Молекула выделенной двунитевой днк, молекула рекомбинантной двунитевой днк и способ получения генетически трансформированных растений

Молекула выделенной двунитевой днк, молекула рекомбинантной двунитевой днк и способ получения генетически трансформированных растений

Реферат

 

Изобретение может быть использовано в сельском хозяйстве. Трансформирование растений с помощью генов, разрушающих гербицид глифозат, позволяет получить растения с устойчивостью к данному гербициду, применяемому для борьбы с сорняками и др. 3 с. и 6 з.п. ф-лы, 13 ил., 17 табл.

Данная заявка является частичным продолжением находящейся на рассмотрении заявки N 07/543236, поданной 25 июня 1990 г.

Последние достижения генной инженерии обеспечили специалистов необходимым инструментом трансформации растений с введением в них чужеродных генов. В настоящее время можно создавать растения с уникальными с точки зрения агрономии показателями. Несомненно, среди достигаемых при этом преимуществ: более экономически эффективная, экологически совместимая борьба с сорняками путем создания толерантности к гербицидам. Толерантные к гербицидам растения могут уменьшить необходимость в обработке почвы с эффективным снижением тем самим эрозии почвы.

Одним из гербицидов, подвергавшимся в этой связи тщательному изучению, является N-фосфонометилглицин, обычно называемый глифозатом. Глифозат ингибирует участие шикимовой кислоты в биосинтезе ароматических соединений, в том числе аминокислоты и витамины. Более конкретно, глифозат ингибирует превращение фосфоенолпировиноградной кислоты и 3-фосфошикимовой кислоты в 5-енолпирувил-3-фосфошикимовую кислоту путем ингибирования фермента 5-енолпирувил-3-фосфошикимовой кислоты-синтетазы (ЕПФШ-синтетаза или ЕПФШС).

Показано, что толерантные к глифозату растения могут быть созданы введением в геном растения способности продуцировать на высоком уровне ЕПФШ-синтетазу, при этом рекомендуется, чтобы фермент был толерантным по отношению к глифозату. (Shah и др., 1986). Введение в растения гена-(ов) разрушения глифозата могло бы послужить способом придания растениям толерантности к глифозату и/или повышения толерантности трансгенного растения, уже экспрессирующего толерантную к глифозату ЕПФШ-синтетазу, в зависимости от физиологического действия продуктов разрушения.

Метаболизм (разрушение) исследован на самых различных растениях, и в большинстве таких исследований установлена небольшая степень такого разрушения. В тех случаях, когда разрушение происходит, начальным продуктом разрушения является аминометилфосфонат (АМФК) (Coupland, 1985; Marshall и др., 1987). И в таких случаях неясно, метаболизируется ли глифозат растением или же посторонними бактериями на поверхности листьев, на которые наносят глифозат. Согласно сообщениям, АМФК для большинства видов растений менее фитотоксичен, чем глифозат (Franz, 1985), но не для всех видов растений (Maier, 1983; Tanaka и др., 1988). В почве разрушение глифозата происходит более интенсивно и быстро (Torstensson, 1985). Основным идентифицированным продуктом разрушения является АМФК (Rueppel и др., 1977; Nomura и Hilton, 1977) - фосфонат, который может быть метаболизирован самыми различными микроорганизмами (Zeleznick и др., 1963; Masfalerz и др., 1965; Cook и др., 1978; Daughton и др., 1979a, 1979b; Wackett и др., 1987a). Идентифицирован целый ряд чистых бактериальных культур, разрушающих глифозат по одному из двух известных путей (Moore и др., 1983; Talbot и др., 1984; Shinabarger и Braymer, 1986; Ballthazor и Hallas, 1986; Kishore и Jacob, 1987; Wackett и др., 1987a; Pipke и др., 1987a; Pipke и др., 1987; Hallas и др., 1988; Jacob и др., 1985 и 1988; Pipke и Amrhein, 1988; Quinn и др., 1988 и 1989; Lerbs и др., 1990; Schowanek и Verstraete, 1990; Weidhase и др., 1990; Liu и др., 1991). Путь с участием "C-P-лиазы", разрушающей глифозат до саркозина и неорганического фосфата (Pi), указан для вида Pseudomonas (Shinabarger и Braymer, 1986; Kishore и Jacob, 1987) и вида Arthrobacler (Pipke и др., 1987b). Чистые культуры, способные разрушать глифозат до АМФК, указаны для вида Flavobacterium (Balthazor и Hallas, 1986), для вида Pseudomonas (Jacob и др., 1988) и для Arthrobacter atrocyaneus (Pipke и Amrhein, 1988). Кроме того, большое число изолятов, превращающих глифозат в АМФК, идентифицирован в промышленных активированных илах, которыми обрабатывают отходы производства глифозата (Hallas и др., 1988). Однако, число и природа бактериальных генов, ответственных за указанные разрушения, до настоящего времени не были определены, как не был выделен и ген-(ы).

