Оральные циклоспориновые составы

Оральные циклоспориновые составы

Реферат

 

Оральный циклоспориновый состав содержит циклоспорин, алканольный растворитель, содержащий от 2 до 3 атомов углерода и неионный полиоксиалкиленовый сурфактант. Указанный сурфактант выбран из группы, состоящей из полиоксиэтиленовых спиртов и сложных моноэфиров жирных кислот этоксилированных полиолов, содержащих от 4 до 6 атомов углерода. Предпочтительно используется циклоспорин А в концентрации от 50 до 150 мг/мл, алканольный растворитель - этанол или пропиленгликоль в концентрации от 5 до 75% (о/о) указанного состава и сложный моноэфир этоксилированного сорбитана в концентрации от 10 до 50% (о/о) указанного состава. Оральный циклоспориновый состав выполняется в форме твердой капсулы. Также описана водная дисперсия наночастиц циклоспорина для введения пациенту. По крайней мере, 50 вес.% циклоспорина в дисперсии присутствует в виде частиц размером менее 1 мкм. Новые циклоспориновые составы имеют высокую биологическую ценность и подходят для введения в твердых капсулах или наночастицах. Составы стабильны в широком диапазоне температур, не происходит кристаллизации активного агента циклоспорина. 7 с. и 12 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл.

Областью изобретения являются оральные циклоспориновые составы Несмотря на попытки избежать отторжение трансплантатов, основанное на соответствии типов тканей "хозяин-донор", иммуносупрессивная терапия является критической для поддержания жизнеспособности донорского органа у хозяина при большинстве процедур трансплантации, когда донорский орган вводится в хозяина. В процедурах трансплантации использовалось множество иммуносупрессивных агентов, включая азатиоприн, метотрексат, циклофосфамид, FK-506, рапамицин и кортикостероиды. Циклоспорины являются агентами, обнаружившими повышенное использование в иммуносупрессивной терапии вследствие их предпочтительного влияния на реакции, опосредованные Т-клетками.

Циклоспорины являются классом циклических полипептидов, состоящих из одиннадцати аминокислот, которые продуцируются как метаболит грибами вида Tolypocladium inflatum Gams. Было обнаружено, что циклоспорины обратимо ингибируют иммунокомпетентные лимфоциты, особенно Т-лимфоциты, в G₀ или G₁ фазах клеточного цикла. Также было показано, что циклоспорины обратимо ингибируют продукцию и высвобождение лимфокинов. Несмотря на то, что известно большое число циклоспоринов, наиболее широко используемым является циклоспорин А.

Считается, что использование циклоспорина А увеличивает выживание аллотрансплантатов, включающих кожу, сердце, почки, поджелудочную железу, костный мозг, малый кишечник и легкие. Было показано, что циклоспорин А супрессирует гуморальный иммунитет и, в большей степени, иммунные реакции клеточного иммунитета, включающие: отторжение аллотрансплантата, замедленную гиперчувствительность, экспериментальные аллергические энцефаломиелиты, артриты, вызванные адьювантом Фрейнда, реакцию "трансплантат против хозяина". Хотя успех и достигается с использованием циклоспорина А, введение агента после трансплантации должно быть продолжено, так как успех циклоспориновой терапии обратим и отторжение трансплантата происходит как только введение циклоспорина А прекращается.

Несмотря на то, что разработаны составы циклоспорина для и орального, и внутривенного введения, оральное введение является более предпочтительным из-за легкости введения и большего одобрения пациентов. Более того, внутривенное введение циклоспорина может приводить к анафилактическим реакциям, побочные эффекты не наблюдаются у оральных составов. Оральные циклоспориновые составы, которые разработаны и в настоящее время продаются, включают и мягкие желатиновые капсулы, и растворимые составы, каждый из которых продаются под торговыми марками SANDIMMUNE и NEORAL .

При использовании оральных циклоспориновых составов в иммуносупрессивной терапии и врачи, и производители должны учитывать многие факторы. В оральных циклоспориновых составах биологическая ценность циклоспорина может быть лимитирована из-за несмешиваемости циклоспорина с водой и тенденции циклоспорина высаждаться в водной среде. В дополнение концентрация циклоспорина, представленная в оральных составах, может быть лимитирована вследствие гидрофобной природы циклоспорина. Далее, адсорбция циклоспорина желудочно-кишечным трактом может быть неустойчивой от одного состава к другому, требуя постоянного мониторинга уровня циклоспорина в крови во время лечения. Наконец, проблемой оральных составов являются упаковка и стабильность при хранении. Например, при использовании мягких желатиновых капсул для составов циклоспорина должна быть использована воздухонепроницаемая упаковка, что неудобно из-за больших размеров и высокой цены. Более того, составы циклоспорина могут быть нестабильными при пониженной температуре, так как может произойти кристаллизация циклоспорина.

