Рекомбинантное антитело, специфичное к cd4, способ его получения и фармацевтическая композиция для лечения псориаза

Рекомбинантное антитело, специфичное к cd4, способ его получения и фармацевтическая композиция для лечения псориаза

Реферат

 

Изобретение относится к рекомбинантному антителу, содержащему область антитела обезьяны Старого Света и область антитела человека. Рекомбинантное антитело состоит из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина обезьяны Старого Света и константных областей человека. Антитело обладает специфичностью к CD4. Рекомбинантное антитело входит в состав фармацевтической композиции, которая может быть использована для лечения псориаза. 3 с. и 3 з.п. ф-лы, 28 ил.

Настоящее заявка является частичным продолжением заявки на патент США (Newman et al.) рег. N 07/856281, поданной 23 марта 1992 г., которая, в свою очередь, является частичным продолжением заявки на патент США рег. N 07/735064, поданной 25 июля 1991; и обе указанные заявки целиком, включая рисунки, входят в настоящее описание посредством ссылки. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным антителам, используемым для терапевтического лечения людей, а также к способам продуцирования указанных антител.

Предшествующий уровень техники Мышиные моноклональные антитела используются в диагностике заболеваний человека и в биологических исследованиях, направленных на решение важных научных задач. Указанные антитела также используются в клинических анализах при лечении острых и хронических заболеваний человека, включая лейкозы, лимфомы, твердые опухоли (например, опухоли прямой кишки, молочной железы, печени), СПИД и другие аутоиммунные заболевания.

Были продуцированы химерные антитела мыши/человека и показано, что эти антитела обладают связывающими свойствами родительского мышиного антитела, а их эффекторные функции ассоциируются с констатнтной областью антитела человека. См. , например, патент США (Cabilly и др. ) 4816567; патент США (Shoemaker и др.) 4978745; патент США (Beavers и др.) 4975369 и патент США (Boss и др.) 4816397, из которых все вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Обычно, указанные химерные антитела конструируют путем получения геномной библиотеки из ДНК, экстрагированной из уже имеющихся мышиных гибридом. Nishimura et al. , 47 Cancer Researeh 999, 1987. Затем библиотеку скринируют на гены вариабельных областей из тяжелой и легкой цепей, обнаруживающих правильные картины реаранжировки фрагмента антитела. Затем клонированные гены вариабельных областей лигируют в вектор экспрессии, содержащий клонированные кассеты соответствующего гена константной области тяжелой или легкой цепи человека. После этого, химерные гены экспрессируют в подходящей клеточной линии, обычно в линии клеток мышиной миеломы.

Описанные химерные антитела были использованы для лечения людей. Однако в ряде случаев у человека-реципиента продуцировались антитела к этим химерным антителам. Такое продуцирование антитела против химерного антитела оказывало неблагоприятное воздействие на проведение терапии с использованием химерного антитела.

Erlich и др. (34 Clinical Chemistry 1681, 1988), Erlich и др. (7 Hybridoma 385, 1988), Erlich и др. (6 Hibridoma 151, 1987) и Erlich и др. (1 Human Antibody Gybridomas 23, 1990) (не принимаемые за прототипы к настоящему изобретению) указывают, что человеческое моноклональное антитело дало бы лучший эффект в in vivo-терапии человека, чем мышиные моноклональные тела. В своих работах они также исходили из постулата, что антитела приматов, не относящихся к человеку, например моноклональные антитела шимпанзе, являются толерантными для человека, поскольку антитела шимпанзе и человека являются структурно схожими. Так как человеческие антитела являются неиммуногенными для макаки-резус (т.е. они не индуцируют антительный ответ), то было высказано предложение, что антитела приматов будут неиммуногенными для человека. В вышеупомянутых работах также указывается, что испытание на продуцирование антител у человека проводить необязательно в том случае, если антитело примата имеет структуру константной области, аналогичную структуре этой области Ig человека, или, по крайней мере, это антитело имеет структуру, которая отличается от структуры иммуноглобулина человека не более, чем различные антитела человека отличается между собой. Таким образом, было высказано предложение, что антитела шимпанзе могут быть использованы в терапии человека.

Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к способам амплификации и клонирования генов, кодирующих антигенсвязывающие участки вариабельной области иммуноглобулина обезьян Старого Света (называемых далее "обезьянами", например павианов или макак); лигирования этих генов с клонированными генами, кодирующими константную область иммуноглобулинов человека, шимпанзе или других обезьян (или, если это необходимо, с генами, кодирующими остов молекулы иммуноглобулина человека, шимпанзе или другой обезьяны); и экспрессии этих генов, кодирующих рекомбинантные антитела человека/обезьяны либо полностью обезьяньи рекомбинантные антитела. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию указанных рекомбинантных антител (этот термин означает антитела, продуцированные в результате гибридизации ДНК двух различных генов антител, которые могут происходить даже от двух одинаковых видов, например, от обезьян, таких как макака-резус и собаковидная обезьяна, и которые будут кодировать обезьяно-обезьянье рекомбинантное антитело) в качестве иммунотерапевтических средств для лечения людей. В основу настоящего изобретения было положено обнаружение того факта, что в отличие от шимпанзе, такие эволюционно далекие от человека виды обезьян, как бабуин или макака (включая собаковидную обезьяну и макаку-резус), не только достаточно отличаются от человека (настолько, что у этих обезьян продуцируются антитела против антигенов человека, даже против относительно консервативных антигенов человека, например C 4 и C 54), но и имеют достаточное сходство с человеком, такое что при введении человеку антител этих обезьян или рекомбинантных антител, происходящих от этих обезьян, у него не продуцируется иммунный ответ против этих антител.

В отличие от некоторых антител, используемых ранее в лечении людей, антитела настоящего изобретения не имеют ряда недостатков, присущих указанным используемым ранее антителам, например, таких как (1) иммуногенность и индуцирование иммунного ответа с образованием антител против антител человека (HAA) после их повторного введения, необходимого для лечения хронических заболеваний; (2) относительно короткое время полужизни по сравнению с человеческими антителами; (3) отсутствие эффекторных функций в отношении клеток человека или комплемента. Благодаря отсутствию вышеуказанных недостатков, антитела настоящего изобретения могут быть с успехом использованы для терапевтического лечения заболеваний у человека. Например, в случае хронических заболеваний человека, включая аутоиммунные заболевания или любые другие заболевания, требующие продолжительного введения антител, одним из главных препятствий для успешного проведения повторной иммунотерапии является иммунный ответ организма-хозяина на терапевтическое антитело. HAA-ответы того или другого пациента часто бывают непредсказуемы. Указанные HAA-ответы преимущественно, хотя и не исключительно, направлены против константной области молекулы антитела и часто сводят на нет или снижают эффективность любой последующей терапии с использованием этого антитела или другого антитела того же изотипа.

В принципе, проблемы, связанные с HAA-ответом, могут быть решены путем использования моноклональных антител человека. Однако такой подход имеет ряд этических, клинических и иммунологических ограничений, связанных с иммунонизацией индивидуума нужными антигенами (например, термин "антигены человека" включает в себя антигенные или иммуногенные части любых белков, полипептидов или их эквивалентов, присутствующие в организме человека) в целях продуцирования антител. Авторы настоящего изобретения подошли к решению этой проблемы путем продуцирования антител с соответствующей специфичностью и нужной эффекторной функцией и использования их для получения рекомбинантных антител. Эти рекомбинантные антитела включают в себя соответствующую часть вариабельной области антитела, происходящего от иммунизированной обезьяны, и константную область антитела, происходящего от человека или шимпанзе. Таким образом, может быть сохранена специфичность и высокая степень аффинности моноклональных антител и легко подобрана константная область, происходящая от антитела человека или шимпанзе и обладающая нужными эффективными функциями.