Соответственно, в одном из его аспектов целью изобретения является создание новых генов, кодирующих фермент метаболизма глифозата, превращающий глифозат в аминометилфосфонат и глиоксилат.

Другой целью изобретения является повышение активности фермента метаболизма глифозата по отношению к глифозату путем замены специфичных аминокислотных остатков.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в создании генетически модифицированных растений, экспрессирующих ген, кодирующий фермент метаболизма глифозата и отличающийся повышенной толерантностью к гербицидному глифозату.

И еще одна цель изобретения заключается в том, чтобы показать, что фермент метаболизма может быть направлен с помощью хлоропластного транзитного пептида в пластиды и что направленный в пластиды фермент придает им толерантность к глифозату на высоком уровне.

И наконец, целью изобретения является создание метода отбора трансформированной растительной ткани использованием фермента метаболизма глифозата в качестве поддающегося отбору маркера в присутствии ингибирующих концентраций глифозата.

Эти и другие цели, аспекты и признаки настоящего изобретения для специалиста станут очевидными из нижеследующего описания и рабочих примеров.

Настоящим изобретением даются структуральные ДНК конструкты, кодирующие фермент глифозат-оксидоредуктазу и применимые в создании способности разрушать глифозат в гетерологичных микроорганизмах (напр.: бактериях и растениях), а также в создании толерантных к глифозату растений.

В соответствии с вышеизложенным согласно с одним из аспектов настоящего изобретения дается способ создания генетически трансформированных растений, толерантных по отношению к гербициду глифозату, включающий стадии: (a) внедрения в геном клетки растения рекомбинантной двунитевой молекулы ДНК, состоящей из: (I) промотора, действие которого в клетках растения вызывает продуцирование РНК последовательности, (II) структуральной ДНК последовательности, вызывающей продуцирование РНК последовательности, кодирующей фермент глифозат-оксидоредуктазу, (III) 3'-нетрансляционной ДНК последовательности, действие которой в клетках растения вызывает присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3'-концу РНК последовательности; причем промотор гетерологичен по отношению к кодирующей последовательности и способен вызывать достаточную экспрессию указанного фермента в растительных тканях, включая меристематическую ткань, с повышением устойчивости клетки растения, трансформированной указанным геном, к глифозату; (b) получения трансформированной клетки растения и (c) регенерирования из трансформированной клетки растения генетически трансформированного растения с повышенной толерантностью к гербициду глифозату.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения дается рекомбинантная двунитевая молекула ДНК, состоящая последовательно из: (a) промотора, действие которого в клетках растения вызывает продуцирование РНК последовательности; (b) структуральной ДНК последовательности, вызывающей продуцирование РНК последовательности, кодирующей фермент глифозат-оксидоредуктазу; и (c) 3'-нетрансляционной области, действие которой в растении вызывает присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3'-концу РНК последовательности.

Согласно еще одному аспекту изобретения даются бактериальные и трансформированные растительные клетки, содержащие, соответственно, ДНК, состоящую из вышеупомянутых элементов (a), (b) и (c).

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения даются дифференцированные растения, включающие трансформированные растительные клетки, охарактеризованные выше, и отличающиеся толерантностью к гербициду глифозату.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения дается способ избирательной борьбы с сорняками на полях с культурными растениями, на которых высажены семена или рассада культурных растений, способ включает стадии: (a) высаживания семян культурных растений или самих растений, отличающихся толерантностью к глифозату в результате введения в семена или растения рекомбинантной двунитевой молекулы ДНК, состоящей из: (I) последовательности промотора, действие которой в растениях вызывает продуцирование РНК последовательности, (II) структуральной ДНК последовательности, вызывающей продуцирование РНК, кодирующей фермент глифозат-оксидоредуктазу, (III) 3'-нетрансляционной области, кодирующей сигнал полиаденилирования, действие которого в растениях вызывает присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3'-концу РНК последовательности. Причем промотор гетерологичен по отношению к кодирующей последовательности и способен вызывать достаточную экспрессию указанного фермента в растительной ткани, включая меристематическую ткань, с повышением толерантности клетки растения, трансформированной указанным геном; и (b) нанесения на растения и семена на полях достаточного количества для борьбы с сорняками гербицида глифозата без существенного действия на урожай.

В особенно рекомендуемом воплощении изобретения двунитевая молекула ДНК включает ген для экспрессии в растении, представляющий собой структуральную ДНК, кодирующую слитый полипептид, содержащий аминоконцевой хлоропластный транзитный пептид, способный вызывать импортацию карбоксиконцевого фермента глифозат-оксидоредуктазу в хлоропласт клетки растения, экспрессирующей указанный ген.

Другое воплощение настоящего изобретения заключается в применении гена глифозат-оксидоредуктазы в качестве поддающегося отбору маркера для отбора и идентификации трансформированной растительной ткани.

На фиг. 1 приведена ДНК последовательность для полной длины промотора мозаичного вируса норичника (FMV).