Таким образом, желательными оральными составами циклоспорина должны быть составы, решающие, по крайней мере, некоторые из приведенных выше проблем. В идеале оральные составы должны обеспечить высокую биологическую ценность, содержать высокие концентрации циклоспорина и быть удобны для приготовления в форме твердых капсул.

Настольная Ссылка для Врачей (1994), стр. 2071-2074, описывает оральные циклоспориновые составы, в настоящее время продаваемые под торговой маркой SANDIMMUNE Оральные иммунные составы также описаны во вкладыше к упаковке NEORAL (1995) (Sandoz Pharmaceutical Corporation, East Hanover, New Jersey, 07936).

Патенты США по теме, описывающие циклоспорины и их производные, включают: 4,220,641; 4,639,434; 4,289,851 и 4,384,996. Патент США N 5.047.396 описывает препарат для внутривенного введения циклоспорина. Патенты США N 4.388.307; 4,970,076 и 4,990,337 описывают препараты оральных составов циклоспорина.

Препараты в твердых капсулах для оральной доставки фармацевтических составов описаны в патентах США N 4,822,618; 4,576,284; 5,120,710 и 4,894,235.

Представлены оральные циклоспориновые составы и способы их использования в иммуносупрессивной терапии. В составах объекта циклоспорин присутствует в орально приемлемом переносчике, содержащем, по крайней мере, один алканольный растворитель, содержащий от 2 до 3 атомов углерода в сочетании с, по крайней мере, одним не ионным поверхностно-активным веществом (сурфактантом). Составы объекта могут, далее, содержать один или более со-растворитель, причем интересующими со-растворителями являются сложные эфиры жирных кислот и диолы. Составы циклоспорина могут быть упакованы в твердые капсулы. Представлены аморфные биологически ценные наночастицы циклоспорина, включающие полиоксиалкиленовый сурфактант, образующие стабильные дисперсии при разбавлении в жидкой среде.

Фиг. 1 показывает концентрацию пика циклоспорина (C_max), достигнутую у мышей для различных оральных составов в соответствии с объектом изобретения, где C_max показана как относительное значение, сравниваемое с C_max, достигнутой для состава SANDIMMUNE ORAL (SO).

Фиг. 2 показывает время, при котором достигается C_max (T_max) для каждого из составов, показанных на фиг. 1, где T_max показано как относительное значение в сравнении c T_maxSANDIMMUNE ORAL (SO).

Фиг. 3 показывает относительную область под кривой "концентрация крови - время" (AUC) для каждого из составов, показанных на фиг. 1, где AUC представлена как относительное значение, сравниваемое со значением AUC для состава SANDIMMUNE ORAL(SO).

Фиг. 4 показывает пик концентрации циклоспорина C_max, достигнутый у пациентов для нескольких оральных составов в соответствии с объектом изобретения, как и для раствора SANDIMMUNE ORAL (на фиг. 4 "Sand").

Фиг. 5 показывает время, за которое C_max становится (T_max) для каждого из составов, показанного на фиг. 4.

Фиг. 6 показывает область под кривой "концентрация крови - время" (AUC) для каждого из составов, показанных на фиг. 4.

Обеспечены оральные циклоспориновые составы, которые увеличивают биологическую ценность и могут быть формулированы в виде капсул, особенно твердых капсул. В составах объекта циклоспорин присутствует в орально приемлемом переносчике, содержащем, по крайней мере, один алканольный растворитель, содержащий от 2 до 3 атомов углерода в сочетании с, по крайней мере, одним не ионным поверхностно-активным веществом (сурфактантом). Составы объекта могут, далее, содержать один или более со-растворитель, причем интересующими со-растворителями являются сложные эфиры жирных кислот и диолы. Каждый из компонентов составов объекта является фармацевтически приемлемым. В дополнение, для обеспечения высокой биологической ценности составы объекта обеспечивают воспроизводимую от одной партии к другой адсорбцию циклоспорина конкретного состава. Составы объекта находят применение в иммуносупрессивной терапии.

