2,3-трансдизамещенное тропановое производное, способ его получения, фармацевтическая композиция

2,3-трансдизамещенное тропановое производное, способ его получения, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Описывается новое 2,3-трансдизамещенное тропановое производное общей формулы I или любая их смесь, или их фармацевтически приемлемая соль, где R представляет собой водород, метил, этил или пропил; R³ представляет собой -CH₂-X-R', где Х представляет собой О или S, а R' представляет собой метил, этил, пропил или циклопропилметил; и R⁴ представляет собой фенил, который может быть замещен один или более чем один раз заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, CF₃ и CN. Новые тропановые производные представляют собой сильные ингибиторы обратного захвата нейромедиаторных моноаминов, то есть дофамина, серотонина и норадреналина, и к применению новых тропановых производных для лечения расстройств или заболеваний, на которые влияет ингибирование обратного захвата нейромедиаторных моноаминов, таких как болезнь Паркинсона, депрессия, обсессивно-компульсивные расстройства, панические состояния, деменция, нарушения памяти, гиперактивность при дефиците внимания, ожирение, состояние тревоги, нарушения аппетита и токсикомания или злоупотребление кокаином. Описывается также способ получения соединений формулы I и фармацевтическая композиция на их основе. 4 с. и 7 з. п.ф-лы, 5 табл.

Изобретение относится к новым тропановым производным, которые представляют собой сильные ингибиторы обратного захвата нейромедиаторных моноаминов, то есть дофамина, серотонина и норадреналина, и к применению новых тропановых производных для лечения расстройств или заболеваний, на которые влияет ингибирование обратного захвата нейромедиаторных моноаминов, таких как болезнь Паркинсона, депрессия, обсессивно-компульсивные расстройства, панические состояния, деменция, нарушения памяти, гиперактивность при дефиците внимания, ожирение, состояние тревоги, нарушения аппетита и токсикомания или злоупотребление лекарственными средствами, включая злоупотребление кокаином.

Мозг состоит из множества нейронов, которые контактируют друг с другом через химические переносчики. Каждый нейрон генерирует нейрохимические вещества, или нейромедиаторы, которые действуют по сайтам на клеточной мембране нейрона, относящимся к рецепторам. Одна из групп нейромедиаторов, которая относится к нейромедиаторным моноаминам, включает в себя серотонин, дофамин и норадреналин.

Нейромедиаторные моноамины высвобождаются в синаптическую щель между нейронами, чтобы стимулировать активность постсинаптического рецептора. Удаление (или инактивация) нейромедиаторных моноаминов осуществляется главным образом по механизму обратного захвата в пресинаптические окончания. При ингибировании обратного захвата имеет место усиление физиологической активности нейромедиаторных моноаминов.

Показано, что серотонэргическая невральная система мозга влияет на разнообразные физиологические функции, и предсказывают, что соединения, обладающие ингибирующей обратный захват серотонина активностью, способны лечить у млекопитающих, включая человека, разнообразные расстройства, связанные с этой невральной системой, например нарушения аппетита, депрессию, обсессивно-компульсивные расстройства, панические состояния, алкоголизм, боль, нарушения памяти и состояние тревоги. В эту группу заболеваний входят расстройства, связанные с депрессией, такие как псевдодеменция или синдром Ганзера, мигрень, булимия, ожирение, предменструальный синдром или синдром поздней лютеиновой фазы, табачная зависимость, паническое состояние, посттравматический синдром, потеря памяти, деменция старения, комплекс деменции синдрома приобретенного иммунодефицита, нарушение памяти при старении, социальная фобия, гиперактивность при дефиците внимания, синдром хронического утомления, преждевременная эякуляция, затруднение эрекции, нервная анорексия, нарушения сна, аутизм, мутизм или трихотилломания.

Патофизиология основного эмоционального нарушения недостаточно понята, и предполагалось, что в патогенез основной депрессии вовлечено несколько нейромедиаторов.

Смешанные ингибиторы обратного захвата норадреналина и серотонина, такие как Имипрамин и Амитриптилин, и ингибиторы обратного захвата норадреналина, такие как Дезипрамин, Нортриптилин и Протриптилин, представляют собой современные фармацевтические препараты, применяемые в антидепрессантной терапии. Более того, несколько серий предклинических и клинических данных указывают на то, что повышение серотонин-опосредованной нейротрансмиссии, возможно, лежит в основе терапевтического эффекта большинства лекарственных средств прошлого и современных лекарственных средств, применяемых в антидепрессантной терапии: Флуоксетина, Циталопрама и Пароксетина.

