных на обычных подходах.

Два фактора могут играть роль в эффективности гуморального ответа на вирусы иммунодефицита. Во-первых, подобно другим РНК-содержащим вирусам (и в частности, подобно ретровирусам) вирусы иммунодефицита проявляют высокую степень мутаций в ответ на иммунный контроль хозяина. Во-вторых, гликопротеины оболочки сами по себе являются интенсивно гликозилированными молекулами, представляющими несколько эпитопов, подходящих для высокоаффинного связывания антител. Слабая антигенная мишень, которую представляет вирусная оболочка, позволяет хозяину немного возможностей противостоять вирусной инфекции путем выработки специфических антител.

Клетки, инфицированные вирусом ВИЧ, экспрессируют гликопротеин gp120 на своей поверхности. Gp120 опосредует процесс слияния среди клеток CD⁺ посредством реакции, близкой к той, которая опосредует проникновение вируса в неинфицированные клетки, приводя к образованию короткоживущих многоядерных гигантских клеток. Образование синтиция зависит от непосредственного взаимодействия гликопротеина оболочки gp120 с белком CD4. Dalgleish et al., выше; Klatzman et al., Nature 312:763 (1984): McDougal et al., Science 231:382 (1986); Sodroski et al., Nature 322:470 (1986); Lifson et al., Nature 323: 725 (1986); Sodroski et al., Nature 321:412 (1986).

Доказательством того, что связывание CD4-gpl20 является ответственным за вирусную инфекцию клеток, несущих антиген CD4, включает обнаружение того, что образуется специфический комплекс между gp120 и CD4 (McDougal et al., выше). Другие исследователи показали, что линии клеток, которые не инфицируются ВИЧ, переводятся в инфицируемые линии клеток после трансфекции и экспрессии к ДНК гена CD4 человека. Maddon et al., Cell 46: 333-348 (1986).

Многими группами были предложены и успешно продемонстрированы in vitro терапевтические программы, основанные на растворимом CD4 в качестве пассивного агента для помехи при вирусной адсорбции и опосредованной синцитием клеточной трансмиссии (Deen et al., Nature 331:82-84 (1988); Fisher et al., Nature 331: 76-78 (1988); Hussey et al., Nature 331: 78-81 (1988); Smith et al. , Science 238: 1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988)) и затем были разработаны белки слияния CD4-иммуноглобулин с увеличенной продолжительностью полужизни и умеренной биологической активностью (Capon et al., Nature 337: 525- 531 (1989); Traunecker et al., Nature 339: 68-70 (1989); Byrn et al., Nature 344: 667-670 (1990); Zettleissl et al., DNA Cell Biol., 9:347-353 (1990)). Хотя конъюгаты CD4-иммунотоксин или белки слияния проявляют эффективную цитотоксичность по отношению к инфицированным клеткам in vitro (Chaudhary et al., Nature 335: 369-372 (1988); Till et al., Science 242: 1166-1168 (1988)), латентность синдрома иммунодефицита делает ее маловероятной, поскольку любое одноразовое лечение будет эффективным в устранении вирусоносительства, а антигенность чужеродных белков слияния очевидно будет ограничивать их применимость для требуемого лечения повторными дозами. Испытания на обезьянах, зараженных SIV, показали что растворимый CD4, если введение животным не сопровождается заметной CD4 цитопенией, может понижать титр SIV и увеличивать показатели миелоидного потенциала in vitro (Watanabe et al., Nature 337: 267-270 (1989)). Однако, наблюдалось быстрое появление вируса после преходящего лечения, предполагая, что введение может быть необходимым в течение всей жизни для предотвращения ослабления иммунной системы.

