Производные цефалоспорина, содержащая их антибактериальная композиция, производные 2-аминотиазолов в качестве промежуточных соединений и способ их получения

Производные цефалоспорина, содержащая их антибактериальная композиция, производные 2-аминотиазолов в качестве промежуточных соединений и способ их получения

Реферат

 

Изобретение относится к новым производным цефалоспорина общих формул I и II, где R¹ выбран из группы, состоящей из -NНС(О)ZR³, -NR⁴R⁵; Z выбран из группы, состоящей из -СН₂(Х)_m-, -С(NОR⁶)-; Х - атом серы; m = 0 - 1; R³ - тиазолил, замещенный хлором или аминогруппой, и (СН₂)Т, где n = 1 - 6; Т - гуанидино; R⁴ и R⁵ каждый - водород; R⁶ - водород или может быть группой, которая со смежным атомом кислорода образует защищенную гидроксильную группу, ² - водород; каждый из G, Н, L и М - углерод; J - азот; кольца А, В, D и Е выбраны из группы, состоящей из тиазолила и тиадиазолила; R¹¹ - водород; alk₁ - С_1-6 алкил; alk₂ - С_1-6 алкил, необязательно замещенный группой, выбранной из гидроксила, амино и карбоксамидо; р равно 0 - 1; R⁹⁹ выбран из группы, состоящей из серы и SО₂; q равно 1; r = 1 - 3; R¹² - NR¹³R¹⁴, группа (а) или (b); R¹³-R¹⁷ каждый - водород, или их фармацевтически приемлемые соли. Антибактериальная композиция, обладающая активностью против метициллинустойчивых, ванкомицинустойчивых или ампициллинустойчивых бактерий, включающая фармацевтически приемлемый носитель и соединение формулы I или I или его соли в эффективном количестве. Способ получения 2-аминотиазола общей формулы III, где Pg₁ - водород или трифенилметил и Pg₂ трифенилметил. Способ получения соединения формулы III путем взаимодействия соединения формулы IIIа с хлорирующим агентом в органическом растворителе. Технический результат - получение новых производных цефалоспорина. 5 с. и 20 з. п.ф-лы, 2 табл., 5 ил.

Рассматриваемая заявка относится к предварительной патентной заявке N 60/005389, поданной 12 октября 1995 г., которая включена в настоящее описание целиком вместе с рисунками.

Настоящее изобретение относится к новым цефалоспориновым антибиотикам, к способу их получения и применения. Ожидается, что эти соединения обладают антибиотической активностью против широкого спектра организмов, включая такие организмы, которые устойчивы к обычным -лактамным антибиотикам.

Представленный обзор предназначен для лучшего понимания настоящего изобретения, и ни его, ни любую из приведенных в нем ссылок не следует принимать в качестве известного уровня техники по отношению к настоящему изобретению.

За последние три десятилетия для клинического использования стал доступен широкий круг антибиотиков. Одним таким классом антибиотиков, который заметно расширяется, является класс цефалоспоринов, причем более 70 соединений этого класса нашли клиническое применение для лечения бактериальных инфекций у млекопитающих, начиная с 1965 г. Эти цефалоспорины демонстрируют свою антибактериальную активность, ингибируя биосинтез, пептидогликанов бактерий, и оказались чрезвычайно эффективными при лечении широкого круга бактериальных инфекций. Цефалоспорины, обладающие антибактериальной активностью, раскрыты в патентах США 3992377 и 4256739.

К сожалению, широкое распространение и неразборчивое использование этих антибиотиков привело к быстрому увеличению числа бактериальных штаммов, которые приобрели устойчивость к этим соединениям. Наиболее важно то, что такая устойчивость проявилась среди клинически важных микроорганизмов, что привело к ограничению применимости доступных в настоящее время цефалоспориновых антибиотиков. В частности, появились устойчивые штаммы Salmonella, S. pneumoniae, Enterobateriaceae и Pseudomonas, которые сводят на нет многие шаги, предпринятые для снижения смертности и заболеваемости в результате бактериальных инфекций.

