Способ дифференциальной диагностики ретинобластомы от ретинита коатса

Способ дифференциальной диагностики ретинобластомы от ретинита коатса

Реферат

 

Изобретение может быть использовано в медицине, а именно в офтальмоонкологии. У пациента осуществляют забор крови, получают сыворотку, в которой определяют концентрацию эритропоэтина, и при его величине 173-230 пкг/мл устанавливают диагноз ретинобластомы, а при отсутствии ЭПО - ретинит Кoатса. Способ более точен, объективен. 1 табл.

Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для повышения эффективности и качества диагностики с целью проведения своевременного и адекватного лечения.

Ретинобластома является наиболее частой злокачественной внутриглазной опухолью у детей. В США ежегодно выявляют 200 новых случаев. В целом ретинобластома встречается у одного ребенка на 14000-20000 новорожденных, по данным различных стран. Опухоль угрожает не только зрительным функциям, но и жизни. Единственным безальтернативным методом лечения монокулярных ретинобластом больших размеров или мультифокальных опухолей является, по мнению многих авторов, энуклеация глаза. Системная полихимиотерапия обязательна для предотвращения метастазов. Хеморедукция (введение жестких химиотерапевтических агентов с целью достижения регрессии опухоли) возможна при условии полной убежденности в диагнозе ретинобластомы.

Вместе с тем, учитывая сходство клинической картины опухоли с ретинитом Коатса, у врача зачастую нет полной уверенности в диагнозе. Оба заболевания встречаются чаще у детей до 5 лет. Клинически (при офтальмоскопии) выявляются опухолевидные бугры, иногда с большим числом новообразованных расширенных сосудов, организованные экссудаты, кальцификаты различной локализации. Помутнение стекловидного тела, отложения опухолевых клеток белесоватого цвета на дне передней камеры, симулирующих гнойный экссудат, который на самом деле является псевдогипопионом, затрудняют постановку диагноза. Принимая во внимание угрозу жизни ребенка в случае ретинобластомы, врач вынужден делать энуклеацию пораженного глаза. Окончательный акцент расставляют гистологи уже после потери органа зрения. Гипердиагностика зафиксирована в 15% случаях, по данным США. Причем в 27% энуклеированных глаз с диагнозом ретинобластомы был установлен ретинит Коатса [Robertson D.M. Analysis of misdiagnosed retinoblastoma in series of 726 enucleated eyes. - Mod. Probl. Ophthalmol. - 1977. - Vol. l8. - P. 156-159]. В то же время, по данным Kopelman, смертность увеличивается в 2,5 раза у пациентов с клинически нераспознанной ретинобластомой (Kopelman J. E. et al. Multivariate analysis of risk factors for metastasis in retinoblastoma treated by enucleation. - Ophthalmology, 1987. - Vol. 94. - P. 371-377].

В настоящее время проведение дифференциальной диагностики между ретинобластомой и ретинитом Коатса остается чрезвычайно актуальной задачей. Для ее решения используются все существующие современные методы исследования, включающие клинико-анамнестические и инструментальные методы исследования (прямая и обратная офтальмоскопия, ядерно-магнитный резонанс, ультразвуковые исследования в двух- и трехмерном изображении, флюоресцентная ангиография, компьютерная томография, интраоперационная биопсия с проведением срочного гистологического исследования биоптата.

Однако ультразвуковое исследование и компьютерная томография не дают четких патогномоничных признаков, свойственных только ретинобластоме или только ретиниту Коатса. При обеих нозологических единицах имеет место проминирующая "+ ткань" с определенными, относительно точными характеристиками (уровень проминенции и диаметр основания, ультразвуковая плотность) и присутствие кальцификатов у 40% детей.

В диагностически сложных случаях решающим оказывается наблюдение в динамике (осмотр, УЗИ каждые 3 месяца; сроки обусловлены скоростью роста подобных опухолей). Однако нельзя забывать о высоком риске метастазирования и значительной прогрессии опухоли даже за указанный срок наблюдения, а также о частых наркозах, в условиях которого проводят эти исследования, учитывая возраст ребенка. Кроме того, в условиях тяжелой экономической инфляции повторные поездки для некоторых больных, проживающих в отдаленных регионах связаны сo значительными материальными затратами, порой неразрешимыми.

