Штамм коровьего вируса герпеса типа 1 (внv-1) сncm №1-1213, вакцина, диагностический серологический реактив, способ вакцинации, способ серологического отличия

Штамм коровьего вируса герпеса типа 1 (внv-1) сncm №1-1213, вакцина, диагностический серологический реактив, способ вакцинации, способ серологического отличия

Реферат

 

Изобретение относится к области вакцинации и диагностики заболеваний К. Р. С. , вызываемых патогенными бактериями, в частности к живым ослабленным и инактивированным вакцинам для защиты животных против вируса герпеса типа 1. Вакцина создана на основе мутанта вируса герпеса BHV-I, имеющего делецию в gЕ-гене гликопротеида, с геном, имеющим соответствующие местоположение в геноме BHV-I, причем указанная делеция позволяет мутанту отличаться серологически от BHV-I дикого типа. Изобретение касается также диагностических наборов для обнаружения нуклеиновой кислоты BHV-I, антител, специфичных для BHV-I, белка BHV-I и способа определения инфекции BHV-I у животных. Разработанные препараты и способ отличаются высокой эффективностью и безопасностью. 5 с.п.ф-лы, 24 ил. 2 табл.

Область изобретения Изобретение относится к областям вакцинации и диагностики в связи с заболеваниями, которые вызываются патогенными бактериями, и включает использование как классических способов получения живой ослабленной вакцины или инактивированной вакцины, так и современных способов, основанных на ДНК рекомбинантной технологии.

Более конкретно, изобретение относится к живым ослабленным вакцинам и инактивированным вакцинам для защиты животных, особенно крупного рогатого скота, против вируса герпеса типа 1 у коров /BHV-1/, причем эти вакцины таковы, что они не только безопасны и эффективны, но также дают возможность отличить зараженных от незараженных животных в вакцинированной популяции.

Диагностические комплексы и процедуры, которые можно использовать для такого теста на различение зараженных и незараженных животных в вакцинированной популяции, являются также аспектом настоящего изобретения.

Предпосылки изобретения BHV-1, включая инфекционный вирус ринотрахеита /IBPV/ и инфекционный пустулезный вирус вульвовагинита /IPVV/, играет важную роль в развитии респираторных заболеваний и нарушении плодовитости у коров. После острого заражения BH-1 часто остается у носителя в латентной форме. Латентный вирус может вновь активизироваться под влиянием стресса - что может сопровождаться клиническими проявлениями -, а затем вывестись из организма. Как следствие, зараженный скот можно рассматривать как потенциальный разносчик BHV-1. BHV-1 часто приобретает эндемический характер приблизительно в 75% голландских ферм. Особенно серологически позитивны к нему старые животные.

Существует ряд инактивированных /"убитых"/ вакцин и множество ослабленных /"живых"/ вакцин для прививки против заражений BHV-1. Инактивированные вакцины готовятся умерщвлением вируса BHV-1, например, теплообработкой, облучением или обработкой этанолом или формалином. Однако это не всегда обеспечивает достаточную защиту. Ослабленные вакцины готовятся большим числом пересевов на гомологичные /коровьи/ или на гетерологичные клетки, такие как клетки свиньи или собаки, и иногда потом вирусы также обрабатываются физически или химически. Таким образом, в геноме вируса развиваются неизвестные мутации/делеции, которые часто снижают свойства вируса, продуцирующие заболевание. Ослабленные живые вакцины дают лучшую защиту, чем инактивированные вакцины, поскольку они дают больше вирусных антигенов иммунной системе хозяина. Другим важным преимуществом живых вакцин является то, что их можно назначать через нос, т.е. на участке, где происходит первое размножение вируса дикого типа после заражения. И все же живые вакцины нуждаются в усовершенствовании. Некоторые живые вакцины все еще обладают абортогенной способностью, что проявляется особенно после внутримышечного назначения. Кроме того, вероятно, все живые вакцины присутствуют в вакцинированной корове в латентном состоянии. И существует вероятность, что, если вакцина не сильно отличается от вируса дикого типа, возможен возврат к вирулентности. Но одна из основных проблем заключается в том, что вакцины BHV-1 не могут помешать заражению вирусами дикого типа. В результате вакцинированный скот может также разносить BHV-1 дикого типа.

Для хорошей программы контроля BHV-1 необходимо иметь эффективную и безопасную вакцину, которую можно отличить от вируса дикого типа, поскольку применение эффективной вакцины может снизить значительно циркуляцию BHV-1, а тест, который может различить вакцину и вирус дикого типа, делает возможным обнаружение /и затем удаление/ инфицированного скота в вакцинированной популяции.