Бактериальная устойчивость к цефалоспоринам развивается по трем основным схемам: (а) выработка -лактамаз, способных инактивировать -лактамовое кольцо цефалоспорина; (b) снижение проникновения цефалоспорина в бактерии за счет изменений состава стенок клеток бактерий; (с) ослабление связывания с пенициллин-связывающими протеинами (PBPS). Последняя схема особенно важна, так как связывание, -лактамов с PBPS необходимо для ингибирования биосинтеза стенок клеток бактерий. Некоторые грамположительные бактерии, а именно, метицилустойчивые Staphylococcus aureus ("MRSA")b enterococci проявляют высокую устойчивость к -лактамовым антибиотикам. Такая устойчивость MRSA связана с наличием высоких уровней необычных PBP, PBP2a, которые невосприимчивы, или слабо связываются с -лактамными антибиотиками. Активность -лактамных антибиотиков против PBP2a-содержащих организмов, как было показано, хорошо коррелируется со связывающей способностью антибиотика и PBP2a. В настоящее время против MRSA бактерий используют, главным образом, гликопептиды ванкомицин и теикопланин. Антибактериальные соединения хинолона и некоторые карбафенемы, такие, как имипенем, как сообщалось, активны против некоторых MRSA штаммов, но их применение ограничено из-за возникновения устойчивых MRSA штаммов.

Экспериментальные соединения, которые можно использовать как анти-MRSA или анти-энтерококковые бактерициды, включают глицилциклины (см. например, Р. -Е. Sum et. al., J. Med. Chem., 37 (1994)), FK-037 (см. например, H. Ohki et. al. , J. Antibiotics 46: 359-361 (1993)), RP-59500 (см. например, S.K. Spangler et.al. Antimicro Agents Chemother 36:856-9(1992)), комплекс эверниномицина (см. например, W.E. Sanders et. al. Antimicro Agents Chemother 6: 232-8(1974)), 2- (биарил)карбапенемы (см. например, патент США N 5025006), 3- (бензотиазолилтио)цефемы (например, ЕР заявка N 527686), 3- (тиазолилтио)карбацефемы (см. например, R.J. Terhansky et.al., J. Med. Chem. 36: 1971 (1993) и патент США N 5077287) и арбекацин (S. Kondo, et. al. J. Antibiotics 46:531 (1993).

Последние достижения в области соединений, композиций и способов, пригодных для лечения инфекций у млекопитающих, возникающих из-за бактерий, устойчивых к -лактамовым антибиотикам, описаны в совместной международной заявке N WO 96/26966.

Настоящее изобретение включает соединения, композиции и способы, эффективные при лечении инфекций у млекопитающих, возникающих из-за бактерий, устойчивых к -лактамовым антибиотикам. Предпочтительные соединения должны иметь минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) менее 50%, более предпочтительно менее 10% и наиболее предпочтительно - менее 1% от МИК цефотаксима или имипенема для организма, устойчивого к бета-лактаму, предпочтительно метициллинустойчивого стафилококкового или ампициллинустойчивого энтерококкового организма. Другие предпочтительные соединения должны быть способны предотвратить или уменьшить смертность у мышей, инфицированных устойчивым к бета-лактаму организму в большей степени, нежели это удается цефотаксиму или имипенему.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к соединениям структурных формул и/или их фармацевтически приемлемым солям, где R¹ выбирают из группы, состоящей из -NHC(O)ZR³, -NR⁴R⁵; Z выбирают из группы, состоящей из -CH₂(X)_m, -C(NOR⁶)-; X означает атом серы; m = 0 или 1; R³ представляет тиазолил, замещенный хлором или аминогруппой, или (CH₂)_nT; T представляет гуанидино; n = 1 - 6; R^4-5 каждый означает водород;, R⁶ представляет водород или может быть также группой, которая со смежным атомом кислорода образует защищенную гидроксильную группу; R⁶ означает водород; A, B, D и E выбирают из группы, состоящей из тиазолила и тиадиазолила; примерами гетероциклических групп, известными в химии; G, H, L и M представляют углерод; J представляет азот; R¹¹ представляет водород; alk₁ и alk₂ представляют алкильные группы, и необязательно и независимо замещены заместителем, выбранным из группы, состоящей из гидроксила, амино и карбоксамидо; p принимает значения 0, 1; R⁹⁹ выбирают из группы, состоящей из серы и SO₂; q = 1; r = 1, 2 или 3; R¹² представляет NR¹³R¹⁴, R¹³-R¹⁷ каждый означает водород.

