Композиция для ингибирования ангиогенеза, моноклональное антитело, полипептид, способ ингибирования роста опухоли (варианты)

Композиция для ингибирования ангиогенеза, моноклональное антитело, полипептид, способ ингибирования роста опухоли (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины и касается композиции для ингибирования ангиогенеза, моноклонального антитела, полипептида и способа ингибирования роста опухоли. Изобретение включает антагонисты фактора роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов человека (hVEGFr), в том числе моноклональные антитела, рецепторы вышеуказанных антагонистов, варианты этих антагонистов, ингибирующих ангиогенную и митогенную активности антагонистов hVEGFr. Антагонисты могут использоваться для ингибирования роста опухоли, а также процессов, связанных с избыточной пролиферацией и неоваскуляризацией. Преимущество изобретения заключается в разработке новых препаратов для решения проблем, связанных с избыточной пролиферацией и неоваскуляризацией. 5 с. и 16 з.п.ф-лы, 10 ил.

Изобретение относится к антагонистам фактора роста клеток сосудистого эндотелия (ФРЭККС), к терапевтическому составу этих антагонистов, а также к методам использования антагонистов в диагностических и терапевтических целях.

Предпосылки изобретения Двумя основными клеточными компонентами кровеносных сосудов являются эндотелиальные клетки и гладкие мышечные клетки. Эндотелиальные клетки образуют выстилку внутренней поверхности всех кровеносных сосудов и представляют собой барьер между кровью и тканями, препятствующий образованию тромбов. Помимо того, эндотелиальные клетки являются важным компонентом в формировании новых капилляров и кровеносных сосудов. Таким образом, эндотелиальные клетки пролиферируют во время ангиогенеза, или неоваскуляризации, связанного с ростом и метастазированием опухолей и с другими заболеваниями или нарушениями, иными чем неопластические.

По имеющимся данным пролиферация эндотелиальных клеток может вызываться различными полипептидами, которые естественным образом встречаются в природе. К числу таких полипептидов относятся основные и кислотные факторы роста фибробластов (ФРФ) (Берджесс и Масиаг, "Ежег. биохим.обозрение" (Animal Rev. Biochem. ) 58, 575 (1989)), фактор роста эндотелиальных клеток, образующийся из тромбоцитов (ФРЭКТ) (Исикава и др., "Природа" (Nature), 338, 557 (1989)), и фактор роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов (ФРЭККС) (Леунг и др. "Наука" (Science) 246, 1306 (1989), Феррара и Ген-цель, "Научн.сообщ.по биохим. и биофиз." (Biochem. Biophys. Res. Commun), 161, 851 (1989), Тишер и др. , "Научн. сообщ. по биохим. и биофиз." (Biochem. Biophys. Res. Commun), 165, 1198 (1989), Феррара и др. PCT Pat. Publ. N WO 90/13649 (опубликовано 15 ноября 1990 г.); Феррара и др. Заявка на патент США (U. S. Pat. App.) N 07/360229).

ФРЭККС был впервые определен в среде, кондиционированной фолликулярными или фолликулостеллярными клетками бычьего гипофиза. Биохимический анализ показывает, что бычий ФРЭККС представляет собой димерный белок с примерным молекулярным весом около 45000 дальтон и с вероятной митогенной специфичностью для эндотелиальных клеток кровеносных сосудов. ДНК, кодирующая бычий ФРЭККС, была выделена посредством скрининга библиотеки кДНК, приготовленной из таких клеток с использованием в качестве пробы гибридизации олегонуклеотидов, основанных на последовательности аминокислот аминного конца молекулы белка.

ФРЭККС человека был приготовлен сначала посредством скрининга библиотеки кДНК, приготовленной из таких клеток человека, с использованием кДНК бычьего ФРЭККС в качестве пробы для гибридизации. Одна из кДНК, выделенных таким способом, кодирует белок, состоящий из 165 аминокислот и имеющий более чем 95% гомологию с бычьим ФРЭККС. Данный белок получил название человеческого ФРЭККС (ФРЭККС). Митогенная активность человеческого ФРЭККС была подтверждена путем экспрессии кДНК человеческого ФРЭККС в клетках млекопитающих. Среда, кондиционированная клетками, которые были трансфецированы кДНК человеческого ФРЭККС, поддерживала пролиферацию капиллярных эндотелиальных клеток, в то время как контрольные клетки не проявляли такой активности [Леунг и др., "Наука" (Science), 246: 1306 (1989)].

