Производные 2,6-дигидрокси-4-аминометилбензоата

Производные 2,6-дигидрокси-4-аминометилбензоата

Реферат

 

Изобретение относится к новым соединениям формулы СI, где группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна от приблизительно 0 до 6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна 6 - 18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна 3 - 12 атомам углерода; R₁ обозначает электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для вступления производного в реакцию с биологически активными компонентами и выбранными из группы, включающей такие фрагменты, как акриламид, аминогруппа, бром, дитиопиридил, бромацетамид, гидразид, N-гидроксисукцинимидный эфирный остаток, N-гидроксисульфосукцинимидный эфирный остаток, имидатный эфирный остаток, имидазолил, йод, йодацетамид, малеимид и тиол, R₂ обозначает одну из таких групп, как алкильная и метиленовая, несущая электроотрицательный фрагмент с отрицательным дипольным моментом. Соединения формулы I пригодны для модификации биологически активных компонентов с целью включения комплексообразующего фрагмента для фенилбороновой кислоты и последующей конъюгации с различными биологически активными компонентами с подвешенными фрагментами фенилбороновой кислоты. 2 з.п.ф-лы, 14 ил.

Перекрестная ссылка на родственные заявки Настоящая заявка является частичным продолжением заявки на патент США 08/188531, поданной 28 января 1994 г., по которой выдан патент США 5594151 и которая включена в настоящее описание в качестве ссылки. Эта заявка также является продолжением заявок на патент США 08/188460, 08/188958 и 08/188176, каждая из которых подана 28 января 1994 г. и каждая из которых включена в настоящее описание в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к получению биоконъюгатов, в частности к классу комплексообразующих реагентов для борсодержащих соединений, пригодных для конъюгации биологических макромолекул, и к способу получения и применения таких реагентов.

Предпосылки создания изобретения Биоконъюгация представляет собой процесс, позволяющий соединять молекулы двух или нескольких различных типов с помощью химического или биологического способов, когда по крайней мере молекула одного типа представляет собой биологическую макромолекулу. Это понятие включает, но не ограничивается ими, конъюгацию протеинов, пептидов, полисахаридов, гормонов, нуклеиновых кислот, липосом и клеток друг с другом или с любыми другими типами молекул, позволяя получать новые лекарства, радиоизотопы, токсины, гаптены, ингибиторы, хромофоры, флуорофоры, лиганды и т.д. с более широким набором полезных свойств. Иммобилизация биологических макромолекул также рассматривается как особый случай биоконъюгации, при котором макромолекулы конъюгируют, либо обратимо, либо необратимо, с нерастворимым носителем. Биоконъюгацию широко используют в биохимических, иммунохимических исследованиях и исследованиях по молекулярной биологии. Основными областями применения биоконъюгации являются обнаружение генных зондов, твердофазный иммуноферментный анализ, получение лекарств на основе моноклональных антител и получение изображений в медицинских целях.

Биоконъюгаты, как правило, классифицируют на прямые или непрямые. Под прямыми конъюгатами понимают таковые, в которых два или более компонентов соединены с помощью прямых ковалентных химических связей. Альтернативно этому под непрямыми конъюгатами понимают таковые, в которых два или более компонентов соединены через промежуточный комплекс, включающий биологические макромолекулы. Представленная в настоящем описании система в первую очередь обладает способностью образовывать непрямые конъюгаты вне зависимости от промежуточных биологических макромолекул.

Система авидин-биотин Хотя в литературе и описаны многочисленные способы получения непрямых конъюгатов, значительная часть известных конъюгатов получена с помощью системы авидин-биотин, в которой специфическое связывание протеина авидина (очищенного из яичного белка) или стрептавидина (очищенного из бактерии Streptomyces avidini) с кофактором биотином (витамин H) используют для связи макромолекулы, конъюгированной с авидином, с биотинилированной макромолекулой. Авидин и стрептавидин несут по 4 сайта связывания с очень высокой аффиностью (К = 10¹⁵ моля^-1) к биотину.