Кроме того, в основу настоящего изобретения был положен метод амплификации генов иммуноглобулина обезьян, осуществляемый, например, посредством полимеразно-цепной реакции (PCR) с использованием РНК, экстрагированной из лимфоцитов обезьяны, и синтетических олигонуклеотидных праймеров, специфичных для семейств генов, кодирующих вариабельную область тяжелой и легкой цепи. Амплифицированные гены или их соответствующие части (например, области, кодирующие гипервариабельный участок (CDR), см. Winter, заявки на патент Великобритании N GB 2188638A, которая вводится в настоящее описание посредством ссылки) клонируют в вектор экспрессии, содержащий ген константной области человека или шимпанзе, в целях продуцирования рекомбинантного антитела обезьяны/человека; либо в вектор экспрессии, содержащий ген константной области обезьяны, в целях продуцирования рекомбинантного антитела нужного изотипа, полностью происходящего от обезьяны. Эти антитела представляют собой иммунотерапевтические агенты, способные к локализации и/или убиванию соответствующих клеток-мишеней (например, опухолевых клеток) после их in vivo-введения.

Таким образом, в первом своем варианте настоящее изобретение относится к способу клонирования гена, кодирующего антигенраспознающий участок вариабельной области антитела обезьяны. Этот способ предусматривает получение нуклеиновой кислоты, например РНК, от обезьяны; проведение синтеза ДНК, комплементарной РНК, (кДНК) (с использованием обратной транскриптазы); получение праймера, комплементарного кДНК-последовательности, кодирующей 5'-лидерную последовательность гена антитела; взаимодействие указанной кДНК и праймера с образованием гибридного комплекса; амплификацию кДНК в целях продуцирования нуклеиновой кислоты, кодирующей ген вариабельного участка антитела обезьяны.

Под термином "антигенраспознавающий участок" подразумевается один или несколько участков вариабельной области антитела обезьяны, которые являются ответственными за связывание и/или распознавание антигена-мишени (или эпитопа, или идиотипа) данного антитела. Например, этот участок включает в себя гипервариабельные участки (CDR, см. ниже), или всю вариабельную область, или любую комбинацию из этих двух областей, включая любые изменения в кодирующих областях, которые могут быть индуцированы в целях получения более человекообразной области (вместо обезьянообразной области) без изменения способности к специфическому связыванию этого антитела. Если используется лишь часть от всей вариабельной области, то остальные участки (например, так называемые "каркасные участки") могут происходить от другого антитела, предпочтительно от антитела человека или шимпанзе (см. ниже и в вышеуказанных работах, вводимых в настоящее описание посредством ссылки).

Используемые в настоящем описании термины "вариабельная область", "лидерная последовательность", "константная область" и "каркас" употребляются в их общепринятом смысле (см., например, ниже или в вышеуказанных работах, вводимых в настоящее описание посредством ссылки).

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лидерная последовательность происходит от человека, шимпанзе или обезьяны и имеет приблизительно 60 оснований (примеры см. на фиг. 1).

Автор настоящей заявки обнаружил, что лидерная последовательности вариабельной области антитела обезьяны, шимпанзе и человека имеют достаточное сходство, такое, что праймеры, сконструированные для одной из них, могут быть использованы для амплификации другой. В этом методе осуществляют амплификацию РНК для продуцирования некоторого количества нуклеиновой кислоты, достаточного для введения этой нуклеиновой кислоты в вектор для последующего клонирования.

Во втором своем варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования антитела против антигена человека, которое не является иммуногенным для человека. Этот способ предусматривает продукцирование в организме обезьяны антитела против антигена человека и выделение нуклеиновой кислоты обезьяны, кодирующей антигенраспознающий участок вариабельной области антитела обезьяны. Затем получают нуклеиновую кислоту человека, кодирующую константную область антитела человека, и полученную нуклеиновую кислоту человека лигируют с нуклеиновой кислотой обезьяны, в результате чего образуется рекомбинантная нуклеиновая кислота. После этого, полученную рекомбинантную нуклеиновую кислоту экспрессируют для получения нужного антитела. Альтернативно для получения рекомбинантного антитела может быть использована нуклеиновая кислота, кодирующая константную область шимпанзе или обезьяны. Имеется очень небольшое различие, если оно вообще имеется, между константными областями аминокислотных последовательностей человека и шимпанзе (то есть они являются гомологичными), а те различия, которые имеются между указанными константными областями человека и шимпанзе, могут быть легко изменены с помощью стандартной техники, в том случае, если для продуцирования рекомбинантного антитела используют нуклеиновую кислоту, кодирующую константную область антитела обезьяны. Основная отличительная особенность настоящего изобретения заключается в том, что продуцируемое антитело является менее иммуногенным, чем константная область обезьяны, поэтому при введении рекомбинантного антитела человеку в его организме не индуцируется значительного иммунного ответа. Далее, указанные области антитела будут называться гомологичными областями. Таким образом, сконструированное рекомбинантное антитело по своей аминокислотной последовательности является функционально аналогичным антителу человека, то есть оно имеет константную область, гомологичную константной области антитела человека или шимпанзе. В целом, это антитело является аналогичным антителу человека, что необходимо для снижения возможности продуцирования нежелательного иммунологического ответа к этому антителу, а также содержит антигенсвязывающий участок, происходящий от антитела обезьяны.