На фиг. 2 приведена структуральная ДНК последовательность для гена глифозат-оксидоредуктазы из бактериального изолята LBAA.

На фиг. 3 приведено сравнение подвергнутого обработке структурального гена глифозат-оксидоредуктазы с модифицированным геном глифозат-оксидоредуктазы, предназначенным для повышенной экспрессии в растениях. Подвергнутый обработке ген глифозат-оксидоредуктазы показан в виде верхней ДНК последовательности. Единственные изменения, осуществленные в модифицированном гене, показаны в нижерасположенной нити последовательностей.

На фиг. 4 приведено сравнение подвергнутого обработке структурального гена глифозат-оксидоредуктазы с синтетическим геном глифозат-оксидоредуктазы, предназначенным для повышенной экспрессии в растениях. Подвергнутый обработке ген глифозат-оксидоредуктазы показан в виде верхней ДНК последовательности.

На фиг. 5 показано строение pMON17032 - pMON1886 вектора, содержащего модифицированный ген глифозат-оксидоредуктазы, внедренный в виде En-CaMV35S -модифицированной глифозат-оксидоредуктазы-NOS-3'-кассеты в NotI сайт вектора. Описание вектора pMON886 можно найти в тексте.

На фиг. 6 приведена нуклеотидная последовательность ХТП1 хлоропластного транзитного пептида, происходящего из A.thaliana SSUIA гена.

На фиг. 7 приведена генетическая/структуральная карта плазмиды pMON17066 - вектора pMON979 типа, содержащего слитый полипептид ХТП/синтетическая глифозат-оксидоредуктаза. Родственными pMON979 типу производными являются pMON17065 и pMON17073.

На фиг. 8 приведена генетическая/структуральная карта плазмиды pMON17138, являющейся примером вектора pMON981 типа, содержащего ген, кодирующий слитый полипептид ХТП/синтетическая глифозат-оксидоредуктаза. В данном примере ген ХТП1-синтетической глифозат-оксидоредуктазы клонирован в pMON979 в виде XbaI-BamHI фрагмента.

На фиг. 9 приведена нуклеотидная последовательность ХТП2 хлоропластного транзитного пептида, происходящего из A.thaliana EPSPS гена.

На фиг. 10 приведена структуральная карта плазмиды pMON17159.

На фиг. 11 приведена структуральная карта плазмиды pMON17226.

На фиг. 12 приведена структуральная карта плазмиды pMON17164.

Экспрессия растительного гена, существующего в форме двунитевой ДНК, включает синтез матричной РНК (мРНК) из одной из нитей ДНК при участии фермента РНК-полимеразы и последующую обработку внутри ядра первичного транскрипта мРНК. Такая обработка включает участие 3'-сигнальной области, облегчающей присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3'-концу РНК.

Транскрипция ДНК в мРНК регулируется областью ДНК, обычно называемой "промотором". Область промотора содержит последовательность оснований, подающих сигналы РНК-полимеразе связываться с ДНК и инициировать транскрипцию в мРНК использованием в качестве матрицы одной из нитей ДНК с образованием соответствующей комплементарной нити РНК.

В литературе описан целый ряд промоторов, проявляющих активность в клетках растений, в их числе; нопалин-синтетаза (NOS) и октопин-синтетеза (OCS) промоторы (находящиеся на индуцирующих опухоль плазмидах из Agrobacterium tumefaciens), каульмовирусные промоторы, такие как 19S-35S-промоторы мозаичного вируса цветной капусты (CaMV) и 35S-промотор мозаичного вируса норичника (FMV), светочувствительный промотор из малой субъединицы рибулозабисфосфаткарбоксилазы (SSRUBISCO, очень распространенного растительного полипептида). Все перечисленные промоторы были использованы для создания различного типа ДНК конструктов, экспрессированных в растениях (см., напр., PCT публикацию WO 84/02913 (Pogers и др., Монсанто)).

Промоторы, для которых известна или обнаружена способность вызывать транскрипцию в клетках растения, могут быть использованы и в настоящем изобретении. Подобные промоторы могут быть получены из различных источников, таких как: растения и растительные ДНК вирусы, в том числе, но без ограничения только ими: CaMV 35S и FMV35S-промоторы и промоторы, выделенные из растительных генов, таких как: гены SSRUBISCO или белки a/b связывания хлорофила. Как показано ниже, рекомендуется, чтобы конкретный выбранный промотор был способен вызывать достаточную экспрессию с продуцированием в результате глифозат-оксидоредуктазы в количестве, эффективном для придания растениям заметной толерантности к глифозатным гербицидам. Количество глифозат-оксидоредуктазы, необходимое для создания целевой толерантности, может меняться в зависимости от вида растения.

Рекомендуется, чтобы используемый промотор характеризовался сравнительно высокой экспрессией во всех меристематических тканях помимо других тканей, поскольку сейчас известно, что глифозат перемещается и накапливается в растительной ткани этого типа. Или же может быть использована комбинация химерных генов с целью кумулятивного создания необходимого общего уровня экспрессии фермента глифозат-оксидоредуктазы с получением в результате толерантного к глифозату генотипа.