Были разработаны BHV-1 вакцины, которые представлены как более безопасные, чем традиционные вакцины, и отличительные от вируса дикого типа. Был изолирован мутант с делецией тимидинкиназы, который обладает меньшей абортогенностью, становится латентным не так часто и не может реактивироваться. Кроме того, с использованием техники рекомбинантной ДНК была создана BHV-1 вакцина, которая имела делецию в гене для гликопротеина gIII, что делает эту вакцину отличаемой от BHV-1 дикого типа посредством серологических приемов. Однако все же существуют возражения против этих вакцин. С одной стороны, ген тимидинкиназы вовлечен в вирусную репликацию, а снижение репликации ведет к снижению защиты. С другой стороны, гликопротеин gIII важен для выработки защитных антител, что делает менее эффективной вакцину с делецией gIII. Практическая проблема заключается в том, что внутриносовое введение, которое дает наилучшую защиту в случае рекомбинантных вакцин, не разрешено в некоторых странах. Соответственно, существует необходимость создания вакцины, которая была бы столь же безопасна, как и эффективна, и, кроме того, отличима от BHV-1 дикого типа, еще также желательно, чтобы, по меньшей мере, одна из таких вакцин была основана на вирусе, ослабленном с помощью традиционной техники, нежели вирусе, созданном техникой рекомбинантной ДНК.

Теперь, с помощью пересевов в клеточных культурах был получен штамм BHV-1, в котором отсутствует ген гликопротеина gE. Первые результаты наших исследований показывают, что этот ген очень полезен в серологическом разграничении с BHV-1 дикого типа и что он участвует в выражении вирулентности. Поэтому его делеция способствует безопасности и может сделать использование делеций тимидинкиназы ненужным. Гликопротеин gE представляется менее важным для индуцирования защиты, чем гликопротеин gIII. Ослабленный традиционным способом штамм BHV-1, который можно серологически отличить от вируса дикого типа, уникален. Расположение и последовательность ДНК гена gE, описанные здесь в первый раз, не были ранее известны. Не были также известны ни олигонуклеотиды, ни полипептиды и олигопептиды, которые можно получить от них. Проба на серологическое различение на основе gE гена также уникальна.

Важное преимущество этого "традиционного" мутанта с делецией gE /"традиционным" считается использование традиционного метода для изоляции ослабленного вируса/ заключается в том, что его внутриносовое назначение допускается в странах, где это запрещено в отношении рекомбинантных вакцин. Однако с учетом различных мнений по безопасности, кроме этой традиционной вакцины с делецией gE, были также созданы конкретные рекомбинантные варианты. Эти рекомбинантные вакцины также имели делению gE и могут иметь или не иметь делецию гена тимидинкиназы, и также могут использоваться как векторы для экспрессии гетерологичных векторов. Все эти рекомбинантные вакцины можно отличить от вируса дикого типа с помощью того же gE-специфичного теста. Использование стандартного теста для ряда разных вакцин может быть большим преимуществом в борьбе с BHV-1 в международном масштабе. Такой подход не был ранее описан в области BHV-1 вакцин.

Серологический анализ ответной реакции на BHV-1 у скота показал, что важная фракция анти-gE антител направлена против комплекса, сформированного гликопротеином gE и другим гликопротеином BHV-1 - гликопротеином gI. Поэтому серологические тесты, которые могут /также/ демонстрировать присутствие таких комплекс-специфических антител, более чувствительны, чем тесты, которые могут только обнаруживать анти-gE антитела. Скот, вакцинированный одним мутантом с делецией gE, может вырабатывать анти-gI антитела, которые могут помешать обнаружению анти-gI/gE антител. Следовательно, это изобретение также включает вакцину с двойной делецией gI/gE.

Содержание изобретения Во-первых, это изобретение предусматривает мутант с делецией BHV-1, который имеет делецию в gE-гене гликопротеина. Слова "деления в" охватывают делецию гена в целом.

Предпочтительный вариант изобретения предполагает мутант BHV-1 с делецией, который имеет делецию в gE-гене гликопротеина, что вызвано процедурой ослабления, такой, как мутант с делецией Difivac-1, описанной ниже.

Другие предпочтительные варианты изобретения заключаются в мутанте с делецией BHV-1, включающем делецию в gE-гене гликопротеина, который был создан технологией рекомбинантной ДНК, такой, как мутанты с делецией IB7 или IB8, описанные ниже.

Другой предпочтительный вариант изобретения состоит из мутанта BHV-1 с двойной делецией, включающего делецию в gE-гене гликопротеина и делецию в gI-гене гликопротеина, такого, как мутант с двойной делецией gI/gE Difivac-1E, описанный ниже.