T клетки и F_c рецепторы Экспрессия на поверхности клетки наиболее распространенного вида антигена рецептора T клетки (TCR) требует совместной экспрессии, по крайней мере, 6 раздельных полипептидных цепей (Weiss et al., J. Exp. Med. 160: 1284-1299 (1984); Orloffhashi et al., Nature 316: 606-609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem. 263: 8528-8536 (1988); Sussman et al., Cell 52: 85-95 (1988)), / цепи связывания антигена, три полипептида CD3 комплекса и . Если любая из цепей отсутствует, то нет уверенности в стабильной экспрессии оставшихся членов комплекса. является лимитирующим полипептидом для экспрессии на поверхности полного комплекса (Sussman et al., Cell 52: 85-95 (1988)), и предполагается, что он опосредует, по крайней мере, часть программ клеточной активации, запускаемой при распознавании лиганда рецептором (Weissman et al. , EMBO J. 8:3651-3656 (1989); Frank et al., Science 249: 174-177 (1990)). Интегральный мембранный гомодимер (зета) I типа 32 kDa имеет внеклеточный домен из 9 остатков при отсутствии сайтов для N-связанного присоединения гликана и внутриклеточный домен из 112 остатков (мышь) или из 113 остатков (человек) (Weissman et al., Science 238:1018-1020 (1988); Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9709-9713 (1988)). Изоформа , называемая (эта) (Baniyash et al., J.Biol. Chem. 263: 9874-9878 (1988); Orloff et al., J.Biol. Chem. 264: 14812-14817 (1989)), которая возникает из альтернативного пути сплайсинга мРНК (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)), присутствует в пониженном количестве в клетке, экспрессирующей рецептор антигена. Предполагается, что - гетеродимеры опосредуют образование инозитолфосфатов, а также рецептор-опосредуемую запрограммированную гибель клетки, называемую апоптозом (Mercep et al., Science 242:571-574 (1988); Mercep et al., Science 246:1162-1165 (1989)).

Подобно и , в клеточных поверхностных комплексах экспрессируется ассоциирующаяся с F_c рецептором (гамма) цепь с дополнительными полипептидами, некоторые из которых опосредуют распознавание лиганда, и другие из них имеют неопределенную функцию, обладает гетеродимерной структурой и в общей организации очень близка к и является компонентом высокоаффинного F_cRI IgE рецептора у тучных клеток и базофилов, который, по крайней мере, состоит из трех различных полипептидных цепей (Blank et al., Nature 337: 187-189 (1989); Ra et al., Nature 241: 752-754 (1989)) и одного из низкоаффинных рецепторов для lgG, представленного у мышей F_cRII (Ra et al., J. Biol. Chem. 264: 15323-15327 (1989)), и у человека подтипом CD16, экспрессируемого макрофагами и природными киллерными клетками - CD16_TM (CD16 трансмембранный) (Lanier et al. , Nature 342: 803-805 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990)) и полипептидом неопределенной функции (Anderson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990). Недавно было сообщено, что экспрессируется линией T клеток мыши CTL, у которой он образует гомодимеры, а также - и - гетеродимеры (Orloff et al., Nature 347: 189-191 (1990)).

F_c рецепторы опосредуют фагоцитоз иммунного комплекса, трансцитоз и зависящую от антитела клеточную цитотоксичность (ADCC) (Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Unkeless et al., Annu. Rev. Immunol. 6: 251-281 (1988); и Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). Недавно было показано, что одна из изоформ низкоаффинного F_c рецептора мыши F_cRIIB1 опосредует интернализацию покрытых Ig мишеней в покрытые клатрином ямки, и что другой низкоаффинный рецептор F_cRIIIA опосредует ADCC посредством их ассоциации с одним или несколькими членами небольшой семьи "триггерных молекул" (Miettinen et al., Cell 58: 317-327 (1989); и Hunziker and Mellman, J. Cell. Biol. 109:3291-3302 (1989)). Эти триггерные молекулы, цепь рецептора T клетки, цепь TCR, цепь F_c рецептора взаимодействуют с доменами распознавания лиганда рецепторов различных иммунных систем и могут автономно инициировать клеточные эффекторные программы, включая цитолиз, последующую агрегацию (Samelson et al., Cell 43: 223-231 (1985); Weissman et al., Science 239: 1018-1020 (1988); Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 3319-3323 (1990); Blank et al., Nature 337: 187-189 (1989); Lanier et al., Nature 342: 803-805 (1989); Kurosaki and Ravetch, Nature 342: 805-807 (1989); Hibbs et al., Science 246: 1608-1611 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990) и lrvin and Weiss, Cell 64: 891-901 (1991)).

Однако в нарисованных параллелях между семействами низкоаффинных F_c рецепторов мыши и человека становится ясно, что изоформы F_cRIIA и C не имеют двойника у мыши. Частично поэтому их функция еще не определена.