Парадоксальные современные ингибиторы обратного захвата серотонина ингибируют переносчик серотонина в течение минут, тогда как их антидепрессантный эффект в полной мере наблюдается лишь через три-четыре недели лечения, что указывает на то, что ингибирование обратного захвата per se не ответственно за антидепрессантный ответ, а скорее дальнейшие адаптивные изменения лежат в основе терапевтического эффекта и/или вносят вклад в него. Считается, что запоздалое проявление антидепрессантного эффекта является серьезным недостатком современных ингибиторов обратного захвата моноаминов.

Считают, что сильная ингибиторная активность обратного захвата дофамина связана с риском нежелательных центрально-стимулирующих эффектов. С другой стороны, полагают, что активирующее воздействие на мезолимбическую дофаминовую систему лежит в основе общего механизма современного антидепрессантного лечения посредством усиления эндогенной компенсаторной системы. Соединения с сильной ингибиторной активностью обратного захвата серотонина в сочетании с хорошо сбалансированной умеренной ингибиторной активностью обратного захвата дофамина могут, следовательно, продуцировать агенты с быстрым появлением антидепрессантного эффекта.

Соединения по настоящему изобретению являются также сильными ингибиторами обратного захвата дофамина и, таким образом, применимы для лечения паркинсонизма, депрессии, ожирения, нарколепсии, лекарственной зависимости или злоупотребления лекарственными средствами, включая злоупотребление кокаином, гиперактивности при дефиците внимания, болезни Жилль де ля Туретта и сенильной деменции. Ингибиторы обратного захвата дофамина косвенно усиливают через дофаминовые нейроны высвобождение ацетилхолина и, следовательно, также применимы для лечения нарушения памяти, например при болезни Альцгеймера, пресенильной деменции, нарушения памяти при старении и синдрома хронического утомления. Ингибиторы обратного захвата норадреналина считают применимыми для повышения внимания, улучшения состояний тревоги, возбуждения, бессонницы и для лечения депрессии.

Задачей настоящего изобретения является создание новых тропановых производных, которые представляют собой ингибиторы обратного захвата нейромедиаторных моноаминов и, следовательно, применимы для лечения таких расстройств, как болезнь Паркинсона, депрессия и родственные ей заболевания, обсессивно-компульсивные расстройства, панические состояния, деменция, нарушения памяти, гиперактивность при дефиците внимания, ожирение, состояние тревоги, нарушения аппетита, лекарственная зависимость или злоупотребление лекарственными средствами, включая злоупотребеление кокаином.

Другой задачей настоящего изобретения является создание новых фармацевтических композиций, содержащих новые тропановые производные.

Еще одной задачей изобретения является создание способа лечения заболеваний или расстройств, на которые влияет ингибирование обратного захвата нейромедиаторных моноаминов, таких как болезнь Паркинсона, депрессия и родственные ей заболевания, обсессивно-компульсивные расстройства, панические состояния, деменция, нарушения памяти, гиперактивность при дефиците внимания, ожирение, состояние тревоги, нарушения аппетита, лекарственная зависимость или злоупотребление лекарственными средствами, включая злоупотребление кокаином.

Другие задачи станут очевидны специалисту далее.