Кроме того, учитывая максимальную безопасность, в соответствии с изобретением, предпочтителен мутант с делецией BHV-1, который имеет делецию в gE-гене гликопротеина и делецию в гене тимидинкиназы. В изобретение включен также мутант с делецией BHV-1, который имеет делецию в gE-гене гликопротеина, gI-гене гликопротеина, и гене тимидинкиназы.

Изобретение предусматривает композицию вакцины для вакцинации животных, в частности млекопитающих, конкретнее коров, чтобы защитить их против BHV-1, включающую мутант с делецией BHV-1, как описано выше, и подходящий носитель или стимулятор. Указанная композиция может быть композицией живой или инактивированной вакцины.

Далее изобретение предусматривает мутант BHV-1, который имеет делецию в gE-гене гликопротеина и содержит гетерологичный ген, введенный технологией рекомбинантной ДНК. Предпочтительно это касается мутанта BHV-1, который содержит гетерологичный ген, введенный технологией рекомбинантной ДНК, в местоположение gE-гена гликопротеина, и этот гетерологичный ген находится под контролем регуляторных последовательностей gE-гена и может быть связан с частью gE-гена, которая кодирует сигнальный пептид. Такой гетерологичный ген может также быть под контролем другого промотора BHV-1 или под контролем гетерологичного промотора. Если мутант BHV-1 имеет другие делеции в дополнение к делеции в gE-гена гликопротеина, такие, как делеция в гене тимидинкиназы и/или делеция в gI-гене гликопротеина, указанный гетерологичный ген можно также ввести в местоположение этой дополнительной делеции /й/. Множественные вставки - еще одна возможность либо в месте в местоположении одной делеции, либо распределенные по местоположениям нескольких делеции.

Введенный гетерологичный ген предпочтительно кодирует для иммунногенного белка или пептида другого патогена или для цитокина, который стимулирует иммунную реакцию. Примерами подходящих цитокинов являются интерлейкин 2, интерферон-альфа и интерферон-гамма.

Изобретение также предусматривает /живую или инактивированную/ композицию вакцины для вакцинации животных, в частности млекопитающих, конкретнее коров, чтобы защитить их против /различных/ патогенных бактерий, включающую мутант BHV-1, имеющий в себе кодирование гетерологичного гена для иммунногенного белка или пептида этого другого патогена, и подходящий носитель стимулятора. Конечно, защита может относиться более чем к одному патогену, т.е. это многовалентная вакцина, в которой мутант содержит множество гетерологичных генов.

Далее изобретение относится к композиции, включающей рекомбинантную нуклеиновую кислоту, содержащую gE-ген гликопротеина BHV-1, часть этого gE-гена гликопротеина или нуклеотидную последовательность, производную от этого gE-гена гликопротеина. Эта композиция может содержать вектор для клонирования или экспрессии, имеющий в себе вставку рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая включает gE-ген гликопротеина BHV-1, часть этого gE-гена гликопротеина или нуклеотидную последовательность, производную от этого gE-гена гликопротеина.

Изобретение также включает композицию, содержащую гликопротеин gE BHV-1, часть этого гликопротеина gE, пептид, производный от этого гликопротеина gE, или комплекс гликопротеинов gE и gI, и композицию, содержащую антитело, которое специфично для гликопротеина gE BHV-1, части этого гликопротеина gE, пептида, производного от этого гликопротеина gE, или комплекса гликопротеинов gE и gI. "Антитело" означает как препарат поликлонального антитела, так и моноклонального антитела, предпочитаемый для большинства применений. Под терминами "часть гликопротеина gE" и "пептид, производный от гликопротеина gE" понимается обозначение последовательностей gE-специфической аминокислоты, которые обычно имеют длину, по меньшей мере, около 8 аминокислот.

Далее изобретение относится к диагностическим комплексам и процедурам для обнаружения нуклеиновой кислоты BHV-1 в образце, биологическом образце, таком как кровь или сыворотка крови, кровяные клетки, молоко, жидкости тела, такие как слезы, промывающая жидкость легких, носовая жидкость, сперма, в частности семенная жидкость, слюна, мокрота или ткань, в частности нервная ткань, животного, в частности млекопитающего, конкретно коровы, включающим зонд или праймер нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, полученную от gE-гена гликопротеинa BHV-1, и средства обнаружения, пригодные для реакции на обнаружение нуклеиновой кислоты.

