Способы переноса генов in vivo для заживления ран

Способы переноса генов in vivo для заживления ран

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к способу специфического "нацеливания" и переноса ДНК в репарационные клетки млекопитающих in vivo. Переносимая ДНК может включать любую ДНК, кодирующую нужный заживляющий белок, при этом репарационные клетки млекопитающих пролиферируют и мигрируют в область раны, где они активно поглощают и экспрессируют ДНК. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые могут быть использованы при осуществлении данного изобретения для переноса нужной ДНК. Такие композиции включают любую подходящую матрицу в сочетании с нужной ДНК и наборы. Изобретение обеспечивает рациональный способ доставки белков, которые выбрасываются на месте их действия в физиологических количествах для заживления ран. 6 с. и 21 з.п.ф-лы, 12 ил.

1. ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ Настоящее изобретение относится к новому способу in vivo представления и прямого переноса ДНК, кодирующей нужный заживляющий белок в репарационных клетках млекопитающих. Данный способ включает имплантирование матрицы, содержащей нужную ДНК (в дальнейшем называемую "активированной геном матрицей"), в свежую рану. Репарационные клетки, обычно возникающие в жизнеспособной ткани, окружающей рану, пролифелируют и мигрируют в активированную генами матрицу, где они сталкиваются, поглощают и экспрессируют ДНК. Поэтому трансфецированные репарационные клетки действуют как биореакторы in situ (локализованные внутри раны), вырабатывающие агенты (РНК, кодированные ДНК, белки и т.д.), заживляющие рану.

Далее данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые могут быть использованы при осуществлении изобретения, т.е. при переносе нужной ДНК. Такие композиции включают подходящую матрицу в сочетании с нужной ДНК.

2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ 2.1. ЗАЖИВЛЕНИЕ РАН Известные в настоящее время способы заживления ран включают введение заживляющих белков. Такие заживляющие белки могут включать регуляторные факторы, входящие в обычный процесс заживления, такие как системные гормоны, цитокины, факторы роста и другие белки, регулирующие пролиферацию и дифференциацию клеток. Факторы роста, цитокины и гормоны, обладающие в соответствии с описаниями такой ранозаживляющей способностью, включают, например, суперсемейство трансформирующего фактора- роста (TGF-) белков (Cox, D.A., 1995, Cell Biology International, 19:357-371), кислотный фибробластный фактор роста (FGF) (Slavin, J., 1995, Cell Biology International, 19:431-444), фактор, стимулирующий колонию макрофагов (M-CSF) и агенты, регулирующие кальций, такие как паратиреоидный гормон (PTH).

Использование заживляющих белков, т. е. цитокинов, для заживления ран связано с рядом проблем. Во-первых, очистка и/или рекомбинантное получение заживляющих белков зачастую является дорогим и длительным процессом. Однако несмотря на прилагаемые усилия, препараты, включающие очищенные белки, часто оказываются нестойкими при хранении и неудобными при использовании, при этом неустойчивость белков может привести к неожиданным воспалительным реакциям (на продукты распада белков), токсичным для хозяина.

Во-вторых, системная доставка заживляющих белков, т.е. цитокинов, может быть связана с серьезным нежелательным побочным действием в незатронутой ткани. Неэффективная доставка к специфическим клеткам и тканям организма требует введения больших доз белка для того, чтобы достаточное количество белка достигло соответствующей ткани-мишени. Из-за короткого периода полураспада в организме, вызванного протеолитическим распадом, введение белков также может быть повторным, что может вызвать иммунную реакцию против заживляющих белков. Циркуляция больших доз заживляющих белков часто токсична благодаря плейотропному действию введенного белка и может вызвать серьезные побочные действия.

В-третьих, экзогенная доставка рекомбинантных белков является неэффективной. Делались попытки ограничить введение больших доз белка путем иммобилизации заживляющего белка на участке-мишени. Однако такой терапевтический подход осложняет повторное введение белка.

В-четвертых, у большого количества белков, таких как мембранные рецепторы, факторы транскрипции и внутриклеточные связывающие белки, биологическая активность зависит от правильной экспрессии и локализации в клетке. У многих белков правильная клеточная локализация происходит после трансляционного модифицирования белка внутри клеток. Поэтому такие белки не могут быть введены экзогенно таким образом, чтобы быть поглощенными и правильно локализованными внутри клетки.