Помимо ФРЭККС в библиотеках кДНК человека были определены еще несколько дополнительных кДНК, которые кодируют изоформы ФРЭККС, состоящие из 121, 189, и 206 аминокислот (совместно называемые белками, близкими к ФРЭККС). Белок, состоящий из 121 аминокислоты, отличается от ФРЭККС наличием делеции 44 аминокислот между позициями аминокислотных остатков 116 и 159 в последовательности ФРЭККС. Белок, состоящий из 189 аминокислот, отличается от ФРЭККС наличием вставки добавочных 24 аминокислот после позиции аминокислотного остатка 116, и, по всей видимости, этот белок идентичен человеческому фактору проницаемости кровеносных сосудов (чФПКС). Белок, состоящий из 206 аминокислот, отличается от ФРЭККС наличием вставки добавочной 41 аминокислоты после позиции аминокислотного остатка 116 [Хоук и др. "Молекулярная эндокринология" (Mol. Endocrinol.), 5: 1806 (1991); Феррара и др. "Журнал клеточной биохимии" (J. Cell Biochem.), 47: 211 (1991); Феррара и др. "Эндокринол. обозрение" (Endrocrine Reviews), 13: 18 (1992); Кек и др. "Наука" (Science), 246: 1309 (1989); Коннолли и др. "Журнал биологической химии" (J. Biol. Chem. ), 264: 20017 (1989); Кек и др. ЕРО. Pat. Publ. N 0370989 (опубликовано 30 мая 1990 г.).

ФРЭККС не только стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, но также индуцирует проницаемость кровеносных сосудов и ангиогенез. Ангиогенез, который включает образование новых кровеносных сосудов из уже существующего эндотелия, является важным компонентом многих заболеваний и нарушений, в том числе таких, как рост и метастазирование опухолей, ревматический артрит, псориаз, атеросклероз, диабетическая ретинопатия, ретролентальная фиброплазия, неоваскулярная глаукома, гемангиомы, иммунное отторжение трансплантированной роговицы и других тканей, а также хронические воспаления.

В случае роста опухолей ангиогенез имеет особенно важное значение при переходе от гиперплазии к неоплазии, а также для обеспечения питания растущей твердой опухоли [Фолкман и др. "Природа" (Nature), 339: 58 (1989)]. Ангиогенез также позволяет опухолям находиться в контакте с кровеносной системой хозяина, в результате чего могут быть определены направления метастазирования для клеток опухоли. Данные, подтверждающие роль ангиогенеза в метастазировании клеток опухоли, были получены, в частности, в результате исследований, показавших корреляцию между количеством и плотностью микрососудов на гистологических срезах инвазивной карциномы груди человека и фактическим наличием метастазов, распространившихся на значительное расстояние [Вейднер и др."Медицинск, журнал Новой Англии" (New Eng. J. Med.), 324: 1 (1991)].

В свете значения роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов и ангиогенеза, а также роли этих процессов в различных заболеваниях и нарушениях желательно было бы иметь средства для уменьшения или остановки одного или нескольких из биологических эффектов, оказываемых ФРЭККС.

Желательно также иметь средства для обнаружения присутствия ФРЭККС в нормальных и патологических условиях, и особенно в случае наличия рака.

Краткое описание изобретения В настоящем изобретении представлены вещества-антагонисты ФРЭКСС, включая (а) антитела и их варианты, способные к специфическому связыванию ФРЭККС, рецептора ФРЭККС или же комплекса ФРЭККС и рецептора ФРЭККС; (б) рецептор ФРЭККС и его варианты и (в) варианты ФРЭККС. Подобные антагонисты ингибируют митогенную, ангиогенную и прочую биологическую активность ФРЭККС и, следовательно, могут быть применены для лечения заболеваний или нарушений, характеризующихся избыточной неоваскуляризацией, в том числе, например, опухолей (в особенности твердых злокачественных опухолей), ревматоидного артрита, псориаза, атеросклероза, диабетической и другой ретинопатии, ретролентальной фиброплазии, неоваскулярной глаукомы, гемангиомы, гиперплазии щитовидной железы (включая болезнь Грейва), иммунного отторжения трансплантировенной роговицы и других тканей, а также хронических воспалений. Антагонисты могут быть применены также для лечения заболеваний или нарушений, характеризующихся нежелательной избыточной проницаемостью кровеносных сосудов, таких как отеки, связанные с опухолью мозга, асциты, связанные со злокачественными опухолями, синдром Мейгса, воспаление легких, нефротический синдром, перикардиальный выпот (например, связанный с перикардитом) и плевральный выпот.

Помимо того, антагонисты ФРЭККС являются полиспецифическими моноклональными антителами, которые способны связываться: (а) с иными эпитопами, чем эпитоп ФРЭККС, например эпитопами белка, участвующего в процессах тромбогенеза или тромболиза, или антигеном поверхности опухолевой клетки и (б) с ФРЭККС, рецептором ФРЭККС или же с комплексом ФРЭККС и рецептора ФРЭККС.

Помимо того, антагонисты ФРЭККС могут быть присоединены к цитотоксическому остатку.