Далее, изобретение относится к диагностическим комплексам и процедурам для обнаружения антител, которые специфичны для BHV-1 в образце, в частности биологическом образце, таком как кровь или сыворотка крови, слюна, мокрота, жидкости тела, такие как слезы, промывающая жидкость легких, носовая жидкость, молоко, или ткань животного, конкретно коровы, включающим гликопротеин gE BHV-1, часть этого гликопротеина gE, пептид, производный от этого гликопротеина gE, или комплекс гликопротеинов gE и gI, и средства обнаружения, пригодные для реакции на обнаружение антитела. Такие диагностические процедуры могут также содержать одно или несколько антител, которые специфичны для гликопротеина gE BHV-1 или специфичны для комплекса гликопротеинов gE и gI BHV-1.

Изобретение также относится к диагностическим процедурам для обнаружения белка BHV-1 в образце, в частности биологическом образце, таком как кровь или сыворотка крови, клетки крови, молоко, жидкости тела, такие как слезы, промывающая жидкость легких, носовая жидкость, сперма, в частности семенная жидкость, слюна, мокрота или ткань, в частности нервная ткань, животного, млекопитающего, конкретнее коровы, включающим одно или несколько антител, которые специфичны для гликопротеина gE BHV-1 или специфичны для комплекса гликопротеинов gE и gI BHV-1, и средства обнаружения, пригодные для анализа на обнаружение белка.

Изобретение далее предусматривает способ определения заражения BHV-1 животного, в частности млекопитающего, конкретно коровы, включающий исследование образца от животного, в частности биологического образца, такого как кровь, или сыворотка крови, клетки крови, сперма, в частности семенная жидкость, слюна, жидкости тела, такие как слезы, промывающая жидкость легких, носовая жидкость, молоко, или ткань, в частности нервная ткань, на присутствие нуклеиновой кислоты, содержащей gE-ген гликопротеина BHV-1, или присутствие гликопротеид gE BHV-1, или присутствие антител, которые специфичны для гликопротеин gE BHV-1 или специфичны для комплекса гликопротеинов gE и gI BHV-1. Образец для исследования может быть взят у животного, которое ранее не вакцинировалось композицией вакцины по изобретению или у животного, которое ранее вакцинировалось препаратом вакцины по изобретению.

Подробное описание изобретения Изобретение относится к ряду BHV-1 вакцин как живых, так и инактивированных, у которых общее то, что в них полностью или частично отсутствует гликопротеин gE ген. Эта серия включает как естественный мутант с gE делецией, так и созданные мутанты с делецией gE, которые могут включать или не включать также делецию гена тимидинкиназы и/или гена gI гликопротеина, и созданные мутанты с делецией gE, которые используются как векторы для гетерологичных генов. Изобретение далее относится к нуклеотидным последовательностям, кодирующим гликопротеид gE-ген BHV-1, олигонуклеотидам, производным от этих последовательностей, самому гликопротеину gE, пептидам, которые получены от них, и /моноклональным или поликлональным/ антителам, которые направлены против gE гликопротеина и пептидов, полученных от них. Изобретение также относится к комплексам гликопротеинов gE и gI BHV-1 и к антителам, направленным против таких комплексов.

Эти материалы в соответствии с изобретением можно использовать для: 1/ вакцинации скота против заболеваний, вызванных BHV-1, так что можно различить зараженных BHV-1 животных и вакцинированных животных, наряду с традиционной можно использовать созданную вакцину; 2/ вакцинации скота против как заболеваний BHV-1, так и заболеваний, вызванных другими патогенными бактериями, кодирующие последовательности которых для защитных антигенов можно ввести в мутанты с делецией BHV-1; 3/ исследования крови, сыворотки, молока или других жидкостей тела скота на серологическое определение или посредством техники обнаружения нуклеиновой кислоты /например, ЦРП (ЦРП - цепная реакция полимеразы)/, были ли животные заражены BHV-1 дикого типа или были вакцинированы мутантом с делецией gE.

Синтез олигопептидов, полипептидов и гликопротеинов, полученных от кодирующей последовательности гликопротеин gE-гена и гликопротеин gI-гена BHV-1.

Результаты анализа последовательности ДНК, описанного в примерах, гликопротеин gE-гена /фиг. 3А/ и изолированных фрагментов ДНК, которые кодируют для этого гена, делают возможным, используя стандартные молекулярно-биологические процедуры, как синтезировать пептиды gE белка /олиго- или полипептиды/, так и выразить gE белок полностью или большими частями через прокариотный путь /в бактериях/ или через эукариотный путь /например, в мышиных клетках/. Через эти пути можно получить gE-специфический антиген, который может, например, служить для выработки gE-специфических моноклональных антител /MAT/. Кроме того, и gE-специфический антиген /и gE-специфические MAT/ можно использовать в серологических тестах, чтобы сделать различие между животными, вакцинированными вакциной BHV-1 делеции gE и животными, зараженными вирусом BHV-1 дикого типа.