Поскольку гуморальные агенты, основанные только на CD4, могут иметь ограниченное применение in vivo, предыдущая работа исследовала возможность усиления клеточного иммунитета к ВИЧ. Было описано получение химерного белка, у которого внеклеточный домен CD4 слит с трансмембранным и/или внутриклеточным доменами рецептора T клетки, F_c рецептором IgG или элементами передачи сигнала В клетки (U.S.S.N/07/847566 и 07/665961 включены здесь в качестве ссылки). Цитотоксические T клетки, экспрессирующие химеры, которые включают внеклеточный домен CD4, показывают эффективное МНС-зависимое разрушение клеточных мишеней, экспрессирующих белки оболочки BИЧ. Особенно важным и новым компонентом данного подхода была идентификация единичного рецептора T клетки, F_c рецептора и рецепторных цепей B клетки, агрегация которых достаточна для инициации клеточного ответа.

Одним из конкретно применимых приложений настоящего подхода было изобретение химер между CD4 и , или , которые направляют цитолитические T лимфоциты на распознавание и уничтожение клеток, экспрессирующих gp120 ВИЧ (U.S. S.N/07/847566 и 07/665961, включенные в качестве ссылки).

Несмотря на то, что по своей сути рецепторы T клетки, В клетки и F_c рецептор являются или могут быть чрезвычайно сложными многомерными структурами, не приспособленными к удобным манипуляциям, настоящее изобретение демонстрирует свойство способности создания химер между внутриклеточным доменом любой из различных молекул, которые способны удовлетворить задаче распознавания мишени. В частности, образование химер, состоящих из внутриклеточной части цепей рецептора T клетки/F_c рецептора зета, эта или гамма, соединенных с внеклеточной частью подходящим образом сконструированной молекулы антитела позволяет потенциалу распознавания мишени иммунной системы клетки быть специфически направленным на антиген, распознаваемый внеклеточной частью антитела. Таким образом, обладая частью антитела, способной к распознаванию некоторой детерминанты на поверхности патогена, иммунная система клеток, вооруженная химерой, будет отвечать на наличие патогена, соответственно эффекторной программе ее дифференцировки, например, T хелперные лимфоциты будут отвечать посредством цитотоксической активности в отношении мишени, а B лимфоциты будут активированы для синтеза антитела. Макрофаги и гранулоциты будут осуществлять свои эффекторные программы, включая выделение цитокина, фагоцитоз и генерирование активного кислорода. Аналогично, имея часть антитела, способную к распознаванию опухолевых клеток, реакция иммунной системы на опухоль будет благотворно повышенной. Обладая антителом, способным к распознаванию, иммунные клетки, имеющие неподходящую реактивность по своим детерминантам, аутореактивные клетки могут быть избирательно нацелены на уничтожение.

Несмотря на эти примеры, описывающие использование химерных антител в качестве удобного демонстрационного инструмента, изобретение не ограничивается в объеме химерными антителами, и конечно, использование специфических внеклеточных доменов не антител может иметь важные преимущества. Например, имея внеклеточную часть, которая является рецептором для вируса, бактерии или паразита, клетки, вооруженные химерами, будут специфически выбирать клетки, экспрессирующие вирусную, бактериальную или паразитарную детерминанты. Преимуществом этого подхода перед использованием антител является то, что естественный рецептор для патогена может иметь уникально высокую селективность или аффинность по отношению к патогену, позволяющую большую степень точности в конечном ответе иммунной системы. Аналогично, удаление клеток иммунной системы, которые неподходящим образом реагируют с собственным антигеном, это может быть достаточным для присоединения антигена (либо в виде интактного белка, в случае обедняющей терапии по B клетке, либо в виде МНС комплекса, в случае обедняющей терапии по T клетке) к внеклеточным цепям зета, эта или гамма, и посредством этого воздействовать на специфическое нацеливание клеток, неправильно реагирующих на собственные детерминанты.

Другим использованием химер является регуляция клеточных популяций in vivo последовательно с другими видами генетической инженерии. Например, предлагается использование проникающих в опухоль лимфоцитов или природных киллерных клеток для внесения цитоксических начал в участок опухоли. Настоящее изобретение описывает удобное приспособление для регуляции количества и активности таких лимфоцитов и клеток без удаления их из тела пациента для амплификации in vitro. Таким образом, поскольку внутриклеточные домены химерных рецепторов опосредуют пролиферативный ответ клеток, координация внеклеточных доменов посредством различных агрегационных стимулов, специфических для внеклеточных доменов (например, антител, специфических по отношению к внеклеточному домену), будет приводить к пролиферации клеток, несущих химеры.

