Анти-эфрр одноцепочечный fv, химерное анти-эфрр антитело и способ его получения, фармацевтическая композиция для лечения опухолей, средство для диагностики локализации или оценки роста опухоли

Анти-эфрр одноцепочечный fv, химерное анти-эфрр антитело и способ его получения, фармацевтическая композиция для лечения опухолей, средство для диагностики локализации или оценки роста опухоли

Реферат

 

Изобретение относится к новым анти-ЭФРР антителам и к их одноцепочечным Fv (оцFv) фрагментам, которые могут быть получены из фаг-антитело библиотек, сконструированных из клеток иммунизированного млекопитающего, предпочтительно мыши. Два одноцепочечных Fv, выделенных из фаг-антитело библиотек, обработаны методами генной инженерии с созданием молекул частично гуманизированного полного антитела. Такие химерные анти-ЭФРР антитела содержат постоянные области иммуноглобулинов человека и могут быть использованы так же, как и их одноцепочечные Fv, в качестве средств для диагностики и лечения опухолей человека. 5 с. и 4 з.п. ф-лы, 5 табл., 9 ил.

Изобретение относится к новым анти-ЭФРР антителам и фрагментам антител, предпочтительно одноцепочечным Fv (оцFv), которые могут быть получены из фаг-антитело библиотек, сконструированных из клеток иммунизированных млекопитающих, предпочтительно мыши. Фрагменты антител, выделенные из фаг-антитело библиотек, могут быть сконструированы с целью создания частично гуманизированной полной молекулы антитела. Подобные химерные анти-ЭФРР антитела содержат постоянные области иммуноглобулинов человека и могут быть использованы так же, как и их фрагменты, в качестве средств диагностики и терапии опухолей человека.

Кроме того, в изобретении показано, что применение фаг-антитело библиотек является альтернативным и более гибким способом выделения антител из иммунизированных млекопитающих по сравнению со стандартной гибридомной технологией.

Изобретение относится также к лекарственным формам, содержащим указанные антитела и их фрагменты и предназначенные для лечения таких опухолей, как меланома, глиома или карцинома. Указанные антитела или их фрагменты могут быть также использованы в диагностических целях для обнаружения и оценки упомянутых опухолей in vitro и in vivo.

В описании применяются некоторые технические термины, определение которых приводится ниже.

"КОи" (каркасные области) означает четыре субрайона из вариабельных областей в тяжелой или легкой цепи, поддерживающих три ОКО.

"ОКО" (определяющие комплементарность области) относится к трем субрайонам вариабельных областей тяжелой или легкой цепи, включающих гипервариабельные последовательности и образующих петельные структуры, которые в первую очередь ответственны за прямой контакт с антигеном.

Термин "химерные" или гуманизированные антитела означает антитела, содержащие постоянные области, источником которых является человек, и вариабельные области (в том числе ОКО), происходящие из отличного от человека источника, например мыши.

Термин "гуманизированные" или полностью гуманизированные антитела относится к антителам, содержащим постоянные области КОи, источником которых служит человек, при этом ОКО происходит из отличного от человека источника.

"ЭФР" и "ЭФРР" означает эпидермальный фактор роста и его рецептор.

"ПЦР" означает полимеразноцепную реакцию.

"оцFv" означает одноцепочечный Fv, являющийся фрагментом антитела.

"V_L" означает вариабельную область легкой цепи.

"V_K" означает вариабельную область легкой каппа-цепи.

"V_H" означает вариабельную область тяжелой цепи.

ФБС означает фосфатный буферный солевой раствор.

ФТС означает фетальная телячья сыворотка.

ССРХ означает сбалансированный солевой раствор Хенка.

ФИТЦ означает флюоресцеинизотиоцианат.

СКК означает смешанная клеточная культура.

Эпидермальный фактор роста (ЭФР) является полипептидным гормоном, характеризующимся митогенностью по отношению к эпидермальным и эпителиальным клеткам. При взаимодействии ЭФР с чувствительными клетками происходит связывание с мембранными рецепторами (ЭФРР). ЭФРР является трансмембранным гликопротеином примерно в 170 кД и генным продуктом протоонкогена c-erb-B.

MAb 425 является мышиными моноклональными антителами, созданными против хорошо известной клеточной линии A431 карциномы человека (ATCC CRL 1555) и связывающимися с полипептидным эпитопом внешнего домена ЭФРР человека с подавлением связывания ЭФР. MAb 425 (ATCC HB 9629), как найдено, передают клеточную цитотоксичность in vitro и подавляют рост клеток опухоли, происходящих из клеточных линий эпидермоидной и колоректальной карциномы in vitro (Kodeck и др., Cancer Res. 1987, 47, 3692). Гуманизированные и химерные варианты MAb 425 раскрыты в патенте WO 92/15683.