Кроме того, данное изобретение относится к выделению нуклеиновых кислот, кодирующих моноклональные антитела согласно вышеописанному, а также к линиям клеток гибридомы, продуцирующим подобные моноклональные антитела.

Помимо того, данное изобретение относится к фармацевтическим составам, включающим антагонист ФРЭККС в количестве, достаточном для снижения или остановки митогенной или ангиогенной активности ФРЭККС млекопитающих.

В другом плане данное изобретение относится к методам лечения, состоящим в применении к млекопитающему, желательно к пациенту-человеку, нуждающемуся в подобном лечении, физиологически эффективного количества антагониста ФРЭККС. При желании, совместно с антагонистом ФРЭККС могут быть применены (одновременно или последовательно) другие антагонисты ФРЭККС или антиопухолевые или антиангиогенные вещества (одно или более).

Кроме того, данное изобретение относится к методу обнаружения ФРЭККС в пробах посредством приведения пробы в контакт с антителом, способным специфически связываться с ФРЭККС, и определения степени такого связывания.

Краткое описание иллюстраций Фиг. 1 показывает эффект моноклональных антител к ФРЭККС (A4.6.1 или В2.6.2), а также постороннего антитела к фактору роста гепатоцитов (анти-ФРГ) на связывание моноклональных антител к ФРЭККС с ФРЭККС.

Фиг. 2 показывает эффект моноклональных антител к ФРЭККС (A4.6.1 или B2.6.2), а также постороннего анти-ФРГ на биологическую активность ФРЭККС в культурах бычьих клеток капиллярного эндотелия коры надпочечников (КЭКН).

Фиг. 3 показывает эффект моноклональных антител к ФРЭККС (A4.6.1, B2.6.2 или A2.6.1) на связывание ФРЭККС с бычьими клетками КЭКН.

Фиг. 4 показывает эффект применения моноклонального антитела к ФРЭККС (A4.6.1) на скорость роста мышиных опухолей NEG55.

Фиг. 5 показывает эффект применения моноклонального антитела к ФРЭККС (A4.6.1) на величину мышиных опухолей NEG55 после применения в течение пяти недель.

Фиг. 6 показывает эффект применения моноклонального антитела к ФРЭККС A4.6.1 (Ат ФРЭККС) на рост мышиных опухолей SK-LMS-1.

Фиг. 7 показывает эффект применения различных по величине доз моноклонального антитела к ФРЭККС A4.6.1 (Ат ФРЭККС) на рост мышиных опухолей A673.

Фиг. 8 показывает эффект моноклонального антитела к ФРЭККС A4.6.1 на рост и выживаемость культуры клеток глиобластомы NEG55 (G55).

Фиг. 9 показывает эффект моноклонального антитела к ФРЭККС A4.6.1 на рост и выживаемость культуры клеток рабдомиосаркомы A673.

Фиг. 10 показывает эффект моноклонального антитела к ФРЭККС A4.6.1 на хемотаксис человеческих эндотелиальных клеток, вызванный человеческой синовиальной жидкостью.

Подробное описание изобретения Термин "ФРЭККС" используется здесь и далее по отношению к человеческому фактору роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, состоящему из 165 аминокислот, а также по отношению к близким человеческим факторам роста эндотелиальных клеток кровеносных сосудов, состоящим из 121, 189 и 206 аминокислот, согласно описанию Леунг и др. "Наука" (Science), 246: 1306 (1989) и Хоук и др., "Молекулярная эндокринология" (Mol. Endocrin.), 5: 1806 (1991), а также по отношению к встречающимся в природе аллельным или модифицированным формам таких факторов роста.

Настоящее изобретение включает вещества-антагонисты ФРЭККС, которые способны ингибировать одну или более из биологических активностей ФРЭККС, например его митогенную или ангиогенную активность. Действие антагонистов ФРЭККС заключается в препятствовании связыванию ФРЭККС с клеточным рецептором, в остановке жизнедеятельности или уничтожении клеток, которые были активированы ФРЭККС, или в препятствовании активации эндотелиальных клеток кровеносных сосудов после того, как ФРЭККС связывается с клеточным рецептором. Для целей данного изобретения все подобные моменты воздействия антагонистов ФРЭККС будут считаться эквивалентными. Таким образом, в состав данного изобретения включаются антитела, предпочтительно моноклональные, или же фрагменты таковых, которые связываются с ФРЭККС, рецептором ФРЭККС или же с комплексом ФРЭККС и рецептора ФРЭККС. Помимо того, в состав данного изобретения включаются фрагменты ФРЭККС и варианты аминокислотной последовательности ФРЭККС, которые связываются с рецептором ФРЭККС, но не проявляют биологической активности нативного ФРЭККС. Помимо того, в состав данного изобретения включаются рецептор ФРЭККС, а также его фрагменты и варианты его аминокислотной последовательности, которые способны связывать ФРЭККС.