мРНК, продуцируемая ДНК конструктом настоящего изобретения, содержит также 5'-нетрансляционную лидер-последовательность. Такая последовательность может происходить из промотора, выбранного для экспрессирования гена, и может быть специально модифицирована с тем, чтобы повысить трансляцию мРНК. 5'-Нетрансляционные области могут быть также получены из вирусных РНК, из приемлемых эукариотных генов или из синтетических генных последовательностей. Настоящее изобретение не ограничено конструктами, представленными в нижеследующих примерах, в которых нетрансляционная область происходит как из 5'-нетрансляционной последовательности, сопутствующей последовательности промотора, так и из части 5'-нетрансляционной области гена белка оболочки вируса. Желательно, чтобы нетрансляционная лидер-последовательность могла происходить из неродственного промотора или кодирующей последовательности, о чем речь шла выше.

Рекомендуемым для использования в настоящем изобретении промотором является полной длины транскриптный (35S) промотор мозаичного вируса норичника (FMV), действующий как сильный и однородный промотор для химерных генов, вводимых в растения, в частности, двудольные растения. В целом, полученные трансгенные растения экспрессируют белок, кодируемый введенным геном на более высоком и равномерном уровне во всех тканях и клетках, чем тот же самый ген, ведомый усиленным CaCV 35S-промотором. ДНК последовательность промотора (см. фиг. 1) расположена между нуклеотидами 6368 и 6930 (ПОСЛЕД. N 1) FMV генома. Рекомендуется, чтобы с промотором сочеталась 5'-нетрансляционная лидер-последовательность, и пример лидер-последовательности приведен на фиг. 1 (ПОСЛЕД. N 2). Лидер-последовательность может происходить из того же FMV генома или же может происходить из источника, отличного от FMV.

3'-нетрансляционная область химерного растительного гена содержит сигнал полиаденилирования, действие которого в растениях вызывает присоединение полиаденилированных нуклеотидов к 3'-концу РНК. Примеры приемлемых 3'-областей включают: (1) 3'-транскрибированные, нетрансляционные области, содержащие сигнал полиаденилирования из Agrobacterium индуцирующих опухоль (Ti) плазмидных генов, таких как ген нопалин-синтетазы (NOS), и (2) растительные гены, такие как гены белков хранения сои и ген малой субъединицы рибулоза-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (ssRUBISCO). Пример рекомендуемой 3'-области представлен областью из ssRUBISCO гена гороха (E9), более подробно раскрытая в нижеследующих примерах.

ДНК конструкты настоящего изобретения кроме того содержат структуральную кодирующую последовательность в форме двунитевой ДНК, кодирующую фермент глифозат-оксидоредуктазы, превращающий глифозат в аминометилфосфонат и глиоксилат.

Краткие сведения о реакциях глифозат-оксидоредуктазы Фермент глифозат-оксидоредуктаза катализирует расщепление C-N связи глифозата с образованием в качестве продуктов реакции аминометилфосфоната (АМФК) и глиоксилата. В аэробных условиях кислород участвует в реакции в качестве сосубстрата. Другие доноры электронов, такие как: метосульфат феназина и убихинон в аэробных условиях стимулируют реакцию. В отсутствие кислорода указанные соединения действуют, как акцепторы электронов.

Анализ на ферментативную реакцию может быть выполнен по поглощению кислорода с помощью кислородного электрода. Глифозат-оксидоредуктаза из LBAA не образует перекиси водорода в качестве продукта восстановления кислорода. Данный фермент требует стехиометрически двух молей окисленного глифозата на моль потребленного кислорода с образованием в качестве продуктов реакции по два моля каждого АМФК и глиоксилата.

Альтернативный метод анализа глифозат-оксидоредуктазы включает реакцию образца с 2,4-динитрофенилгидразином и определение количества глиоксилат-2,4-динитрофенилгидразона с помощью ВЭЖХ-анализа, более подробно описанного в последующем разделе.

Третий метод анализа глифозат-оксидоредуктазы заключается в использовании /3-¹⁴C/-глифозата в качестве субстрата, при этом образуемый ферментом радиоактивный АМФК отделяют от субстрата с помощью ВЭЖХ на анионообменной колонке по нижеприведенной методике. Связанная с АМФК радиоактивность является мерой глубины реакции глифозат-оксидоредуктазы.

Глифозат-оксидоредуктаза из LBAA относится к флавопротеинам с участием ФАД в качестве софактора. Один из механизмов, предложенных нами для реакции, катализируемой данным ферментом, включает восстановление ФАД по активному сайту фермента глифозатом. Это приводит к образованию восстановленного ФАД и основания Шиффа аминометилфосфоната с глиоксилатом. Основание Шиффа гидратируется водой и гидролизуется до его компонентов: АМФК и глиоксилата. Восстановленный флавин вновь окисляется молекулярным кислородом. Мы полагаем, что в процессе повторного окисления восстановленного ФАД в качестве промежуточного продукта образуется окисленный флавин. Промежуточный флавин может катализировать окисление глифозата с образованием АМФК и глиоксилата. Данная гипотеза согласуется с наблюдаемой стехиометрией и невозможностью обнаружить нами в реакционной смеси перекись водорода.