В последние несколько лет появились описания способов, которыми могут быть получены функциональные фрагменты антитела в эукариотных клетках-хозяевах, например E.coli (Skerra и Pliickthun, Science 1988, 240, 1038; Better и др., Science 1988, 240, 1041). Такие фрагменты включают Fv фрагмент и Fab фрагмент, причем Fv представляет особый интерес. Одноцепочечные Fv (в которых V_L и V_H цепи связаны друг с другом) описаны также в работах: Bird и др. Science 1988, 242, 423; Huston и др., Proc. Natl. Acad. Sci. США 1988, 85, 5879.

Технология с применением фаг-антитело библиотек является альтернативной гибридомной технологии выделения антител из иммунизированных животных. Гибридомная технология состоит в иммортализации клеток, продуцирующих антитела. Фаг-антитело технология заключается в иммортализации генов, кодирующих антитела (Winter G. и Milstein C., Nature, 1991, 349, 293). В фаг-антитело технологии гены вариабельной области легкой цепи (V_L) и гены вариабельной области тяжелой цепи (V_H) антитела подвергают ПЦР-амплификации, вариабельные области неупорядоченно соединяют и экспрессируют в виде фрагментов антитела на поверхности фаговых частиц, после чего библиотеки фаговых антител отбирают с выявлением антител, связывающихся с представляющими интерес антигенами.

Гибридомная технология оказалась чрезвычайно успешной в выделении мышиных моноклональных антител при условии возможности создания сильной иммунной реакции в селезенке животного. К примеру, мышиные MAb к рецептору эпидермального фактора роста (ЭФРР) человека выделены из селезенки мыши, иммунизированной внутрибрюшинно клетками A431 опухоли человека (Murthy и др., Arch. Biochem. Biophys. 1987, 252, 549). Потенциальное преимущество фаг-антитело технологии над гибридомной технологией заключается в возможности использования в качестве исходного продукта фактически любого источника экспрессирующих антитело клеток и возможности быстрого отбора большого числа различных антител. Другое преимущество фаг-антитело технологии состоит в том, что гены, кодирующие вариабельные области представляющих интерес антител, оказываются уже клонированными и непосредственно доступными для дальнейшей обработки методами генной инженерии.

Имеется сообщение о превращении противостолбнячного токсоидного Fab фрагмента, выделенного из фаг-антитело библиотеки, в полную молекулу антитела (Bender и др., Hum. Antibod. Hybridomas. 1983, 4, 74).

Последние десять лет в качестве альтернативы активной иммунизации с целью создания моноклональных антител (mAb) к широкому спектру антигенов из как человечьих, так и мышиных систем применяется иммунизация in vitro (например, Vaux D. J. T. , Helenius A., Melliman I., Nature 1988, 336, 36; Gathuru J. K. и др., J. Immunol. Methods, 1991, 137, 95; Bornebaek C.A.K., Immunol. Today, 1988, 9, 355). Преимущества такого подхода заключаются в том, что требуются очень небольшие количества антигена, и в том, что способ применим в создании человечьих гибридом. Однако образование IgM антител с плохим сродством и трудность иммортализации человечьих лимфоцитов после in vitro иммунизации - это постоянные проблемы, связанные с данной технологией.

Новый путь получения антител состоит в ПЦР амплификации репертуара генов вариабельных областей тяжелой (V_H) и легкой (V_L) цепей, которые затем неупорядоченно рекомбинируют и зкспрессируют в виде библиотек фагового отображения (7-9), Гены вариабельной области антитела клонируют и сливают с минорным белком оболочки (ген 3) в виде одноцепочного Fv фрагмента (оцFv) (10). Фаговая частица отражает на своей поверхности фрагмент антитела, которое может быть отобрано пеннингом с использованием способности антитела к связыванию. Данная технология обладает тем преимуществом, что неупорядоченная рокомбинация V-генов может привести к образованию новых пар оснований с неизвестной специфичностью и сродством, которые могут быть отобраны естественными процессами. Более того, такой подход делает возможным применение простых или in vitro иммунизированных лимфоцитов, источником которых является мышь или человек.

Предшествующие попытки получения к ЭФРР иммунизацией in vitro мышиных B-клеток и применением гибридомной технологии привели к антителам, характеризующимся низким сродством и перекрестной реакционностью. Для преодоления указанных недостатков использована комбинация иммунизации in vitro с последующим проведением ПЦР клонирования.

Таким образом, цель изобретения заключается в создании антител и фрагментов антител, обладающих высоким сродством к ЭФР-рецепторам и которые могут быть получены перспективной технологией, раскрываемой выше и ниже.

В настоящем изобретении проведено сравнение мышиных анти-ЭФРР антител, выделенных из трех различных фаг-антитело библиотек, с мышиными MAb (425), выделенными применением стандартной гибридомной технологии (Murthy и др., Arch. Biochem. Biophys. 1987, 252, 549; Kettleboroug и др., Protein Eng. 1991, 4, 773). Библиотеки приготовлены не только из селезенки иммунизированной мыши, но также из обезвоженных лимфатических узлов иммунизированной мыши и из in vitro иммунизированных мышиных клеток. Два одноцепочных Fv (оцFv), выделенные из библиотек, обработаны методами генной инженерии с созданием химерных полных молекул антитела, в которых мышиные вариабельные области соединены с человечьими постоянными областями.