Система авидин-биотин широко использовалась для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), в котором конъюгат фермент-авидин (пригодный для обнаружения путем реакции с субстратом фермента с получением окрашенного или хемолюминисцентного продукта) применяют для обнаружения биотинилированного антитела после первого связывания антитела с иммобилизованным антигеном или гаптеном. Применение системы авидин-биотин широко представлено в большом количестве посвященных этой теме работ, которые в настоящее время обобщены в обзоре Wilchek М. и Bayer Е.А. (1990), Methods in Enzymology, 184.

Несмотря на интенсивное применение, известно несколько связанных с системой авидин-биотин ограничений, которые включают неспецифическое связывание, обычно обусловленное щелочными свойствами молекулы авидина, неспецифическое связывание, обусловленное присутствием углеводных остатков на молекуле авидина, и фоновые помехи, обусловленные присутствием эндогенного биотина, который повсеместно встречается как в эукариотичеаских, так и в прокариотических клетках.

Система дигоксигенин- -дигоксигенин В настоящее время разработана альтернативная система непрямой биоконъюгации, предназначенная для преодоления некоторых ограничений, связанных с системой авидин-биотин, для обнаружения генных зондов с помощью ELISA (Kessler C. , Holtke H. - J., Seibl R., Burg J. и Muhlegger К. (1990) Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 371, 917 - 965). Эта система предусматривает применение стероидного гаптена дигоксигенина, алкалоида, встречающегося исключительно в растениях сем. Digitalis, и Fab-фрагмента, выделенного из овечьих антител к дигоксигенину ( -дигоксигенин). Высокая специфичность различных антител в виде -дигоксигенина обусловливает низкие фоновые уровни и устраняет неспецифическое связывание, которое характерно для систем авидин-биотин. Меченные дигоксигенином ДНК- и РНК-зонды способствуют обнаружению с помощью Саузерн-блоттинга уникальных копий последовательностей в геноме человека. Данные о разработке системы дигоксигенин- -дигоксигенин в настоящее время обобщены у Kessler C. (1990) в Advances in Mutagenesis Research (под ред. Obe G.), стр. 105-152, Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg. Система дигоксигенин- -дигоксигенин представляет собой наиболее современную систему, характерную для нескольких систем гаптен-антитело, которые применяются в настоящее время для биоконъюгации.

Иммобилизованные фенилборонаты Известно, что фенилбороновые кислоты взаимодействуют с широким спектром полярных молекул, которые имеют определенные необходимые функциональные группы. Известно, что комплексы различной стабильности, включающие 1,2-диолы, 1,3-диолы, 1,2-гидроксикислоты, 1,3-гидроксикислоты, 1,2-гидроксиламины, 1,3-гидроксиламины, 1,2-дикетоны и 1,3-дикетоны, образуются как с нейтральной фенилбороновой кислотой, так и с анионом фенилбороната. Вследствие этого иммобилизованные фенилбороновые кислоты применялись в качестве хроматографических носителей для селективного удерживания различных биологических образцов, молекулы которых имели необходимые функциональные группы. Многие важные биологические молекулы, включая углеводы, катехоламины, простагландины, рибонуклеозиды и стероиды, содержат необходимые функциональные группы и либо анализировались, либо очищались этим способом. Применение фенилбороновой кислоты в качестве хроматографической среды для выделения и разделения биологических молекул описано в нескольких обзорных работах (Singal R.P. и DeSilva S.S.M. (1992) Adv. Chromatog. 31, 295-335; Mazzeo J. R. и Krull 1.S. (1989) BioChromatog. 31, 293-335; Bergold А. и Scouten W. H. (1983) в Solid Phase Biochemistry (под ред. Scouten W. H.) стр. 149-187, John Wiley & Sons, New York).