Таким образом, изобретение, inter alia, включает в себя следующее, по отдельности или в сочетании: Соединение формулы или любая их смесь, или их фармацевтически приемлемая соль; где R представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, циклоалкилалкил или 2-гидроксиэтил; R³ представляет собой -CH₂-X-R', где X представляет собой O, S или NR'', где R'' является водородом или алкилом, а R' представляет собой алкил, алкенил, алкинил, циклоалкил, циклоалкилалкил или -CO-алкил; и R⁴ представляет собой фенил, который может быть замещен один или более чем один раз заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, CF₃, CN, алкокси, циклоалкокси, алкила, циклоалкила, алкенила, алкинила, амино, нитро, гетероарила и арила; 3,4-метилендиоксифенил; бензил, который может быть замещен один или более чем один раз заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, CF₃, CN, алкокси, циклоалкокси, алкила, циклоалкила, алкенила, алкинила, амино, нитро, гетероарила и арила; гетероарил, который может быть замещен один или более чем один раз заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, CF₃, CN, алкокси, циклоалкокси, алкила, циклоалкила, алкенила, алкинила, амино, нитро, гетероарила и арила; или нафтил, который может быть замещен один или более чем один раз заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, CF₃, CN, алкокси, циклоалкокси, алкила, циклоалкила, алкенила, алкинила, амино, нитро, гетероарила и арила; соединение по п.1, которое представляет собой 2-метоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, 2-изопропоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, 2-этоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, 2-циклопропилметилоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, 2-метоксиметил-3-(4-хлорфенил)-тропан, N-норметил-2-метоксиметил-3-(4-хлорфенил)-тропан, 2-этоксиметил-3-(4-хлорфенил)-тропан, N-норметил-2-метоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, N-норметил-2-этоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, N-норметил-2-этоксиметил-3-(4-хлорфенил)-тропан, 2-этилтиометил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, 2-циклопропилметилоксиметил-3-(4-хлорфенил)-тропан, или N-норметил-2-циклопропилметилоксиметил-3-(4-хлорфенил)-тропан, или его фармацевтически приемлемую соль присоединения; соединение по п.1, которое представляет собой (1R,2R,3S)-2-метоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, (1R,2R,3S)-2-изопропоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, (1R,2R,3S)-2-этоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, (1R,2R,3S)-2-циклопропилметилоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, (1R,2R,3S)-2-метоксиметил-3-(4-хлорфенил)-тропан, (1R,2R,3S)-N-норметил-2-метоксиметил-3-(4-хлорфенил)-тропан, (1R,2R,3S)-2-этоксиметил-3-(4-хлорфенил)-тропан, (1R,2R,3S)-N-норметил-2-метоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, (1R,2R,3S)-N-норметил-2-этоксиметил-3-(3,4-дихлорфенил)-тропан, (1R,2R,3S)-N-норметил-2-этоксиметил-3-(4-хлорфенил)-тропан, (1R, 2R, 3S)-N-норметил-2-циклопропилметилоксиметил-3-(4- хлорфенил)-тропан, (1R,2R,3S)-2-циклопропилметилоксиметил-3-(4-хлорофенил)-тропан, или (1R,2R,3S)-2-этилтиометил-3-(3,4-дихлорофенил)-тропан или его фармацевтически приемлемую соль присоединения; фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество соединения, такого как любое из указанных выше, или его фармацевтически приемлемой соли присоединения, вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем; применение соединения, такого как любое из указанных выше, для изготовления лекарственного средства для лечения расстройства или заболевания у живого организма, включая человека, причем расстройства или заболевания, реагирующего на ингибирование обратного захвата нейромедиаторных моноаминов в центральной нервной системе; применение соединения, такого как любое из указанных выше, где расстройство или заболевание представляет собой паркинсонизм, депрессию, псевдодеменцию, ожирение, нарколепсию, лекарственную зависимость и/или злоупотребление лекарственными средствами, гиперактивность при дефиците внимания, сенильную деменцию или нарушение памяти; способ получения соединений, таких как указано выше, включающий в себя стадию, на которой соединение формулы или любой из его энантиомеров или любую их смесь, где R и R₄ такие, как определено в п. 1, подвергают взаимодействию с алкоголятом R'-Z-Na, где R' такой, как определено в п.1, а Z представляет собой O или S, с образованием соединения по изобретению, в котором X представляет собой O или S; соединение формулы или любой из его энантиомеров или любую их смесь, где R и R₄ такие, как определено в п.1, подвергают взаимодействию с амином NHR''-R' с образованием соединения по изобретению, в котором X представляет собой NR''; или соединение формулы или любой из его энантиомеров или любую их смесь, где R и R₄ такие, как определено в п.1, подвергают взаимодействию с гидридом натрия и соединением формулы R'-SO₂, где R' такой, как определено в п.1, с образованием соединения по изобретению, в котором X представляет собой O; способ лечения расстройства или заболевания у живого организма, включая человека, причем расстройства или заболевания, реагирующего на ингибирование обратного захвата нейромедиаторных моноаминов, содержащий стадию, на которой нуждающемуся в таком лечении живому организму, включая человека, вводят терапевтически эффективное количество соединения по пп. 1-3; и способ, как указано выше, отличающийся тем, что лечат паркинсонизм, депрессию, псевдодеменцию, ожирение, нарколепсию, лекарственную зависимость и/или злоупотребление лекарственными средствами, гиперактивность при дефиците внимания, нарушение познавательной способности, сенильную деменцию или нарушение памяти.