Термин "рецептор ФРЭККС" (рФРЭККС) используется здесь и далее по отношению к клеточному, как правило, поверхностному рецептору, находящемуся на эндотелиальных клетках кровеносных сосудов человека, а также к его вариантам, которые сохраняют способность связывать ФРЭККС. Как правило, те рецепторы ФРЭККС и их варианты, которые являются антагонистами ФРЭККС, будут фигурировать в изолированной форме, в отличие от ситуации в естественных условиях, где они могут быть интегрированы в состав клеточной мембраны или прикреплены к поверхности клетки. Одним из примеров рецептора ФРЭККС является fms-подобная тирозинкиназа (flt), трансмембранный рецептор из группы тирозинкиназ [ДеФриз и др. "Наука" (Science), 255: 989 (1992); Шибуя и др. "Онкоген" (Oncogene), 5: 519 (1990)]. Рецептор flt состоит из внеклеточного домена, трансмембранного домена и внутриклеточного домена, имеющего тирозинкиназную активность. Внеклеточный домен участвует в связывании ФРЭККС, в то время как внутриклеточный домен участвует в передаче сигнала.

Другим примером рецептора ФРЭККС является рецептор flk-1 (называемый также KDR) [Мэтьюс и др. "Известия национальн. Акад. Наук" (Proc. Nat. Acad. Sci. ), 88: 9026 (1991); Терман и др. "Онкоген" (Oncogene), 6: 1677 (1991); Терман и др. "Научн. сообщ. по биохим. и биофиз". (Biochem. Biophys. Res. Commun.), 187: 1579 (1992)].

Связывание ФРЭККС с рецептором flt приводит к образованию по меньшей мере двух комплексов с высоким молекулярным весом от 205000 до 300000 дальтон. Комплекс с весом 300000 дальтон, по-видимому, является димером, включающим две молекулы рецептора, связанные с одной молекулой ФРЭККС.

В состав данного изобретения включены также варианты рФРЭККС. Примеры таких вариантов включают усеченные формы рецепторов, где отсутствуют трансмембранный и цитоплазматический домены, а также слитые белки, в которых полимеры или полипептиды, отличные от рФРЭККС, присоединены к рФРЭККС или же, предпочтительно, к его усеченным формам. Примером такого полипептида, отличного от рФРЭККС, является иммуноглобулин. В этом случае, например, внеклеточный домен рФРЭККС замещен Fv-доменом легкой или (предпочтительно) тяжелой цепи иммуноглобулина, причем C-конец внеклеточного домена рецептора ковалентно соединен с аминоконцом фрагмента тяжелой цепи (CH-1, сочленения, CH-2, или другого фрагмента). Подобные варианты построены таким же образом, как известные иммуноадгезоны, см., например: Гаскойн и др. "Известия национальн. Акад. Наук" (Proc. Nat. Acad. Sci.), 84: 2936 (1987); Капон и др. "Природа" (Nature), 337: 525 (1989); Аруффо и др. "Клетка" (Cell), 61: 1303 (1990); Ашкенази и др. "Известия национальн. Акад. Наук" (Proc. Nat. Acad. Sci.), 88: 10535 (1991); Беннетт и др. "Журн. биол. химии" (J. Biol. Chem.), 266: 23060 (1991). В других случаях рФРЭККС может быть присоединен к небелковому полимеру, такому как полиэтиленгликоль (ПЭГ) [см. Дэвис и др. Патент США (U. S. Patent) N 4179337; Гудсон и др. "Биотехнология" (Biotechnology), 8: 343-346 (1990); Абуховски и др. "Журн. биол. химии" (J. Biol. Chem.), 252: 3578 (1977); Абуховски и др. "Журн. биол. химии" (J. Biol. Chem.), 252: 3582 (1977)] или углеводы [см., например: Маршалл и др. "Архив биохимии и биофизики" (Arch. Biochem. Biophys. ), 167: 77 (1975)]. Посредством этого достигается увеличение срока биологического полураспада рФРЭККС и уменьшается вероятность того, что рецептор окажет иммуногенное влияние на млекопитающее, к которому этот рецептор будет применен. Использование рФРЭККС аналогично использованию антител к ФРЭККС, если принять во внимание сродство антагониста и число мест его связывания с ФРЭККС.

Внеклеточный домен рецептора ФРЭККС сам по себе или же слитый с иммуноглобулинным полипептидом или другим полипептидом-носителем в особенности полезен для использования в качестве антагониста ФРЭККС ввиду того, что внеклеточный домен может связывать ФРЭККС клетки-хозяина, не связанный с рФРЭККС на поверхности клетки.