Если более подробно, то настоящее изобретение относится к анти-ЭФРР одноцепочным Fv, получаемых из фаг-антитело библиотек, сконструированных из клеток, предпочтительно из клеток селезенки или обезвоженных лимфатических узлов иммунизированного млекопитающего, предпочтительно мыши или из in vitro иммунизированных клеток. В принципе, изобретение не ограничено только оцFv, но изобретением охватываются также и другие анти-ЭФРР фрагменты антитела, например: Fab или F(ab')₂.

Некоторые оцFv по изобретению характеризуются четко определенными ДНК и аминокислотными последовательностями. Таким образом, другая цель изобретения заключается в создании одноцепочного Fv фрагмента, в котором вариабельные области тяжелой и легкой цепей состоят из ДНК и/или аминокислотной последовательности, выбранной из одной из последовательностей тяжелой и легкой цепей, представленных Последовательностями NN 1 - 32, приведенными в конце описания, предпочтительно последовательностями на фиг. 5 - 8.

Вследствие того что во многих случаях для диагностических и терапевтических целей могут быть использованы только полностью функциональные полные антитела, для изобретателей было интересно связать переменные области из одноцепочных Fv с постоянными областями иммуноглобулинов человека с образованием полных частично или полностью гуманизированных анти-ЭФРР антител.

Таким образом, еще одна цель изобретения состоит в создании полного анти-ЭФРР антитела, сконструированного из ДНК последовательностей, происходящих из фрагментов антитела согласно выше- и нижеприведенному определениям или определению, приведенному в формуле изобретения, и из ДНК последовательностей, происходящих из постоянных областей иммуноглобулинов человека, при этом в рекомендуемом воплощении изобретения тяжелая цепь состоит из аминокислотной последовательности гамма-1 цели, а легкая цепь состоит из аминокислотной последовательности каппа-цепи.

Согласно настоящему изобретению анти-ЭФРР оцFv выделяют применением технологии с использованием фаг-антитело библиотек. Таким образом, изобретение относится к способу получения анти-ЭФРР одноцепочного Fv, включающему следующие стадии: (I) выделение РНК из клеток иммунизированного млекопитающего, предпочтительно мышиных клеток; (II) синтез первой нити кДНК; (III) амплификация V_H и V_K генов в кДНК из иммунизированных клеток; (IV) клонирование указанных генов вместе с приемлемыми сайтами рестрикции в фагемидный вектор; (V) трансформация клеток прокариотов лигирующими смесями; (VI) отбор фаговых библиотек для фаговых антител, направленных на ЭФРР, применением очищенного ЭФРР, и (VII) продуцирование целевого одноцепочного Fv в прокариотических клетках-хозяевах, предпочтительно E.coli.

Кроме того, цель изобретения заключается в раскрытии способа получения полного анти-ЭФРР антитела путем клонирования ДНК, кодирующей переменные области фрагментов анти-ЭФРР антитела, продуцируемых, как указано выше или по определению, приведенному в формуле изобретения, в, по меньшей мере, один эукариотический экспрессионный вектор, содержащий геномную ДНК, кодирующую постоянные области иммуноглобулинов человека, трансформацией эукариотических клеток указанным вектором(ами) с последующей экспрессией и выделением антитела.

Анти-ЭФРР оцFv и прежде всего полные анти-ЭФРР антитела могут быть использованы в диагностике и терапии опухолей человека. Таким образом, изобретение относится к лекарственным формам, содержащим анти-ЭДРР одноцепочный Fv или полное анти-ЭФРР антитело по вышеприведенному определению или по определению, приведенному в формуле изобретения.

Результаты и преимущества настоящего изобретения могут быть суммированы следующим образом.

Из фаг-антитело библиотек выделены новые мышиные анти-ЭФРР антитела. Новые антитела представлены по меньшей мере четырьмя различными V_H подгруппами и четырьмя различными V_K подгруппами (Kabat и др., "Представляющие иммунологический интерес последовательности белков", 5-ое изд., Деп. здоровья и службы человека США, Бетседа, 1991). Полученные антитела показали образование пар оснований и последовательностей отличных от мышиных MAb, выделенных применением гибридомной технологии. Мышиное MAb 425 имеет V_H 2b и V_K 4 пары, которые не обнаруживаются в фаговых антителах.