В области известно большое число циклоспоринов, проявляющих иммуносупрессивную активность, и могут быть отнесены к объекту оральных составов. Циклоспорины, которые могут быть введены в составы объекта, включают циклоспорин А, циклоспорин В, циклоспорин C, циклоспорин D и циклоспорин G, также как и их синтетические аналоги. См. Merck Index (1989) 2759. Оральные составы объекта особенно подходят для доставки циклоспорина А. При доставке составов объекта циклоспорин А будет присутствовать в концентрациях диапазона от 50 до 150 мг/мл, обычно от 100 до 150 мг/мл, основываясь на объеме компонента переносчика состава.

Компонент переносчика составов объекта будет включать алканольный растворяющий компонент, причем алканольный растворяющий компонент будет содержать, по крайней мере, один алканол и, обычно, не более чем три различных алканола, наиболее обычно, не более, чем два различных алканола, где алканолы будут, обычно, атомами углерода в количестве от 2 до 3, и от 1 до 2 гидрокси групп, таким образом, что существует не более, чем 1 гидрокси группа на 1.5 атома углерода. Подходящие алканолы включают этанол и пропилен гликоль. Общее количество алканольного растворителя в составе будет, по крайней мере, около 1% (о/о), обычно, по крайней мере, около 3% (о/о) и может быть таким высоким, как 95% (о/о), но, обычно, будет в диапазоне от примерно 5 до 75% (о/о), обычно от, примерно, 5 до 60% (о/о), и наиболее обычно от, примерно, 10 до 60% (о/о) состава. Когда в качестве алканольного растворителя в составе присутствует этанол, количество этанола может находиться в диапазоне от 5 до 20% (о/о), обычно от, примерно, 5 до 15% (о/о) состава, тогда как, когда пропилен гликоль присутствует в качестве алканольного растворителя, количество пропилен гликоля в составе объекта может находиться в диапазоне от, примерно, 5 до 90% (о/о), обычно от, примерно, 5 до 85% (о/о), наиболее обычно от примерно 10 до 50% (о/о) состава.

Также в орально приемлемом переносчике будет присутствовать, по крайней мере, один неионный полиоксиалкиленовый сурфактант, обычно не более, чем два полиоксиалкиленовых неионных сурфактанта. Полиоксиалкиленовые сурфактанты будут иметь гидрофобно-липофильный баланс (HLB) от примерно 5 до 20: обычно от, примерно, 8 до 16. Предпочтительно, полиоксиалкиленовые сурфактанты, использованные в составах объекта, будут являться полиоксиэтиленовыми компонентами. Интересующие полиоксиэтиленовые соединения включают: этоксилированный спирт, т.е. полиоксиэтиленовые спирты или этоксилированные жирные спирты, где спиртовые мотивы, обычно, в количестве от 10 до 18, обычно, от 10 до 14 атомов углерода, также как эфиры и заменители сложных эфиров, и полиоксиэтиленовые производные частичных эфиров жирных кислот, обычно моноэфиры, из полиолов в количестве от 4 до 6 атомов углерода, обычно 6 атомов углерода, где полиолами могут быть ангидриды полиолов, т.е. сорбитан. Мотивы жирных кислот сурфактанта объекта будут, типично, в диапазоне от 10 до 18 атомов углерода. Число этиленоксидных групп будет, в основном, в диапазоне от 2 до 30, обычно, в диапазоне от, примерно, 2 до 25. Предпочтительными сурфактантами являются полиоксиэтилен (4) лауриловый эфир (BRIJ 30) и полиоксиэтилен (20) моно сорбитан моно-олеат (TWEEN 80). Общее количество неионного сурфактанта, представленного в составах объекта, будет в диапазоне от 5 до 65%, обычно, от, примерно, 5 до 60% (о/о) состава. Там, где TWEEN 80 присутствует в составе, он будет, обычно, представлен в количествах диапазона от 5 до 60%, наиболее обычно от, примерно, 10 до 50% (о/о) состава. Когда BRIJ 30 присутствует в составе объекта, он будет, обычно, присутствовать в количествах диапазона от 10 до 45%, наиболее обычно, от, примерно, 15 до 40% (о/о) состава.