Не желая связываться с какой-либо конкретной теорией относительно функционирования настоящего изобретения, следует отметить, что существует несколько новых структурных особенностей настоящего изобретения, которые, как считают, вносят вклад в существенно улучшенные функциональные характеристики. В частности, хлорные заместители у гетероциклических R³ групп, по-видимому, в 2-4 раза улучшают значения МИК по сравнению с соединениями, в которых нет хлорированных гетероциклических R³ групп.

Предпочтительные фармацевтически приемлемые соли включают (1) такие неорганические соли, как хлорид, бромид, иодид, нитрат, фосфат или сульфат; (2) такие карбоксилаты, как ацетат, пропионат, бутират, малеат или фумарат; (3) такие алкилсульфонаты, как метансульфонат, этансульфонат, 2-гидроксиэтилсульфонат, н-пропилсульфонат или изо- пропилсульфонат; и (4) такие гидроксикарбоксилаты, как лактат, малат и цитрат.

В другом варианте в настоящем изобретении предложены композиции, включающие такое количество соединения со структурой II, III, IV, V или VI, которое эффективно для лечения бактериальных инфекций у млекопитающих, вызванных бактериями, которые устойчивы в отношении -лактамовых антибиотиков.

В еще одном варианте настоящее изобретение включает способы лечения бактериальной инфекции у млекопитающих, вызванных бактериями, устойчивыми в отношении -лактамовых антибиотиков, которые включают введение страдающему от такой инфекции млекопитающему терапевтически эффективного количества соединения со структурой II, III, IV, V или VI. Естественно, соединения настоящего изобретения также находят применение в композициях и способах лечения млекопитающих, инфицированных бактериями, которые восприимчивы к обычным -лактамовым антибиотикам.

В другом варианте настоящее изобретение характеризует соединения и способы для получения промежуточного соединения VII, которое можно использовать для получения соединений, обладающих конкретной потенциальной активностью против метициллинустойчивых Staphilococci и ампициллинустойчивых Enterococci.

Другие характерные особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего описания предпочтительных вариантов и из формулы изобретения.

Фиг. 1-5 представляют предпочтительные схемы получения соединений настоящего изобретения.

Фиг. 1 представляет схему получения цефема.

Фиг. 2 представляет схему получения C(7)-заместителя.

Фиг. 3 представляет схему получения 3-заместителя.

Фиг. 4 представляет схему окончательной сборки.

Фиг. 5 представляет схему удаления защиты и образование соли.

Термин "бактерия, устойчивая к -лактаму" относится к бактериям, в отношении которых -лактамовый антибиотик имеет минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) больше чем 32 мг/мл.

Термин "метициллинустойчивая бактерия" относится к бактериям, которые устойчивы к метициллину. Примеры таких бактерий представлены в таблице 1 или обозначены как Meth^R Термин "метициллинвосприимчивые бактерии" относится к бактериям, которые чувствительны к метициллину. Примеры таких бактерий представлены в таблице 1 и обозначены как Meth^S.

В настоящем изобретении предложены соединения, способы и композиции, которые эффективны при лечении бактериальных инфекций, особенно инфекций, возникающих из-за бактерий, которые выработали устойчивость к обычным -лактамовым антибиотикам. Более важно то, что в настоящем изобретении предложены соединения, способы и композиции, эффективные при лечении бактериальных инфекций, вызванных бактериями, которые выработали устойчивость к обычным цефалоспориновым антибиотикам.

Получение соединений со структурой II Соединения настоящего изобретения можно легко получить в соответствии со следующими схемами. Однако следует учитывать, что другие схемы синтеза для получения соединений настоящего изобретения возможны, и что нижеследующие схемы приведены просто для примера, и не являются ограничивающими. Следует учитывать также, что можно использовать различные подходы для введения защитных групп и их удаления, которые обычно используют на практике (см. например. Green and Wuts). Специалистам известно, что выбор любой конкретной защитной группы (например, карбоксизащитной группы) зависит от стабильности защищенного фрагмента в отношении условий последующей реакции.