V_H для оцFv L 3 11 D обладает наиболее высоким процентом идентичности с 425 V_H (84,9%). Большая часть отличий приходится на ОКО. V_K для оцFv S4 2D обладает наиболее высоким процентом идентичности с 425 V_K (83,2%). И в этом случае большая часть отличий падает на ОКО, в частности ОКОЗ. В данном изобретении из фаг-антитело библиотек выделены разнообразные новые анти-ЭФРР антитела, и все эти антитела отличаются от 425 MAb по меньшей мере двумя оцFv фрагментами, распознающими расположенный на ЭФРР эпитоп, отличный от эпитопа, распознаваемого 425 MAb. В этом отличие от имеющегося сообщения, согласно которому антитела, выделенные из комбинированных библиотек, как утверждается, очень похожи на антитела, выделенные гибридомной технологией (Caton и Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. США 1990, 87, 6450).

Из трех фаг-антитело библиотек наилучшей библиотекой с точки зрения числа стадий отбора, необходимых для получения антител с высоким сродством, и с точки зрения различий выделенных и обладающих высоким сродством антител, является библиотека, образованная из обезвоженного лимфатического узла. Лимфатические узлы выбраны при построении фаг-антитело библиотек в качестве источника РНК по двум причинам. Во-первых, предшествующей работой показано, что B-клетки, продуцирующие IgG антитела, с высоким сродством получают в большем количестве из подколенных лимфатических узлов после иммунизации через подушечку на лапке, чем из селезенки после иммунизации через брюшину (Venn и Dresser, J. Immunol. Methods 1987, 102, 95). Во-вторых, считается, что обезвоженные лимфатические узлы являются хорошим источником для выделения противоопухолевых антител человека. Таким образом, выделение мышиных анти-ЭФРР антител из подколенного лимфатического узла иммунизированной через подушечку на лапке мыши является моделью для выделения анти-ЭФРР антител человека из подмышечных лимфатических узлов больного раком молочной железы. Показана возможность получения библиотек хорошего размера из небольших количеств материала лимфатических узлов с последующим выделением из библиотек, обладающих высоким сродством антител.

Хотя из всех трех фаг-антитело библиотек были выделены мышиные анти-ЭФРР антитела, совсем не очевидно, что любое из вновь выделенных антител будет отличаться более высоким сродством по сравнению с мышиным 425 MAb, выделенным с помощью гибридомной технологии. Первоначальные анализы показывают, что происходящие из фаг-антитела оцFv оказываются с ЭФРР лучше, чем оцFv, сконструированные из 425 MAb (фиг. 2). В других экспериментах с молекулами полного химерного антитела одно из химерных антител (S4 2D) показало сродство к ЭФРР, равное сродству химерного 425 антитела. Второе химерное антитело (L3 11D) обладает в четыре раза более низким сродством по сравнению с химерным 425 антителом (фиг. 4). Данные по связыванию, полученные с применением оцFv, столь противоречивы, вероятно, вследствие присутствия в препаратах оцFv смесей мономеров и димеров (Criffiths и др., EMBO J. 1993, 12, 725). Напротив, трудно ожидать, что химерные IgG антитела будут образовывать димеры, и, как показано, химерные L 3 11D и S4 2D антитела, имеющие именно тот размер, который следует ожидать для двухвалентных, мономерных химерных IgG антител. Однако анализ аффинно очищенных 425, L 3 11D и S4 2D оцFv показал, что указанные препараты оцFv содержат мономерные, димерные и иные полимерные формы. Кроме того, относительные количества мономерных и полимерных форм меняется для каждого оцFv 425 оцFv имеет самый низкий процент димерных форм. Предположительно, димерные и особенно более крупные полимерные формы отличаются более сильным связыванием с очищенным ЭФРР по сравнению с мономерной формой. По-видимому, 425 оцFv характеризуются более слабой тенденцией к димеризации, чем вновь выделенные оцFv.

Хотя экспрессия фрагментов антител на поверхности фаговых частиц создает основу эффективного способа для быстрого отбора антител с целевой специфичностью, тем не менее ни фаговые антитела, ни сами фрагменты антител (оцFv или Fab) вряд ли станут целевыми конечными продуктами. К тому же показано, что мышиные оцFv, выделенные из фаговых библиотек, могут быть легко превращены в молекулы полного антитела. В этом случае мышиные вариабельные области соединяют с постоянными областями человека, в результате чего создаются частично гуманизированные химерные антитела.

Эти результаты показывают возможность применения фаг-антитело технологии для получения анти-ЭФРР фрагментов антитела от иммунизированной мыши. Из фрагментов антитела могут быть сконструированы молекулы полного антитела с необходимыми постоянными областями. В отдельных случаях для получения моноклональных антител от мыши в качестве выбранного способа может быть использована и гибридомная технология. Если при этом оказывается доступным в высшей степени иммуногенный антиген и, если могут быть получены несколько адекватных клеточных линий, продуцирующих одно или несколько противоантигенных антител, в этом случае, видимо, нет причин обращаться к фаг-антитело технологии. Однако, если в создании обладающих высоким сродством антител преимущества дает особая методика иммунизации, например, инъекцией в подушечку лапки или, если необходимо большое количество антител против разнообразных эпитопов на антигене, или, если необходимы антитела, направленные против очень точного и возможно менее иммуногенного эпитопа, в этом случае выбранным способом может служить фаг-антитело технология. Кроме того, если предстоит дополнительная обработка методами генной инженерии антител, тогда преимущества фаг-антитело технологии проявляется в том, что гены оказываются уже клонированными.