Помимо глифозата глифозат-оксидоредуктаза из LBAA окисляет иминодиуксусную кислоту (ИДУ) до глицина и глиоксилата. Скорость реакции с ИДУ значительно быстрее, чем с глифозатом.

Выделение бактерий, эффективно разлагающих глифозат до АМФК Бактерии, способные разлагать глифозат, известны (Hallas и др., 1988; Malik и др., 1988). Ряд таких бактерий отобран для быстрого разрушения глифозата следующим путем. Двадцать три бактериальных изолята перенесены с TSA-пластинок (Триптиказный соевый агар, BBL) в среду A, состоящую из среды с солями Дворкина-Фостера, содержащей глюкозу, глюконат и цитрат (каждый в концентрации 0,1%) в качестве источника углерода и содержащей глифозат в качестве источника фосфора (концентрация глифозата 0,1 мМ).

Минимальную среду Дворкина-Фостера готовят смешиванием в 1 л обработанной в автоклаве воды по 1 мл каждого из компонентов A, B и C и 10 мл компонента D, тиаминHCl (5 мг), C-источников до конечной концентрации в 0,1% каждого и P-источника (глифозат или иной фосфонат, или Pi) до необходимой концентрации.

A. Соли Д-Ф (1000Х партия, на 100 мл, с обработкой в автоклаве): H₃BO₃ - 1 мг MnSO₄7H₂O - 1 мг ZnSO₄7H₂O - 12,5 мг CuSO₄5H₂O - 8 мг NaMoO₃3H₂O - 1,7 мг B. FeSO₄7H₂O (1000Х партия, на 100 мл, с обработкой в автоклаве) 0,1 г; C. MgSO₄7H₂O (1000Х партия, на 100 мл, с обработкой в автоклаве) 0,1 г; D. (NH₄)₂SO₄ (1000Х партия, на 100 мл, с обработкой в автоклаве) 20 г.

Дрожжевой экстракт (УЕ, Дифко) добавляют до конечной концентрации 0,01-0,001%.

Кроме того, каждый 1 мл культурной среды содержит примерно 200000 cpm /3-¹⁴C/-глифозата (Амерсхам, CFA-745). Культуры инкубируют с встряхиванием при 30^oC. Изоляты LBAA показали значительный рост в первый день, в то время как другие испытуемые культуры показали незначительный рост до третьего дня. Определение радиоактивности (сцинтилляционный счетчик) в культуре, клеточных дебрис и надосадочной жидкости культуры (на четвертый день) показали общее снижение ¹⁴C-радиоактивности и распределение остаточной радиоактивности в отношении 1:1 в надосадочной жидкости и дебрис, что указывает на произошедший значительный метаболизм глифозата с его поглощением (см. табл. I).

На пятый день 75 мкл надосадочной жидкости всех испытуемых культур анализируют с помощью ВЭЖХ следующим образом. Применяют анионообменную колонку СИНХРОПАК^R AX100 (P. J.Cobert), подвижная фаза состоит из 65 мМ KH₂PO₄ (pH 5,5 добавлением NaOH, в зависимости от требований эксперимента для изменения времен удерживания материала концентрацию фосфатного буфера меняют в пределах 50-75 мМ), режим изократный и элюируемый продукт регистрируют непрерывно с помощью детектора радиоактивности. Данным анализом выявлено, особенно в одном из изолятов (LBAA) полное отсутствие пика глифозата (Время удерживания /ВУ/ = 7 мин в данном анализе) и появление нового пика радиоактивности с тем же временем удерживания, что у метиламина или N-ацетилметиламина (ВУ = 3,5 мин). Охарактеризована коллекция бактерий, в которую входит и штамм LBAA, как разрушающих глифозат до АМФК (Hallas и др., 1988), обнаружение метиламина или N-ацетилметиламина предполагает, что АМФК или N-ацетил АМФК были метаболизированы за счет активности LBAA "C-P-лиазы" с выделением фосфата, необходимого в данном эксперименте для роста культуры. Штамм LBAA исследован более подробно.

Превращение глифозата в АМФК в микробиальных изолятах Для четкости и краткости описана нижеследующая методика выделения генов, кодирующих фермент глифозат-оксидоредуктазу, дается для выделения подобного гена из бактериального изолята (LBAA). Для специалиста очевидно, что такая же или аналогичная стратегия может быть использована для выделения таких генов из других микробиальных изолятов.