Как показывают эти проблемы, современные способы использования рекомбинантных белков для заживления ран имеют ряд недостатков, поскольку они не имеют рационального способа доставки экзогенных белков. Эти белки, т.е. цитокины, обычно вырабатываются на месте их действия в физиологических количествах и эффективно доставляются к клеточным поверхностным сигнальным рецепторам.

2.2. ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ Генная терапия изначально задумывалась как терапия по специфическому замещению генов с целью исправления наследуемых дефектов для доставки функционально активных заживляющих генов в клетки-мишени. Первоначальные разработки в соматической генной терапии основывались на косвенных средствах введения генов в ткани, называемых генной терапией ex vivo, т.е. клетки-мишени удаляют из организма, трансфецируют и инфицируют посредством векторов, несущих рекомбинантные гены, и имплантируют обратно в организм ("аутогенный перенос клеток"). В настоящее время существуют методы трансфекции для переноса ДНК в клетки in vitro, включая кальциево-фосфатное осаждение ДНК, трансфекцию диэтиламиноэтилом-декстраном, электропорацию, перенос ДНК посредством липосом или трансдукцию с помощью рекомбинантных вирусных векторов. Такие протоколы, описывающие обработку ex vivo, были предложены для переноса ДНК во многие различные виды клеток, включая эпителиальные клетки (патент США 4868116; Morgan and Mulligan WO 87/00201; Morgan et al., 1987, Science 237: 1476-1479; Morgan and Milligan, патент США N 4980286), эндотелиальные клетки (WO 89/05345), гепатоциты (WO 89/07136; Wolff et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3344-3348; Ledley et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 5335-5339; Wilson and Mulligan, WO 89/07136; Wilson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 8437-8441), фибробласты (Palmer et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1055-1059; Anson et al., 1987, Mol. Biol. Med. 4: 11-20; Rosenberg et al., 1988, Science 242:1575-1578; Naughton & Naughton, патент США 4 963 489), лимфоциты (Anderson et al., патент США N 5 399 346; Blaese, R. M. , et al., 1995, Science 270:475-480) и кроветворные стволовые клетки (Lim, B. , et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8892-8896; Anderson et al., патент США N 5399346).

Недавно был осуществлен прямой перенос генов in vivo препаратами, включающими захваченную липосомами ДНК (Ledley et al., 1987, J. Pediatrics 110: 1); или протеолипосомами, содержащими белки рецептора вирусных оболочек (Nicolau et al. , 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. США 80:1068); а также ДНК, присоединенные к комплексу полилизинового-гликопротеинового носителя. Кроме того, для доставки генов в клетки используют "генные шприцы" (Австралийский патент N 9068389). Высказывалось даже предположение о том, что "оголенная" ДНК или ДНК, связанная с липосомами, может быть включена в состав растворов жидкого носителя для инъецирования в межстеночное пространство для переноса ДНК в клетки (Felgner, WO 90/11092).

Возможно, одной из самых больших проблем, связанных с последними разработками методов генной терапии ex vivo или in vivo, является невозможность эффективного переноса ДНК в популяцию клеток-мишеней и достижения высокого уровня экспрессии генного продукта in vivo. Наиболее эффективной системой считаются вирусные векторы; рекомбинационные репликационно-дефективные вирусные векторы используют для трансдукции, т.е. инфицирования, клеток как ex vivo, так и in vivo. Такие векторы включают ретровирусные, аденовирусные и аденоассоциированные векторы, а также вирусные векторы герпеса. Несмотря на высокую эффективность передачи генов, основные недостатки, связанные с использованием вирусных векторов, включают неспособность многих вирусных векторов инфицировать неделимые клетки; проблемы, связанные с инсерционным мутагенезом; воспалительные реакции на вирус и выработку потенциального вируса-хелпера и/или выработку и передачу опасных вирусов другим пациентам.

Помимо низкой способности большей части видов клеток поглощать и экспрессировать чужую ДНК, многие популяции клеток-мишеней присутствуют в организме в таких небольших количествах, что эффективность представления ДНК специфически нацеленным видам клеток еще более снижается. В настоящее время не существует протокола или способа повышения эффективности, в котором ДНК нацеливалась бы на популяцию клеток-мишеней.