Настоящий подход, сочетающий in vitro иммунизацию конкретным антигеном с технологией ПЦР-клонирования, позволяет создавать оцFv фрагменты, реагирующие с ЭФРР и не вступающие в перекрестные реакции с другими антигенами. Методика иммунизации, о которой сообщается здесь, зависит от состояния антигена, который не растворим, но является препаратом мембранного везикула, и от самой культуральной среды, в которой отсутствует ФТС. Об обоих методиках сообщается, как о средстве повышения эффективности иммунизации in vitro за счет доступности антигена для представляющих антиген клеток (например, Brans P. и др., J. Immunol. Methods, 1987, 98, 11).

Результаты, полученные применением СКК, согласуются с известными работами (например: Borrebaek C. A. K. и Moller S.A., J. Immunol., 1986, 136, 3710; Moller S.A. и Borrebaeck C.A.K. в Borrebaek C.A.K. (ред.) "Иммунизация in vitro в гибридомной технологии". Эльзевир Сайенс Паблишерс Б.В., Амстердам 1988, стр. 3), в которых для усовершенствования процесса иммунизации in vitro в качестве источника лимфокинов предлагается применение надосадочной жидкости от СКК. Препараты мембранных везикул следует рассматривать как полиантиген, поскольку в таких везикулах присутствуют многие различные антигенные детерминанты. По этой причине кажется вероятным, что они будут создавать определенный уровень поликлональной активации. Все это нами исключено, поскольку специфичная анти-ЭФРР реакция абсолютно отлична от реакции, полученной после применения стандартного поликлонального активатора.

Вместо иммортализации B-клеток после иммунизации in vitro была применена молекулярная стратегия иммортализации V_H и V_L генов антитела. Указанные фрагменты моноклонального антитела были экспрессированы и продуцированы в бактерии. Система фагового отображения является эффективным методом выделения фрагментов антитела, направленных против специфичных антигенов. Присутствие терминирующего кодона между фрагментом антитела и g3p белком оболочки допускает переключение между поверхностным отображением и секрецией в виде растворимого оцFv фрагмента применением супрессорных несупрессорных штаммов (Hogoenboom и др., Nucl. Acids Res. 1991, 19, 4133).

Вследствие увеличения специфичной реакции и уровня мРНК в стимулированных in vitro антигеном B-клетках способ иммунизации in vitro вносит свой вклад в выделение фрагментов антитела с высокой специфичностью к антигену. После двух циклов отбора 100% клонов оказались положительными для связывания ЭФРР. Напротив, клоны, полученные способами in vivo иммунизации, были на 100% положительными после четырех циклов отбора (Kettleborough и др., патент EP 94/104160 и Eur. J. Immunol. 1994, 24, 952).

Применение библиотек фагового отображения из простых генов антитела могло бы позволить получать фрагменты специфичного антитела без иммунизации или после иммунизации in vitro, т.е. простым, быстрым и экономичным путем.

Биологические материалы и общие методы Микроорганизмы, клеточные линии, плазмиды, фагемиды, промоторы, маркеры устойчивости, точки инициации репликации или иные фрагменты векторов, упоминаемые в данной заявке, являются коммерчески или в целом каким-то иным путем доступны. При условии, что в заявке не приводится никакой другой информации, все они использованы в виде примеров и несущественны по изобретению, и могут быть заменены другими приемлемыми инструментами и биологическими материалами соответственно.

Для клонирования оцFv и для продуцирования оцFv белков рекомендуются бактериальные хозяева. Примерами таких хозяев является E.coli и Bacillus.

Для продуцирования полных анти-ЭФРР антител по изобретению рекомендуются такие эукариотичные хозяева, как например: COS, CHO или дрожжи.

Методики, имеющие существенное значение для изобретения, подробно рассматриваются в описании. Другие, не раскрываемые подробно методики, соответствуют известным стандартным методам, хорошо известным специалистам или более подробно раскрываемым в цитируемых ссылках, заявках на патенты и справочной литературе.

Краткие пояснения к диаграммам Фиг. 1 - аминокислотные последовательности оцFv, выделенных из фаг-антитело библиотек. (A) оцFv из библиотеки лимфатического узла. (B) оцFv из библиотеки селезенки. Указаны определяющие комплементарность области (ОКО) и каркасные области (КО).