Обычно синтез цефалоспоринов настоящего изобретения можно осуществить, используя хорошо известные способы и легко доступные материалы (см. например, March; Zarock, Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers, 1989); and G.I. Georg The Organic Chemistry of - Lactams (VHC 1992), каждая из которых включена сюда по ссылке). Как представлено далее на схеме 1, обработка цефемтрифлата 1 нужным необязательно защищенным тиолатным нуклеофилом 2, с использованием таких стандартных способов, как те, которые описаны у Farina et. al. J. Org. Chem. 54:4962 (1989) и в патенте США 4870168 Baker et. al. , (оба включены сюда по ссылке), приводит к получению 3-тио производного 3. После последующего удаления защиты с использованием известных специалистам способов, получают биологически активный 4-карбоксицефем 4 (см. схему 1 в конце описания).

Соединение 1 легко получить из коммерчески доступных исходных материалов, например, в реакции (7R)-7- [(фенилацетил)амино]-3-гидрокси-3-цефем-4-карбоновой кислоты (Otsuka Chemical Co. Ltd, Otsuka Japan) с трифликангидридом (Aldrich, Milwaukee, WI), используя известные способы (см. Farina) и патент США 4870168 Baker et. al.). Другие 3-гидрокси-3-цефемы можно получить в результате озонолиза 3-экзометиленцефемов, используя известные способы (см. Farina). Аналогично, тиолатный нуклеофил 2 можно получить, используя известные способы и коммерчески доступные исходные материалы.

Заместителем R¹ может быть любой заместитель из группы, описанных ранее, и он может быть либо доступен коммерчески, либо его можно получить, используя известные методики и исходные материалы (см., например, March; Zarock). Эти группы могут замещать те, которые присутствуют на исходных материалах, различными хорошо известными способами (см. Barrett, J.C.S. Perkin 1, 1629 (1979) или Chauvette, J. Org. Chem. 36:1259 (1971) (обе включены сюда по ссылке), например, за счет трансаминирования существующего заместителя для получения нужного заместителя, или за счет гидролитического удаления существующего заместителя с последующей реакцией с соответствующей реакционноспособной формой нужного заместителя, например, с ацилхлоридом. И снова, соответствующие реагенты и способы должны быть очевидны специалистам.

В качестве карбоксильной группы R² могут быть такие защитные группы, которые поддаются восстановительному отщеплению, такие, как бензил, пара- или ортонитробензил, 2,2,2-трихлорэтил, аллил, циннамил, бензгидрил, 2-хлораллил и т. п.

В другом варианте R² может быть защитной группой, поддающейся кислотному отщеплению, такие как трет-бутил, трет-амил, тритил, 4-метокситритил, 4,4'-диметокситритил, триметилсилил, трет-бутилдиметилсилил, фенацил, - (триметилсилил) этил, бензил, 4-(или 2)-метоксибензил, 2,4-диметоксибензил, 3,4-диметоксибензил, 2,4,6-триметоксибензил, метоксиметил, бензгидрил или 3,3-диметилаллил. Предпочтительными защитными группами являются п-метоксибензил, п-нитробензил, аллил и бензгидрил. Такие группы могут быть присоединены к незащищенной карбоксильной группе цефалоспоринового исходного материала с помощью известных реагентов и методик, таких, как те, которые описаны у Green and Wuts.

В. Синтез соединений со структурой III Соединения с общей структурой III получают аналогично соединениям структуры II. В большинстве случаев, ключевым этапом является соединение замещенного гетероарилтиолата с цефемтрифлатом 1 или функционально эквивалентным цефемом, содержащим альтернативную отщепляемую группу C-(3). Соединения структуры III, в которых кольцо, содержащее G, H, J, L и М представляет 4-пиридил, можно также получить по способу, представленному на фиг. 4.) В соответствии с настоящим изобретением терапевтически или фармацевтически эффективное количество цефалоспорина, и, конкретно, соединения со структурой II, III, IV, V или VI, вводят млекопитающему, страдающему от инфекции, вызванной метициллинустойчивыми бактериями (или другими инфекциями, вызванными другими -лактамустойчивыми бактериями, такими, как ванкомицинустойчивые или ампициллинустойчивые бактерии), особенно, устойчивыми S.aureus, в количестве, эффективном для по крайней мере частичного ослабления инфекции. Особенно важными являются инфекции, вызываемые штаммами, которые обладают активностью, аналогичной активности таких штаммов, как S.aureus Col (Meth^R) (lac-), S. aureus 76 (Meth^R) (lac⁺), E. faecium ATCC 35667 или E. faecium ATCC 29212. И снова, такие соединения также эффективны против бактерий, чувствительных к метициллину, ванкомицину, и/или ампициллину, и поэтому находят применение в таких композициях и способах.