3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Настоящее изобретение относится к новому способу специфического нацеливания и переноса ДНК в репарационные клетки млекопитающих, принимающие участие в заживлении ран для экспрессирования терапевтических продуктов в рану. Способ по данному изобретению включает введение активированной генами матрицы в свежую рану в организме. В таких условиях репарационные клетки локализуются у раны, где они трансфецируются и в результате вырабатывают агенты, кодированные ДНК (РНК, белки и т.д.), улучшающие заживление раны.

Данное изобретение частично основано на открытии того факта, что репарационные клетки, принимающие активное участие в процессе заживления ран, пролиферируют и мигрируют из окружающей ткани в рану и инфильтрируют активированную генами матрицу. Матрица играет роль строительных лесов, способствующих врастанию клеток, и, в свою очередь, передаче генов путем локального накопления репарационных клеток вблизи ДНК. Находясь в матрице, репарационные клетки удивительно эффективно поглощают ДНК и экспрессируют ее в виде продуктов трансляции, т.е. белков, или продуктов транскрипции, т.е. антисенсов и рибозимов. Трансфецированные репарационные клетки в дальнейшем служат локальными биореакторами, усиливая выработку генного продукта in vivo.

Несмотря на то, что в данном способе может быть использовано любое количество последовательностей ДНК, предпочтительно последовательностями ДНК являются последовательности, кодирующие продукты трансляции, т.е. белки, или продукты транскрипции, т.е. антисенсы или рибозимы, которые (а) способствуют репарации тканей; или (б) способны прервать болезненный процесс, обеспечивая таким образом нормальное заживление ткани.

Данное изобретение устраняет недостатки используемых в настоящее время процедур для заживления ран, включающих введение заживляющих белков. Во-первых, устойчивая и нетоксичная ДНК может быть безопасно введена в больших дозах in vivo. Во-вторых, при возможности не требуется повторное введение. Клетки, поглощающие и экспрессирующие ДНК, обеспечивают запас генного продукта в области раны. В-третьих, данное изобретение может быть использовано таким образом, чтобы удовлетворить временным требованиям дозировки. Например, ДНК может быть представлена в векторах, интегрирующих в геном клетки-мишени. В этом случае все дочерние клетки содержат и экспрессируют перенесенную ДНК, действуя таким образом как непрерывный источник терапевтического агента. В противоположность этому, могут быть использованы неинтегрирующие системы, в которых ДНК не интегрирует в геном и ген не передается дочерним клеткам. В таком случае, когда процесс заживления раны завершен и генный продукт более не нужен, он не экспрессируется.

Данное изобретение иллюстрируется примерами, показывающими, что гены могут быть воспроизводимо перенесены и экспрессированы в большом количестве раненых мягких и твердых тканей in vivo. В частности, показано, что способ по данному изобретению снимает проблемы, связанные с имеющимися в настоящее время протоколами по генной терапии. Способ по данному изобретению обеспечивает перенос генов к соответствующему количеству репарационных клеток для достижения функционального действия, т. е. при отсутствии любого другого нацеливания или клеточной идентификации врачом. Способы in vivo генной терапии требуют некоторой формы нацеливания, которая очень часто не срабатывает. В способе по данному изобретению нацеливание не представляет собой проблему. По аналогии, ДНК действует весьма похоже на "приманку" в "ловушке": ДНК сталкивается со случайными репарационными клетками, пролиферировавшими, а затем мигрировавшими в активированную генами матрицу. Эти клетки, в свою очередь, обладают удивительной способностью захвата ДНК и экспрессирования ее в виде терапевтического агента.

В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения способ по данному изобретению может быть использован в качестве системы для доставки лекарственных препаратов путем переноса ДНК в репарационные клетки млекопитающих с целью стимулирования заживления мягких и твердых тканей, а также их регенерации. Репарационными клетками являются такие клетки, которые обычно прибывают в область заживляемой раны. Соответственно, не возникает трудности, связанной с получением подходящих клеток-мишеней, на которые должны воздействовать используемые терапевтические композиции. Все что требуется - это имплантация активированной генами матрицы в области раны. Природа этого биологического окружения такова, что соответствующие репарационные клетки активно поглощают и экспрессируют ДНК-"приманку" при отсутствии какого-либо дальнейшего нацеливания или клеточной идентификации, проводимой практическим врачом.