Фиг. 2 - связывание оцFv с ЭФРР. Определяют концентрации оцFv в бактериальных надосадочных жидкостях и оцFv анализируют методом ФИСА (ELISA) на связывание с очищенным ЭФРР. (A) оцFv из библиотеки лимфатического узла. (B) оцFv из селезенки библиотеки. P1 (положительный контроль) относится к оцFv происходящим из 425 MAb. L1 и S1 (отрицательный контроль) относится к несвязывающимся оцFv из предварительно отобранных библиотек лимфатического узла и библиотек селезенки.

Фиг. 3 - промежуточные вектора, применяемые для реконструкции вариабельных областей для экспрессии в клетках млекопитающего. (A) V_H вектор. (B) V_L вектор.

Фиг. 4 - связывание химерных полных антител с ЭФРР. Методом ФИСА определяют концентрации антител в надосадочных жидкостях от COS клеток и антитела испытывают методом ФИСА на связывание с очищенным ЭФРР.

Фиг. 5 - ДНК и аминокислотная последовательность оцFv N L211C. (A) Легкая цепь. (B) Тяжелая цепь.

Положение аминокислот: (A) ФР.-1: 1-23, ОКО-1: 24-34, ФР.-2: 25-49, OКO-2: 50-56, ФР.-3: 57-88, ОКО-3: 89-97, ФР.-4: 98-109.

(B) ФР.-1: 1-30, ОКО-1: 31-35, ФР.-2: 36-49, ОКО-2: 50-66, ФР.-3: 67-98, ОКО-3: 99-108, ФР.-4: 109-119.

Фиг. 6 - ДНК и аминокислотная последовательность оцFv N L2 12B. (A) Легкая цепь. (B) Тяжелая цепь.

Положение аминокислот: (A) ФР.-1: 1-23, ОКО-1: 24-38, ФР.-2: 39-49, ОКО-2: 50-56, ФР.-3: 57-88, ОКО-3: 89-97, ФР.-4: 98-109.

(B) ФР.-1: 1-30, ОКО-1: 31-35, ФР.-2: 36-49, ОКО-2: 50-66, ФР.-3: 67-98, ОКО-3: 99-108, ФР.-4: 109-119.

Фиг. 7 - ДНК и аминокислотная последовательность оцFv N L3 11D. (A) Легкая цепь. (B) Тяжелая цепь.

Положения аминокислот во ФР. и ОКО соответствуют положениям, приведенным для фиг. 6.

Фиг. 8 - ДНК и аминокислотная последовательность оцFv N S4 2D.

(A) Легкая цепь. (B) Тяжелая цепь.

Положения аминокислот: (A) ФР.-1: 1-23, ОКО-1: 24-35, ФР.-2: 36-50, ОКО-2: 51-57, ФР.-3: 58-89, ОКО-3: 90-98, ФР.-4: 99-110.

(B) ФР.-1: 1-30, ОКО-1: 31-35, ФР.-2: 36-49, ОКО-2: 50-66, ФР.-3: 67-98, ОКО-3: 99-107, ФР.-4: 108-118.

Приведенные на фиг. 5-8 последовательности указаны также в Перечне последовательностей, являющихся частью описания данного изобретения.

Подробное описание изобретения (1) Конструирование и скрининг фаг-антитело библиотек Сконструированы три фаг-антитело библиотеки: одна из селезенки мыши, иммунизированной клеточной линией A431 карциномы человека (8,810⁵ элементов), одна из подколенного лимфатического узла мыши, иммунизированной в подушечку лапки очищенным ЭФРР (6,510⁶ элементов) и одна из мышиных лимфоцитов, иммунизированных in vitro A431 везикулами (1,110⁵ элементов) (подробности конструирования A431 везикулов и иммунизации in vitro приведены в Примерах 1, 2). Перед отбором по меньшей мере 46 клонов из каждой библиотеки анализируют методом BstNI фингерпринтинга (Clackson и др., Nature 1991, 352, 624) с целью определения отличий в наборах детерминант. Наблюдается широкий спектр типов переваривания. Также перед отбором оцFv из 96 клонов из каждой библиотеки оценивают методом ФИСА на связывание с ЭФРР. Ни один оцFv из библиотеки селезенки и лимфатического узла не связывается с ЭФРР. Один из оцFv из иммунизированной in vitro библиотеки связывается с ЭФРР, После одного цикла отбора с применением покрытых ЭФРР иммунопробирок наблюдается явное обогащение оцFv, связывающимися с ЭФРР, в случае библиотеки лимфатического и в случае библиотеки из иммунизированных in vitro клеток. Дня обнаружения каких-либо оцFv, связывающихся с ЭФРР, из библиотеки селезенки требуется второй цикл отбора. После третьего цикла отбора большая часть оцFv из библиотеки лимфатического узла и библиотеки из иммунизированных in vitro клеток оказываются положительными на связывание с ЭФРР. После четвертого цикла отбора в случае библиотеки селезенки большая часть оцFv оказываются положительными на связывание с ЭФРР (табл. 1).