Композиции, содержащие соединение (соединения) настоящего изобретения можно вводить для профилактики и/или терапевтического лечения. При терапевтическом применении композиции вводят пациенту, который уже страдает от инфекции, как указано ранее, в количестве, достаточном для лечения или по крайней мере частичной приостановки симптомов инфекции. Количество, которое позволяет осуществить это, определяют как "терапевтически эффективное количество или доза". Количества, которые эффективны для этого, зависят от тяжести и течения заболевания, проведенной ранее терапии, состояния здоровья пациента и его реакции на лекарства, и судить обо всем этом должен лечащий врач. В случае профилактического применения, композиции, содержащие соединения настоящего изобретения, вводят пациенту, который восприимчив, или находится в группе риска в отношении конкретной инфекции. Такое количество определяют как "профилактически эффективное количество или дозу". При таком использовании точное количество снова будет зависеть от состояния здоровья пациента, его веса и т.п.

После того как происходит улучшение в состоянии пациента, вводят при необходимости поддерживающую дозу. Затем дозу или частоту введения, или оба эти фактора, можно уменьшить в зависимости от симптомов, до такого уровня, при котором сохраняется это улучшенное состояние. После того, как симптомы уменьшаются до нужного уровня, лечение можно прекратить. Пациенту, однако, требуется периодическое лечение в течение длительного времени в случае рецидивов симптомов заболевания.

Обычно подходящая эффективная доза соединения настоящего изобретения находится в интервале значений от 0,1 до 1000 мг в день для реципиента, предпочтительно в интервале от 1 до 100 мг/день. Нужная доза может быть представлена в виде единичной, двух, трех, четырех или более субдоз, вводимых с соответствующими интервалами на протяжении всего дня. Такие субдозы можно вводить в виде единичных дозовых форм, например, содержащих от 5 до 1000 мг, предпочтительно от 10 до 100 мг активного ингредиента на единичную дозовую форму. Предпочтительно вводить соединения настоящего изобретения в количествах от около 2,0 мг/кг до 250 мг/кг веса пациента и от около одного до четырех раз в день.

Хотя активный ингредиент настоящего изобретения можно вводить отдельно, предпочтительно, чтобы он присутствовал как часть фармацевтической композиции. Композиции настоящего изобретения включают по крайней мере одно соединение или ингибитор настоящего изобретения в терапевтически или фармацевтически эффективной дозе вместе с одним или более из фармацевтически или терапевтически приемлемых носителей. Твердые носители включают, например, крахмал, лактозу, дикальцийфосфат, микрокристаллическую целлюлозу, сахарозу и каолин, а также необязательно другие терапевтические ингредиенты. Жидкие носители включают, например, стерильную воду, полиэтиленгликоли, неионные поверхностно-активные агенты, такие пищевые масла, как кукурузное, арахисовое и кунжутное масла. Кроме того, могут быть включены различные адьюванты, такие, как те, которые обычно используют на практике. Их примеры: вкусовые агенты, красители, консерванты и антиоксиданты, например, витамин E, аскорбиновая кислота, ВНТ и ВНА. Описаны различные другие аспекты, например, у Gilman et. al. (ed) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8Ed., Pergamon Press; and Remington's supra. Там обсуждаются способы введения, например, пероральный, внутривенный, внутрибрюшинный или внутримышечный и другие. Фармацевтически приемлемые носители включают воду, физиологический раствор, буферы и другие описанные соединения, например, у Merck Index, Merck and Co., Rahway, NJ. Обычно предпочтительные способы введения представляют внутривенный и внутрибрюшинный. Эти фармакологические агенты могут быть в различных формах. Эти формы включают, например, твердые, полутвердые и жидкие дозовые формы, такие, как таблетки, пилюли, порошки, жидкие растворы или суспензии, липосомы, растворы для инъекций и вливаний. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Обычно, используют фармакологически приемлемую соль соединения для упрощения приготовления композиции. Предпочтительные соли включают соли натрия, калия, аргинина, глицина, аланина, треонина. Их приготавливают предпочтительно в соответствующей смеси воды с таким поверхностно-активным агентом, как гидроксипропилцеллюлоза.