Хотя специфические осуществления настоящего изобретения включают химеры между зета, эта или гамма цепями, или их активными фрагментами (например, обсуждаемыми ниже), любой рецепторной цепью, имеющей близкую функцию с этими молекулами, например, у гранулоцитов или В лимфоцитов, могут быть использованы в целях, описанных здесь. Отличительные черты желаемых триггерных молекул иммунной клетки включают способность сливаться с внеклеточным доменом таким образом, чтобы полученная химера присутствовала на поверхности терапевтической клетки, и способность инициировать клеточные эффекторные программы после имевшей место вторичной агрегации с лигандом-мишенью.

В настоящее время наиболее удобным способом доставки химер к клеткам иммунной системы является генетическая терапия в некоторых видах. Однако перенастройка клеток иммунной системы химерными рецепторами путем смешивания клеток с подходящим солюбилизированным очищенным химерным белком будет также приводить к образованию популяции сконструированных клеток, способных к ответу на мишени, распознаваемые посредством внеклеточного домена химер. Подобные подходы были использованы, например, для введения интактного CD4 рецептора для BИЧ в эритроциты в терапевтических целях. В этом случае сконструированная клеточная популяция не будет способна к самообновлению.

Настоящее изобретение относится к функциональным упрощенным химерам рецептора T клетки, рецептора B клетки и _c рецептора, которые способны к перенастройке функции иммунной системы. Более конкретно, оно относится к регуляции лимфоцитов, макрофагов, природных киллерных клеток или гранулоцитов путем экспрессии в указанных клетках химер, которые направляют клетки реагировать на мишени, распознаваемые химерами. Изобретение относится также к способу направления клеточных ответов на инфицирующий агент, раковую или канцерогенную клетку или на аутоиммуногенерированную клетку. Способ направления клеточного ответа у млекопитающих включает введение эффективного количества терапевтических клеток указанному животному, указанные клетки являются способными к распознаванию и разрушению указанного инфекционного агента, опухоли, раковой клетки или аутоиммуногенерированной клетки. Клеточный ответ может быть опосредован единой рецепторной химерой или может быть результатом взаимодействия между многими химерами (например, набором из двух или нескольких химер, одна из которых включает внутриклеточный домен CD28). Соответственно, изобретение включает использование этих клеток, экспрессирующих химерные рецепторы для получения лекарственного препарата для лечения заболевания (как описано выше).

В другом осуществлении способ направления клеточного ответа на инфекционный агент включает введение терапевтических клеток, способных к распознаванию и разрушению указанного агента, где агентом является специфический вирус, бактерия, простейшее или грибок. Еще более специфически способ разрабатывается против агентов, таких как ВИЧ и Р neumocystis carinii.

В особенности, изобретение описывает способ направления клеточного ответа на инфицированную ВИЧ клетку. Способ включает введение пациенту эффективного количества цитотоксических T лимфоцитов, указанные лимфоциты являются способными к специфическому распознаванию и лизису клеток, инфицированных ВИЧ, а также циркулирующего вируса.

Таким образом, в одном осуществлении, в соответствии с изобретением описан способ направления клеточного ответа на клетки, инфицированные ВИЧ, включающий введение пациенту эффективного количества цитотоксических T лимфоцитов, которые способны специфически распознавать и лизировать клетки, инфицированные ВИЧ.

В еще другом осуществлении описываются химерные рецепторные белки, которые направляют цитотоксические T лимфоциты для распознавания и лизиса инфицированной ВИЧ клетки. Еще другое осуществление изобретения включает клетки-хозяева, трансформированные вектором, содержащим химерные рецепторы.

В еще другом осуществлении настоящее изобретение описывает антитело против химерных рецепторов по изобретению.

Для того чтобы получить цитотоксические T лимфоциты, которые специфически связывают и лизируют клетки, инфицированные ВИЧ, изобретатели настоящего изобретения, таким образом, попытались и описали здесь рецепторные химеры. Эти рецепторные химеры являются функционально активными и проявляют экстраординарные способности специфического связывания и лизиса клеток, экспрессирующих gp120.

Это является предметом настоящего изобретения, далее описывается способ лечения индивидуумов, инфицированных ВИЧ. Таким образом, настоящее изобретение описывает многие важные преимущества в лечении СПИДа.

Эти и другие не ограничивающие осуществления по настоящему изобретению будут очевидны для квалифицированного специалиста из последующего подробного описания изобретения.