Кроме того, рФРЭККС и его варианты могут использоваться в скрининговых анализах для выявления агонистов и антагонистов ФРЭККС. Например, клетки хозяина, трансфецированные ДНК, кодирующей рФРЭККС (например, ДНК flt или flk-1), проявляют избыточную экспрессию рецепторного полипептида на поверхности клетки, в результате чего такие рекомбинантные клетки хозяина могут идеально служить для анализа того, как тестируемое вещество (например, небольшая молекула, линейный или циклический пептид или полипептид) связывается с рФРЭККС. Подобным же образом могут быть использованы белки, в которых рФРЭККС слит с другим белком, например слитый белок рФРЭККС-ИгГ. К примеру, слитый белок может быть присоединен к иммобилизованному основанию, после чего определяется способность тестируемого вещества удалять ФРЭККС, помеченный радиоактивным изотопом, из домена слитого белка, включающего рФРЭККС.

Термин "рекомбинантный", применяемый в отношении к ФРЭККС, рецептору ФРЭККС, моноклональным антителам или прочим белкам, обозначает белки, которые производятся путем экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках хозяина. Клетка-хозяин может быть прокариотической (например, бактериальная клетка, такая как Е. coli) или эукариотической (например, клетка дрожжей или млекопитающих).

Моноклональные антитела-антагонисты Термин "моноклональное антитело" используется здесь и далее для обозначения антитела, полученного из популяции достаточно однородных антител, т. е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, идентичны в своей специфичности и сродству, за исключением возможных, естественно встречающихся мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Необходимо обратить внимание на то, что в результате подобных, естественно встречающихся, мутаций состав моноклональных антител в данном изобретении, которое в большинстве своем содержит антитела, способные специфически связывать ФРЭККС, рецептор ФРЭККС или же комплекс ФРЭККС и рецептора ФРЭККС, может также включать незначительные количества прочих антител.

Таким образом, термин "моноклональное" указывает на характер антитела, происходящего из достаточно однородной популяции антител, но здесь не имеется в виду, что антитела должны производиться каким-либо определенным путем. Например, моноклональные антитела, описанные в данном изобретении, могут быть получены гибридомным методом [Колер и Милстейн."Природа" (Nature), 256: 495 (1975)] или с применением методов, использующих рекомбинантную ДНК [Кабилли и др. Патент США (U. S. Patent) N 4816567].

При получении моноклональных антител гибридомным методом мышь или другое подходящее животное-хозяин иммунизируется антигеном посредством подкожной, внутриперитонеальной или внутримышечной инъекции с целью выявить лимфоциты, которые производят или же способны производить антитела, специфически связывающиеся с белком(ами), использованным(и) для иммунизации. В качестве альтернативы, лимфоциты могут быть иммунизированы in vitro. Затем лимфоциты сливают с клетками миеломы с использованием соответствующего агента, например такого, как полиэтиленгликоль, чтобы создать гибридомную клетку [Годинг, "Моноклональные антитела: Принципы и практика" (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, с. 59-103 (Academic Press, 1986)].

Таким антигеном могут являться ФРЭККС, рФРЭККС или же комплекс ФР ЭККС и рФРЭККС. Антиген может представлять собой фрагмент или часть ФРЭККС или рФРЭККС, обладающие одним или несколькими аминокислотными остатками, которые участвуют в связывании ФРЭККС с одним из его рецепторов. Например, иммунизация внеклеточным доменом рФРЭККС (т.е. усеченным полипептидом рФРЭККС, в котором отсутствуют трансмембранный и внутриклеточный домены) будет особенно пригодна для получения антител, являющихся антагонистами ФРЭККС, поскольку именно внеклеточный домен участвует в связывании ФРЭККС.

Также могут быть использованы моноклональные антитела, способные к связыванию комплекса ФРЭККС и рФРЭККС, в особенности если они при этом не связываются с неассоциированными (не находящимся в составе комплекса) ФРЭККС и рФРЭККС. Подобные антитела, таким образом, связываются только с клетками, которые находятся в данный момент в состоянии активации, вызванном ФРЭККС, и, соответственно, не изолированы свободными ФРЭККС и рФРЭККС, что является обычной ситуацией в клетках млекопитающих. Такие антитела обычно связывают эпитоп, который занимает одно или несколько мест контакта между рецептором и ФРЭККС. Такие антитела были получены и для других лигандных рецепторных комплексов и могут быть аналогичным образом получены и в данном случае. Подобные антитела, независимо от наличия или отсутствия способности связываться с неассоциированными ФРЭККС и рФРЭККС, не обязательно должны нейтрализовать или ингибировать биологическую активность неассоциированных ФРЭККС и рФРЭККС.

Приготовленные таким образом гибридомные клетки высеваются и выращиваются в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно должна содержать одно или несколько веществ, которые ингибируют рост или выживание неслитых, родительских клеток миеломы. Например, в случае, если в родительских клетках миеломы отсутствует фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ или ГФРТ), культуральная среда для гибридом обычно будет содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), каковые вещества препятствуют росту клеток, не обладающих ГГФРТ.