Составы объекта могут, далее, содержать один или более со-растворителей, обычно, не более, чем три различных со-растворителя, наиболее обычно, не более, чем два различных со-растворителя, где подходящий со-растворитель включает сложные эфиры жирных кислот и диолы, где со-растворитель может являться 100% сложным эфиром жирной кислоты, 100% диолом или их комбинацией. Общее количество со-растворителя, представленного в составе, может быть в диапазоне от, примерно, 20 до 80% (о/о) и будет, обычно, в диапазоне от, примерно, 25 до 75% (о/о). Будучи представленным в составе, соотношение со-растворителя к сольвенту в составах объекта может быть в диапазоне от, примерно, 1:1 к 15:1, но, обычно, будет в диапазоне от, примерно, 1:1 до 13: 1.

Сложными эфирами жирных кислот могут служить как со-растворители в составах объекта такие сложные эфиры жирных кислот, у которых гидрокарбоновая цепь жирной кислоты длиной от 12 до 18, обычно, от 14 до 18 атомов углерода, где сложный эфир жирной кислоты будет моно-эфиром низшего алканола. Подходящие сложные эфиры жирных кислот будут, в основном, содержать сходную по числу цепь жирной кислоты, где гидрокарбоновая цепь может быть насыщенной или ненасыщенной, обычно, имеющей не более, чем два сайта насыщения. Интересующие жирные кислоты будут, как правило, растительного или животного происхождения и включают пальмитат, стеарат, пальмитолеат, линолеат, линоленат и подобные, особенно, миристат и олеат. Спиртом моно-эфира жирной кислоты будет низший алканол длиной от 2 до 4 атомов углерода, обычно от 2 до 3 атомов углерода длиной, с или без ответвлений. Особо интересующими сложными эфирами жирных кислот являются изопропил миристат и этил олеат. Изопропил миристат, если присутствует, будет в диапазоне от, примерно, 55 до 75% (о/о), и этил олеат, если присутствует, будет в диапазоне от примерно, 35 до 75% (о/о) от общего состава. Обычно сложный эфир жирной кислоты будет представлен в количестве, по крайней мере, практически равном (о/о) и до 8 раз большем, чем количество сурфактанта в составе, обычно, не более, чем в 5 раз больше количества сурфактанта в составе (о/о).

Диолы также могут быть представлены в составах объекта, причем диолы могут присутствовать в дополнение к, или вместо со-растворителя сложного эфира жирной кислоты. Интересующими диолами в качестве со-растворителя являются, обычно, липиды при физиологической температуре и включают диолы из от 8 до 28 атомов углерода, обычно от 16 до 20 атомов углерода, где диолом может быть полиоксиалкилен диол, где алкилен содержит от 2 до 3 атомов углерода. Подходящие диолы для использования в качестве ко-сольвентов могут быть в диапазоне от, примерно, 200 до 800 дальтон, обычно от, примерно, 200 до 650 дальтон. Особо интересующие диолы включают полиэтилен гликоли, особенно, полиэтилен гликоль 200 (PEG₂₀₀), полиэтилен гликоль 400 (PEG₄₀₀), полиэтилен гликоль 600 (PEG₆₀₀) и подобные, с наиболее предпочтительным PEG₄₀₀. Будучи представленными как со-растворитель в составах объекта, диолы будут в диапазоне от, примерно, 5 до 60% (о/о), обычно от 5 до 55% (о/о) состава.

Для формирования аморфных наночастиц, желательных в составе, общее количество низшего алканола будет, обычно в диапазоне, примерно, 25-60 весовых процентов, наиболее обычно, в диапазоне, примерно, 30-50 весовых процентов. Общее количество алкиленокси соединения(й) будет обычно в диапазоне, примерно, 20-50 весовых процентов, наиболее обычно, в диапазоне, примерно, 25-40 весовых процентов. Там, где используются комбинации полиоксиалкиленовых соединений, количество сложных эфиров жирных кислот будет, обычно, в диапазоне от, примерно 25 до 100% полиоксиалкиленовых соединений.

В составах объекта со-растворители сами по себе могут придавать составу желательные физические особенности, такие как вязкость, стабильность и подобные. Где желательно, состав может, далее, содержать дополнительные агенты, которые придают составу желательные физические особенности, такие как загущающие агенты, суспендирующие агенты, отверждающие агенты и подобные, где такие агенты включают акацию, карбоксиметил-целлюлозу, гидроксипропил-целлюлозу, лецитин, метил-целлюлозу, полиэтилен гликоль высокого молекулярного веса, т.е. полиэтилен гликоли с молекулярным весом в диапазоне от, примерно, 1000 до 6000, обычно от 1000 до 5000 дальтон, повидон, альгинат натрия, трагакант и подобные. Также в составах объекта может присутствовать число минорных компонентов, которые обеспечивают различные функции, такие как ингибиторы ферментов, презерванты, антиоксиданты, антимикробиальные агенты, стабилизаторы и подобные. Общее количество этих загущающих агентов и других добавлений, если таковые присутствуют в составе, будет, в норме, не выше 5 весовых процентов, обычно 2 весовых процентов, наиболее обычно 1 весовой процент состава. Как известно в области, эксципиенты также могут быть представлены в составах объекта.