Путь разрушения глифозата охарактеризован на покоящихся клетках выращенного в присутствии глифозата штамма LBAA следующим образом. Клетки из культуры LBAA (100 мл) выращивают в DF среде с глюкозой, глюконатом и цитратом в качестве источников углерода, с тиамином и дрожжевым экстрактом (0,01%) для поступления следовых добавок (=DF3S среде) и с 0,2 мМ глифозата в качестве источника фосфора, собирают при значении Klett = 200, промывают дважды 20 мл DF3S среды и эквивалент в 20 мл клеток повторно суспендируют в 100 ul той же среды, содержащей /3-¹⁴C/-глифозат (2,5 ul с радиоактивностью 52 мCi/ммоль). Клеточную смесь инкубируют со встряхиванием при 30^oC и через промежутки времени отбирают образцы (20 мл). Образцы центрифугируют и как надосадочную жидкость, так и клеточные дебрис анализируют с помощью ВЭЖХ (дебрис вновь суспендируют в 100 ul кислой DF3S среды /=DF3S, 0,65 н. HCl/, кипятят 5 мин, недолго центрифугируют и надосадочную жидкость анализируют; подкисленный контроль с глифозатом также анализируют). За 2 ч количество радиоактивности в пике глифозата (ВУ = 7,8 мин) из надосадочной жидкости уменьшилось до -33% от исходного уровня, примерно 3% глифозата обнаружено в клетках. Продукт, элюирущийся совместно с метиламином в качестве стандарта, составил -5% от исходных показаний счетчика для надосадочной жидкости и -1,5% для дебрис. Новый пик, составивший -1,5% от исходной радиоактивности при ВУ = 7,7 мин (ВУ глифозата = 8,9 мин при подкислении в данном эксперименте), идентифицирован в клеточном содержимом. Большое уменьшение общей радиоактивности также предполагает, что в данном эксперименте глифозат подвергается интенсивному метаболизму. Такой путь метаболизма получил дополнительное освещение в опыте, в котором метаболизм /¹⁴C/-АМФК сравнивался с метаболизмом /3-¹⁴C/-глифозата (см. выше) в покоящихся клетках, собранных при значении Klett = 165 и вновь суспендированных при эквиваленте в 15 мл клеток на 100 ul DF3S среды. Образцы, анализируемые с помощью ВЭЖХ, состоят из полных культур, подкисленных и обработанных вышеописанным способом. В первые 2 ч опыта с глифозатом 25% радиоактивности обнаруживаются в пике метиламин/N-ацетилметиламин (БУ = 4,8 мин), 12,5% в виде пика АМФК (ВУ = 6,4 мин), 30% в виде пика, указанного выше (ВУ = 9,4 мин) и 30% в виде пика глифозата (ВУ = 11,8 мин). В опыте с АМФК 15% радиоактивности обнаружено в виде N-ацетилметиламина/метиламина, 59% в виде АМФК и 18% в виде пика с ВУ = 9,4 мин. Модифицированная форма АМФК идентифицирована, как N-ацетил-АМФК. Вывод об аналогичной стадии ацетилирования сделан на основе продуктов, идентифицированных в E.coli, выращенной в аминометилфосфонатах в качестве единственного источника P (Avita и др., 1987). Полученные данные указывают на следующий путь разложения глифозата в LBAA: глифозат ---> АМФК (---> метиламин)---> N-ацетилАМФК ---> N-ацетилметиламин.

Клонирование гена-(ов) глифозат-оксидоредуктазы в E.coli После установления превращения глифозата в АМФК в штамме LBAA был изучен общий подход клонирования в E.coli гена-(ов), участвующего в подобном превращении. Клонирование и генные технологии, если нет особых указаний, соответствуют в целом ранее опубликованным (Maniatis и др., 1982). Стратегия клонирования заключалась в следующем. Введение космидного банка штамма LBAA в E. coli и отбор на ген-(ы) превращения глифозата в АМФК определялись ростом на глифозате в качестве источника фосфора (P). Отбор основывался на применении АМФК, образованным ферментом метаболиза глифозата, в качестве источника P с последующим выделением из АМФК под действием E.coli "C-P-лиазы" неорганических фосфатов (Pi). Большинство штаммов E.coli неспособны усваивать фосфонаты в качестве источника P в исходном состоянии, однако, такие штаммы быстро адаптируются (независимо от RecA) и усваивают фосфонаты (становятся Mpu⁺) (Wackett и др. 1987b). E.coli Mpu⁺ выделен из E.coli SR200 (Leu^-, Pro^-, recA, hsdR, supE, Sm^r, tonA) следующим образом. Аликвоты свежей культуры E.coli SR200 в 1-бульоне наносят на MOPS (Neidhardt и др., 1974) полный агар (т. е. содержит L-лейцин и L-пролин в концентрации 25 ug/мл и витамин B1 /тиамин/ в концентрации 10 ug/мл; агар - ДИФКО "Очищенный"), содержащий в качестве источника P аминометилфосфонат (АМФК, 0,2 мМ, Сигма), MOPS среда включает: 10 мл 10X MOPS солей 2 мл 0,5 мг/мл ТиаминHCl 1 мл 20% глюкозы 10X MOPS соли включает: на 100 мл 40 мл 1М MOPS, pH 7,4 4 мл 1М Трицина, pH 7,4 1 мл 0,01М FeSO₄7H₂O 5 мл 1,9M NH₄Cl 1 мл 0,276 М K₂SO₄ 1 мл 0,5 мМ CaCl₂ 1 мл 0,528 М MgCl₂ 10 мл 5 М NaCl 1 мл 0,5% L-Метионина 1 мл питательных микродобавок В число микродобавок входят: 310^-9 М (NH₄)₆Mn₇O₂₄ 410^-7 М H₃BO₄ 310^-8 М CoCl₂ 1,610^-8 М CuSO₄ 810^-8 М MnCl₂ 110^-8 М ZnSO₄ Шесть отдельных колоний собирают с пластинки с агаром после трехдневного инкубирования при 37^oC и наносят в виде штрихов на MOPS полный агар, содержащий в качестве источника P либо АМФК, либо метилфосфонат (Альфа). Одна колония, обозначенная как E.coli SR200 Mpu⁺, выбрана из тех колоний, которые в равной степени и однородно росли на обоих фосфонатных средах.