(2) Анализ последовательности связывающихся с ЭФРР клонов После каждого цикла отбора оцFv вставки из связывающихся с ЭФРР клонов анализируют методом BstNI фингерпринтинга (Clackson и др., Nature 1991, 352, 624). В результате становится очевидным, что происходит обогащение для определенных типов переваривания. Клоны с разными BstNI фингерпринтами выбраны после второго и третьего циклов отбора в случае библиотеки из лимфатического узла и после третьего и четвертого циклов отбора в случае библиотеки из селезенки для проведения ДНК-секвенирования V_H и V_L генов. Клоны с более поздних циклов отбора анализируются по той причине, что, как ожидается, на поздних этапах отбора появляются антитела, обладающие более высоким сродством (Clackson и др., Nature 1991, 352, 624).

Шестнадцать клонов из библиотеки лимфатического узла подвергнуты секвенированию с получением шести различных оцFv (фиг. 1). Пять из них являются парными уникальным V_H и V_L. Шестой клон является вариантом ранее обнаруженной V_H с шестью изменениями в аминокислотах, пять из которых приходятся на каркасную область (ФР.-1). Два из таких изменений могут быть отнесены за счет применения вырожденного VHIBACK-SFI праймера (Hoogenboom и др., Nucl. Acids Res. 1991, 19, 4133). Прочие могут быть результатом ошибок в ПЦР. V_H разделены на две подгруппы: V_H2b и V_H3d, в то время как V_K охватываются четырьмя подгруппами: V_K3, V_K4, V_K5 и V_K6 (Kabat и др. "Представляющие иммунологический интерес последовательности белков", 5-ое изд. Деп. Здоровья и службы человека США, Бетесда 1991). Десять индивидуальных клонов из библиотеки селезенки подвергнуты секвенированию, в результате выявлены четыре разных оцFv. Три из них являются парными уникальным V_H и V_K, в то время как четвертый был аналогичен одной из предшествующих пар, но только с двумя аминокислотными отличиями в V_Н, одно из которых обнаруживается в определяющей комплементарность области (ОКО-2), и двумя отличиями в аминокислотах в V_K. Подразделение на подгруппы выявило V_H из подгрупп V_H2a, V_H2c и V_H3d и V_K из подгрупп V_K3 и V_K4. Сравнение оцFv из библиотек лимфатического узла и селезенки выявило всего лишь один оцFv, являющимся общим для обеих библиотек (оцFv L3 10A/оцFv S4 10H) (фиг. 1). При анализе методом ФИСА указанный клон, видимо, прочно связывается с ЭФРР. Хотя и принимались особые меры, чтобы исключить всякое перекрестное загрязнение между библиотеками, тем не менее трудно исключить небольшое загрязнение в случае клона, прочно связывающего ЭФРР. Однако, с учетом инбредной природы линии Balb/c мышей возможно, что в двух различных библиотеках возникают одинаковые оцFv.

(3) Анализ сродства и специфичности связывания с ЭФРР На основе хорошего связывания с антигеном и отличий в ДНК последовательностях для дополнительного анализа отобрано несколько оцFv, происходящих из библиотек лимфатического узла и селезенки. Отобранные оцFv анализируют методом ФИСА на связывание с очищенным ЭФРР, связывание с отличными от ЭФРР антигенами и связывание с клеточными линиями опухолей, экспрессирующими и не экспрессирующими ЭФРР. В качестве положительного контроля готовят оцFv из мышиных 425 MAb (P1), в качестве отрицательного из фаговых антител, выделенных из библиотек лимфатического узла и селезенки для проведения отбора (L1 и S1 соответственно). Концентрацию оцFv определяют сравнением разбавлений подлежащего анализу оцFv с разбавлениями очищенного оцFv известной концентрации в Вестерн-блотинге.

оцFv анализируют методом ФИСА на связывание с очищенным ЭФРР, и полученные результаты откладывают на графике (фиг. 2). Появляется возможность оценить оцFv с точки зрения их связывания с ЭФРР. Полученная оценка воспроизводима в разных опытах. К наиболее прочно связывающимся с ЭФРР относятся следующие оцFv: L2 1C и L3 10A из библиотеки лимфатического узла и S4 10H из селезеночной библиотеки. Как указано ранее, оцFv L3 10A и S4 10H имеют одинаковые ДНК последовательности. оцFv (S4 5A), очень похожий на оцFv S4 10H, с двумя изменениями в аминокислотах в V_H и двумя - в V_K получает более низкую, чем у S4 10H, оценку. Напротив, различия, наблюдаемые между L2 12B и L3 11D, видимо, не оказывают значительного влияния на связывание. Из выделенных оцFv только два (L2 8C и L2 11C), видимо, связываются хуже, чем оцFv 425.

Методом ФИСА анализируют оцFv на связывание с нанесенными на пластик набором неродственных белков (овальбумин, лизолим куриного яйца, цитохром Ц, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, СВА альбумин и БСА). Ни один из оцFv не дал сигнал выше фона.