В другом варианте осуществления изобретения способ по данному изобретению, использующий как биологические, так и синтетические матрицы, может быть использован для переноса ДНК в репарационные клетки млекопитающих с целью стимулирования скелетной регенерации. В следующем варианте осуществления изобретения способ по данному изобретению, использующий как биологические, так и синтетические матрицы, может быть использован для переноса ДНК в клетки млекопитающих с целью стимулирования заживления связок и сухожилий. Далее, способ по данному изобретению, использующий как биологические, так и синтетические матрицы, может быть использован для переноса ДНК в репарационные клетки млекопитающих с целью стимулирования заживления скелетных мышц и/или кровеносных сосудов.

ДНК, используемая при осуществлении данного изобретения, может включать любые кодируемые ДНК трансляционные продукты (т.е. белки) или транскрипционные продукты (т. е. антисенсы или рибозимы), способствующие заживлению тканей или способные прервать процесс заболевания. Например, ДНК может включать гены, кодирующие терапевтически полезные белки, такие как факторы роста, цитокины, гормоны и т.д. Кроме того, ДНК может кодировать антисмысловые или рибозимные молекулы, которые могут ингибировать трансляцию белков, кодирующих мРНК, ингибирующих заживление раны или вызывающие воспаление.

ДНК, кодирующая нужный терапевтический продукт, ассоциируется с матрицей или импрегнируется внутри ее, образуя активированную генами матрицу. После образования активированная генами матрица находится в организме млекопитающего в области раны.

Данное изобретение иллюстрируется примерами, показывающими эффективный перенос и экспрессию генов in vivo в заживающую и регенерирующую ткань.

3.1. ОПРЕДЕЛЕНИЯ Следующие термины имеют в данном описании нижеприведенные значения.

"Активированная геном матрица" (GАМ) означает в данном описании любой матричный материал, содержащий ДНК, кодирующую нужный терапевтический агент. Например, активированные генами матрицы располагаются в организме хозяина-млекопитающего в области раны, способствуя ее заживлению.

"Репарационная клетка" означает в данном описании любую клетку, стимулируемую к миграции и пролиферации в ответ на повреждение ткани. Репарационные клетки являются компонентом заживляющей ответной реакции раны. Такие клетки включают фибробласты, капиллярные эндотелиальные клетки, капиллярные перициты, мононуклеарные воспалительные клетки, сегментированные воспалительные клетки и гранулированные тканевые клетки.

"Область раны" означает любой участок в хозяине, возникающий в результате травматического повреждения тканей или же, наоборот, в результате повреждения тканей во время хирургических процедур.

4. ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ Фиг. 1A. Модель бедренной остеотомии несрастания волокон. Хирургическим способом проводят 5-мм остеотомию бедер взрослых изъятых самцов крыс породы Sprague-Dawley. Показанные зазоры характерны для всей контрольной группы, при этом хозяевам-млекопитающим проводят либо только остеотомию (n=3), остеотомию с коллагеновой губкой (n=10) или остеотомию с коллагеновой губкой, содержащей контрольную (ген-маркер) плазмиду ДНК (n=23). Простой рентгеновский снимок, показывающий бедро контрольной крысы сразу же после операции. Зазор стабилизируют с помощью наружного фиксатора, состоящего из пластинки и 4 штифтов. Разрез кожи закрывают металлическими клипсами.

Фиг. 1B. Простой рентгеновский снимок, показывающий остеотомию бедра контрольной крысы через 9 недель после операции. Закругленные хирургические края (стрелки) возникают в результате реактивного костного образования и согласуются с классическим радиографическим проявлением несросшегося перелома.

Фиг. 1C. Гистологический разрез ткани зазора через 3 недели после операции, показывающий пролиферативные репарационные фибробласты и капилляры, внедренные в отечную внеклеточную матрицу. Также присутствует фокальный воспалительный инфильтрат, состоящий из лимфоцитов и макрофагов.

Фиг. 1D. Гистологический разрез 9-недельного контрольного зазора, показывающий плотную фиброзную ткань. 1 см = 20 м (C и D).

Фиг. 2. Схематическое изображение конструкции pGAM1, кодирующей мышиный BMP-4. Показано положение промотора CMV, последовательности, кодирующей BMP-4, эпитопа HA и сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста.