Хромосомную ДНК получают из штамма LBAA следующим путем. Дебрис из 100 мл поздней log-фазы культуры LBAA в L-бульоне (Miller, 1972) вновь суспендируют в 10 мл Раствора 1 (Birnboim и Doly, 1979). Добавляют НДС до конечной концентрации в 1% и суспензию подвергают трем циклам замораживания-оттаивания, каждый из которых заключается в погружении на 15 мин в сухой лед и в воду на 10 мин при 70^oC. Лизат затем экстрагируют четыре раза равными объемами смеси фенол-хлороформ (1:1, фенол насыщен TE) (TE = 10 мМ Трис с pH 8; 1 мМ ЭДТК) и фазы разделяют центрифугированием (15000 G, 10 мин). Осаждаемый этанолом продукт получают из надосадочной жидкости в виде дебрис непродолжительным центрифугированием (8000 G, 5 мин) после добавления двух объемов этанола. Дебрис вновь суспендируют в 5 мл TE и диализуют 16 ч при 4^oC в 2 л TE. В результате получено 6 мл раствора ДНК в концентрация 150 мкг/мл.

Частично рестриктированную ДНК получают следующим образом. Три аликвотных образца по 100 мкг LBAA ДНК обрабатывают 1 ч при 37^oC эндонуклеазой рестрикции HindIII в количестве соответственно 4,2 и 1 ферментных единиц/мкг ДНК. Образцы ДНК объединяют, добавляют ЭДТК до концентрации 0,25 мМ и экстрагируют равным объемом фенол-хлороформ. После добавления NaАцетата и этанола ДНК осаждается двумя объемами этанола и отделяется в виде дебрис центрифугированием (12000 G, 10 мин). Высушенные дебрис ДНК вновь суспендируют в 500 мкл TE и расслаивают на 10-40% градиенты сахарозы (5% приращение по 5,5 каждый раз) в 0,5 М NaCl, 50 мМ Трис с pH 8, 0,5 мМ ЭДТК. После центрифугирования в течение 20 ч со скоростью 2600 об/мин в SW28 роторе пробирки пунктируют и отбирают фракции по 1 мл. Пятнадцать мкл образца из каждой третьей фракции пропускают на 0,8% геле агарозы и размер ДНК определяют сравнением с линейной лямбда-ДНК и HindIII-гидролизованной лямбда-ДНК в качестве стандартов. Фракции, содержащие ДНК в виде фрагментов в 25-35 к.о., объединяют, обессоливают на колонках АМИКОН10 (7000 об./мин, 20^oC, 45 мин) и концентрируют осаждением. По этой методике получено 50 ug LBAA ДНК необходимого размера.

Плазмидную pHC79 (Hohn и Collins, 1980) ДНК и вектор, обработанный HindIII-фосфатазой, получают по литературной методике (Maniatis и др., 1982). Лигация проводилась в следующих условиях: Векторная ДНК (обработана HindIII и щелочной фосфатазой теленка) - 1,6 мкг Фракционированные по размеру LBAA HindIII фрагменты - 3,75 мкг 10X буфер лигации - 2,2 мкл 250 мМ Трис-HCl, pH 8 100 мМ MgCl₂ 100 мМ дитиотреитола 2 мМ спермидина T4 ДНК-лигаза (Боэрингер-Маннхэйм) (400 ед./ul) - 1 мкл H₂O - До 22 ul 18 ч при 16^oC.

Подвергнутую лигации ДНК (4 мкл) упаковывают в частицы лямбда-фага (Стратаген, Гигпак Гоулд) использованием методики изготовителя.

E. coli SR200 Mpu⁺, выращиваемую около суток в L-бульоне (с 0,2% мальтозы), заражают 50 мкл упакованной ДНК. Трансформанты отбирают на MOPS полном агаре плюс ампициллин и с глифозатом (0,2 мМ) в качестве источника P.