Фенилбороновая кислота, подобно борной кислоте, представляет собой кислоту Льюиса и ионизируется не в результате прямого депротонирования, а путем гидрирования с получением тетраэдрного аниона фенилбороната (рК_a = 8,86). Фенилбороновая кислота в три раза сильнее борной кислоты. Ионизация фенилбороновой кислоты представляет собой важный фактор в комплексообразовании, поскольку в результате ионизации бор изменяет треугольную координацию (имеющую средние углы между связями 120^o и средние длины связей 1,37) на тетраэдрную координацию аниона (имеющую средние углы между связями 109^o и средние длины связей 1,48).

Известно, что молекулы, имеющие цис- или коаксиальные 1,2-диольные и 1,3-диольные функциональные группы, в частности углеводы, образуют комплексы с иммобилизованным анионом фенилбороната с образованием циклических сложных эфиров в щелочных водных условиях (Lorand J.P. и Edwards J.O. (1959) J. Org. Chem. 24, 769).

Известно далее, что подкисление комплексов на основе 1,2-диола и 1,3-диола до нейтрального значения pH приводит к высвобождению диолсодержащих молекул, вероятно вследствие гидролиза циклического сложного эфира. Известно также, что копланарные ароматические 1,3-диолы типа 1,8-дигидроксинафталина образуют комплекс даже в кислых условиях вследствие гидролитической стабильности шестичленных циклических эфиров бороновой кислоты (Sienkiewicz Р. А. и Roberts D. C. (1980) J. Inorg. Nucl. Chem. 42, 1559-1571). Также известно, что молекулы, содержащие в качестве функциональных групп подвешенные 1,2- гидроксиламин, 1,3-гидроксиламин, 1,2-гидроксиамид, 1,3- гидроксиамид, 1,2-гидроксиоксим и 1,3-гидроксиоксим, образуют обратимые комплексы с фенилболроновой кислотой в водных щелочных условиях, аналогичных таковым, которые связаны с сохранением диолсодержащих молекул (Tanner D.W. и Bruice T. C. (1967) J. Amer. Chem. Soc. 89, 6954).

Биоконъюгаты на основе фенилбороната Орто-замещенные ацетамидофенилбороновые кислоты были предложены в качестве потенциальных линкеров для избирательной биоконъюгации через соседние диольные фрагменты углеводных остатков, связанных с гликопротеинами (Cai S. X. и Keana J.F.W. (1991) Bioconjugate Chem., 2, 317-322). Биоконъюгаты фенилбороновой кислоты, полученные из 3-изотиоцианатфенилборной кислоты, успешно применялись для присоединения комплексов диоксима технеция к моноклональным антителам для получения изображений в медицинских целях (Linder К. Е. , Wen M.D., Nowotnik D.P., Malley M.F. Gougoutas J.Z., Nunn A.D. и Eckelman W. C. (1991) Bioconjugate Chein. 2, 160- 170; Linder K.E. Wen M.D., Nowotnik D.P., Ramalingam K., Sharkey P.M. Yost F. Narra R.K. и Eckelman W.C. (1991) Bioconjugate Chem., 2, 407-414).

3-аминофенилбороновая кислота была ковалентно присоединена к протеинам с помощью различных химических методов, и полученные в результате биоконъюгаты фенилбороновой кислоты были изучены в отношении их связывания с D-сорбитом, D-маннозой и глицированным гемаглобином (GHb). Было установлено, что взаимосвязи являются обратимыми, и вследствие очень низкой аффинности биоконъюгаты имеют очень ограниченное практическое применение. Аналогично этому биоконъюгаты щелочной фосфатазы и фенилбороновой кислоты, которые пытались применять в ферментном анализе для обнаружения GHb, оказались неспособны выявить присутствие глицированного протеина (Frantzen F., Grirnsrud К., Heggli D. и Sundrehagen Е. (1995) Journal of Chromatography B, 670, 37-45).