Фиг. 3A. Экспрессия BMP-4 репарационными фибробластами. Экспрессию BMP-4, кодированную плазмидой, выявляют на фиксированных по способу Bouins, деминерализованных, внедренных с помощью парафина срезах ткани, используя анти-HA антитело и иммуноперекисный метод, через 4 недели после имплантирования активированной генами матрицы, содержащей плазмидную ДНК pGAM1. Стрелки указывают на примеры позитивного (красно-коричневого) окрашивания фибробластной цитоплазмы (микроснимок слева вверху). Эти клетки идентифицируют как фибробласты на основе морфологии веретен, росте пучка и позитивного иммуноокрашивания проколлагена, тип I (не показано). Серийные срезы, инкубированные с неиммунной сывороткой кролика или без первого антитела, являются отрицательными. Отрицательные результаты также получают на контрольных образцах с ложной операцией (только коллагеновая губка), инкубированных с анти-HA.11 антителом (микроснимок справа вверху). Ложное положительное окрашивание макрофагов, остеокластов и остеобластов постоянно наблюдают на контрольных срезах, инкубированных с антителом HA.11. Островок новообразовавшейся кости через 3 недели после переноса pGAM1 показан на микроснимке внизу слева. Новая кость связана с образованием грануляционной ткани. Увеличенный вид новообразовавшейся кости показан на микроснимке внизу справа. Стрелки показывают на предположительные остеобласты на поверхности новых костных трабекул. Ткани зазоров окрашивают, используя гематоксилин и эозин (верхний микроснимок или трихроматическим способом Gomori) (богатые коллагеном ткани окрашиваются в зеленый цвет, нижние микроснимки). 1 см - 20 мм (верхние микроснимки).

Фиг. 3B. Простые рентгенограммы животного (через 23 недели после операции). На рентгенограмме слева стрелки показывают приблизительное расположение остеотомического зазора, заполненного радиоплотной тканью. Следует отметить, что наружный фиксатор убран. Как показано на пестром рисунке, происходит ремоделирование кости. Кончики стрелок показывают дефекты в кости, прилежащей к зазору (последствие размещения штифтов). Два дистальных отверстия от штифтов к этому времени полностью зажили (не показано). Вся фотография, помещенная справа, показывает срез ткани, окрашенной трихроматическим способом Gomori с зазора животного (после умерщвления). Стрелки показывают на зазор, который теперь находится на поверхности хорошо интегрированной кортикальной части кости. Круглые дефекты в области костного мозга (или в области зазора) образуются в результате размещения самых глубоких штифтов фиксатора. Нарушение ткани в нижней части микрограммы является артефактом, возникшим в результате обработки образца.

Фиг. 4A. Схематическое изображение конструкции pGAM2, кодирующей человеческий PHT1-34. Показано положение верхнего длинного концевого повтора, ведущего экспрессию PTH1-34 (стрелка), кодирующей последовательности PTH1-34, промотора SV40, ведущего неоэкспрессию (стрелка), неокодирующей последовательности, последовательностей pBR и нижнего длинного концевого повтора.

Фиг. 4B. Перенос и экспрессия гена PHT1-34 вызывает новообразование кости in vivo. Простая рентгенограмма показывает новый костный мостик 5-мм остеотомического зазора через 9 недель после имплантации в животное, получившее активированную генами матрицу, содержащую плазмиду ДНК pGAM2. Стрелки показывают на радиоплотную ткань в зазоре. Результаты, приведенные в данном случае, характерны для экспериментов с одним дополнительным животным.

Фиг. 5. Новое костное образование in vivo с помощью двухплазмидной активированной геном матрицы. (Верх) Простая рентгенограмма показывает новый костный мостик 5-мм зазора через 4 недели после имплантации в животное, получившее активированную генами матрицу, содержащую pGAM1 плюс плазмидную ДНК pGAM2. Стрелки показывают на радиоплотную ткань в зазоре (гистологически подтвержденную как кость). (Низ) Простая рентгенограмма зазора показана на фото вверху после удаления (пятью неделями ранее; в целом через 17 недель после операции) наружного фиксатора. Стрелки показывают расположение зазора, заполненного радиоплотной тканью, за исключением полоски недоминерализованной ткани вблизи проксимального хирургического края. Как показано на пестром участке, происходит экстенсивная реакция ремоделирования. Результаты, приведенные в данном случае, характерны для экспериментов с одним дополнительным животным.