Термин "неиммуногенное" антитело означает, что это антитело не вызывает иммунного ответа с образованием антител, достаточного для снижения эффективности продолжительного введения антитела большинству людей, осуществляемого в период времени, достаточный для достижения терапевтического эффекта (например, по сравнению с мышиным или мышь-человеческим химерным антителом). Предпочтительно, если этого иммунного ответа вообще не будет продуцироваться.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рассматриваемый способ предусматривает иммортализацию клеток обезьяны, которые являются ответственными за продуцирование антител обезьяны, например, путем синтеза гибридомы, вирусной трансформации с использованием Herpes papio, лишь B-клеточного клонирования (такая иммортализация называется также "временной иммортализацией"); и продуцирование библиотеки рекомбинантных иммуноглобулинов. В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения этот способ предусматривает отбор B-клеток из лейкоцитов периферической крови, селезенки, костного мозга или лимфатических узлов обезьяны; отбор клона, который продуцирует соответствующее антитело; "спасение" генов иммуноглобулина, кодирующих данное антитело из иммортализованной клеточной линии; и повторную экспрессию генов в линии клеток-продуцентов (т.е. в линии клеток, способствующих продуцированию антитела, достаточному для его использования в целях терапии человека).

В третьем своем варианте настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его Fab-, (Fab)₂-фрагментам, димеру легкой или тяжелой цепи или к любому минимальному рекомбинантному фрагменту, такому как FV или SCA (одноцепочечному антителу), либо другому его фрагменту с иммуноглобулиновой активностью (например, CDR-область) против антигена человека, продуцируемого иммортализованной B-клеткой обезьяны. Данные фрагменты используются в качестве иммуносупрессорных агентов. Альтернативно антитело настоящего изобретения может присоединять к себе эффекторную или репортерную молекулу. Например, антитело настоящего изобретения может иметь макроцикл для образования хелатного комплекса с тяжелымт атомом металла или с токсином, таким как рицин; причем антитело присоединяет указанную молекулу посредством ковалетной мостиковой связи. Кроме того, Fc-фрагмент или CH3-домен полной молекулы антитела может быть заменен молекулой фермента или токсина, а часть цепи иммуноглобулина может быть связана с полипептидным эффектором или молекулой-репортером. С помощью стандартной процедуры могут быть также сконструированы биспецифические антитела.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат антитела настоящего изобретения, используемые в терапевтических или профилактических целях. Такие антитела могут быть также получены в виде иммунотоксинов, то есть молекул, состоящих из двух компонентов и предназначенных, в частности, для убивания определенных клеток in vitro или in vivo. Одним из компонентов указанных антител является цитотоксичный агент, который, при его присоединении или абсорбции, оказывает убивающее действие на клетку. Второй компонент, известный как "транспортный механизм", обеспечивает доставку указанного токсического агента к клетке конкретного типа, например, такой как клетка карциномы. Эти два компонента, обычно, химически связаны друг с другом посредством любой из известных химических или генетических связей. Например, если цитотоксическим агентом является белок, а вторым компонентом является цельный иммуноглобулин, то они могут быть связаны между собой с помощью гетеробифункционального перекрестно-сшивающего агента, такого как карбодиимид, глутаральдегид, и т.п. Способы продуцирования различных иммунотоксинов хорошо известны специалистам.