Проведение интраоперационной тонко-игольной аспирационной биoпсии со срочной цитологической верификацией сопряженo с психологической нагрузкой, операционной травмой и необходимостью принимать решение о тактике ведения больного на операционном столе. Но более важным, на наш взгляд, является повышение риска метастазирования или повреждение глазного яблока во время биопсии. Лишь отдельные авторы признают этот метод верификации диагноза. Кроме того, в 25% случаях метод оказывается неинформативным.

В связи с вышеизложенным представляется чрезвычайно актуальной разработка способов дифференциальной диагностики, внедрение которых позволит не только поставить диагноз, но и своевременно и обоснованно начать органосохранное лечение, а следовательно, повысить эффективность проводимой терапии и увеличить продолжительность и качество жизни офтальмоoнкологических больных.

Известен иммунологический способ дифференциальной диагностики ретинобластомы от ретинита Коатса на основе исследования комплекса показателей: количественного определения иммуноглобулинов G, A, M в сыворотке крови и слезной жидкости методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, определение содержания T-лимфоцитов в тесте розеткообразования, исследование функциональной активности в реакции бласттрансформации с фитогемаглютинином, набором вирусных и бактериальных антигенов [Хватова А.В. и др. Роль иммунологических тестов в дифференциальной диагностике и прогнозировании ретинобластом. B сб. Диагностика и лечение внутриглазных опухолей. - МНИИ ГБ имени Гельмгольца. - М. , 1986. - C. 68-70]. Установлено, что у детей с ранними стадиями ретинобластом в периферической крови содержание T-лимфоцитов, иммуноглобулинов G, A, M не изменено. Отклонения от нормы в ряде случаев выявляются в периферической крови лишь на поздних стадиях ретинобластомы. Так, снижается общее количество T-лимфоцитов и функциональной их активности, а также общего количества иммуноглобулинов G, A, M в сыворотке крови.

Более выраженные отклонения от нормы выявлены в слезной жидкости пациентов. На ранних стадиях иммуноглобулины G и М (Ig) несколько превысили возрастную норму, а количество Ig A соответствует норме. При ретинобластоме III-IV стадии содержание Ig G и М ниже, чем при I-II стадии, а Ig A ниже, чем в норме, и составляет (2,921,21) мг/%.

Сравнительный анализ показателей неспецифического иммунитета в сыворотке крови детей с увеитами показал, что показатель бласттрансформации с митогенами ниже возрастной нормы, имеет место наличие частичного иммунодефицита Ig A, в то время как в слезной жидкости уровень Ig A, напротив, повышен и составляет в среднем (19,210,1) мг/%.

Таким образом, комплексная оценка иммунологических показателей оказывает определенную помощь в дифференциальной диагностике ретинита Коатса от ретинобластомы. Однако при этом проводится ряд иммунологических реакций и определяется комплекс показателей. Все используемые методики трудоемки. По мнению самих авторов, отмечается общественная вариабельность и индивидуальные колебания, что существенно снижаeт информативность и достоверность способа дифференциальной диагностики (там же, с. 71).

За последнюю декаду в связи с появившимися публикациями о том, что в патогенезе ретинобластомы определенное значение имеют иммунные механизмы, мы предположили, что какие-либо иммунологические показатели могут свидетельствовать о присутствии злокачественного неопластического процесса в организме [Nieken J. et al. Recombinant human interleukin-6 induces a rapid and reversible anemia in cancer patients. - Blood. - 1995. - Vol. 86. - N 3. - P. 900-905]. В качестве такого показателя мы предлагаем использовать эритропоэтин.