Фиг. 6. Аденовирусно-опосредованный перенос генов в репарационные/регенерационные клетки in vivo. Имплантат UltraFiber^TM замачивают в течение 6 минут в растворе вируса AdCMV1acZ (10¹⁰ - 10¹¹ бляшкообразующие единицы или PFU/мл), а затем имплантируют на участок остеотомии. Дефекту дают возможность зажить в течение 3 недель, наблюдая в течение этого времени ход процесса заживления раны путем еженедельного рентгенографического исследования. Через 3 недели определяют, что 40% дефекта заполнено мозольной тканью. Хозяина-млекопитающего умерщвляют, ткани закрепляют фиксацией по методу Bouins, а затем деминерализуют в течение 7 дней, используя стандартные растворы муравьиной кислоты. Делают фотомикроснимки поперечного сечения новой кости (мозоль), образовавшегося на месте остеотомии через 3 недели после операции. Снимок слева вверху: следует отметить положительное (красное) -гал цитоплазматическое окрашивание клеток мозольной ткани от аденовирусного имплантата UltraFiber^TM. Этот результат показывает, что рецепторы поверхности клеток, передающие инфекцию, а следовательно, и вирусную трансдукцию, экспрессируются (по крайней мере одна популяция) мозольными клетками во время процесса заживления перелома. Снимок слева вверху: серийный отрицательный контроль среза, окрашенный носителем -гал антитела плюс смесь неспецифических антител LgG кролика. Снимок внизу: следует отметить положительное (красное) -гал ядерное окрашивание хондроцитов на участке остеотомии, заполненном UltraFiber^TM и AdRSVntlacZ. Этот результат показывает полную специфичность анти--гал антитела и окончательно демонстрирует экспрессию продукта гена-маркера в остеотомическом зазоре.

Фиг. 7. Перенос гена плазмиды pGAM2 к репарационным фибробластам приводит к росту новой кости на модели остеотомии у крысы. Простая рентгенограмма показывает новый костный мостик 5-мм зазора через 6 недель после имплантации в животное, получившее активированную генами матрицу, содержащую pGAM1 плюс плазмидную ДНК pGAM2. Стрелки показывают на радиоплотную ткань в зазоре (гистологически подтвержденную как кость).

5. СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ОСУЩЕСТВИМОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Настоящее изобретение относится к способу представления и переноса ДНК in vivo в репарационные клетки млекопитающих с целью экспрессирования терапевтических агентов. Способ по данному изобретению включает имплантирование или размещение активированной геном матрицы в область свежей раны.

Заживление ран обычно представляет собой координированную, стереотипную последовательность событий, включающих (a) разрыв ткани и потерю ее нормального строения; (b) некроз клеток и кровоизлияние; гемостаз (образование сгустков); (c) инфильтрацию сегментированных и мононуклеарных воспалительных клеток с сосудистым застоем и отеком тканей; (d) растворение сгустка, а также поврежденных клеток и тканей мононуклеарными клетками (макрофаги) и (e) образование грануляционной ткани (фиброплазия и ангиогенез). Эта последовательность клеточных явлений наблюдается в ранах в отношении всех тканей и органов в большом количестве видов млекопитающих (Gailet et al., 1994, Curr. Opin. Cell. Biol. 6: 717-725). Поэтому вышеописанная клеточная последовательность является универсальной при заживлении всех тканей млекопитающих.

Данное изобретение основано на открытии того факта, что репарационные клетки, принимающие участие в процессе заживления раны, естественно пролиферируют и мигрируют в область повреждения тканей и инфильтруют активированную генами матрицу. Удивительно, что эти репарационные клетки, которые обычно трудно успешно трансфецировать in vitro или in vivo, чрезвычайно эффективно поглощают и экспрессируют ДНК при активировании пролиферации процессом заживления ран.

Используя эту особенность, способы по данному изобретению направлены на эффективный перенос одной или нескольких молекул ДНК, кодирующей терапевтические агенты, к пролиферирующим репарационным клеткам. Способы включают введение активированной генами матрицы, содержащей продукты трансляции, кодируемые ДНК (т.е. заживляющие белки) или продукты транскрипции (т.е. антисенсы или рибозимы), в млекопитающее хозяина в области раны. Рана может возникнуть в результате травматического повреждения тканей или, наоборот, в результате повреждения тканей во время хирургических процедур.