Хотя иммобилизованные фенилборонаты использовали для хроматографического разделения биологических молекул, имеющих необходимые функциональные группы, несмотря на достаточное количество исследований биоконъюгации и достаточное число работ в этой области, избирательность фенилбороновой кислоты тем не менее не применялась достаточно успешно в целях конъюгации биологических макромолекул друг с другом или с другими типами молекул, которые расширяют спектр полезных свойств.

Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к новому классу комплексообразующих реагентов для борсодержащих соединений, пригодных для получения биоконъюгатов, и к способу получения и применения таких реагентов. В одном из вариантов осуществления борсодержащее соединение представляет собой фенилбороновую кислоту или ее производные, которые образуют комплекс с комплексообразующими реагентами по настоящему изобретению. Если не указано иное, понятие "комплесообразующий реагент для фенилбороновой кислоты" в контексте настоящего описания включает более широкий класс комплексообразующих реагентов для борсодержащих соединений, а понятие "фенилбороновая кислота" в контексте настоящего описания включает более широкий класс борсодержащих соединений, которые образуют комплекс с комплексообразующими реагентами для борсодержащих соединений. В отличие от известного применения систем авидин-биотин и дигоксигенин- -дигоксигенин согласно настоящему изобретению для облегчения химической конъюгации используются комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений вместе с борсодержащим соединением, такие как реагенты для фенилбороновой кислоты (многие из которых известны из уровня техники), без использования промежуточных биологических макромолекул. Получение биоконъюгатов часто включает конъюгацию протеинов, пептидов, полисахаридов, гормонов, нуклеиновых кислот, липосом и клеток, но не ограничено ими, друг с другом или с любыми другими типами молекул, позволяя получать лекарства, радиоизотопы, токсины, гаптены, ингибиторы, хромофоры, флуорофоры, лиганды, твердофазные носители и комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений и т.д. с более широким набором полезных свойств. Эти различные компоненты, применяемые для получения биокоонъюгата, вместе и по отдельности обозначены ниже понятием "биологически активные компоненты" или "биоактивные компоненты".

Реагенты, пригодные для модификации биологически активных компонентов с целью включения комплексообразующего фрагмента для фенилбороновой кислоты и последующей конъюгации с различными (или с этими же) биологически активными компонентами с подвешенными фрагментами фенилбороновой кислоты, представлены общей формулой, которая обозначена как общая формула CI Общая формула CI В этой формуле группа R₁ обозначает реакционноспособный электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для вступления в реакцию предполагаемого комплексообразующего реагента для фенилбороновой кислоты с биоактивными компонентами. Группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой составляет приблизительно 0-6 атомов углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группу R₂ выбирают из алкила (например, метила, этила и т.д.) и метилена, несущего электроотрицательный заместитель.

Взаимодействие реагента общей формулы CI с биоактивными компонентами позволяет получить конъюгат с подвешенными комплексообразующими фрагментами для фенилбороновой кислоты (один или несколько) общей формулы CII Общая формула CII Символом BAS обозначены биологически активные компоненты (или биоактивные компоненты), которые могут содержать часть реакционноспособного фрагмента (который сам может иметь спейсер), применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту, или могут не содержать этот фрагмент. Следует отметить, что во многих вариантах осуществления несколько идентичных реагентов общей формулы CI могут реагировать с одной молекулой BAS. Например, если BAS представляет собой протеин, многие комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты могут реагировать с протеином, при этом каждый из них может вступать во взаимодействие с одним из нескольких сайтов на протеине, который является реакционноспособным для группы R₁. Группа Z в общей формуле CII обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой составляет приблизительно 0-6 атомов углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группу R₂ выбирают из алкила (например, метила, этила и т.д.) и метилена, несущего электроотрицательный заместитель.