Эритропоэтин (ЭПО) относится к семейству иммунорегуляторных пептидов цитокинового ряда. Он осуществляет контрольно-регуляторные функции гемопоэза. Его молекулярный вес 30 тысяч kD. Физиологическим стимулом для усиления его продукции является тканевая гипоксия, которая в большинстве случаев обусловлена снижением числа циркулирующих эритроцитов. Таким образом, ЭПО-продукция и эритропоэз являются частью цикла, который защищает ткани от гипоксии, контролируя число циркулирующих эритроцитов. В норме гипоксия, обусловленная потерей крови, влечет тканевую гипоксию, которая ощущается прежде всего на уровне клеток-продуцентов в почках или печени. Последние начинают секретировать ЭПО. ЭПО достигает костный мозг, связывается с рецепторами на клетках-мишенях (колониеформирующих единицах), проэритробластах, базофильных эритробластах. ЭПО-рецептор относится к семейству рецепторов цитокинов и гематопоэтических факторов роста (гранулоцит-макрофагального колониестимулирующего фактора, тромбопоэтина и ингибирующего лейкемию фактора). Процесс рецептор-лигандного взаимодействия увеличивает продолжительность жизни (путем предотвращения программированной клеточной смерти - апоптоза эритроцитов) и число циркулирующих эритроцитов, а следовательно, устраняет тканевую гипоксию. Концентрация ЭПО, ингибирующая апоптоз, в 100 раз должна превышать физиологическую.

В условиях нормы клетками-продуцентами ЭПО являются небольшая популяция кортикальных интерстициальных почечных клеток, печени и несколько блуждающих клеток [Koury S.T., Boundurant M.C. Quantitation of erythropoietin producing cells in kidneys of mice by in situ hubridization: Correlation with hematocrit, renal erythropoietin mRNA and serum erythropoietin concentration. - Blood. - 1989. - Vol. 74. - P. 645-651]. 90% продукции ЭПО осуществляется в почках. Остальные 10% ЭПО производится в печени. К настоящему моменту известно, что некоторые опухолевые клетки (гепатомных и меланомных линий) также продуцируют ЭПО in vitro [Keay L. et al. Production of recombinant human erythropoietin in Bowes melanoma cells in suspension culture. - Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1990, Nov., 34(2): 198-212; Jelkmann W. et al. Monokines inhibiting erythropoietin production in human hepatoma cultures and in isolated perfused rat kidneys. - Ann. Hematol. - 1993. - Vol. 50. - P. 301-308] .

Известно, что продукция ЭПО печенью значительно повышена у новорожденных и при регенерации органа; не изменена или снижена при болезнях почек, миелопролиферативных состояниях, таких как истинная полицитемия. Высокие уровни ЭПО наблюдаются при любых нарушениях, вызывающих тканевую гипоксию. Эта гипоксия может возникать либо вследствие сниженной (из-за анемии) концентрации гемоглобулина, либо в результате повышения сродства гемоглобина к кислороду, как это наблюдается при увеличении уровня окиси углерода в крови или гемоглобинопатиях с высоким сродством гемоглобина к кислороду. Сниженная оксигенация гемоглобина также может вызывать повышение ЭПО, что также может происходить при заболеваниях легких, сердца или при пребывании на больших высотах. Следовательно, уровень ЭПО может быть использован для дифференцировки первичных и вторичных эритроцитозов.

Избыток ЭПО часто сочетается с эритроцитозом, который обнаруживается в 50% случаев рака почек, в 20% случаев мозжечковой гемангиобластомы, в 15% случаев доброкачественной кисты почек и аденомы. Описаны случаи этого феномена при гепатомах, феохромоцитомах, параганглиомах, фиброзной гистиоцитоме околоушной железы.

В условиях заболеваний почек или гипероксии продукция ЭПО снижается, усиливается апоптоз эритроцитов. Развивается анемия.

У пациентов с раковыми заболеваниями возникает недостаточность компонентов, необходимых для нормального эритропоэза (фолата, железа, витамина B₁₂). Это обусловливает срывы продукции ЭПО. У одних пациентов наблюдается гиперпродукция ЭПО, у других - гипопродукция, у третьих она не изменяется, несмотря на нарастающую анемию.