Для титрования упакованных космид аликвотные образцы также наносят на MOPS (Neidhardt и др., 1974) полный агар плюс ампициллин, содержащий Pi (1 мМ). Космидные трансформанты выделяют спустя 2 дня при 37^oC на той же среде при отношении - 10^-5 на мкг/LBAA HindIII ДНК. Колонии возникают на глифозат-агаре в интервале от дня 3 до дня 10 с конечным отношением 1 на 200-300 космид. Плазмидную ДНК получают из двадцати одного космидного трансформанта, отобранных с глифозатных пластинок. Данные космиды, основываясь на характере HindIII рестрикции плазмидной ДНК, можно разделить по меньшей мере на два класса. Общими для космид класса I являются клонированные фрагменты HindIII рестрикции в 6,4 и 4,2 к.о., для класса II общим является фрагмент в 23 к.п. о. Десять космид, представляющие отклонения от клонированных фрагментов, вновь трансформируют с E.coli SR200 Mpu⁺ и способность усваивать глифозат проверяют отбором путем выращивания на пластинках с MOPS полным агаром плюс ампициллин плюс глифозат. Кроме того определяют конечную плотность клеток, достигаемую культивированием в присутствии глифозата (0,2 мМ в MOPS среде) в качестве источника P, при этом между различными трансформантами удалось обнаружить лишь небольшие отличия. Трансформантами также инокулируют MOPS полный бульон с АМФК в концентрации 0,1 мМ в качестве источника P (для подтверждения наличия активности "C-P-лиазы) и после выдерживания 24 ч при 37^oC разбавляют 100-кратно MOPS полной средой с глифозатом в концентрации 0,1 мМ и /3-¹⁴C/-глифозатом (40000 cpm/мл). Все содержащие космиду клетки разрушают глифозат и образуют N-ацетилАМФК и N-ацетилметиламин без заметной разницы в скорости. В данных испытаниях N-ацетилАМФК обнаружен в надосадочной жидкости культуры. Одна космида класса I, идентифицированная как pMON7468, выбрана для дальнейшего исследования. Второй ген глифозат-оксидоредуктазы идентифицирован в космидном клоне класса II.

Бесклеточные лизаты E. coli SR200 Mpu⁺/pMON17468 получены из клеток, выращенных на MOPS полной среде с глифозатом в концентрации 1 мМ (и с добавками L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана, концентрация каждого 100 мкг/мл, а также п-аминобензойной кислоты, п-гидроксибензойной кислоты и 2,3-дигидроксибензойной кислоты, концентрация каждой 5 мкг/мл для сведения к минимуму ингибирующего действия E.coli ЕПФП-синтетазы). Дебрис (масса примерно 0,5 г во влажном состоянии) вновь суспендируют 1 мл лизисного буфера (40 мМ MOPS с pH 7,4, 4 мМ трицина с pH 7,4, 10% глицерина, 1 мМ ДТТ) и дважды пропускают через французский пресс. Клеточные дебрис удаляют центрифугированием 10 мин при 15000 об./мин. Надосадочную жидкость после добавления MgCl₂ до концентрации 10 мМ анализируют на разрушение радиомеченного глифозата. Глифозат в качестве субстрата поставляется в виде /3-¹⁴С/-глифозата (конечная концентрация = 17 мкМ). Выявленными продуктами являются преимущественно АМФК и некоторое количество N-ацетилАМФК; образование АМФК указывает на клонирование ферментативной активности из штамма LBAA, однако образование N-ацетилАМФК может быть вызвано эндогенной E.coli активностью (Avila и др., 1987). Удельная активность для образования в этих условиях АМФК составляет 13,3 пмоля АМФК/минмг белка.

Характеристика гена превращения глифозата в АМФК Затем в космиде локализуют клонированную область, ответственную за ферментативную активность глифозат-оксидоредуктазы. Выделяют делеции pMON7468 преимущественно в пределах клонированной области использованием ферментов рестрикции, обрезающих внутри вставки случайным образом, применением следующей методики. Образцы плазмидной ДНК по 0,5-2 мкг полностью гидролизуют следующими эндонуклеазами рестрикции; NotI, SacI, BglII или BamHI, экстрагируют смесью фенол-хлороформ, осаждают этанолом, вновь суспендируют в TE буфере и подвергают лигации 2-4 ч при комнатной температуре (или 18 ч при 16^oC) в конечном объеме 50 мкл с буфером лигации и T4 ДНК-лигазой. Трансформанты отбирают в E.coli SR200 Mpu⁺ и эти делеции исследуют на потерю или сохранение фенотипа усвоения глифозата. Эти данные в сочетании с рестрикционным картированием клонов использованы для локализации активной области, оказавшейся вблизи центральной части вставки в pMON7468, включающей два общих HindIII фрагмента (6,4 и 4,2 к.о.). HindIII рестрикционные фрагменты из этой области затем субклонируют в pBIueScript (Стратаген)