Поскольку пролифелирующие репарационные клетки мигрируют в активированную генами матрицу и контактируют с ней, они поглощают и экспессируют нужную ДНК, таким образом увеличивая количество терапевтического вещества, белка или РНК. При этом трансфецированные репарационные клетки служат локальными биореакторами, вырабатывающими терапевтические вещества, действующие на локальную репарационную среду. Например, факторы роста или цитокины, вырабатывающиеся трансфецированными репарационными клетками, связывают и стимулируют эффекторные клетки-мишени, экспрессирующие рецепторы поверхности родственных клеток, таким образом стимулируя и усиливая цепь физиологических явлений, обычно ассоциируемых с процессом заживления ран.

Альтернативно, репарационные клетки могут поглощать и экспрессировать белки, кодируемые ДНК, которые ингибируют активность антагонистов процесса заживления ран. ДНК может также кодировать антисмысловые или рибозимные молекулы РНК, которые могут быть использованы для ингибирования трансляции мРНК, кодирующих воспалительные белки или другие факторы, ингибирующие заживление ран или вызывающие излишний фиброз.

Активированная генами матрица по данному изобретению может быть использована в организме пациента в соответствии с различными способами. Например, при стимулировании заживления и регенерации ран матрицы помещают непосредственно в область раны, т.е. поломанную кость, поврежденную соединительную ткань и т.д. При заживлении кожи матрицы находят местное применение. При использовании для регенерации органов матрицы хирургическим путем помещают в рану на органе.

Поскольку способ по данному изобретению основан на естественной миграции и пролиферации репарационных клеток в область раны, а также инфильтрации в активированную генами матрицу, расположенную в области раны, с последующим поглощением ДНК, следует указать, что матрицы должны применяться в организме только после индуцирования процесса заживления ран.

Важной особенностью настоящего изобретения является тот факт, что репарационный процесс может быть проведен таким образом, чтобы привести к образованию либо рубцовой ткани и/или регенерации ткани. Например, сверхэкспрессия заживляющих белков в области раны может привести к регенерации поврежденной ткани без образования рубцовой ткани. Во многих случаях, например, таких как заживление костей, такая регенерация желательна, потому что рубцовая ткань не лучшим образом предназначена для выполнения обычных механических функций. Альтернативно, может возникнуть необходимость образования вокруг шва рубцовой ткани для соединения изначально слабой ткани. Следовательно, способы по данному изобретению могут быть использованы для стимулирования ран с образованием рубцовой ткани или без него в зависимости от вида и уровня экспрессируемых заживляющих белков.

Прямой перенос плазмидной ДНК из матрицы в репарационную клетку млекопитающего путем стимулирования процесса заживления ран имеет ряд преимуществ. Во-первых, легкость получения и очистки конструкций ДНК говорит в его пользу по сравнению со стоимостью традиционного способа получения белка. Во-вторых, матрицы могут действовать как строительные леса, способствуя врастанию и пролиферации клеток. Таким образом, они облегчают нацеливание репарационных клеток для переноса генов. В-третьих, прямой перенос генов может оказаться преимущественным способом доставки лекарственных веществ в молекулы, обычно подвергающиеся комплексной биосинтетической обработке, или в рецепторы, которые должны быть правильно размещены в клеточной мембране. Эти виды молекул окажутся недееспособными при экзогенной доставке в клетки.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим содержащие ДНК матрицы, используемые для заживления ран. Композиции по данному изобретению обычно состоят из биосовместимого или совместимого с костями матричного материала, содержащего ДНК, кодирующую нужный заживляющий белок.

Данное изобретение устраняет недостатки, связанные с используемыми в настоящее время рекомбинантно-белковыми методами заживления ран. Во-первых, прямой перенос генов является рациональным, что позволяет трансфецированным клеткам (a) вырабатывать физиологическое количество заживляющего белка, модифицированного в соответствии со специфической тканью и средой, и (b) доставлять этот белок к соответствующему сигнальному рецептору на поверхности клетки в соответствующих условиях. По вышеизложенным причинам ожидается, что экзогенная доставка таких молекул связана с серьезными проблемами по дозировке и доставке. Во-вторых, там, где это возможно, при использовании технологии активированной генами матрицы повторное введение не требуется: поглощение ДНК клетками может точно контролироваться с помощью хорошо разработанной технологии непрерывной доставки или, наоборот, интеграция трансфецированной ДНК может быть связана с длительной экспрессией рекомбинантного белка.