В другом, близком к предыдущему, варианте настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантное антитело человека/обезьяны. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует константную область человека или шимпанзе и антигенсвязывающий участок вариабельной области обезьяны; и эту нуклеиновую кислоту очищают, т. е. отделяют от биологических компонентов, которые связаны с ней в природных условиях, либо, что более предпочтительно, эту нуклеиновую кислоту получают в виде гомогенного раствора.

В еще одном своем варианте настоящее изобретение относится к CDR-привитому антителу, содержащему, по крайней мере, 1 из гипервариабельных участков (CDR, complementarity determining region), то есть аминокислотных остатков (с использованием стандартной системы мечения аминокислот kabat) 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) и 95-102 (CDR3) указанной тяжелой цепи, и аминокислотных остатков 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) и 89-97 (CDR3) указанной легкой цепи вариабельной области обезьяны, и каркас вариабельной области иммуноглобулина, происходящего от другого вида. Антитело со встроенным CDR способно связываться с тем же самым антигеном, что и исходное антитело обезьяны. Константная область этого антитела происходит от иммуноглобулина человека или шимпанзе. Методология осуществления рассматриваемого варианта настоящего изобретения, в общих чертах, описана Jones и др. (321 Nature 522, 1986). Указанные CDR-вставки могут быть изменены, если это необходимо для обеспечения большего человекообразия данного антитела в целях снижения вероятности индуцирования нежелательной иммунной реакции против этого антитела.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рассматриваемый способ предусматривает иммортализацию или селекцию клеток от макаки, ответственных за продуцирование антител макак, и выделение генов иммуноглобулина из этих клеток; клонирование и секвенирование генов, ответственных за продуцирование антител; отбор каркасной последовательности вариабельной области человека (предпочтительно, с наибольшей гомологией по отношению к каркасной последовательности вариабельной области макаки); замещение CDR-последовательностей человека CDR-последовательностями макаки; а также для сохранения аффинности антитела по отношению к его антигену могут быть осуществлены небольшие модификации в каркасной области человека.

Под термином "небольшие модификации" подразумевается, что в указанной каркасной области могут быть, в целом, заменены другими аминокислотами менее чем около 6 аминокислот, обычно такие замещения или модификации осуществляют только, если эти аминокислоты участвуют в конформационных взаимодействиях, которые поддерживают каркас в соответствующей форме так, чтобы нужный антиген распознавался антителом. Эти модификации будут, в основном, относится к аминокислотам, присутствующим в антителе макаки, и отличающимся от аминокислот антитела человека. Например, аминокислотная последовательность антитела человека, расположенная как раз перед CDR3 тяжелой цепи, 92-94 представляет собой, в основном, цистеин-аланин-аргинин (известно, что в меньшинстве антител, аргинин бывает заменен серином или треонином); а в некоторых антителах последовательности мартышек, эта последовательность представляет собой цистеин-аланин-серин; таким образом, в этом примере может быть предпочтительным использовать в положении 94 серин (см. фиг. 9D).

В еще одном своем варианте, настоящее изобретение относится к способу лечения человека, имеющего конкретный антиген, например антиген, ассоциируемый с каким-либо заболеванием. Этот способ предусматривает введение терапевтически эффективного количества рекомбинантного антитела, специфичного для данного антигена; причем указанное антитело содержит константную область человека или шимпанзе и антигенраспознающий участок вариабельной области обезьяны; либо константную область первой обезьяны и антигенсвязывающий участок вариабельной области второй, отличающейся от первой обезьяны.

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения антигеном является опухолевый антиген; антиген, вызывающий аутоиммунный ответ; рецептор, экспрессируемый на клетке-хозяине; или антиген, выбранный из антигенов человека CD58, VLA4 (интегрин 4 1), CD2, LFA3, ELAM, LAM, CD25, CD4, CD19, CD20, рецептор T-клеток человека, CD3, CD8, CD23, CD41, CD44, CD45, CD71, TNF, TNF, антиген Tn, IL-1, IL-8, C5a, факторы адгезии, например VCAM, CD54, CD28, CD11a, CD11c, CD18 и CD11b, продукт онкогенного вируса neu, MDR-1 (P-гликопротеин), TGF и его рецептор и PDGF; а рекомбинантное антитело обладает супрессорным действием (убивающим или элиминирующим) на нежелательные клетки (например, анти-CD4) путем активации комплемента или клеток-киллеров, либо указанное антитело является цитотоксическим агентом или способствует связыванию Fc-рецептора фагоцитом. Альтернативно это антитело блокирует или стимулирует функции рецептора либо нейтрализует активные растворимые продукты, такие как один или более интерлейкинов, TNF и C5a.