Реагент общей формулы CII также может реагировать с получением целого класса конъюгатов комплексообразующих реагентов для борсодержащих соединений, например, реагентов с одним или с несколькими подвешенными комплексообразующими фрагментами для фенилбороновой кислоты общей формулы CIV Общая формула CIV В конъюгате общей формулы CIV группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3 - 12 атомам углерода. Группу R₃ выбирают из Н, алкила и метилена или этилена с электроотрицательным заместителем. В завершение символ BAS, как указано выше, обозначает биоактивные компоненты, которые могут содержать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов, или могут не содержать его.

Структуры общей формулы CIII и общей формулы CIV и способы их получения представлены в настоящем описании и являются объектом одновременно рассматриваемой заявки на патент США 08/689283, озаглавленной "Комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений и высокостабильные комплексы на их основе", поданной 5 августа 1996 г. на имя Mark L. Stolowitz, Robert J. Kaiser и Kevin P. Lund и включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

Реагенты для фенилбороновой кислоты, многие из которых известны из уровня техники, а также те, которые описаны более подробно в одновременно рассматриваемой заявке на патент США 08/188958, озаглавленной "Комплекс на основе фенилбороновой кислоты для получения биоконъюгатов", поданной 28 января 1994 г. и включенной в настоящее описание в качестве ссылки, могут быть присоединены к биологически активным компонентам с получением конъюгата с подвешенными фрагментами фенилбороновой кислоты (один или несколько) общей формулы CV Общая формула CV где символ BAS^* обозначает вторые биоактивные компоненты, которые могут включать линкерную область и которые могут отличаться от биоактивных компонентов, обозначенных через BAS. BAS^* также могут включать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту для фенилбороновой кислоты.

Конъюгат общей формулы CIV, имеющий по крайней мере один из биологически активных компонентов и содержащий подвешенные комплексообразующие фрагменты для фенилбороновой кислоты (один или несколько), может образовывать комплексы с конъюгатом общей формулы CV, полученным с участием вторых биоактивных компонентов BAS^* и имеющим подвешенные фрагменты фенилбороновой кислоты (один или несколько), с получением биоконъюгата общей формулы CVI Общая формула CVI где символы BAS и BAS^* и группы Z и R₃ имеют указанные выше значения. В этом случае биологические макромолекулы могут конъюгироваться друг с другом или с другими функциональными группами, которые придают продукту новые полезные свойства.

Биоконъюгаты общей формулы CVI могут быть получены в забуференном водном растворе или в органических растворителях. Биоконъюгаты образуются в течение нескольких минут в диапазоне температур приблизительно от 4^oC до 70^oC. На стабильность биоконъюгата в водном растворе при данных значении pH и температуре в значительной степени влияет заместитель группы R₃. Биоконъюгаты общей формулы CVI стабильны в водном растворе при приблизительных значениях pH не выше 3,5 и не ниже 10,5.

Реакция биоконъюгации (образование комплекса с фенилбороновой кислотой) нечувствительна к значительным изменениям ионной силы, к присутствию органических растворителей, к присутствию детергентов и к присутствию хаотропических агентов (агентов, денатурирующих протеины), что отличает ее от известных из уровня техники непрямых меченых систем, причем строение биологической макромолекулы должно сохраняться с целью сохранности необходимых характеристик связывания. Во многих случаях ограничения, налагаемые на образование биоконъюгатов с помощью представленной в настоящем описании системы, обусловлены ограничениями, налагаемыми условиями, необходимыми для сохранения жизнеспособности биоактивных компонентов.

В целом настоящее изобретение относится к комплексообразующим реагентам для борсодержащих соединений и способам синтеза этих реагентов. Эти реагенты, включая реагенты, представленные общей формулой CI и общей формулой CII, могут применяться после дополнительных реакций, представленных в настоящем описании, для образования комплексов с борсодержащими соединениями, такими как фенилбороновая кислота или ее производные.