Составы объекта стабильны при широком диапазоне температур, причем под стабильным понимается то, что физическая целостность состава не нарушена, т. е. не происходит кристаллизации активного агента циклоспорина. Включенными в диапазон температур, при которых составы объекта стабильны, являются пониженные температуры, такие, которые используются при холодильном хранении, где такие пониженные температуры обычно находятся в диапазоне от, примерно, 0 до 15^oC, более типично, от, примерно, 2 до 8^oC.

Составы объекта подходят для введения в форме капсул, т.е. твердых и мягких капсул. Способы производства твердых капсул, содержащих жидкие составы, известны в области и описаны в Патентах США N 4,822,618 и 4,576,284, раскрытия которых внесены здесь в ссылки. Обычно, твердые капсулы, которые находят использование с составами объекта, будут содержать две части: компонент оболочки и компонент крышки. Компоненты оболочки и крышки совпадают вместе для образования вложенной полости определенного объема, запечатанные в оболочку твердой капсулы. Компоненты оболочки и капсулы могут быть произведены из гидрофильного полимера, такого как крахмал или желатин. При приготовлении твердых капсул жидкий состав будет заливаться в компонент оболочки и затем капсула будет запечатана путем помещения компонента крышки поверх компонента оболочки. Изоляция между двумя компонентами может быть укреплена, предотвращая таким образом вытекание из капсулы помещенного состава, путем использования изолятора, как описано в ЕР 116744, раскрытие которого внесено здесь в ссылки. Для предотвращения разрушения в желудке капсулы, содержащие составы объекта, могут быть покрыты кишечной оболочкой, которая ингибирует деградацию капсулы в кислотном окружении желудка. В области известно множество кишечных оболочек. См., например, Патент США N 5,206,219, раскрытие которого внесено здесь в ссылки.

Составы, особенно составы, продуцирующие наночастицы, могут быть приготовлены первоначально путем растворения циклоспорина в низшем алканоле, куда может также быть включена малая пропорция полиоксиалкиленового соединения, обычно, менее чем, примерно, 50 весовых процентов состава, использованного для растворения циклоспорина. Может быть использована повышенная температура, обычно в диапазоне от, примерно, 60 до 90^oC. После растворения циклоспорина может быть добавлена основная пропорция полиалкиленокси соединения, и полный состав доведен до желательных соотношений путем добавления подходящих соединений. Как правило, циклоспорин может быть растворен в низшем алканоле (оптимально, включая порцию полиалкиленокси соединения) в весовом соотношении примерно 1:1.5-5, наиболее обычно, 1:2-4.

Составы объекта находят использование в иммуносупрессивной терапии. Иммуносупрессивная терапия показана при ряде различных заболеваний, включая идиопатичный нефротический синдром, инсулин-зависимый диабет I типа, синдром Вэсета, активная болезнь Крона, апластическая анемия, тяжелая кортикостероид-зависимая астма, псориаз, ревматоидный артрит и другие заболевания, при которых иммунная система может играть патогенную роль. Особо интересующим является использование составов объекта в ситуациях с трансплантатами, включая и аллогенные, и ксеногенные органы, трансплантацию тканей или клеток, когда желательна иммуносупрессия для обеспечения поддержания жизнеспособности трансплантированного органа или ткани, или клетки после трансплантации, т. е. для предотвращения отторжения трансплантата или предотвращения реакции "трансплантат против хозяина", например после трансплантации костного мозга.