В других своих вариантах настоящее изобретение относится к фармацевтическим комбинациям, содержащим вышеуказанные антитела или их фрагменты. Композиции или продукты настоящего изобретения могут быть получены в виде растворов, подходящих для парентерального, назального, или перорального введения. Соответствующие препараты, содержащие антитело, могут быть использованы в сочетании с соответствующими препаратами других агентов для повышения клинической эффективности.

Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеприведенного описания предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения и из нижеприведенной формулы изобретения.

Описание предпочтительного осуществления настоящего изобретения Ниже приводится краткое описание чертежей: фиг. 1 - схематическое изображение 20 кодонов в девяти различных лидерных последовательностях тяжелой цепи Ig человека и десяти лидерных последовательностей тяжелой цепи Ig обезьяны; фиг. 2 - схематическое изображение структуры различных цепей Ig, где показаны относительные положения лидерной, вариабельной и константной областей, а также положения рестриктирующих сайтов и праймеров, используемых для амплификации; фиг. 3 - схематическое изображение вектора-кластера тяжелой цепи для экспрессии человеческого или химерного антител; фиг. 4 - схематическое изображение вектора-кластера легкой цепи для экспрессии человеческого или химерного антител; фиг. 5 и 6 - схематические изображения векторов, предназначенных для экспрессии иммуноглобулина из кДНК, кодирующей каппа- и лямбда-легкие цепи соответственно. В этих векторах, гены иммуноглобулина выстроены в тандемной конфигурации с помощью неомицин-фосфотрансферазы в качестве селектируемого маркера; фиг. 7-1, 7-2 и 8 - изображение нуклеиновокислотной последовательности различных праймеров лидерных последовательностей, используемых в настоящем изобретении (эти праймеры на фиг. 8 соответствуют праймерам, представленным ниже, см. SEQ ID N 1-12); фиг. 9A-9H - сравнение областей, происходящих от человека и обезьяны, в VH1, VH2, VH3, VH4 и VH5-последовательностях VKI и VKII и Y III соответственно; фиг. 10 - сравнение VH3-последовательностей человека и обезьяны и с VH2-последовательностью человека; фиг. 11 - графическое изображение связывания антитела настоящего изобретения с CD4-антигеном человека; фиг. 12 - графическое изображение ингибирования связывания IF3 с антителом, показанным на фиг. 10; фиг. 13-14 - части нуклеотидных последовательностей областей VH и VL против CD4 соответственно; фиг. 15 - график, иллюстрирующий анти-CD54-активность; фиг. 16 - гистограмма, иллюстрирующая сравнительную экспрессию плазмид.

Антитела обезьян К обезьянам Старого Света относятся бабуин и макаки (включая макаку-резус и павиана). В данной заявке подробно описано использование в настоящем изобретении генов различных обезьян. Приведенные ниже примеры служат лишь иллюстрацией настоящего изобретения и не ограничивают его объема, а поэтому оно может быть с таким же успехом применено и к другим видам обезьян Старого Света.

На фиг. 2 в схематическом виде показана основная структура генов, кодирующих тяжелую, каппа-легкую и лямбда-легкую цепи иммуноглобулина. Каждая их этих цепей имеет инициирующий ATG-кодон, после которого следует лидерная последовательность приблизительно из 60 оснований, затем область, кодирующая вариабельную область иммуноглобулина, и, наконец, область, кодирующая константную область этого иммуноглобулина. Примеры различных лидерных последовательностей или сигнальных пептидов тяжелых цепей показаны на фиг. 1. Эти последовательности и их эквивалент у обезьян могут быть определены с помощью стандартной техники, хорошо известной специалистам и описанной ниже.