В зависимости от конкретных условий лечения такие агенты могут быть введены в композицию и введены системно или локально. Описание способов получения композиций и их введения можно обнаружить у Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th ed. Mack Publishing Co., Easton, PA (1990). Подходящие способы могут включать пероральный, ректальный, трансдермальный, вагинальный, через слизистую или через кишечник; парэнтеральный способ включает внутримышечный, подкожный, интрамедуллярный, прямой интравнетрикулярный, внутривенный, внутрибрюшинный, интраназальные или интраокулярные инъекции (перечислено просто в качестве примеров).

Для инъекций агенты настоящего изобретения можно приготовить в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенка, раствор Рингера, или физиологический солевой буфер. Для трансмукозальных введений в композиции используют агенты, обеспечивающие проникновение через барьер. Такие агенты, способствующие проникновению, обычно известны специалистам.

В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, например, в жидких маслах, жидких парафинах или жидких полиэтиленгликолях. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы.

Биологическая активность Антибактериальная активность in vitro Соединения настоящего изобретения оценивают в отношении их эффективности против некоторых -лактамустойчивых (например, метициллинустойчивых, ванкомицинустойчивых и/или ампициллинустойчивых) бактериальных штаммов, определяя минимальную ингибирующую концентрацию (МИК, мкг/мл) каждого из соединений в отношении каждого штамма. МИК, наименьшая концентрация антибиотика, которая ингибирует рост тестового организма, определяется с помощью метода разбавления агара.

Для определения МИК для изолятов бактерий, тестовое соединение вводят в двукратные разбавления в ожиженный агар Мюллера-Хинтона (Mueller-Hinton). После отверждения, ряд различных бактериальных штаммов инокулируют пятном на поверхность агара с помощью специального приспособления. После инкубирования в течение ночи определяют пороговое значение МИК как наименьшую концентрацию лекарства, которая полностью ингибирует рост вне зависимости от того, относится это только к одной колонии, или ко всему газону. Процедура, которую используют в этих исследованиях, была стандартизована National Comittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) в виде NCCLS публикации, озаглавленной Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests (1991), которая включена сюда по ссылке.

Аликвоты антимикробных агентов приготавливают в буферированном фосфатом физиологическом растворе (PBS) при pH 7,2. При необходимости в качестве солюбилизирующего агента используют Tween 20 или ДМСО. Для облегчения солюбилизации тестируемого агента используют стандартные способы центрифугирования, обработки ультразвуком и осторожного нагревания. Обычно концентрация исходного раствора составляет 10Х от наивысшей концентрации тестируемого лекарства. 1,28 мг/мл исходного раствора используют с последующей наивысшей рабочей концентрацией 128 мкг/мл. Осуществляют сериальные двукратные разбавления по 0,25 мкг/мл. Каждый из уровней лекарства тестируют дважды. Двукратные разбавления лекарства осуществляют в стерильных 50 мл ампулах с конечным объемом лекарственного препарата 5 мл. После добавления 45 мл расплавленного агара происходит 10 кратное разбавление. Затем две 25 мл пластины помещают в 15 х 150 мм квадратные чашки Петри с решеткой и оставляют затвердевать.

В качестве позитивного контроля роста используют контрольную пластину со сравнительным лекарством, либо цефотаксимом, либо ванкомицином, либо имипенемом. Исходные концентрации сравнительных антибиотиков приготавливают и замораживают при температуре -80^oC. После их приготовления контрольные пластины герметизируют и хранят в холодильнике вплоть до 1 недели до использования, однако контрольные пластины с имипенемом необходимо приготавливать непосредственно перед использованием. Все тестовые пластины используют в течение 24 часов после приготовления.