Предпочтительно выбирать такие клетки миеломы, которые эффективно сливаются, поддерживают стабильный высокий уровень экспрессии антител в отобранных клетках, производящих антитела, и являются чувствительными к средам, таким, например, как среда HAT. Среди таких клеток предпочтительными клеточными линиями являются: мышиные линии миеломы, такие как линии, происходящие от мышиных опухолей МОРС-21 и МРС-11, которые можно получить из Центра распределения клеток Института им. Солка в Сан-Диего (Калифорния, США); клетки SP-2, которые можно получить из Американской коллекции типовых культур в Роквилле (Мэриленд, США); и клетки P3X63Ag8U.1, описанные Йелтоном и др. ("Текущие вопросы в микробиологии и иммунологии" (Curr. Top. Microbiol. Immunol.), 81: 1 (1978). Кроме того, были описаны клеточные линии человеческой миеломы и человеческо-мышиной гетеромиеломы, способные производить человеческие моноклональные антитела (Козбор, "Журн. иммунологии" (J.Immunol.), 133: 3001 (1984); Бродер и пр. "Получение моноклональных антител: методы и их применение" (Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications), c. 51-63 (Marcel Dekker Inc., New York, 1987).

Культурная среда, в которой выращиваются клетки гибридомы, подвергается анализу для производства моноклональных антител, направленных против соответствующего антигена. Предпочтительно, чтобы специфичность связывания моноклональных антител, производимых клетками гибридомы, определялась путем иммунопреципитации или анализа связывания in vitro, например радиоиммуноанализом (RIA) или твердофазным иммуноферментным анализом (ELISA). Данное изобретение относится к тем моноклональным антителам, которые предпочтительно образуют иммунопреципитат с ФРЭККС, рФРЭККС или комплекс ФРЭККС и рФРЭККС, или же предпочтительно связывают по меньшей мере один из этих антигенов при анализе связывания и способны ингибировать биологическую активность ФРЭККС.

После определения клеток гибридомы, которые производят антагонистические антитела желаемой специфичности, сродства и активности, клоны могут быть субклонированы методом ограниченных разбавлений и выращены стандартными методами [Годинг, "Моноклональные антитела: Принципы и практика" (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, с. 59-104 (Academic Press, 1986)]. К подходящим культуральным средам относятся, например, среда Игла, модифицированная Дулбекко (СИМД), или среда RPMI-1640. Кроме того, клетки гибридомы могут выращиваться in vivo в животных как асцитные опухоли.

Моноклональные антитела, продуцированные субклонами, отделяются от культуральной среды, асцитной жидкости или плазмы путем использования обычных методов иммуноглобулинной очистки, таких как, например, белок A-Сефароза, гидроксилапатитная хроматография, электрофорез в гелях, диализ или аффинная хроматография.

ДНК, кодирующая моноклональные антитела, описанные в данном изобретении, может быть с легкостью выделена и секвенирована обычными методами (например, с использованием олигонуклеотидных проб, способных связываться специфически с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепу мышиных антител). В качестве предпочтительного источника ДНК служат клетки гибридомы, описанные в данном изобретении. После выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем трансфецируются в клетки хозяина, такие как обезьяньи клетки линии COS, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые в иной ситуации не продуцируют иммуноглобулинный белок, для того чтобы достигнуть синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках хозяина.

ДНК может быть модифицирована по выбору для того, чтобы изменить характер иммуноглобулина, продуцируемого экспрессией этой ДНК. Так, например, гуманизированные формы мышиных антител могут быть получены путем замещения комплементарной определяющей области (CDR) вариабельного домена мышиного антитела на соответствующую область человеческого антитела. В некоторых вариантах отдельные аминокислоты из базовой области (FR) мышиного антитела также замещаются на соответствующие аминокислотные остатки человеческого антитела [Картер и др. "Известия национальн. Акад. Наук" (Proc. Nat. Acad. Sci.), 89: 4285 (1992); Картер и др. "Биотехнология" (Biotechnology), 10: 163 (1992)]. Химерные формы мышиных антител могут быть получены также путем замещения гомологичных мышиных последовательностей ДНК на последовательность, кодирующую отдельные области человеческих постоянных цепей иммуноглобулина (тяжелой и легкой) [Кабилли и др., Патент США (U. S. Patent) N 4816567; Моррисон и пр. "Известия национальн. Акад. Наук" (Proc. Nat. Acad. Sci.), 81: 6851 (1984)].

Антитела, описанные в данном изобретении, включают варианты антител, такие как химерные (в том числе "гуманизированные") антитела и гибридные антитела, представляющие собой иммуноглобулинные цепи, способные связывать ФРЭККС, рецептор ФРЭККС, комплекс ФРЭККС и рецептора ФРЭККС, или же эпитоп, не принадлежащий к ФРЭККС.