Последовательности, показанные в нижней части фиг. 1, представляют собой лидерные последовательности человека. Авторами настоящей заявки было обнаружено, что конструирование праймеров, комплементарных этим лидерным последовательностям, позволяет осуществить амплификацию генов Ig обезьян. Аналогично праймеры, гомологичные лидерным последовательностям обезьян (см., например, верхнюю часть фиг. 1), могут быть использованы для амплификации генов иммуноглобулина обезьяны, а также для амплификации генов иммуноглобулина человека.

При использовании указанных праймеров в стандартных процедурах амплификации гены, кодирующие различные иммуноглобулины обезьян, могут быть легко выделены, в результате чего могут быть определены последовательности, кодирующие вариабельные области антител. Примеры таких процедур описаны ниже. Результаты анализов представлены на фиг. 9A-9H и фиг. 10. Неожиданно было обнаружено, что несмотря на способность к продуцированию у обезьян антител к относительно консервативным антигенам человека, вариабельные последовательности каркасных участков продуцированных таким образом антител будут неотличимы от соответствующих последовательностей антител человека. То есть, степени вариабельности последовательности иммуноглобулина, наблюдаемой у обезьян и у человека, аналогичны, а поэтому без анализа самого источника невозможно определить, какое из антител принадлежит человеку, а какое обезьяне.

Так, например, на фиг. 10 дано сравнение аминокислотной последовательности VH3-области человека и обезьяны. Антитела человека обнаруживают область гомологии между собой на 83-98%, а антитела обезьяны на 90-95% гомологичны VH3-области человека. В противоположность этому VH2-область человека гомологична VH3-области человека на 60%. На этом чертеже так же, как и на других чертежах, присутствие одинаковых аминокислот в любом положении показано пунктирной линией, тогда как присутствие различных аминокислот показано стандартным буквенным обозначением. Положения, которым не могут быть приписаны аминокислоты "консенсуса" (обобщающего типичного элемента структуры), обозначены X. Аналогично гомология для VH1, VH2, VH3, VH4 и VH5, и для VKI и VKIII и V III показана на фиг. 9A-9H соответственно. И снова, наблюдалась значительная гомология между последовательностями иммуноглобулина обезьян и человека в каждой вариабельной области, включая последовательности J-участков иммуноглобулина. Такая высокая гомология аналогична той, что наблюдается между антителами человека.

Методика определения этих последовательностей описана в нижеприведенных примерах. При этом, следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается этими примерами, и эквивалентные результаты, а также моноклональные и химреные антитела могут быть получены с использованием аналогичных процедур, хорошо известных специалистам. См., например, выше патенты США 4816567, 4978745, 4975369 и 4816397. Например, после клонирования гена, кодирующего вариабельную область обезьяны, этот ген может быть легко лигирован с геном, кодирующим константную область обезьяны или человека, после чего эти слитые гены экспрессируют в клетке-продуценте для получения нужного антитела. Эти процедуры описаны в представленных ниже примерах.

В нижеприведенных примерах первая стадия описываемого метода включает в себя выделение полной РНК из клеток периферической крови или клеток селезенки обезьяны. B-клетки от иммунизированных обезьян могут быть получены из периферической крови или лимфоузлов и непосредственно использованы, либо они могут быть, предпочтительно, размножены. Указанное размножение может включать в себя трансформацию вирусом Herpes papio, гибридизацию с гетерологической клеткой, миеломы, и последующую селекцию или клонирование отдельных B-клеток при ограниченном разделении в присутствии стимулированных T-клетках человека.