При использовании составов объекта для обеспечения иммуносупрессивной терапии у хозяина эффективное количество циклоспорина будет вводиться орально для достижения желательного уровня иммуносупрессии у хозяина, в зависимости от лечения конкретного состояния. При трансплантации, обычно, первоначальная доза циклоспорина будет вводиться перед операцией. После трансплантации донорского органа хозяину циклоспорин будет вводиться хозяину повторно, т. е. постоянно, для поддержания иммуносупрессии. Первоначальная доза должна вводиться за от 4 до 12 часов до трансплантации и может варьировать от 10 до 18 мг/кг, обычно, от 10 до 15 мг/кг хозяина. После операции начальная доза будет, обычно, продолжена на ежедневной основе на период от 1 до 3 недель, обычно, от 1 до 2 недель. Доза может далее постепенно ослабляться до поддерживающей дозы от 3 до 10 мг/кг в день, обычно, от 3 до 6 мг/кг в день. Уровень, при котором доза постепенно ослабляется до поддерживающего уровня, находится в диапазоне от 3 до 8% в неделю и будет, обычно, около 5% в неделю. Доза может быть, как правило, подобрана, основываясь на уровнях крови в углублениях для поддержания концентрации от 150 до 250 нг/мл, как подсчитано при помощи жидкостной хроматографии под высоким давлением, радиоиммуноанализа, твердофазного иммуноферментного или TDx анализа. Составы объекта могут быть введены в сочетании с дополнительными агентами, когда рекомендуется дополнительная терапия и известная в области. Например, составы объекта могут быть введены в сочетании с адреналиновыми кортикостероидами, азатиоприном и подобными.

Введение составов объекта в сочетании с трансплантацией донорского органа хозяину приводит к удлинению жизнеспособности донорского органа в хозяине как результат супрессии иммунного ответа хозяина на присутствие донорского органа. Под "удлинением жизнеспособности" понимается то, что донорский орган остается жизнеспособным в хозяине в течение более длительного периода времени, чем если бы иммуносупрессивная терапия не была использована в сочетании с трансплантацией. Таким образом, удлинение жизнеспособности включает поддержание жизнеспособности на неопределенный период времени. Донорский орган считается жизнеспособным до момента, пока он поддерживает функциональность в окружении хозяина.

Для удобства пользователя могут быть обеспечены наборы, имеющие подходящее количество циклоспорина, один или два уровня дозы и со-растворителя, а именно низший алканол(ы) и полиалкиленокси соединение(я), т.е., по крайней мере, один из этанола и пропилен гликоль, и, по крайней мере, один полисорбат 80 и PEG400.

Следующие примеры предложены с иллюстрациями и без ограничений.

Было приготовлено несколько оральных циклоспориновых составов в соответствии с объектом изобретения (см. таблицу). Биологическая ценность циклоспорина в приготовленных составах далее была оценена у крыс и пациентов.

I. Оральные цикпоспориновые составы Были приготовлены следующие оральные составы циклоспорина А. В каждом случае в мерный сосуд объемом 1.0 мл были добавлены 100 мг CsA, указанное количество сурфактанта и указанное количество этанола или пропилен гликоля, и конечный объем в 1.0 мл был достигнут путем добавления подходящего объема сложного эфира жирной кислоты и/или диола.

II. Исследования биологической ценности in vivo для составов 19-24 и 33-42 Биологическую ценность составов 19-24 и 33-42 циклоспорина изучали следующим образом. Для измерения биологической ценности определяли следующие фармакокинетические параметры: (а) пиковая концентрация циклоспорина в крови (C_max); (б) время, необходимое для достижения C_max (T_max), и область под кривой зависимости "время концентрации крови - кривая времени" (AUC). В дополнение к составам 19-24 и 33-42 оценивали для сравнения биоценность циклоспорина в SANDIMMUNE Oral Solution (SO) при аналогичных условиях. Для каждого из перечисленных выше состава крыс CsA-naive Sprague Dawley весом 250-350 гр кормили стандартной пищей в пилюлях Agway 3000, Granville Mill, Greensboro, NC) и водой ad libitum. За один день до эксперимента в правую шейную и правую бедренную вены были вставлены силиконовые каучуковые канюли под небольшой эфирной анестезией. После ночного голодания был введен CsA через желудочный зонд.

После введения из шейной вены были отобраны пробы крови по 200 мкл в 0.5 мл полипропиленовые пробирки, содержащие 0.3 мг лиофилизированного ЭДТА-Na, и немедленно перемешаны в течение 10 сек. Время отбора проб у животных, получивших оральные составы, составляло 0, 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 и 72 часа после введения.