В состав таких антител включаются все виды, классы (например, IgA, IgD, lgE, IgG и IgM) и подклассы иммуноглобулинов, а также и фрагменты антител (например, Fab, F(ab')₂ и Fv), пока они обладают способностью связывать ФРЭККС, рецептор ФРЭККС или комплекс ФРЭККС и рецептора ФРЭККС и пока они проявляют антагонизм по отношению к биологической активности ФРЭККС.

В случае предпочитаемого варианта данного изобретения моноклональные антитела будут проявлять сродство к иммунизирующему антигену в размере по меньшей мере 10⁹ литров/моль, как определяется, например, анализом Скатчарда [Мансон и Поллард, "Аналит. биохимия" (Anal. Biochem), 107: 220 (1980)]. Кроме того, моноклональные антитела обычно будут ингибировать митогенную или ангиогенную активность ФРЭККС по крайней мере на 50%; предпочтительно на 80% и наиболее предпочтительно на 90%, как определяется, например, анализом выживания или пролиферации клеток in vitro, подобно описанному в Примере 2.

Для некоторых терапевтических и диагностических применений желательно, чтобы моноклональные антитела реагировали не со всеми различными молекулярными формами ФРЭККС. Например, может быть желательно получить моноклональное антитело, которое способно специфически связываться только с полипептидом ФРЭККС, имеющим последовательность из 165 аминокислот, но не с полипептидами ФРЭККС, имеющими последовательности из 121 или 189 аминокислот. Такие антитела легко определяются путем сравнения анализов ELISA или путем сравнения иммуноприпитации различных полипептидов ФРЭККС.

Конъюгаты с цитотоксическими остатками В некоторых вариантах желательно иметь цитотоксический остаток в виде конъюгата с моноклональным антителом, специфическим для ФРЭККС, или же в виде конъюгата с рФРЭККС. В подобных вариантах цитотоксин служит для приостановки жизнедеятельности или для уничтожения клеток, которые проявляют экспрессию ФРЭККС или рецептора ФРЭККС или же связывают эти белки. Конъюгат нацеливается на клетку-мишень через посредство домена, который способен связываться с ФРЭККС, рФРЭККС или комплексом ФРЭККС и рФРЭККС.

Таким образом, моноклональные антитела, способные связываться с ФРЭККС, рФРЭККС или комплексом ФРЭККС и рФРЭККС, конъюгируются с цитотоксинами. Подобным же образом конъюгируется с цитотоксином ФРЭККС. В то время, как в оптимальном случае моноклональные антитела способны нейтрализовать активность ФРЭККС и без участия цитотоксина, в случае данного варианта не является необходимым, чтобы моноклональное антитело или рецептор были способны к какой-либо другой активности, кроме связывания с ФРЭККС, рФРЭККС или комплексом ФРЭККС и рФРЭККС.

В обычном случае в качестве цитотоксина выступает белковый цитотоксин, например токсин возбудителя дифтерии, рицин или токсин Pseudomonas, хотя в ряде случаев с некоторыми классами иммуноглобулинов домен Fc самого моноклонального антитела может служить в качестве цитотоксина [например, в случае антител IgG2, которые способны фиксировать комплемент и участвовать в антителозависимой клеточной цитотоксичности (АТКЦ)]. Однако цитотоксин не обязательно должен иметь белковую природу и может включать химиотерапевтические вещества, до настоящего времени употреблявшиеся, например, для лечения опухолей.

Обычно цитотоксин присоединяется к моноклональному антителу или же фрагменту такого антитела через амидную связь в составе основной цепи молекулы антитела в ее домене Fc (или же замещая этот домен или его часть). В случае, когда рФРЭККС обеспечивает функцию нацеливания на клетку, цитотоксический остаток присоединяется к любому домену рецептора, который не участвует в связывании ФРЭККС. Предпочтительно, чтобы остаток замещал трансмембранный или цитоплазматический домены рецептора или присоединялся к ним. Оптимальный участок замещения должен быть определен путем стандартных экспериментов, не требующих дополнительных навыков.

Конъюгаты, являющиеся слитыми белками, легко производятся в рекомбинантной культуре клеток путем экспрессии гена, который кодирует данный конъюгат. В альтернативном случае конъюгаты производятся путем ковалентного перекрестного сшивания цитотоксического остатка с боковой цепью или с C-терминальным карбоксилом антитела рецептора с использованием методик, которые известны сами по себе как дисульфидный обмен или сшивание посредством тиоэфирной связи, например, с использованием иминотиолата и метил-4-меркаптобутиримадата.