Примеры фармацевтически приемлемых солей присоединения включают в себя соли присоединения неорганических и органических кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, фосфат, нитрат, перхлорат, сульфат, цитрат, лактат, тартрат, малеат, фумарат, манделат, бензоат, аскорбат, циннамат, бензолсульфонат, метансульфонат, стеарат, сукцинат, глутамат, гликолат, толуол-п-сульфонат, формат, малонат, нафталин-2-сульфонат, салицилат и ацетат. Такие соли получают по методикам, хорошо известным специалисту.

Другие кислоты, такие как щавелевая кислота, хотя сами по себе не являются фармацевтически приемлемыми, можно использовать при получении солей, применимых в качестве промежуточных соединений для получения соединений по изобретению и их солей присоединения фармацевтически приемлемых кислот.

Галоген представляет собой фтор, хлор, бром или иод.

Алкил означает нормальную или разветвленную цепь, содержащую от одного до шести атомов углерода, включая в себя, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, трет-бутил, пентил и гексил; предпочтительными группами являются метил, этил, пропил и изопропил.

Циклоалкил означает циклический алкил, содержащий от трех до семи атомов углерода, включая в себя, но не ограничиваясь ими, циклопропил, циклобутил, циклопентил и циклогексил.

Алкенил означает группу, содержащую от двух до шести атомов углерода, содержащую по меньшей мере одну двойную связь, например этенил, 1,2- или 2,3-пропенил, 1,2-, 2,3- или 3,4-бутенил, но не ограничиваясь этими примерами.

Алкинил означает группу, содержащую от двух до шести атомов углерода, содержащую по меньшей мере одну тройную связь, например этинил, 2,3-пропинил, 2,3- или 3,4-бутинил.

Циклоалкилалкил означает циклоалкил, как указано выше, и алкил, как указано выше, например, циклопропилметил.

Алкоксигруппа представляет собой O-алкил, где алкил такой, как определено выше.

Циклоалкоксигруппа представляет собой O-циклоалкил, где циклоалкил такой, как определено выше.

Аминогруппа представляет собой NH₂, или NH-алкил, или N-(алкил)₂, где алкил такой, как определено выше.

Гетероарил представляет собой 5- или 6-членную гетероциклическую моноциклическую группу. Такая гетероарильная группа включает в себя, например, оксазол-2-ил, оксазол-4-ил, оксазол-5-ил, изооксазол-3-ил, изооксазол-4-ил, изооксазол-5-ил, тиазол-2-ил, тиазол-4-ил, тиазол-5-ил, изотиазол-3-ил, изотиазол-4-ил, изотиазол-5-ил, 1,2,4-оксадиазол-3-ил, 1,2,4-оксадиазол-5-ил, 1,2,4-тиадиазол-3-ил, 1,2,4-тиадиазол-5-ил, 1,2,5-оксадиазол-3-ил, 1,2,5-оксадиазол-4-ил, 1,2,5-тиадиазол-3-ил, 1,2,5-тиадиазол-4-ил, 1-имидазолил, 2-имидазолил, 4-имидазолил, 1-пирролил, 2-пирролил, 3-пирролил, 2-фуранил, 3-фуранил, 2-тиенил, 3-тиенил, 2-пиридил, 3-пиридил, 4-пиридил, 2-пиримидтинил, 4-пиримидтинил, 5-пиримидтинил, 3-пиридазинил, 4-пиридазинил, 2-пиразинил и 3-пиразинил и 1-пиразолил, 3-пиразолил и 4-пиразолил.

Арил представляет собой ароматический углеводород, такой как фенил и нафтил.

Кроме того, соединения по настоящему изобретению могут существовать как в несольватированной, так и в сольватированной форме с фармацевтически приемлемыми растворителями, такими как вода, этанол и им подобные. Как правило, считается, что для назначений настоящего изобретения сольватированные формы эквивалентны несольватированным.

Специалисты должны принимать во внимание, что соединения по настоящему изобретению содержат несколько хиральных центров, и что такие соединения существуют в форме изомеров, то есть, энантиомеров. Изобретение включает в себя все такие изомеры и любые их смеси, включая рацемические смеси.

Рацемические формы могут быть разделены на оптические антиподы известными способами, например разделением их диастереомерных солей с помощью оптически активной кислоты и высвобождением оптически активного аминосоединения обработкой основанием. Другой способ разделения рацематов на оптические антиподы основан на хроматографии на оптически активной стационарной фазе. Рацемические соединения по настоящему изобретению можно, таким образом, разделить на оптические антиподы, например, путем фракционной кристаллизации d- или l-солей, например тартратов, манделатов или камфорсульфонатов. Соединения по настоящему изобретению можно также разделить путем образования диастереомерных амидов посредством взаимодействия этих соединений с оптически активной активированной карбоновой кислотой, такой как производное от (+) или (-) фенилаланина, (+) или (-) фенилглицина, (+) или (-) камфановой кислоты, или путем образования диастереомерных карбаматов взаимодействием соединений по настоящему изобретению с оптически активным хлорформатом или ему подобным веществом.