Анемия - частое осложнение рака. Часто в отсутствие признаков костно-мозговой инфильтрации или потери крови, гемолиза, заболевания почек, печени или эндокринной системы развиваются внутренние причины, объясняющие анемию. Этот тип анемии может называться канцер-ассоциированной анемией (КАА), представляет собой исключительно последовательность развивающихся событий, обусловленных раковым заболеванием. Она разделяет многие черты, присущие анемиям при хронических воспалительных (ревматоидном артрите) и инфекционных заболеваниях (туберкулез) или системных грибковых инфекциях [Cartwaright G. E. The anemia of chronic disorders. - Semin. Hematol. - 1966. - Vol. 3. - P. 351-375]. Этот вид анемии, ассоциирующийся с хроническими заболеваниями, составляет до 52% среди анемичных пациентов без кровопотери, гемолиза или рака крови [Lee G. R. The anemia of chronic disease: spectrum of associated diseases in series of unselected hospitalized patients. - Am. J. Med. - 1989. - Vol. 87. - P. 638-644]. Однако у ряда этих пациентов (в 19% случаях) развитие анемии провоцировал рак [Zucker S. Anemia in cancer. - Cancer Invest. - 1985. - Vol. 3. - P. 249-260].

Суммируя данные нескольких исследователей, канцер-ассоциированная анемия может быть следствием активации иммунной системы злокачественным процессом, в условиях которой определенные провоспалительные цитокины, такие как интерфероны (ИФН), фактор некроза опухоли (ФНО) или интерлейкин-1 (ИЛ-1) могут потенциально опосредовать развитие КАА. У пациентов с гематологическими раками и КАА обнаруживают значительно повышенные уровни ИФН- и неоптерина, маркера активации клеточного иммунитета.

Добавление ИФН- в культуру клеток-продуцентов in vitro сопровождается подавлением продукции ЭПО [Vanucci А.М. et al. Inhibition of erythropoetin production in vitro by human interferon gamma.- Br. J. Haematol. - 1994. - Vol. 87. - P. 18-23]. Уровни неоптерина прямо пропорционально коррелируют с показателями продукции ИФН- и обратно пропорционально с уровнями гемоглобина и железа [Denz Н. et al. Correlation between neopterin, interferon gammaand haemoglobin in patients with haematological disorders. - Eur. J. Haematol. - 1990. - Vol. 44. - P. 186-189]. Эти корреляции указывают на активацию клеточно-опосредованного иммунитета и возможную связь между активированными макрофагами и анемией у этих пациентов.

Концентрация ИФН- увеличивается также при других хронических заболеваниях и коррелирует с активностью воспалительного процесса [Hooks J.J. et al. Immune interferon in circulation of patients with autoimmune disease. - N. Engl. J. Med. - 1979. - Vol. 301. - P. 5-8].

Другим цитокином, выделяемым макрофагами и повышающимся при раках, является ФНО [Balkwill F. et al. Evidence for tumour necrosis factor/cachectin production in cancer. - Lancet. - 1987. - P. 1229-1232]. Продукция ФНО зависит от типа и степени злокачественности опухоли [Tracey K.J. et al. Cachectin/tumor necrosis factor - a alters red blood cell kinetics and induces anemia in vivo. - FASEB J. - 1989. - Vol. 3 - P. 1637-1643]. Пациенты с быстрорастущей опухолью демонстрируют более высокие уровни ФНО, чем в стадии ремиссии и развивающуюся анемию [Nieken L. et al. Chronic exposure to tumor factor in vivo preferentially inhibits erythropoiesis in nude mice. - Blood. - 1989. - Vol. 74. - P. 130-138]. Систематическое назначение рекомбинантного ФНО мышам индуцирует развитие анемии, схожей КАА.

ИЛ-1, как и ФНО, является цитокином с широким спектром действий в иммунном ответе и воспалении [Maury C.P.J. Mechanism of anaemia in rheumatoid arthritis: demonstration of raised interleukin 1 concentrations in anaemic patients and of interleukin 1 mediated supression of normal erythropoiesis and proliferation of human erythroleukaemia (HEL) cells in vitro. - Ann. Rheum. Dis. - 1988. - Vol. 47. - P. 972-978]. Концентрация ИЛ-1 увеличивается при ревматоидном артрите и других хронических процессах, ассоциирующихся с анемией [Hyman G.A. Anemia in malignant neoplastic disease. J. Chron. Dis. - 1963. - Vol. 16. - P. 645-666]. Их уровни прямо пропорциональны степени анемии.