Конъюгаты с другими остатками Моноклональные антитела и рФРЭККС, являющиеся антагонистами ФРЭККС, также могут конъюгироваться с веществами, которые сами по себе не могут быть непосредственно отнесены к цитотоксинам, но которые повышают активность описанных составов. Например, моноклональные антитела, способные связываться с ФРЭККС, рФРЭККС или комплексом ФРЭККС и рФРЭККС, сливают с гетерологичными полипептидами, такими как последовательности вирусов, клеточные рецепторы, цитокины (такие как ТНФ), интерфероны или интерлейкины, с полипептидами, имеющими прокоагулянтную активность, и с прочими биологически или иммунологически активными полипептидами. Подобные слитые конструкции легко изготовляются с помощью рекомбинантных методов. Обычно такие неиммуноглобулинные полипептиды замещаются на постоянный домен (или домены) антитела к ФРЭККС или к комплексу ФРЭККС и рФРЭККС или на трансмембранный и/или внутриклеточный домены рФРЭККС. В альтернативном случае они замещаются на вариабельный домен одного антигенсвязывающего участка описанного антитела к ФРЭККС.

Предпочтительными являются те варианты, в которых такие неиммуноглобулинные полипептиды соединены с или заменяют постоянные домены описанного антитела [Беннетт и др. "Журнал биологической химии" (J. Biol. Chem.), 266: 23060 (1991)]. В альтернативном случае они замещаются на Fv описанного антитела для создания химерного поливалентного антитела, включающего по крайней мере один остающийся антигенсвязывающий участок, специфичный для ФРЭККС, рФРЭККС или комплекса ФРЭККС и рФРЭККС, и суррогатный антигенсвязывающий участок, имеющий иную специфичность, чем исходное антитело.

Гетероспецифические антитела Моноклональные антитела, способные связываться с ФРЭККС, рФРЭККС или комплексом ФРЭККС и рФРЭККС, должны содержать только один связывающий участок для данных эпитопов, обычно одиночный комплекс тяжелой и легкой цепей или фрагмент такого комплекса. Однако подобные антитела могут также иметь антигенсвязывающие домены, способные связывать иные эпитопы, нежели эпитопы ФРЭККС, рФРЭККС или комплекса ФРЭККС и рФРЭККС. Например, в результате замещения соответствующей аминокислотной последовательности или аминокислотных остатков нативных антител к ФРЭККС, рФРЭККС или к комплексу ФРЭККС и рФРЭККС на остатки, определяющие комплементарность, и, в случае необходимости, остовные остатки антитела, специфического по отношению к антигену, иному чем ФРЭККС, рФРЭККС или комплекс ФРЭККС и рФРЭККС, может быть создано полиспецифическое антитело, включающее один антигенсвязывающий участок, специфический для ФРЭККС, рФРЭККС или комплекса ФРЭККС и рФРЭККС, и другой антигенсвязывающий участок, специфический для антигена, иного чем ФРЭККС, рФРЭККС или комплекс ФРЭККС и рФРЭККС. Такие антитела являются по меньшей мере бивалентными, но могут быть и поливалентными, в зависимости от числа антигенсвязывающих участков, которым обладают антитела выбранного класса. Например, антитела класса IgM будут поливалентными.

Предпочтительными являются те варианты, в которых такие антитела способны связывать эпитопы ФРЭККС или рФРЭККС, а также (а) полипептид, активный при коагиляции крови, такой как белок C или тканевый фактор, или (б) цитотоксический белок, такой как фактор некроза опухолей (ФНО), или (в) рецептор клеточной поверхности, отличный от рФРЭККС, такой как рецепторы CD4 или HER-2 [Мэддон и др., "Клетка" (Cell), 42: 93 (1985); Куссенс и др., "Наука" (Science), 230: 1137 (1985)]. Гетероспецифические, мультивалентные антитела могут быть получены путем котрансформации клетки-хозяина ДНК, кодирующей тяжелую и легкую цепи обоих антител, с последующим сохранением, путем имунноаффинной хроматографии или подобным методом, той части экспрессированных антител, которые обладают желаемыми антигенсвязывающими свойствами. В альтернативном случае подобные антитела получаются путем рекомбинации моноспецифических антител in vitro.

Моновалентные антитела Моновалентные антитела, способные связываться с ФРЭККС или комплексом ФРЭККС и рФРЭККС, особенно полезны в качестве антагонистов ФРЭККС. Данное изобретение не ограничено описанием какого-либо отдельного механизма биологической активности; предполагается, что активация клеточных рецепторов ФРЭККС следует механизму, в котором связывание ФРЭККС и клеточных рецепторов ФРЭККС индуцирует агрегацию рецепторов, что в свою очередь активирует киназную активность внутриклеточного рецептора. Поскольку моновалентные антитела к рецептору ФРЭККС не способны индуцировать подобную агрегацию и вследствие этого активировать