Затем, полную РНК конвертируют в одноцепочечную (оц) кДНК с помощью обратной транскриптазы и с использованием неспецифических (олиго-dT или неупорядоченных гексамеров) или специфических (константные области C или CK или CH1 иммуноглобулина) олигонуклеитидных праймеров. Одноцепочечную кДНК, продуцированную с помощью этой реакции, амплифицируют с использованием полимеразно-цепной реакции, в которой оц кДНК вместе с дезоксинуклеотидтрифосфатами, ДНК-полимеразной (например, термостабильной полимеразной) и специфическими праймерами используют для амплификации генов вариабельной области тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина. Используемые праймеры представляют собой одноцепочечные синтетические олигонуклеотиды из 20-40 оснований, содержащие вырожденные основания, которые связаны с 5'-лидерными последовательностями иммуноглобулина. Для амплификации семейств вариабельных областей тяжелой цепи антитела обезьяны, исходя из их схожести с генными семействами вариабельных областей тяжелой цепи антитела человека, были сконструировали 6 различных 5'-праймеров для лидерных последовательностей (см. фиг. 7-1), вводящих рестрикционный сайт (например, Sall). Причем, с каждым из этих шести 5'-праймеров для лидерных последовательностей был использован 3'-праймер, являющийся специфическим для константной области домена соответствующего изотипа (например, IgG, IgM, IgA или IgE) и также вводящий рестриктирующий сайт (например, Nhel). Аналогично для легких каппа- и лямбда-цепей обезьяны были использованы другие пары праймеров для амплификации соответствующей вариабельной области легкой цепи (фиг. 7-2).

Другие серии праймеров могут быть использованы для введения других уникальных рестрикционных сайтов для непосредственного клонирования PCR-амплифицированной ДНК в соответствующий экспрессирующий вектор, имеющий тот же самый рестрикционный сайт. Как показано на фиг. 7-1, может быть также использован набор праймеров, связывающихся с 3'-концом лидерной последовательности тяжелой цепи антитела и вводящих Ml и l-сайт, либо набор праймеров, связывающихся с первыми 23 основаниями каркасной последовательности и вводящих Xhol-сайт. Гены вариабельной области легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина обезьяны могут быть клонированы в "челночный" вектор непосредственно после PCR-амплификации, что позволяет проводить дальнейшие молекулярные манипуляции, если они необходимы; либо эти гены могут быть клонированы непосредственно в экспрессирующий вектор, который содержит гены константной области тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина человека. Молекулярная конфигурация генов иммуноглобулина в экспрессирующем векторе может быть геномной, где присутствуют промотор/энхансер иммуноглобулина и другие регуляторные области, а также последовательности донора/акцептора сплайсированного фрагмента в экзон/интронном стыке. Альтернативно химерные гены иммуноглобулина могут быть вставлены в кДНК-конфигурации, используют гетерологические вирусные промоторные/энхансерные последовательности.

Пример 1. Последовательность антител обезьян На фиг. 7 и 8 показаны праймеры с рестрикционными или без рестрикционных сайтов соответственно, используемые в PCR-амплификации генов иммуноглобулина от кДНК обезьяны и/или человека. Подробно эти процедуры описаны ниже. РНК выделяли из клеток селезенки, периферической крови и лимфатических узлов обезьян при помощи метода с использованием гуанидинизотиоцианата. Фракцию полной РНК выделяли указанным методом, а затем использовали в качестве матрицы для последующей реакции амплификации. Аликвоту РНК инкубировали в присутствии 200 единиц обратной транкриптазы вируса Малони мышиного лейкоза неспецифических (олиго dT или неупорядоченных гексамеров) или специфических (CH1-область иммуноглобулина IoG или константная область CK каппа-цепи) олигонуклеотидных праймеров (50-100 пикомолей) в целях генерации некодирующей смысловой одной цепи кДНК. Затем, однонитевую кДНК, продуцированную таким образом, амплифицировали с помощью полимеразно-цепной реакции (PCR). Аликвоту одноцепочечной кДНК инкубировали вместе с дезоксинуклеотидтрифосфатами (20 мкМ), термостабильной ДНК-полимеразой (2-5 единиц) и происходящими от человека синтетическими олтгонуклеитидными праймерами (50 пикомолей) в целях амплификации генов вариабельной области либо тяжелой, либо легкой цепи иммуноглобулина.

Используя пары праймеров, показанных на фиг. 8, также амплифицировали несколько характерных последовательностей ряда генных семейств вариабельной области тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина павиана. Эти амплифицированные последовательности клонировали в EcoRV-сайт плазмидного вектора p-Bluescript (pBS, поставляемый от Stratagene, CA) и использовали для секвенирования ДНК. Секвенирование ДНК осуществляли с использованием плазмиды, содержащей вставку в виде двухцепочечной ДНК-ма