Реагенты, пригодные для модификации биоактивных компонентов с целью включения комплексообразующего фрагмента для фенилбороновой кислоты и последующей конъюгации с различными (или с этими же) биологически активными компонентами с подвешенными фрагментами фенилбороновой кислоты, представлены общей формулой, которая обозначена как общая формула CIII Общая формула CIII В этой формуле группа R₁ обозначает реакционноспособный электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для вступления в реакцию комплексообразующего реагента для фенилбороновой кислоты с биоактивными компонентами. Группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группу R₃ выбирают из H, алкила и метилена или этилена с электроотрицательным заместителем.

Группу R₃ предпочтительно выбирают из одного из таких радикалов, как H, CH₃, CH₂CN, CH₂COOH, CH₂CONH₂, CH₂CH₂OH и CH₂OCH₃. Когда группа R₃ обозначает H, группу R₁ предпочтительно выбирают из одного из таких фрагментов, как акриламид, аминогруппа, дитиопиридил, гидразид, имидат, малеимид и тиол. Группа Z предпочтительно обозначает неразветвленную алкильную цепь общей формулы (CH₂)_n, где n равно 1-6.

Взаимодействие реагента общей формулы CIII с биоактивными компонентами позволяет получить конъюгат с подвешенными комплексообразующими фрагментами для фенилбороновой кислоты (один или несколько) общей формулы CIV Общая формула CIV Символ BAS обозначает биологически активные компоненты (или биоактивные компоненты), которые могут содержать часть реакционноспособного фрагмента (который сам может иметь спейсер), применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту, или могут не содержать его. Следует отметить, что во многих вариантах осуществления несколько идентичных реагентов общей формулы CIII могут реагировать с одной молекулой BAS. Например, если BAS представляет собой протеин, многие комплексообразующие реагенты для фенилбороновой кислоты могут реагировать с протеином, при этом каждый из них может вступать во взаимодействие с одним из нескольких сайтов на протеине, который является реакционноспособным для группы RI.

Группа Z в общей формуле CIV обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группу R₃ выбирают из одного из таких фрагментов, как H, алкил и метилен или этилен с электроотрицательным заместителем.

Структуры общих формул CI и CII и способы их получения представлены в настоящем описании и являются объектом одновременно рассматриваемой заявки на патент США 08/691230, озаглавленной "Комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений и высокостабильные комплексы на их основе", поданной 5 августа 1996 г. на имя Mark L. Stolowitz, Robert J. Kaiser и Kevin P. Lund и включенной в настоящее описание в качестве ссылки.

Реагенты для фенилбороновой кислоты, многие из которых известны из уровня техники, а также те, которые описаны более подробно в одновременно рассматриваемой заявке на патент США 08/188958, озаглавленной "Комплекс на основе фенилбороновой кислоты для получения биоконъюгатов", поданной 28 января 1994 г. и включенной в настоящее описание в качестве ссылки, могут быть присоединены к биологически активным компонентам с получением конъюгата, имеющего подвешенные фрагменты фенилбороновй кислоты (один или несколько) общей формулы CV Общая формула CV где символ BAS^* обозначает вторые биоактивные компоненты, которые могут включать линкерную область и которые могут отличаться от биоактивных компонентов, обозначенных как BAS. BAS^* также могут содержать часть реакционноспособного фрагмента, применяемого для присоединения биоактивных компонентов к реагенту для фенилбороновой кислоты.

Конъюгат общей формулы CIV, имеющий по крайней мере один из биологически активных компонентов и содержащий подвешенные комплексообразующие фрагменты для фенилбороновой кислоты (один или несколько), может образовывать комплексы с конъюгатом общей формулы CV. полученным с участием вторых биоактивных компонентов BAS^* и имеющим подвешенные фрагменты фенилбороновой кислоты (один или несколько), с получением биоконъюгата общей формулы CVI Общая формула CVI где символы BAS и BAS^* и группы Z и R₃ имеют указанные выше значения. В этом случае, как это в общем виде показано на фиг. 1', биологические макромолекулы могут конъюгироваться друг с другом или с другими функциональными группами, которые придают продукту новые полезные свойства.