Можно использовать известные дополнительные методы разделения оптических изомеров, которые очевидны для среднего специалиста. Такие методы описаны J. Jaques, A. Collet, S.Wilen ("Enantiomers, racemates and resolutions", John Wiley and Sons, New York, 1981).

Оптически активные соединения можно также получить из исходных оптически активных материалов.

Следующая схема иллюстрирует способы, которыми можно получить соединения по изобретению: Процессы на реакционной схеме, приведенной выше, осуществляют традиционным образом. Заместитель Z в приведенной выше схеме означает O или S.

Исходные материалы для способов, описанных в настоящей патентной заявке, известны или могут быть получены известными способами из имеющихся в продаже материалов (см. WO-95/28401).

Соединение по изобретению может быть превращено в другое соединение по изобретению с использованием стандартных способов.

Продукты описанных здесь реакций выделяют стандартными способами, такими как экстракция, кристаллизация, дистилляция, хроматография и т.п.

Биология Соединения по настоящему изобретению были исследованы на их способность связываться с медиатором дофамина с помощью следующих тестов на in vitro ингибирование ³H-WIN 35428.

Ингибирование in vitro связывания ³H-WIN 35428 Предпосылки Дофаминовые медиаторы/сайты захвата на нервных окончаниях предположительно функционируют как терминаторы нейронного импульса путем удаления дофамина из синаптической щели. Активность или наличие транспортного интегрального белка дофамина могут быть измерены в анализах in vitro по синаптосомальному захвату или мембранному связыванию ³H-дофамина с помощью ³H-лигандов, для которых известно связывание с переносчиком.

Исследования связывания in vitro кокаина показали, что он связывается с переносчиком дофамина и ингибирует захват ³H-дофамина. Сообщалось, что многочисленные лиганды нескольких структурных типов связываются по сайту захвата дофамина, но остается под вопросом, идентичны ли эти сайты таковым для кокаина. Структурный аналог кокаина, ³H-WIN 35428, избирательно связывается с транспортным комплексом дофамина с высокой степенью сродства.

Препараты ткани: Препараты готовят при 0-4^oC, если не указано иначе. Полосатое тело из самцов крыс линии Вистар (150-200 г) гомогенизируют в течение 5-10 сек в 10 мл NaH₂PO₄ (50 мМ, pH 7,4) в гомогенизаторе Ultra-Turrax. Суспензию центрифугируют при 27000 g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а остаток заново суспендируют в 50 мМ NaH₂PO₄, pH 7,4 (1000 мл на г исходной ткани) и используют для анализов на связывание.

Анализ: К 25 мл исследуемого раствора и 25 мл ³H-WIN 35428 (конечная концентрация 1 нМ) добавляют аликвоты ткани по 0,5 мл, смешивают и инкубируют в течение 60 мин при 2^oC. Неспецифическое связывание определяют с использованием кокаина (конечная концентрация 30 мМ). После инкубации к образцам добавляют 5 мл охлажденного во льду буфера, наливают их прямо на фильтры из стекловолокна Whatman GF/C под отсосом и немедленно промывают 5 мл охлажденного во льду буфера. Количество радиоактивности на фильтрах определяют стандартным счетом жидкостной сцинтилляции. Специфическим связыванием является общее связывание минус неспецифическое.

Прежде чем вычислять IC₅₀, должно быть достигнуто 25-75% ингибирование специфического связывания. Тестируемое значение приводят в виде IC₅₀ (концентрация (мкМ) исследуемого вещества, которая ингибирует специфическое связывание ³H-WIN 35428 на 50%).

Результаты, полученные тестированием соединений по изобретению, приведены в таблице 1.

Приведенные выше результаты тестов показывают, что соединения по изобретению связываются с комплексом транспорта дофамина с высоким сродством.

Соединения по изобретению также были протестированы на их способность ингибировать обратный захват дофамина (DA), норадреналина (NA) и серотонина (5-HT) в синаптосомах.

Предпосылки Дофаминовые медиаторы/сайты захвата на нервных окончаниях предположительно функционируют как терминаторы нейронного импульса путем удаления нейромедиаторов дофамина, норадреналина и серотонина, соответственно, из синаптической щели. Активность транспортных интегральных белков может быть измерена in vitro на синаптосомальный захват ³H-дофамина, ³H-норадреналина и ³H-серотонина, соответственно.