CsA, включая некоторые его метаболиты, определяли в полной крови флуоресцентным поляризационным иммуноанализом (FPI)(Tdx, Abbot Lab.). Кратко, 150 мкл пробы полной крови количественно переносили в микроцентрифужную пробирку объемом 1.5 мл. Клетки лизировали и растворяли в 50 мкл сурфактант содержащего растворяющего агента. Далее высаждали белки 300 мкл ацетонитрила. После центрифугирования подвергали супернатант FPI анализу в Tdx Автоанализаторе, следуя процедуре, рекомендованной Abbott Diagnostics. Поскольку Tdx анализ был, первоначально, разработан для человеческой крови, некоторые из рекомендованных процедур были модифицированы следующим образом. Были приготовлены серии стандартных растворов с известной концентрацией CsA путем добавления известного количества CsA к крови крыс, обработанной ЭДТА. Когда ожидалось, что концентрация CsA в пробе выше, чем 1.0 мг/мл, пробу крови разбавляли в 10 раз 0.1 М фосфатным буфером, pH 7.0. Для разбавленных проб была сделана другая калибровочная кривая с использованием серий стандартных растворов, содержащих известные количества CsA, равный по объему 10% в крови крыс и 90% фосфатного буфера.

Из некомпартментного анализа были получены наглядные фармакокинетические параметры. Пик концентрации (C_max) и время, в которое появлялся пик концентрации (T_max) оценивали проверкой профиля неразбавленная концентрация - время для каждой крысы. Область под кривой "концентрация крови - время" (AUC) от времени "0" до последней точки данных (AUC_0t) была просчитана в соответствии с линейной трапецеидальной процедурой. Остаточная область под хвостом кривой "концентрация крови - время" (AUC₀) оценивалась как соотношение последней наблюдаемой концентрации (C^*) с первоначальной константой скорости, связанной с конечной фазой элиминации профиля "концентрация - время" (_z). Константу скорости _z определяли log-линейной регрессией данных "концентрация - время" в видимой терминальной log-линейной фазе профиля "концентрация - время" (т.е. последние данные от 3 до 5 точек, в зависимости от анализируемого профиля). Общее значение AUC (AUC_0t) было получено как сумма AUC_0t и AUC₀.

Результаты для каждого состава сравнивали с результатами, полученными для SO и таковы, как показано на фиг. 1-3. Результаты демонстрируют, что для большинства составов достигнута большая биологическая ценность циклоспорина с составами объекта по сравнению с SANDIMMUNE Oral Solution (SO), как показано более высокими значениями AUC составов объекта.

III. Биоценность составов 35, 43-46 и 48-52 у человека in vivo 48 здоровых мужчин в возрасте между 19 и 55, с отклонением от идеального веса не более чем на 20% были использованы для теста. Было проведено однодозовое, при голодании, рандомизированное, двойное слепое, тройное перекрестное исследование. 48 пациентов были случайно распределены в 6 групп по 8 пациентов. Каждая группа получала одну дозу по 300 мг циклоспорина из перечисленных выше составов или SANDIMMUNE Oral Solution (SO) тремя различными способами, причем каждое введение отделял 7-дневный период вымывания.

Пациентам требовалось голодать в течение 10 часов до и 4 часа после введения дозы. Во время исследования позволялось принимать воду ad lib, за исключением одночасового периода до, во время, и 2 часа после введения дозы. Перед введением дозы отбирали 15 мл пробы крови. Для введений объединяли 3 мл аликвот состава (300 мг) с 200 мл шоколадного молока и вводили орально. Отбирали 10 мл проб крови при значении времени t=0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 и 24 часа. После исследования также отбирали 15 мл пробы крови.

Концентрации циклоспорина А в пробах полной крови анализировали, используя Tdx (Abbott Diagnostics, N.Chicago, IL) в соответствии с инструкциями производителя.

Некомпартментные фармакокинетики были сняты с использованием стандартных методов. Максимум концентрации полной крови (C_max) и время его появления (T_max) были собраны из данных "концентрация - время". Область под кривой "концентрация крови - время" (AUC) была просчитана по линейному трапецеидальному правилу по последней концентрации крови над пределом чувствительности (25 нг/мл) и экстраполирована на бесконечность.

Полученные значения C_mac, T_max и AUC для каждого состава являлись средними. Средние значения для каждого состава представлены на фиг. 4-6. Результаты демонстрируют, что для каждого протестированного состава C_max появлялось, по меньшей мере, в два раза быстрее, чем для SANDIMMUNE Oral Solution (SO) при тех же условиях. Более того, значение AUC, полученное в тестах составов, было, по крайней мере, на 2000 нгчас/мл больше, чем таковое, полученное для SANDIMMUNE Oral Solution (SO) при тех же условиях. Основываясь на этих результатах, составы 35, 43-46 и 48-52 обеспечивают большую биоценность, чем SANDIMMUNE Oral Solution (SO).