Удовлетворительные результаты получены в тех случаях, когда инокулюм содержит около 10⁴ колонии образующих единиц (КОЕ) 0,5 log. Начиная с чистых культур тестовых изолятов на агарных пластинах, несколько выделенных колоний переносят в ампулу с питательным бульоном и оставляют расти на 4-6 часов при температуре 35-36^oC для достижения логарифмической фазы роста. К PBS прикапывают бульонную культуру до достижения стандарта помутнения 0,5 McFarland равного 10⁸KOE/мл. Это разбавляют далее в 10 раз в PBS до достижения рабочей концентрации инокулюма в 10⁷ КОЕ/мл. Если 1 мкл рабочего инокулюма наносят на поверхность агара, достигается концентрация около 10⁴ КОЕ на пятно.

Для инокулирования тестовых пластин используют одноразовые стерильные 1 мкг петли, причем каждый изолят высевают в сконструированную на агарной пластине решетку. В альтернативном способе инокулирования используют устройство с 48 стальными шипами, которое позволяет обеспечить одновременное инокулирование множества изолятов. После того, как пятна высыхают, пластины инкубируют при 35-36^oC в течение 16-20 часов. И, наконец, конечную точку оценивают как минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) антимикробного агента.

Новые агенты настоящего изобретения отличаются своей повышенной активностью против S. aureus Col и Enterococci (Е. faecium и E. faecalis). Штамм S. aureus Col является PBP2a продуцентом с высоким уровнем, тогда как S. aureus Col 8A, его изогенный партнер, дает мало PBP2a.

Некоторые соединения демонстрируют широкий спектр активностей против как S. aureus Col и S. aureus Col 8A, a также против Enterococci. Штамм S. aureus Col 8A сильно подвержен воздействию всех тестированных агентов, включая цефотаксимовый контроль. Таким образом, соединения настоящего изобретения оказываются эффективными против РВР2а-продуцирующих бактерий. Некоторые соединения демонстрируют потенциальную активность против энтерококков. Некоторые другие соединения настоящего изобретения оказываются эффективными против Е. coli помимо грамположительных организмов.

Оценка антибактериальной активности in vivo Те соединения, которые обладают превосходной активностью ин витро, при сравнении со сравнительными антибиотиками, в дальнейшем оценивают в модели на мышах для летальных бактегемических перитонитов.

Группы из 5 мышей штамма Swiss-Webster (Simonsen Gilroy, CA) каждую заражают с помощью внутрибрюшинных инъекций 10-кратными инкрементами бактериального инокулюма. Это позволяет произвести оценку средней летальной дозы (ЛД₅₀) и ЛД₁₀₀. Для предварительной оценки нового антибиотика мышей заражают с помощью внутрибрюшинной инъекции ЛД₁₀₀ титром бактерий. Двумя равными дозами, вводимыми в момент бактериального заражения и 2 часа спустя, группы по 10 мышей в каждой обрабатывают подкожным введением двукратных инкрементов тестового лекарства и антибиотика известной для мышей и человека эффективности (т. е., позитивный контроль). За мышами ведут наблюдение в течение 72 часов. Тех мышей, которые выживают в течение 72 часов, рассматривают как долгожителей. Полную дозу (мк/кг) лекарства, которая обеспечивает защиту 50% мышей в группе от гибели, рассматривают как среднюю защитную дозу (ЗД₅₀). ЗД₅₀ аналогичным образом определяют для ряда патогенов. Затем количественные результаты для нового лекарства сравнивают с результатами, полученными для сравнительных антибиотиков Группам по пять мышей в каждой внутрибрюшинно вводят шесть десятикратных разбавлений инокулюма, суспендированного в 0,5 мл стерилизованного 7% свиного желудочного муцина (Sigma). Контрольной группе мышей вводят только один муцин. За мышами наблюдают в течение 72 часов. Тех, которые остались живы после 72 часов, рассматривают как долгожителей. Среднюю летальную дозу (ЛД₅₀) и 100% летальную дозу (ЛД₁₀₀) определяют в пробит-тесте.