Биоконъюгаты общей формулы CVI могут быть получены в забуференном водном растворе или в органических растворителях. Биоконъюгаты образуются в течение нескольких минут в диапазоне температур приблизительно от 4^oC до 70^oC. На стабильность биоконъюгата в водном растворе при данных значении pH и температуре в значительной степени влияет заместитель группы R₃. Биоконъюгаты общей формулы CVI стабильны в водном растворе при приблизительных значениях pH не выше 2,5 и не ниже 12,5. Реакция биоконъюгации (образование комплекса с фенилбороновой кислотой) нечувствительна к значительным изменениям ионной силы, к присутствию органических растворителей, к присутствию детергентов и к присутствию хаотропических агентов (агентов, денатурирующих протеины), что отличает их от известных непрямых меченых систем, причем строение биологической макромолекулы должно сохраняться с целью сохранности необходимых характеристик связывания. Во многих случаях ограничения, налагаемые на образование биоконъюгатов с помощью представленной в настоящем описании системы, обусловлены ограничениями, налагаемыми условиями, необходимыми для сохранения жизнеспособности биоактивных компонентов.

В целом изобретение относится к комплексообразующим реагентам для борсодержащих соединений, комплексам на основе борсодержащих соединений и способам синтеза этих реагентов и комплексов. Эти реагенты и комплексы представляют собой реагенты и комплексы, представленные общими формулами CIII, CIV и CVI. В одном из вариантов осуществления реагент общей формулы CIII после конденсации с биоактивными компонентами (BAS) может применяться для получения реагента общей формулы CIV. Реагент общей формулы CIV может применяться для образования комплекса с борсодержащим соединением, такого как комплекс, представленный общей формулой CVI.

Краткое описание чертежей На фиг. 1 показано применение предлагаемых комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы I и комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы III при получении конъюгатов общей формулы IV, которые в свою очередь могут использоваться для получения биоконъюгатов общей формулы VI.

На фиг. 2 показана общая схема получения алкил-4- и -5-аминометилсалицилатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы 1, в которых R₂ обозначает алкильную группу, например, метил, этил, пропил и т.д. Алкил-4- и -5-аминометилсалицилаты также являются пригодными промежуточными продуктами для получения реагентов общей формулы III.

На фиг. 3 показана общая схема получения алкил-4- и -5-аминометилсалицилатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы I, в которых R₂ обозначает метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, например карбоксиметил, цианметил, метоксиметил и т.д.

На фиг. 4 показана общая схема получения алкил-4- и -5-аминометилсалицилатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы III, в которых R₃ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую или этиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент.

На фиг. 5 показана общая схема получения реагентов общих формул I и III, в которых R₂ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, а для R₁ выбирают одно из значений из группы, включающей фрагменты имидазолида, гидразида и N-гидроксисукцинимидного эфира.

На фиг. 6 показана общая схема получения реагентов общих формул I и III. в которых R₂ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, а для R₁ выбирают одно из значений из группы, включающей бром, хлор, йод, малеимид, динитропиридил и имидат.

На фиг. 7 показана общая схема получения реагентов общих формул I и III, в которых R₁ обозначает N-гидроксисукцинимидный эфир, a Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом.

На фиг. 1' показано применение предлагаемых комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы CI и комплексообразующих реагентов для фенилбороновой кислоты общей формулы CIII при получении конъюгатов общей формулы IV, которые в свою очередь могут использоваться для получения биоконъюгатов общей формулы CVI.

На фиг. 2' показана общая схема получения алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CI, в которых R₂ обозначает алкильную группу, например метил, этил, пропил и т.д. Алкил-4- и -5-аминометилсалицилаты также являются пригодными промежуточными продуктами для получения реагентов общей формулы CIII.

На фиг. 3' показана общая схема получения алкил-4-аминометил-2,6-дигидроксибензоатов, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CI, в которых R₂ обозначает метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, например карбоксиметил, цианметил, метоксиметил и т.д.