В следующем подробном описании будут сделаны ссылки на различные методологические приемы, известные квалифицированному специалисту в области молекулярной биологии и иммунологии. Публикации и другие материалы, устанавливающие подобные известные методологические приемы, на которые сделаны ссылки, включаются здесь в качестве полных ссылок, как было установлено.

Стандартные ссылки на работы, устанавливающие общие принципы технологии рекомбинантной ДНК, включают Watson et al., Molecular Biology of Gene, том I и II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc. , publisher. New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, publishers, Berkley, CA (1985); Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, ^nd edition. University of California Press, publisher, Berkley, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989) и Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989).

ОПРЕДЕЛЕНИЯ "Клонирование" обозначает использование in vitro рекомбинантной техники для введения конкретного гена или другой последовательности ДНК в молекулу вектора. Для успешного клонирования желаемого гена необходимо использовать способы получения фрагментов ДНК для соединения с фрагментами молекул вектора, для введения составленной молекулы ДНК в клетку хозяина, в которой он будет реплицироваться, и для отбора клона среди клеток реципиентов хозяина, обладающего геном мишенью.

"кДНК" обозначает комплементарную или копию ДНК, полученную из матрицы РНК путем воздействия РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Следовательно, "клон кДНК" обозначает дуплекс последовательности ДНК, комплементарной к интересующей молекуле РНК, переносимый вектором клонирования.

"Библиотека кДНК" обозначает коллекцию молекул рекомбинантной ДНК, содержащей вставки кДНК, которые содержат ДНКовые копии мРНК, экспрессируемые клеткой ко времени, когда получена библиотека кДНК. Подобная библиотека кДНК может быть получена методиками, известными специалистам и описанными, например, у Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, см. выше. Обычно сначала выделяется РНК из клетки организма, геном которого содержит желаемый клон конкретного гена. Для этой цели предпочтительным является млекопитающее, в частности, линии клеток лимфоцитов человека. Настоящим предпочтительным вектором для этой цели является штамм WR вируса осповакцины.

"Вектор" обозначает молекулу ДНК, происходящую, например, из плазмиды, бактериофага или вируса млекопитающего или насекомого. Вектор будет содержать один или несколько особенных сайтов рестрикции и может быть способен к автономной репликации у определенного хозяина или организма носителя таким образом, чтобы клонируемая последовательность являлась репродуцибельной. Таким образом, "вектор экспрессии ДНК" обозначает любой элемент, способный направлять синтез рекомбинантного пептида. Такиe векторы экспрессии ДНК включают бактериальные плазмиды и фаги, и плазмиды млекопитающих и насекомых, и вирусы.

"Чистое по существу" относится к соединению, например, белку, полипептиду или антителу, которое является по существу чистым от компонентов, которые естественно сопутствуют ему. В целом соединение является по существу чистым, если в образце содержится интересующего соединения, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере, 75%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% от общего материала. Чистоту можно измерить при помощи подходящего способа, например, хроматографией на колонке, электрофорезом на полиакриламидном геле или путем ЖХВР анализа. В этом контексте "по существу чистая" нуклеиновая кислота обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, сегмент или фрагмент, который не является непосредственно примыкающим к (то есть, ковалентно присоединенным к) обеим из кодирующих последовательностей, с которыми он непосредственно соседствует (то есть к одной по 5' концу и к одной по 3' концу) в природно имеющемся геноме организма, от которого происходит ДНК по изобретению.