Результаты частичного анализа последовательности ДНК гликопротеина gI гена - описанного в примерах - и изолированные фрагменты ДНК, которые кодируют для этого гена, вместе с эукариотными клетками, выражающими гликопротеин gE, позволяют экспрессию gI/gE комплекса в эукариотных клетках /См. фиг. 13 и 14/. Этот гликопротеиновый комплекс может быть использован, чтобы получить gI/gE специфические моноклональные антитела. gI/gE комплекс можно также использовать как антиген в серологических пробах для дифференциации между животными, вакцинированными одним gE BHV-1 мутантом с делецией или двойным gI/gE BHV-1 мутантом с делецией, и животными, зараженными вирусом BHV-1 дикого типа.

gE-специфические пептиды На основе известной кодирующей последовательности белка с помощью автоматического синтезатора можно получить полипептиды не менее чем 40-50 аминокислот. Теперь, когда выявлена кодирующая последовательность белка gE гликопротеина штамма Lam BHV-1 /фиг. 3A/, можно синтезировать полипептиды этого BHV-1 gE гликопротеина. Такими полипептидами по стандартным методам можно иммунизировать экспериментальных животных, таких как мышей или кроликов, чтобы выработать gE-специфические антитела. Кроме того, используя эти gE-специфические пептиды, можно также определить местоположения, где анти-gE антитела реагируют с gE белком /эпитопы/, например, способом PEPSCAN /Geysen и др. , 1984, Proc. Natl, Acad. Sci, США 81, 3998-4002/. gE-специфические олигопептиды можно также использовать в серологических реакциях, которые демонстрируют анти-gE антитела.

Прокариотная экспрессия gE Для синтеза gE белка в бактериях /т.е. прокариотной экспрессии gE/, фрагменты ДНК, которые кодируют для гликопротеина gE или для его частей, должны клонироваться в векторы прокариотной экспрессии. Векторы прокариотной экспрессии представляют собой циркулярные молекулы ДНК, которые могут сохранять себя в бактерии как отдельная воспроизводящая молекула /плазмида/. Эти векторы экспрессии содержат один или несколько маркерных генов, которые кодируют для устойчивости к антибиотику, и таким образом позволяют выбор для бактерий с вектором экспрессии. Кроме того, векторы экспрессии включают /часто контролируемый/ участок промотора, за которым фрагменты ДНК можно лигировать и которые затем выражаются под влиянием промотора. Во многих настоящих векторах прокариотной экспрессии нужный белок выражен в состоянии слияния с так называемым белком-носителем. В векторе за промотором располагается кодирующая последовательность для белка-носителя, непосредственно к которому можно лигировать нужный фрагмент ДНК. Белки слияния часто более стабильны и/или их легче распознать и/или изолировать. Уровень состояния устойчивости, которого может достичь определенный слитый белок в определенном бактериальном штамме, зависит от вида слияния и от штамма. Обычно пробуют различные комбинации.

Эукариотной экспрессии гликопротеин gE-гена Хотя прокариотная экспрессия белков предлагает некоторые преимущества, белки не имеют модификаций, таких как гликосилация и других, которые имеют место в эукариотных клетках. В результате этого эукариотически выраженный белок часто является более стабильным антигеном. Для гетерологичной экспрессии белков в эукариотных клетках, таких как мышиные клетки, используются векторы эукариотной экспрессии. Этими векторами являются плазмиды, которые не только могут размножаться в клетках E.coli, но также стабильно существуют в эукариотных клетках. В дополнение к прокариотному селективному маркеру они также включают эукариотный селективный маркер. Аналогично векторам прокариотной экспрессии векторы эукариотной экспрессии содержат участок промотора, за которым можно лигировать желаемые гены. Однако последовательности промотора в эукариотных векторах специфичны для эукариотных клеток. Более того, в эукариотных векторах слияние с белками-носителями используется очень редко. Эти векторы вводятся в эукариотные клетки посредством стандартного способа трансфекции /Graham и A.I.van der Eb, 1973, Virology, 52, 456-467/. Кроме эукариотных плазмидных векторов имеются также вирусные векторы, где гетерологичный ген вводится в геном вирусе /напр., ретровирусы, вирусы герпеса и коровьей оспы/. Следовательно, эукариотные клетки можно заразить рекомбинантными вирусами.

В общем, нельзя предсказать какой вектор и тип клетки наиболее приемлемы для определенного продукта гена. По большей части пробуются несколько комбинаций.