На фиг. 4' показана общая схема получения 4-аминометил-2,6-дигидроксибензогидроксамовых кислот, промежуточных продуктов синтеза, приводящего к получению реагентов общей формулы CIII, в которых R₃ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую или этиленовую группу, несущую злектроотрицательный фрагмент.

На фиг. 5' показана общая схема получения реагентов общих формул CI и CIII, в которых R₂ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, а для R₁ выбирают одно из значений из группы, включающей фрагменты имидазолида, гидразида и N- гидроксисукцинимидного эфира.

На фиг. 6' показана общая схема получения реагентов общих формул CI и CIII, в которых R₂ обозначает либо алкильную группу, либо метиленовую группу, несущую электроотрицательный фрагмент, а для R₁ выбирают одно из значений из группы, включающей бром, хлор, йод, малеимид, динитропиридил и имидат.

На фиг. 7' показана общая схема получения реагентов общих формул CI и CIII, в которых R₁ обозначает N-гидроксисукцинимидный эфир, a Z обозначает неразветвленную насыщенную или ненасыщенную цепь, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом.

Подробное описание изобретения Комплексообразующие реагенты и конъюгаты фенилбороновой кислоты, полученные из 4- или 5-аминометилсалициловой кислоты Этот раздел относится к классу комплексообразующих реагентов и конъюгатов фенилбороновой кислоты, полученных из 4- или 5-аминометилсалициловой кислоты, и относится к фиг. 1-7. Реагенты и конъюгаты фенилбороновой кислоты, полученных из 4- или 5-аминометилсалициловой кислоты, являются объектом одновременно рассматриваемой заявки на патент США 08/689341, озаглавленной "Комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений и комплексы на их основе", поданной 5 августа 1996 г., и одновременно рассматриваемой заявки на патент США 08/691929, озаглавленной "Комплексообразующие реагенты для борсодержащих соединений и комплексы на их основе", поданной 5 августа 1996 г. , номера дел патентного поверенного 81741.P005 и 81741.P006 соответственно. Приведенное в настоящем описании получение этих соединений позволяет более наглядно пояснить отличия этих соединений от новых соединений, представленных в настоящем описании. Предоставление данных о получении различных соединений из близкого семейства комплексообразующих реагентов и конъюгатов позволяет более полно охарактеризовать объем настоящего изобретения.

Общая схема трехстадийного процесса, в котором для получения биоконъюгатов используются реагенты общей формулы I, показана на фиг. 1. Сначала выбирают реагент общей формулы I, который включает пригодную реакционноспособную электрофильную или нуклеофильную группу R₁, способную реагировать с требуемыми биологически активными компонентами.

Общая формула I Группа R₁ представляет собой реакционноспособный электрофильный или нуклеофильный фрагмент, пригодный для взаимодействия предлагаемого комплексообразующего реагента для фенилбороновой кислоты с биоактивными компонентами. Группу ₁ предпочтительно выбирают из таких фрагментов (не ограничиваясь только ими), как акриламид, бром, дитиопиридил, бромацетамид, гидразид, N-гидроксисукцинимидный эфир, N-гидроксисульфосукцинимидный эфир, имидат, имидазолид, йод, йодацетамид, малеимид, аминогруппа и тиол.

Группа Z обозначает спейсер, выбранный из насыщенной или ненасыщенной, предпочтительно неразветвленной цепи, длина которой равна приблизительно 0-6 атомам углерода, неразветвленной насыщенной или ненасыщенной цепи, длина которой равна приблизительно 6-18 атомам углерода, по крайней мере с одним промежуточным амидным или дисульфидным фрагментом и полиэтиленгликолевой цепи, длина которой равна приблизительно 3-12 атомам углерода. Группа Z предпочтительно обозначает неразветвленную алкильную цепь общей формулы (CH₂)_n, где n равно 1-6.

Группу R₂ выбира