В норме общая масса красных кровяных клеток определяется продолжительностью их жизни и размерами их продукции. Анемия представляется дисбалансом между этими двумя факторами. В случае КАА оба фактора вовлечены в патогенез. Однако более важным является отказ со стороны костного мозга увеличивать продукцию красных кровяных клеток для компенсации укорочения их жизни. Следующими патогенетическими шагами, ответственными за развитие КАА, являются 1) ослабленная утилизация железа; 2) супрессия предшественников эритроидных клеток; 3) неадекватная продукция ЭПО.

За ослабление утилизации железа может быть ответственны другие цитокины: гипоэкспрессия трансферринового рецептора или гиперпродукция ИЛ-6.

КАА развивается при миелодиспластическом синдроме, хронических миелопролиферативных заболеваниях, хронической лимфолейкемии, злокачественной лимфоме, миеломе и солидных опухолях. Сывороточные уровни ЭПО при неопластических процессах представлены в таблице.

Основанием для разработки предлагаемого нами способа явились данные, полученные при обследовании 34 первичных больных с различными стадиями моно- и бинокулярной формы ретинобластомы. Группу сопоставления составили 11 человек с ретинитом Коатса, у которых в сыворотке крови не обнаружили ЭПО ни в одном из случаев.

Частота выявления повышенных уровней ЭПО находилась во взаимосвязи со стадией опухолевого процесса. Так, если при начальных формах монокулярной ретинобластомы ЭПО обнаруживали у 20% (n=5), на стадии T₂N₀M₀ у 50% (n=8), то при далеко зашедших бинокулярных формах опухолей, заполняющих половины глаза и больше, он достигал 90% (n=21). В целом выявляемость сывороточного ЭПО в группе пациентов с ретинобластомой составляла 72%. При этом средние уровни ЭПО составляли (20327) пкг/мл (от 173 до 230 пкг/мл).

Несмотря на то что у наших доноров (детей в возрасте от 3-х месяцев до 14 лет) ЭПО не выявлялся ни в одной из сывороточных проб (n=20), по данным литературы, у доноров выявляют ЭПО в сыворотке в среднем на уровне 4,41,2 мU/мл или 13236 пкг/мл [Jelkmann W. Biology of eritropoeitin. -Clin. Invest. - 1994. - Vol. 72. - P. S3-S10]. В норме уровни циркулирующего сывороточного ЭПО, по данным различных авторов, колеблются от 0 до 25 мU/мл (25%-ная частота выявления, n= 99) [rhErythropoietin in Cancer Supportive Treatment edited J. Smyth, Marc A. Boogaerts, Bernhard R.-M. Ehmer, New York-Basel-Hong Kong. - 1996. - P. 3-33]. При этом авторы не указывают возраст здоровых доноров, которые служили контролем, однако, судя по всему, это были взрослые люди.

Поскольку, по нашим данным, при ретинобластоме выявляемые уровни ЭПО колебались в диапазоне 173-230 пкг/мл, а у детей-доноров контрольной группы он не выявлен ни в одном из случаев, так же, как и в группе сопоставления (больных детей с ретинитом Коатса), мы предлагаем использовать этот иммунологический показатель как дополнительный аргумент в пользу ретинобластомы при проведении дифференциальной диагностики между ретинобластомой и ретинитом Коатса.

Для объяснения гиперпродукции ЭПО может быть предложена версия, согласно которой онкотоксические пептиды, продуцируемые опухолью, вызывают дисбаланс в цитокиновой сети с ускорением апоптоза эритроцитов. В ответ на это развивается тканевая гипоксия и усиливается продукция ЭПО. Мы не раз наблюдали анемию различной степени у детей с первичной нелеченой ретинобластомой.

В качестве другой версии можно высказать предположение о том, что на определенной степени дифференцировки ретинобластомы опухолевые клетки в условиях стимуляции регуляторными пептидами цитокинового ряда (например, ИЛ-6) продуцируют ЭПО на низком уровне.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего произвести дифференциальную диагностику ретинобластомы от ретинита Коатса.

Техническим результатом является объективизация и повышение точности диагностики.

Технический результат достигается за счет исследования сывороточного эритропоэтина как фактора, отражающего дисбаланс в цитокиновой сети, наблюдающегося с самых ранних этапов неопластического процесса до стадии метастазирования.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Из локтевой вены осуществляют забор крови в сухую пробирку в количестве не менее 1 мл.

2. Путем центрифугирования после 30-минутной инкубации в термостате получают сыворотку, которую используют для последующих исследований.