Эукариотная экспрессия и гликопротеина gE и гликопротеина gI Конечная структура, которой достигает белок, зависит от последовательности его основной аминокислоты, его укладки, его посттрансляционной модификации и т. д. Важный фактор, от которого зависит структура белка, - его взаимосвязь с одним или несколькими другими белками. Мы выявили, что BHV-1 гликопротеин gE образует комплекс, по меньшей мере, с одним другим гликопротеином: BHV-1 гликопротеином gI. Первое указание на такой комплекс появилось из наших результатов с кандидатом анти-gE MAT 1, 51, 67, 75 и 78 /См. таблицу 2/. Эти MAT не реагировали ни с Difivac-1, ни с Lamg E^-, а также не опознавали гликопротеин gE-экспрессирующие ЗТЗ клетки. Однако эти MAT не реагировали с gE-экспрессирующими ЗТЗ клетками после заражения Difivac-1, показывая, что нужны комплементарные факторы, чтобы дать гликопротеину gE нужную антигенную конформацию для этих МАТ. В некоторых из наших экспериментах по радио-иммунопреципитату с MAT 81 мы выявили копреципитацию белка с молекулярным весом в 63 кД. Ввиду того, что гликопротеин gE вируса простого герпеса образует комплекс с белком со сравнительным молекулярным весом /HSVI гликопротеин gI/, мы сделали вывод, что BH-1 гликопротеин gE образует комплекс с BHV-1 гомологом гликопротеина gI. Чтобы изучить этот BHV-1 gE/gI комплекс и получить gE антиген с должной антигенной структурой, мы экспрессировали оба гликопротеина в одной эукариотной клетке. Для этого мы применили те же процедуры, что описаны для эукариотной экспрессии одного гликопротеина gE. Единственным дополнительным условием было использование векторов экспрессии с различными эукариотными селектируемыми маркерами.

Серологические реакции Серологические методы для различения скота, вакцинированного Defivac-1 скота, зараженного BH-1 дикого типа на основе антител против gE, предпочтительно основываются на использовании моноклональных антител, направленных против gE.

Они используются следующим образом: a/ В соответствии с принципом, описанным Van Oirschot и др. /Jorn. of Virological Methods, 22, 191-206, 1988/. В этом ELISA (ELISA - блокирующий ферментный иммуносорбентный тест) для обнаружения gI антител против вируса болезни Aujeszky's, антитела проявляются своим блокирующим действием на реакцию двух MAT, имеющих два разных эпитопа на gI. Тест или реакция проводится следующим образом. Микротитрационные планшеты покрываются MAT 1 в течение ночи при 37^oC, после чего они стоят, например, при 4^oC или -20^oC. Исследуемая сыворотка преинкубируется антигеном в отдельных непокрытых микротитрационных планшетах, например, 2 часа при 37^oC. Планшеты, покрытые МАТ-1, промываются, скажем, 5 раз, после чего на эти планшеты добавляется MAT 2, связанное с пероксидазой хрена обыкновенного /HRPO/. Затем преинкубированные смеси сыворотка-антиген переносятся на планшеты, в которых находятся два MAT, с последующей инкубацией, например, в течение 1 часа при 37^oC. Планшеты промываются и субстрат добавляется к каждой лунке. После приблизительно 2 часов при комнатной температуре планшеты считываются спектрофотометрически. На каждом планшете имеются четыре отрицательные контрольные сыворотки и четыре серийных разведения положительной сыворотки. Сыворотка с величиной оптической плотности /ОП/ менее 50% средней величины ОП 4 отрицательных контрольных сывороток, которые исследовались на том же планшете, считается положительной.

b/ В соответствии с принципом бутерброда непрямого двойного антитела /IDAS/. Здесь микротитровальные планшеты покрываются MAT или поликлональной сывороткой, направленной против gE белка. Инкубация препаратом gE-антигена приводит к тому, что gE связывается с покрытием. Антитела, специфически направленные против gE в исследуемой коровьей сыворотке, последовательно связываются с gE. Эти связанные антитела распознаются антикоровьим иммуноглобулиновым конъюгатом. Антитела в этом конъюгате ковалентно связаны с ферментом пероксидазы. Наконец, связанный конъюгат виден при добавлении хромогенного субстрата. Специфичность реакции проверяется проведением той же процедуры с gE-отрицательным контрольным препаратом вместо препарата gE-антигена. На каждом микротитровальном планшете имеются положительные и отрицательные контрольные сыворотки. Тест считается действительным, если положительные сыворотки дают положительный результат в определенном разбавлении. Сыворотка положительна, если ее ОП выше на 0.2, чем у стандартной отрицательной контрольной сыворотки.