Ингибирование in vitro захвата ³H-дофамина (³H-DA) в стриарных синаптосомах Препараты ткани: Препараты готовят при 0-4^oC, если не указано иначе. Corpi striati из самцов крыс линии Вистар (150-200 г) гомогенизируют 5-10 сек в 100 объемах охлажденной во льду 0,32 М сахарозе, содержащей 1 мМ паргилина, в гомогенизаторе Ultra-Turrax. Активность моноаминоксидазы должна ингибироваться в присутствии паргилина. Гомогенат центрифугируют при 1000 g в течение 10 мин. Полученную надосадочную жидкость затем центрифугируют при 27000 g в течение 50 мин и надосадочную жидкость отбрасывают. Остаток (P₂) заново суспендируют в оксигенированном (уравновешенном в атмосфере 96% O₂ : 4% CO₂ в течение по меньшей мере 30 мин) инкубационном буфере Кребса-Рингера (8000 мл на г исходной ткани) с pH 7,2, содержащем 122 мМ NaCl, 0,16 мМ ЭДТА, 4,8 мМ KCl, 12,7 мМ Na₂HPO₄, 3,0 мМ NaH₂PO₄, 1,2 мМ MgSO₄, 1 мМ CaCl₂, 10 мМ глюкозы и 1 мМ аскорбиновой кислоты.

Анализ: К 100 мкл тестируемого раствора и 100 мкл ³H-DA (конечная концентрация 1 нМ) добавляют аликвоты по 4,0 мл тканевой суспензии, смешивают и инкубируют в течение 25 мин при 37^oC. Неспецифический захват определяют с использованием бензтропина (конечная концентрация 10 мкМ). После инкубации образцы наливают прямо на фильтры из стекловолокна Whatman GF/C под отсосом. Затем фильтры промывают три раза 5 мл охлажденного во льду 0,9% (мас./об.) раствора NaCl. Количество радиоактивности на фильтрах определяют стандартным счетом жидкостной сцинтилляции. Специфический захват вычисляют как разницу между общим и неспецифическим захватом.

Перед вычислением IC₅₀ должно быть получено 25-75% ингибирование специфического связывания.

Тестируемое значение приводят в виде IC₅₀ (концентрация (мкМ) тестируемого вещества, которая ингибирует специфическое связывание ³H-DA на 50%).

Ингибирование in vitro захвата ³H-норадреналина (³H-NA) в синаптосомах гиппокампа Препараты ткани: Препараты готовят при 0-4^oC, если не указано иначе. Hippocampi из самцов крыс линии Вистар (150-200 г) гомогенизируют 5-10 сек в 100 объемах охлажденной во льду 0,32М сахарозе, содержащей 1 мМ паргилина, в гомогенизаторе Ultra-Turrax. Активность моноаминоксидазы должна ингибироваться в присутствии паргилина. Гомогенат центрифугируют при 1000 g 10 мин. Полученную надосадочную жидкость затем центрифугируют при 27000 g в течение 50 мин, и надосадочную жидкость отбрасывают. Остаток (P₂) заново суспендируют в оксигенированном (уравновешенном в атмосфере 96% O₂ : 4% CO₂ в течение по меньшей мере 30 мин) инкубационном буфере Кребса-Рингера (2000 мл на г исходной ткани) с pH 7,2, содержащем 122 мМ NaCl, 0,16 мМ ЭДТА, 4,8 мМ KCl, 12,7 мМ Na₂HPO₄, 3,0 мМ NaH₂PO₄, 1,2 мМ MgSO₄, 1 мМ CaCl₂, 10 мМ глюкозы и 1 мМ аскорбиновой кислоты.

Анализ: К 100 мкл тестируемого раствора и 100 мкл ³H-NA (конечная концентрация 1 нМ) добавляют аликвоты по 4,0 мл тканевой суспензии, смешивают и инкубируют в течение 90 мин при 37^oC. Неспецифический захват определяют с использованием дезипрамина (конечная концентрация 1 мкМ). После инкубации образцы наливают прямо на фильтры из стекловолокна Whatman GF/C под отсосом. Затем фильтры промывают три раза 5 мл охлажденного во льду 0,9% (мас./об.) раствора NaCl. Количество радиоактивности на фильтрах определяют стандартным счетом жидкостной сцинтилляции. Специфический захват вычисляют как разницу между общим и неспецифическим захватом.