3. После двукратного промывания лунок планшета вносят 300 мкл буфера, соответствующего разведения, предоставляемого тест-системой фирмой-изготовителем, в каждую лунку, затем аспирируют жидкость.

4. Растворяют содержимое ампул со стандартными препаратами, внося по 1 мл буфера для образцов в каждую лунку.

5. В ячейки планшета, предназначенные для нулевой пробы (Blank), вносят по 100 мкл буфера C. В ячейки планшета, предназначенные для калибровки значений, вносят по 100 мкл стандартов ЭПО.

6. В оставшиеся ячейки планшета вносят исследуемые образцы сыворотки в объеме 50 мкл. Инкубируют.

7. Удаляют жидкость из ячеек и трижды промывают их буфером В (300 мкл на одну ячейку). Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

8. Пипеткой вносят в каждую лунку по 100 мкл раствора вторых антител (находящихся в тест-системе). Вновь инкубируют 1 ч.

9. Удаляют жидкость из ячеек и трижды промывают их буфером В (300 мкл на одну ячейку). Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

10. Разбавляют необходимое для анализа количество конъюгатом стрептовидина с пероксидазой хрена (буфером C) и вносят по 100 мкл раствора в каждую ячейку планшета.

11. После инкубации удаляют жидкость из ячеек и трижды промывают их буфером B (300 мкл на одну ячейку). Проводят полную аспирацию оставшейся жидкости.

12. Дважды промывают ячейки путем постукивания по поверхности стока, покрытого фильтровальной бумагой.

13. Вносят во все лунки по 100 мкл раствора субстрата с красителями.

14. После инкубации в течение 15-30 мин в защищенном от света месте и развития голубой окраски реакцию останавливают добавлением 50 мкл раствора серной кислоты в каждую лунку.

15. Проводят учет результатов с использованием автоматического фотометра при длине волны 450 нм, устанавливая нулевое поглощение по нулевой лунке.

16. Строят калибровочную кривую - оптическая плотность/концентрация, на которой определяют графически концентрацию ЭПО в образцах.

В случае выявления уровня ЭПО 173-230 пкг/мл диагностируют ретинобластому.

Пример 1. Ребенок 8 месяцев. Поступил в стационар с жалобами на девиацию левого глаза, свечение левого зрачка в проходящем свете. Глаз стал отклоняться около 2-х месяцев назад, свечение отметили недавно. При биомикроскопии определяются расширенные извитые сосуды эписклеры. При офтальмоскопии: белые массы в стекловидном теле с врастающими сосудами. На УЗИ - "+ткань", выполняющая половину глаза. Клиническая картина напоминает как ретинобластому, так и ретинит Коатса. Исследование сыворотки крови показало высокий уровень ЭПО - 212 пкг/мл. Установлен диагноз ретинобластомы в стадии T₃N₀M₀. Произвели энуклеацию глаза с одномоментной полихимиотерапией на операционном столе. Гистологически верифицирована недифференцированная ретинобластома.

Пример 2. Девочка 5 лет. Поступила в стационар с жалобами на отсутствие зрения в правом глазу. Левый глаз здоров.

При обследовании: острота зрения правого глаза = счет пальцев у лица, левого глаза = 1.0.

Объективно: левый глаз здоров. Инъекция правого глаза по смешанному типу. В передней камере рыхлые белесоватые массы в виде уровня до 1 мм; напоминающие гипопион. Сразу за хрусталиком выявляются плотные белые массы с участками кальцификатов. Сосудов почти нет. Рубеоз радужки. УЗИ: "плюс ткань" с проминенцией до 10 мм. ЭПО в сыворотке крови не выявлен. Диагностировали ретинит Коатса. Пациенту провели противовоспалительное и десенсибилизующее лечение, на фоне которого наступило клиническое улучшение с повышением зрительных функций до 0,5. Ребенок отпущен домой. На контрольной явке: отрицательной динамики не выявлено.

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики между ретинобластомой и ретинитом Коатса, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют концентрацию эритропоэтина (ЭПО) и при его величине 173 - 230 пкг/мл устанавливают диагноз ретинобластомы, а при отсутствии ЭПО - ретинит Коатса.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3