Методом ФИСА анализируют оцFv на связывание с тремя клеточными линиями опухоли. Клеточные линии A431 и MDA MB 468 являются ЭФРР-несущими клетками опухоли, выделенными из вульвы и молочной железы соответственно. Клеточная линия SK-MEL-23 является ганглиозиднесущей клеточной линией меланомы, которая включена в качестве отрицательного контроля. Из десяти проанализированных оцFv только четыре связываются как с очищенным ЭФРР, так и с ЭФРР-несущими клетками опухоли (L2 12B, L3 11D, L2 11C и S4 2D, фиг. 5-8). Никакого связывания с SK-MEL-23 клетками не обнаружено. Имеется несколько возможных объяснений этому неожиданному результату. Одно из них заключается в том, что ЭФРР, используемый для иммунизации, отбора и ФИСА, является секретируемым родственным ЭФРР белком (Weber и др., Science 1984, 224, 294). Этот белок имеет у C-окончания 17 дополнительных аминокислот (Giinther и др., J. Biol. Chem., 1990, 265, 22082). Методом ФИСА анализируют оцFv на связывание с пептидом из таких 17 аминокислот и никакого связывания не наблюдают. Возможно, что секретируемый родственный ЭФРР белок и ЭФРР на поверхности клетки опухоли имеют отличия в конформации и гликозилирования.

Для дальнейших исследований связывания с клетками опухоли три оцFv (L2 11A, L3 11D и S4 2D) очищают и анализируют на связывание с A431 клетками опухоли проточной цитометрией. В качестве положительного контроля применяют 425 оцFv. Из трех испытанных оцFv только L3 11D и S4 2D связываются с A431 клетками. Эти два оцFv проявляют связывание по своему характеру, аналогичное оцFv 425.

Очищенные оцFv, приготовленные из двух отдельных образцов, связывающихся как с ЭФРР, так и с ЭФРР-несущими клетками опухоли (L3 11D и S4 2D) испытывают в анализах на конкурентное связывание с мышиными 425 MAb. В то время как очищенный оцFv 425 способен препятствовать связыванию 425 MAb с ЭФРР в данном интервале концентраций, оцFv L3 11D и S4 2D не препятствуют связыванию мышиного 425 MAb с ЭФРР в тех же концентрациях. Эти два оцFv, видимо, распознают эпитоп на ЭФРР, отличающийся от эпитопа, распознаваемого мышиным 425 MAb.

(4) Химерные полные антитела, происходящие из оцFv Два оцFv (L3 11D и S4 2D) отобраны для превращения в молекулу полного антитела. ДНК, кодирующие мышиные V_H и V_K, клонируют в промежуточные вектора, содержащие ДНК последовательности, кодирующие лидерные последовательности иммуноглобулина и сигналы сплайс-донора (фиг. 3). Регулировка положения участков клонирования в V_H промежуточном векторе означает замену первого остатка в V_H (аспаргиновой кислоты на глутаминовую кислоту). Из промежуточных векторов ДНК фрагменты, содержащие V_H и V_K, уже присоединенные к лидерным последовательностям и сплайс-донора, клонируют в клеточные экспрессионные вектора млекопитающего, содержащие ДНК, кодирующие либо постоянную гамма-1-область человека, либо постоянную каппа-область человека (Maeda и др. , Hum. Antibod. Hybridomas 1991, 2, 124). Для каждого химерного антитела COS клетки трансфектируют одновременно векторами экспрессии тяжелой цепи и легкой цепи. В качестве положительного контроля, клетки также одновременно трансфектируют векторами экспрессии тяжелой и легкой цепей, кодирующими химерное 425 антитело (Kelleborough и др., Protein Eng. 1991, 4, 773). От клеток отделяют среду, которую анализируют методом ФИСА с целью определения концентрации присутствующего антитела и способности антитела связываться с ЭФРР (фиг. 4). При сравнении концентрации, необходимой для достижения полумаксимума связывания с антигеном, химерное S4 2D антитело связывается с ЭФРР на уровне, равном связыванию для химерного 425 антитела. Однако химерное L3 11D антитело связывается с ЭФРР примерно в четыре раза хуже, чем химерное 425 антитело. Сродство химерного 425 антитела (Kettleborough и др., Protein Eng. 1991, 4, 773), определенное анализом с конкурентным связыванием, равняется 1,9 и 10⁸ М^-1. Полученные результаты довольно неожиданны, поскольку предшествующие данные анализа оцFv указывают на то, что и оцFv S4 2D, и оцFv L3 11D связываются с ЭФРР лучше, чем оцFv 425 (фиг. 2). Очищенные белком A образцы химерных L3 11D и S4 2D антител анализируют методом НДС-ПАГЭ в восстановительных и невосстановительных условиях. Кроме того, химерные L3 11D и S4 2D антитела анализируют проточной цитометрией на связывание с A431 и SK-MEL-23 клетками. Оба химерных антитела хорошо связываются с ЭФРР-экспрессир