Составы были приготовлены для формирования аморфных наночастиц при разбавлении в водной среде.

IV. Составы наночастиц А. 5 г циклоспорина А добавляли к 5 мл этанола. Смесь перемешивали до полного растворения циклоспорина А. К полученному раствору добавляли 25 г полисорбата 80 и доводили объем до 50 мл 1,2-пропилен гликолем. Смесь перемешивали при комнатной температуре достаточно для формирования гомогенного раствора.

Б. 5 г циклоспорина А добавляли к 5 мл этанола. Смесь перемешивали до полного растворения циклоспорина А. К полученному раствору добавляли 15 г полисорбата 80 и доводили объем до 50 мл смесью 1,2-пропилен гликоль и полиэтилен гликоль 400. Смесь перемешивали при комнатной температуре достаточно для формирования гомогенного раствора.

В. 1 мл раствора, полученного в Примере 1, добавляли к 50 мл воды стеклянным шприцем, как рекомендовано для орального введения концентрированных эмульсий или микроэмульсий человеку. После добавления раствора следовали быстрое растворение и получение белой суспензии из малых частиц, имеющей голубой отсвет, как коллоидные суспензии (эффект Тиндалля). После центрифугирования при 26.000 g в течение 5 часов осадок промывали водой и затем центрифугировали при 26.000 g в течение 24 часов. Процессы промывания и центрифугирования повторяли дважды при тех же условиях. После высушивания проводили диаграмму рентгена порошка. Твердое тело было исключительно в аморфной форме.

Осадок исследовали сканирующей электронной микроскопией. Осадок состоял из аморфных сферических наночастиц с диаметром между 200 и 400 нм с присутствием некоторых агрегатов.

Г. 2 мл раствора, полученного в Примере 1, добавляли в 100 мл воды и исследовали коллоидную суспензию 10 минут и 1 час после растворения дифракционным/диффузионным лазерным гранулометром (Malvern SB.OD).

По прошествии 1 часа наблюдали две популяции частиц: одна представляла 70% веса циклоспорина А со средним диаметром 300 нм и вторая представляла 30% веса циклоспорина А со средним диаметром 20 мкм, возможно, содержащую агрегаты наночастиц.

Д. 1 мл раствора, полученного в Примере 1, добавляли в 50 мл воды и перемешивали коллоидную суспензию в течение 10 минут. Затем суспензию добавляли к 200 мл искусственного кислого желудочного сока и нагревали при 37^oC. Гомогенная коллоидная суспензия была проанализирована дифракционно/диффузионной лазерной гранулометрией (Malvern SB.OD). Суспензия состояла исключительно из наночастиц со средним диаметром 600 нм.

Е. 1 мл раствора, полученного в Примере 1, добавляли прямо к 200 мл искусственного кислого желудочного сока.

Гомогенную суспензию нагревали при 37^oC и быстро анализировали дифракционно/диффузионной лазерной гранулометрией (Malvern SB.OD). Суспензия состояла исключительно из наночастиц со средним диаметром 350 нм.

Из продемонстрированных выше результатов и обсуждения очевидно, что обеспечены новые циклоспориновые составы, имеющие высокую биологическую ценность. Составы объекта способны содержать высокие концентрации циклоспорина и стабильны при хранении при широком диапазоне температур, включая низкие температуры, широко используемые при охлаждении. Составы объекта подходят для доставки в форме капсулы, включая твердую форму капсулы, обеспечивающую простоту хранения и обращения. Составы также обеспечивают аморфные наночастицы, которые приводят к усиленной биологической ценности циклоспорина.

Все публикации и заявки на патенты, помеченные в данной спецификации, включены здесь как ссылки, как и каждая индивидуальная публикация или заявки на патенты, специально и индивидуально помеченные, включены в ссылки.

Хотя упомянутое выше изобретение было описано в некоторых деталях путем иллюстрирования и примера для целей чистоты понимания, для работающих в области будет легко очевидным в свете учений настоящего изобретения, что к нему могут быть сделаны определенные изменения и модификации без изменения идеи и покидания рамок прилагаемой формулы изобретения.

Формула изобретения

1. Оральный циклоспориновый состав, содержащий циклоспорин, по крайней мере, один алканольный растворитель, содержащий от 2 до 3 атомов углерода, и, по крайней мере, один неионный полиоксиалкиленовый сурфактант, причем указанный сурфактант выбран из группы, состоящей из полиоксиэтиленовых спиртов