c/ В соответствии с принципом IDAS, описанным под 2, но после инкубации исследуемой сыворотки вместо конъюгата анти-коровьего иммуноглобулина используется анти-gE MAT/HPPO. Можно использовать сыворотку анти-gE пептида или анти-gE поликлональную сыворотку вместо анти-gE MAT. Планшеты промываются и к каждой лунке добавляется хромогенный субстрат. Приблизительно после 2 часов при комнатной температуре планшеты считываются спектрофотометрически. В каждый планшет включены четыре отрицательных контрольных сыворотки и четыре серийных разбавления положительной сыворотки. Сыворотка с величиной ОП менее 50% величины ОП 4-х отрицательных контрольных сывороток, которые исследовались на том же планшете, считается положительной.

d/ В соответствии с принципом блокирующего ферментного иммуносорбентного теста /ELISA/, по которому антиген вируса, который может быть очищенным или неочищенным, наносится покрытием на микротитровальный планшет на всю ночь. На этих планшетах исследуемая сыворотка инкубируется примерно один час или больше при 37^oC. После процедуры промывания на планшеты добавляется анти-gE MAT с последующей инкубацией приблизительно 1 час при 37^oC. Вместо анти-gE MAT можно использовать сыворотку анти-gE пептида или анти-gE поликлональную сыворотку. Планшеты промываются и к каждой лунке добавляется хромогенный субстрат. После примерно 2 часов при комнатной температуре планшеты считываются спектрофотометрически. На каждом планшете имеются четыре отрицательные контрольные сыворотки и четыре серийных разбавления положительной сыворотки. Сыворотка с величиной ОП менее 50% средней величины ОП 4^х отрицательных контрольных сывороток, которые исследовались на том же планшете, считается положительной.

Во всех указанных выше процедурах может использоваться традиционный культивированный антиген вируса, который содержит gE, а также gE-антиген, который выражен через прокариоты или эукариоты. Как вариант, вместо традиционного антигена в указанных диагностических пробах могут использоваться олигопептиды, основанные на BHV-1 gE последовательности. Кроме того, такие олигопептиды можно использовать для разработки так называемого "коровьего" теста в соответствии с принципом, описанным в статье Kemp и др. Science, 241, 1352-1354, 1988. Такой тест будет основываться на связи антигенной последовательности олигопептида антителами, направленными против gE, присутствующего в зараженных животных. Для такого теста олигопептиды должны быть связаны с MAT, направленными против эритроцитов коров.

Анализ на нуклеиновую кислоту с использованием цепной реакции полимеразы Олигонуклеотиды /зонды и праймеры/ могут, например, использоваться в цепной реакции полимеразы, чтобы различить вакцинированных и зараженных животных. Цепная реакция полимеразы /ЦРП/ - технологический прием, посредством которого нуклеиновые кислоты патогена можно в короткое время размножить миллиарды раз /De polymesase kettingreactie. P.F. Hilderiuk, J.A. Wagenaar, J. W. B. van der Giessen u B.A.M. van der Jeijst, 1990, Fijdschrift voor Dierdeneeskunde deel 115, 1111-1117/. gE олигонуклеотиды можно выбрать таким образом, что в gE положительном геноме образуется другой продукт, нежели в gE отрицательном геноме. Преимуществом этого является то, что и животное, которое было вакцинировано вакциной с делецией gE, дает положительный сигнал в тесте на ЦРП. Однако этот подход зависит от присутствия нуклеиновых кислот вируса в образце, например, крови от животного, на которой проводится тест.

После острого заражения BHV-1 имеется большая вероятность, что BHV-1 специфические нуклеиновые кислоты могут быть продемонстрированы в крови, но еще не определилось, будут ли также демонстрироваться в крови нуклеиновые кислоты BHV-1 во время латентного периода.

Использование ВНV-1 в качестве вектора Для экспрессии гетерологичных генов в BHV-1 геноме необходимо иметь в наличии точную информацию об участке, куда должен вставляться гетерологичный ген. Основные последовательности не должны нарушать структуру, а для экспрессии гетерологичного гена должны быть регуляторные последовательности. Гликопротеин gE-ген является подходящим местом для экспрессии гетерологичных генов. gE-ген не является существенным, следовательно, не может быть возражений по замене gE гена гетерологичным геном. Как следствие этого, гетерологичный ген может так располагаться, что он будет находиться под влиянием регуляторных последовательностей gE гена. Однако нет необходимости использовать регуляторные последовательности gE-гена. Экспрессия гетерологичных генов может контролироваться другими, т. е. более сильными регуляторными последовательностями различных генов. Представляется возможным также лигировать гетерологичный ген к /экпортному/ сигнальному пептиду gE гена с тем, чтобы повлиять на секрецию продукта гетерологичного гена. Очевидно, что подробное знание гена gE и белка gE дает возможность использовать BHV-1 как вектор достаточно контролируемым образом. Разработанные векторы можно серологически отличить от дикого типа. Создание ВНV-1 мутантов, которые эксцрессируют гетерологичные гены, можно реализовать таким же образом, что и создание мутантов с делецией gE, показанное в примерах. Однако тогда фрагменты делеции следует заменить фрагментом, на котором гетерологичный ген расположен в местоположении делеции.