Перед вычислением IC₅₀ должно быть получено 25-75% ингибирование специфического связывания.

Тестируемое значение приводят как IC₅₀ (концентрация (мкМ) исследуемого вещества, которая ингибирует специфическое связывание ³H-NA на 50%).

Ингибирование in vitro захвата ³H-5-гидрокситриптамина (³H-5-HT, серотонин) в кортикальных синаптосомах Препараты ткани: Препараты готовят при 0-4^oC, если не указано иначе. Кору головного мозга из самцов крыс линии Вистар (150-200 г) гомогенизируют в течение 5-10 сек в 100 объемах охлажденной во льду 0,32М сахарозе, содержащей 1 мМ паргилина, в гомогенизаторе Ultra-Turrax. Активность моноаминоксидазы должна ингибироваться в присутствии паргилина. Гомогенат центрифугируют при 1000 g в течение 10 мин. Полученную надосадочную жидкость затем центрифугируют при 27000 g в течение 50 мин и надосадочную жидкость отбрасывают. Остаток (P₂) заново суспендируют в оксигенированном (уравновешенном в атмосфере 96% O₂ : 4% CO₂, в течение по меньшей мере 30 мин) инкубационном буфере Кребса-Рингера (1000 мл на г исходной ткани) с pH 7,2, содержащем 122 мМ NaCl, 0,16 мМ ЭДТА, 4,8 мМ KCl, 12,7 мМ Na₂HPO₄, 3,0 мМ NaH₂PO₄, 1,2 мМ MgSO₄, 1 мМ CaCl₂, 10 мМ глюкозы и 1 мМ аскорбиновой кислоты.

Анализ: К 100 мкл тестируемого раствора и 100 мкл ³H-5-HT (конечная концентрация 1 нМ) добавляют аликвоты по 4,0 мл тканевой суспензии, смешивают и инкубируют в течение 30 мин при 37^oC. Неспецифический захват определяют с использованием циталопрама (конечная концентрация 1 мкМ). После инкубации образцы наливают прямо на фильтры из стекловолокна Whatman GF/C под отсосом. Затем фильтры промывают три раза 5 мл охлажденного во льду 0,9% (мас./об.) раствора NaCl. Количество радиоактивности на фильтрах определяют стандартным счетом жидкостной сцинтилляции. Специфический захват вычисляют как разницу между общим и неспецифическим захватом.

Перед вычислением IC₅₀ должно быть получено 25-75% ингибирование специфического связывания.

Тестируемое значение приводят в виде IC₅₀ (концентрация (мкМ) исследуемого вещества, которая ингибирует специфическое связывание ³H-5-HT на 50%).

Результаты, полученные при тестировании соединений по настоящему изобретению, приведены в таблице 2.

Представленные выше результаты показывают, что тестируемые соединения эффективно ингибируют обратный захват дофамина, норадреналина и серотонина в синаптосомах.

Фармацевтические композиции Хотя возможно, что для применения в терапии соединение по изобретению можно вводить в виде химического соединения как такового, предпочтительно представлять активный ингредиент в виде фармацевтического препарата.

В изобретении, таким образом, далее предложены фармацевтические препараты, содержащие соединение по изобретению или его фармацевтически приемлемую соль или производное вместе с одним или более чем одним фармацевтически приемлемым носителем для него и возможно другими терапевтическими и/или профилактическими ингредиентами. Носитель(и) должен быть "приемлемым", то есть совместимым с другими ингредиентами препарата и безвредным для реципиента.

Фармацевтические препараты включают в себя формы, пригодные для перорального, ректального, назального, местного (включая защечное и подъязычное), вагинального или парентерального введения (включая внутримышечное, подкожное и внутривенное) или формы, пригодные для введения путем ингаляции или инсуффляции.

Соединения по изобретению вместе со стандартным адъювантом, носителем или разбавителем, таким образом, могут быть уместны в форме их фармацевтических композиций и стандартных доз, и в такой форме они могут быть использованы в виде твердых форм, таких как таблетки или капсулы, или жидких форм, таких как растворы, суспензии, эмульсии, эликсиры, или заполненные ими капсулы, все для перорального применения; в форме суппозиториев для ректального введения или в форме стерильных инъекционных растворов для парентерального применения (включая подкожное). Такие формы фармацевтических композиций и их стандартных доз могут включать в себя стандартные ингредиенты в стандартных соотношениях, с дополнительными активными соединениями или элементами или без них, и такие формы стандартных доз могут содержать любое соответствующее эффективное количество активного ингредиента, соразмерное с предназначенным диапазоном суточной дозировки, которая должна применяться. Препараты, содержащие 10 мг активного ингредиента или, в более широком диапазоне, от 0,1 до 100 мг на таблетку, являются, таким образом, подходящими характерными формами стандартных доз.