"Функциональное производное" обозначает "фрагмент", "вариант", "аналог" или "химическое производное" молекулы. "Фрагмент" молекулы, такой как любая из последовательностей ДНК, по настоящему изобретению относится к обозначению любого нуклеотидного поднабора молекулы. "Вариант" такой молекулы относится к обозначению встречающейся в природе молекулы, по существу, сходной с полной молекулой или ее фрагментом. "Аналог" молекулы относится к обозначению не встречающейся в природе молекулы, по существу, сходной с полной молекулой или ее фрагментом. Указанная молекула является "по существу сходной" с другой молекулой, если последовательность аминокислот обеих молекул является по существу одинаковой. В частности, "по существу сходная" является последовательность аминокислот, которая имеет, по крайней мере, 50%, предпочтительно, 85% и, наиболее предпочтительно, 95% идентичности с природной или референс-последовательностью и/или последовательностью, которая отличается от природной или референс-аминокислотной последовательности только консервативными аминокислотными заменами. По существу сходная аминокислотная последовательность обладает сходной биологической активностью. Таким образом, описано, что если две молекулы имеют сходную активность, то предполагается, что они являются вариантами, согласно используемому здесь термину, даже если одна из молекул содержит дополнительные или менее аминокислотных остатков, не обнаруженных в другой, или если последовательность аминокислотных остатков не является идентичной. Как здесь использовано, указанная молекула является "химическим производным" другой молекулы, если она содержит дополнительные химические радикалы, не являющиеся обычно частью молекулы. Такие радикалы могут улучшать растворимость, адсорбцию, биологическое время полужизни молекулы и т.п. Радикалы могут альтернативно снижать токсичность молекулы, устранять или ослаблять нежелаемые побочные эффекты молекулы и т.п. Радикалы способны опосредовать такие описанные эффекты, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980).

Аналогично, "функциональное производное" гена рецепторной химеры по настоящему изобретению включает обозначение "фрагменты", "варианты" или "аналоги" гена, который может быть "по существу сходным" с нуклеотидной последовательностью и который кодирует молекулу, проявляющую сходную активность с рецепторной химерой, например T клетки, В клетки или рецепторной химерой F_c. "По существу сходные" нуклеиновые кислоты кодируют по существу сходные последовательности аминокислот и также могут включать любую последовательность нуклеиновой кислоты, способную к гибридизации с последовательностью нуклеиновой кислоты дикого типа в подходящих условиях для гибридизации (см., например, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989) для условий гибридизации подходящей жесткости).

Таким образом, как использовано здесь, белок рецепторной химеры T клетки, В клетки или F_c включает обозначение любых функциональных производных, фрагментов, аналогов или химических производных, которые могут быть по существу сходными с химерой "дикого типа" и которые проявляют сходную активность (то есть, наиболее предпочтительно, 90%, более предпочтительно, 70%, предпочтительно, 40%, или, по крайней мере, 10% активности рецепторной химеры дикого типа). Активность функционального производного рецепторной химеры включает специфическое связывание (его внеклеточной части) с агентом мишенью или клеткой и конечное разрушение (направляемое его внутриклеточной или трансмембранной частью) того агента или клетки; такая активность может быть определена, например, путем использования любого из исследований, описанных здесь.

Последовательности ДНК, кодирующую рецепторную химеру T клетки, В клетки или F_c по настоящему изобретению, или ее функциональное производное может быть рекомбинировано с вектором ДНК в соответствии с общепринятыми способами, включая окончания для лигирования с "затупленными" или "расшатанными" дефосфорилированными концами, расщепление ферментом рестрикции для обеспечения подходящих концов, получение связывающих концов при подходящей обработке щелочной фосфатазой, чтобы избежать получения нежелательного соединения, и лигирование подходящими лигазами. Способы для подобного манипулирования описаны у Maniatis et al., выше и хорошо известны в технике.

Указанная молекула нуклеиновой кислоты, такая как ДНК, "способна к экспрессии" полипептида, если он содержит последовательности нуклеотидов, которые содержат транскрипционную или трансляционную регуляторную информацию, и такие последовательности являются "оперативно примыкающими" к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют полипептид. Оперативное примыкание является примыканием, в котором регуляторные последовательности ДНК и последовательности ДНК, предполагаемые к экспрессии, состыкованы таким образом, чтобы позволять экспрессию гена. Точная природа регуляторных областей, требующихся для экспрессии гена, может отличаться от организма к организму, но будет в целом включать промоторную область, которая содержит у прокариотов промотор (который направляет инициацию транскрипции РНК), а также последовательности ДНК, которые, при транскрипции в РНК, будут давать сигнал инициации синтеза белка. Такие области обычно будут включать те 5'-некодирующие последовательности, участвующие в инициации транскрипции и трансляции, такие как ТАТА-бокс кэппированную последовательность, последовательность СААТ и подобные.

Если требуется, некодирующая 3'-область у последовательности гена, кодирующей белок, может быть получена путем вышеописанных способов. Эта область может быть сохранена для своих транскрипционных терминирующих регуляторных последовательностей, таких как терминация и полиаденилирование. Таким образом, путем сохранения 3'-области, естественно примыкающей к последовательности ДНК, кодирующей белок, могут быть обеспечены транс