Способ по данному изобретению может быть универсально применен для заживления ран, включающих множество различных клеток, тканей и органов; репарационные клетки грануляционной ткани (Gailet et al., 1994, Curr. Opin. Cell. Biol. 6: 717-725) "нацелены" при использовании способа по данному изобретению. В данном случае изобретение демонстрируется на трех моделях животных (собака, крыса и кролик) и пяти тканях (костной, сухожилий, связок, кровеносно-сосудистой и скелетно-мышечной) с использованием трех генов-маркеров (-галактозидаза, люцифераза и щелочная фосфатаза), трех систем промоторов (CMV, RSV, LTR и SV40), двух видов матриц (биологической и синтетической). Во всех случаях репарационные клетки, мигрировавшие в активированную генами матрицу, успешно трансфицируются. В частности, функциональный выход (рост костей) показан после переноса генов в репарирующие фибробласты плазмидной конструкции, кодирующей либо BMP-4, действующий как сигнально-трансдуцирующий переключатель для дифференциации и роста остеобластов (Wozney, 1992, Mol. Reprod. Dev. 32:160-167; Reddi, 1994, Curr. Opin. Genet. Deve. 4:737-744), либо PTH1-34, рекрутирующий предшественники остеоклеток (Orloff, et al., 1992, Endocrinology 131:1603-1611; Dempster et al., 1995, Endocrin. Rev. 4:247-250).

5.1. АКТИВИРОВАННАЯ ГЕНАМИ МАТРИЦА Любой биосовместимый матричный материал, содержащий ДНК, кодирующую нужное терапевтическое вещество, такое как продукт трансляции, т.е. заживляющие белки, или продукты траскрипции, т.е. антисенсы или рибозимы, может быть получен и использован в соответствии с данным изобретением.

Активированные генами матрицы по данному изобретению могут быть получены из любого биосовместимого материала. Такие материалы могут включать, но не ограничиваются ими, биоразлагаемые или небиоразлагаемые материалы, изготовленные в виде "подмостков", поддерживающих присоединение и рост клеток, порошки или гели. Матрицы могут быть изготовлены из синтетических полимеров или натуральных белков, таких как коллаген, других внеклеточных матричных белков или иных структурных макромолекул.

ДНК, внедренная в матрицу, может кодировать любой из различных заживляющих белков в зависимости от предполагаемого терапевтического применения. Такие белки могут включать факторы роста, цитокины, гормоны или любые другие белки, способные регулировать рост, дифференцирование или физиологическую функцию клеток. ДНК может также кодировать антисмысловые или рибозимные молекулы, ингибирующие трансляцию белков, которые ингибируют заживление ран и/или вызывают воспаление.

Нет необходимости интегрировать перенесенную ДНК в геном клетки-мишени; на самом деле, использование неинтегрирующейся ДНК в активированной генами матрице является предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения. Таким образом, после завершения процесса заживления раны и прекращения необходимости в генном продукте этот продукт не экспрессируется.

Терапевтические наборы, содержащие биосовместимую матрицу и ДНК, являются еще одним аспектом данного изобретения. В некоторых случаях наборы содержат заранее приготовленные активированные генами матрицы, таким образом давая возможность врачу непосредственно вводить матрицу в организм. Альтернативно, указанные наборы могут содержать компоненты, необходимые для получения активированной генами матрицы. В таких случаях врач может соединять компоненты для получения активированных генами матриц, которые могут быть затем использованы для терапевтических целей путем введения в организм. В соответствии с вариантом осуществления данного изобретения матрицы могут быть использованы для нанесения покрытий на хирургические материалы, такие как шовные материалы или имплантаты. В соответствии со следующим вариантом осуществления данного изобретения активированные генами матрицы могут включать готовые к использованию губки, трубки, перевязочные средства, лиофилизированные компоненты, гели, накладки или порошки и прокладки из тефлы.

5.1.1. МАТРИЧНЫЕ МАТЕРИАЛЫ В соответствии с одним из аспектов данного изобретения получают композиции, в которых ДНК, кодирующая нужное терапевтическое вещество, связана или импрегнирована внутри матрицы для получения активированной генами матрицы. Состав матрицы предназначен для (i) облегчения врастания репарационных клеток (нацеливания); и (ii) принятия ДНК (доставка). После получения активированной генами матрицы ее сохраняют для б