Соединения по настоящему изобретению можно вводить в большом разнообразии пероральных и парентеральных дозовых форм. Специалисту должно быть очевидно, что следующие дозовые формы могут включать в себя в качестве активного компонента либо соединение по изобретению, либо его фармацевтически приемлемую соль.

Для получения фармацевтических композиций из соединений по настоящему изобретению фармацевтически приемлемые носители могут быть либо твердыми, либо жидкими. Твердые лекарственные формы включают в себя порошки, таблетки, драже, капсулы, облатки, суппозитории и диспергированные гранулы. Твердым носителем могут быть вещества, одно или более чем одно, которые могут также действовать как разбавители, корригенты, солюбилизаторы, смазки, суспендирующие агенты, связующие вещества, консерванты, разрыхляющие агенты таблеток или инкапсулирующий материал.

В порошках носитель представляет собой тонко измельченное твердое вещество, которое находится в смеси с тонко измельченным активным компонентом.

В таблетках активный компонент смешан с носителем, имеющим необходимую связывающую способность, в подходящих соотношениях и спрессован в желаемую форму желаемого размера.

Порошки и таблетки предпочтительно содержат от пяти или десяти до примерно семидесяти процентов активного соединения. Подходящими носителями являются карбонат магния, стеарат магния, тальк, сахар, лактоза, пектин, декстрин, крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, натрий-карбоксиметилцеллюлоза, легкоплавкий воск, масло какао и тому подобное. Термин "препарат" должен включать в себя препарат активного соединения вместе с инкапсулирующим материалом в качестве носителя, образующего капсулу, где активный компонент, с носителями или без них, окружен носителем, который таким образом с ним связан. Сюда относятся также облатки и лепешки. Таблетки, порошки, капсулы, драже, облатки и лепешки можно применять как твердые формы, подходящие для перорального введения.

Для приготовления суппозиториев легкоплавкий воск, такой как смесь глицеридов жирных кислот или масло какао, сначала плавят, и активный компонент гомогенно диспергируют в нем путем перемешивания. Расплавленную гомогенную смесь затем заливают в формочки подходящего размера, дают остыть и затем затвердеть.

Препараты, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в форме пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или аэрозолей, содержащих в дополнение к активному ингредиенту соответствующие носители, известные специалистам.

Жидкие лекарственные формы включают в себя растворы, суспензии и эмульсии, например растворы в воде или в воде с пропиленгликолем. Например, жидкие препараты для парентерального введения могут быть приготовлены в виде растворов в водном растворе полиэтиленгликоля.

Соединения по настоящему изобретению, таким образом, могут быть приготовлены в виде препарата для парентерального введения (например инъекцией, например болюсной инъекцией или непрерывной инфузией) и представлены в форме разовой дозы в ампулах, предварительно наполненных шприцах, малых объемов вливания или в контейнерах для многоразовых доз с добавлением консерванта. Композиции могут иметь такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных растворителях и могут содержать суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, активный ингредиент может находиться в форме порошка, полученного путем асептического выделения стерильного твердого вещества или путем лиофилизации из раствора, для приготовления состава с подходящим растворителем, например стерильной апирогенной водой, перед использованием.

Водные растворы, подходящие для перорального применения, можно приготовить путем растворения активного компонента в воде и добавления подходящих красителей, корригентов, стабилизирующих и загущающих агентов по желанию.

Водные растворы, подходящие для перорального применения, можно приготовить путем диспергирования тонко измельченного активного компонента в воде с вязким материалом, таким как натуральные и синтетические смолы, метилцеллюлоза, натрий-карбоксиметилцеллюлоза или другие хорошо известные суспендирующие агенты.

Включены также твердые лекарственные формы, которые предназначены для превращения непосредственно перед применением в жидкие лекарственные формы для перорального введения. Такие жидкие формы включают в себя растворы, суспензии и эмульсии. Эти препараты могут содержать в дополнение к активному компоненту красители, корригенты, стабилизаторы, буферы, искусственные и натуральные подсластители, диспергирующие агенты, загустители, солюбилизирующие агенты и тому подобное.

Для местного введения через кожу соединения по изобретен