Примеры 1/ Изоляция и определение естественного мутанта с делецией gE.

a/ Изоляция естественного /природного/ мутанта Геномная ДНК была изолирована из ряда ослабленных традиционным путем вакцин в соответствии со стандартными способами и проанализирована с использованием рестрикционных ферментов. В частности, мы искали отклонения генома, которые бы подходили, чтобы отличить от вируса BHV-1 дикого типа.

Ослабление было направлено, в частности, на U_s участок генома BHV-1, потому что в этом участке - по аналогии с вирусом герпес простой - вероятно располагается ряд генов, кодирующих для несущественных гликопротеинов /Определение гена гликопротеида вируса простого герпеса 1 внутри кластера генов, необязательного для роста в клеточной культуре, R. Longnecker S. Chatterjee, R.J. Whitley u B. Roijrnan (1987) Proc. Natl dead. Sci, 84, 4,03-4307/.

Подборка BHV-1 вакцин из Загребского университета, Югославия /Lugovic и др. Veterinarski Arhiv, 55, 241-245, 1985/, после большого числа пересевов на эмбриональные почечные клетки коровы и эмбриональные трахеальные клетки коровы /Эбтр/, обладала участком отклонения U_s, помимо наличия нормального участка U_s. Более того, эта вакцина образовывала и большие и малые пятна на Эбтр клетках. Из этой смешанной популяции тремя этапами ограниченного разведения был изолирован вирус с участком U_s отклоняющейся формы, с небольшими пятнами в каждом случае. Вирус, изолированный этим путем, исследовался дальше и был назван Difivac-1. Он был депонирован в Институт Пастера, Париж, Франция 27 мая 1992 г, номер депозита 1-1213.

b/ Определение делеции в gE гена в Difivac-1 Для дальнейшего анализа этого отклонения в U_s участке геномная ДНК Difivac-1 была изолирована в соответствии со стандартными методами и подвергнута блот-анализу /фиг. 1A/. Гиридизация этого блота фрагментом Hind III K дикого типа, помеченного 32p подтвердила, что этот фрагмент, расположенный в центре участка U_s, короче на 1.0 тысячу пар нуклеотидов /т.п.н./ в Difivac-1. Более того, этим анализом можно было приблизительно определить позицию отсутствующей части /фиг. 1B/. Для дальнейшего анализа этой делеции U_s участок BHV-1 штамма Lam дикого типа был изолирован и клонирован в прокариотные векторы. С этой целью в соответствии со стандартными методами геномная ДНК штамма Lam /фиг. 2A/ была изолирована и клонирована в векторы pUC18, рACYC и pBP322 /фиг. 2B/. Была составлена физическая карта участка вокруг предполагаемой позиции делеции /фиг. 2C/. Исходя из этой физической карты, в векторах pKUN 19 и pUC18 /фиг. 2/ были конструктированы субклоны, пригодные для определения последовательности нуклеотидов этой области. Используя эти субклоны, методом Сангера была определена нуклеотидная последовательность двух цепей всей области /показано на фиг. 2C/. Эта нуклеотидная последовательность была анализирована с использованием программы PC/ген. Из концептуальной трансляции оказывается, что нуклеотиды /нт/ 168-1893 кодируют для открытой рамки считывания 575 аминокислот /фиг. 3A/. Дальнейший анализ показал, что эта последовательность аминокислоты имеет характеристики трансмембранного гликопротеина, как показано на фиг. 3B. Факт таков, что эти первые 26 аминокислот /ак/ опознаются как типично эукариотный экспортный сигнал и область между ак 423 и ак 450 опознается как трансмембранная область. Кроме того, в этой последовательности оказываются три потенциальных участка N-связанной гликосиляции. Эта предсказанная последовательность аминокислоты демонстрирует близкое сходство с gE-геном гликопротеина вируса простого герпеса /HSV/; см. фиг. 4A и 4B. Эти и другие