Для исследования антибиотической эффективности мышей заражают внутрибрюшинно бактериальными титрами, которые приводят к ЛД₁₀₀ для тестовых штаммов. Двумя равными дозами, вводимыми в момент бактериального заражения и 2 часа спустя, группы по 10 мышей в каждой обрабатывают с помощью подкожного введения двукратных инкрементов тестового антибиотика; другую группу обрабатывают аналогично сравнительным антибиотиком с известной эффективностью для животных и человека. Дозы лекарств могут быть в интервале от 0,01 до 512 мг/кг. Если лекарство плохо растворяется, то для его солюбилизации можно использовать твин 20 или пропиленгликоль. За животными наблюдают в течение 72 часов. 50%-ную защитную дозу (ЗД₅₀) рассчитывают в мк/кг с помощью пробит-анализа. ЗД₅₀ представляет собой то же самое, что и 50%-ная эффективная доза (ЭД₅₀) и 50%-ная лечебная доза (Леч.Д₅₀). Образцы крови из сердец всех животных, которые погибли, и от половины животных, которые выжили, культивируют на инфузионном агаре мозг-сердце. Животные, которым ввели защитную дозу тестового соединения, остаются живыми в течение 72 часов, хотя они на вид могут казаться умеренно больными или очень больными на протяжении периода наблюдений. Инфицированные и получившие плацебо контрольные мыши, а также те, которым вводили неэффективные, то есть более низкие дозы тестовых лекарств, демонстрируют высокую степень смертности. Большинство из этих мышей погибает в течение 6-48 часов. Те же, которые остаются живыми после 72 часов, рассматриваются как долгожители.

Соединение N 1. (7R)-7-[(фенилацетил)амино] -3-(3-изотиоуреидометилпирид-4-илтио)- 3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 2. (7R)-7-[(фенилацетил)амино] -3-(4-изотиоуреидометил-1,2,3-тиадиазол- 5-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 3. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)ацетамидо]-3- (3-изотиоуреидометилпирид-4-илтио-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 4. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)ацетамидо]-3- (4-изотиоуреидометил-1,2,3-тиадиазол-5-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 5. (7R)-7-[(фенилацетил)амино] -3-(4-изотиоуреидометилтиазол-5-илтио)- 3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 6. (7R)-7-[(фенилацетил) амино]-3-[4-(3-пирролидинотиометил)-1,2,2- тиадиазол-5-илтио-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 7. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)ацетамидо]-3- (4-изотиоуреидометилтиазол-5-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 8. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(циклопентилоксиимино)- ацетамидо] -3-(3- изотиоуреидометилпирид-4-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 9. (7R)-7-[(фенилацетил)амино] -3-(3-аминоэтилтиометилпирид-4-илтио)- 3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 10. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)ацетамидо] -3- (3-аминоэтилтиометилпирид-4-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 11. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)ацетамидо] -3- [(метиламиноэтиламиноэтилтиометил)-1,2,3-тиадиазол-5-илтио]-3-цефем-4- карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 12. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино) ацетамидо] -3-[(гуанидиноэтиламиноэтилтиометил)-1,2,3-тиадиазол-5-илтио] - 3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 13. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил-2-(циклопентилоксиимино)ацетамидо]- 3-(3-аминоэтилтиометилпирид-4-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 14. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)ацетамидо] -3- (3-гуанидиноэтилтиометилпирид-4-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 15. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино) ацетамидо] -3-(3-метиламиноэтилтиометилпирид-4-илтио)-3-цефем-4- карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 16. (7R)-7-[(Z)-2-(2-амино-5-хлоротиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино) ацетамидо] -3-(3-аминоэтилтиометилпирид-4-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 17. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино ацетамидо] -3- [3-(3-пирролидинотиометил)пирид-4-илтио] -3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 18. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)ацетамидо] -3- [3-(N-мeтилглицил)-аминоэтилтиометилпирид-4-илтио]-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 19. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)ацетамидо] -3- [3-(2-амино-1,1-диметилэтилтиометил)пирид-4-илтио] -3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 20. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)ацетамидо] -3- (3-аминоэтилтиопирид-4-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 21. (7R)-7-[(Z)-2-(2-амино-5-бромотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)-ацетамидо] -3-(3-аминоэтилтиометилпирид-4-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 22. (7R)-7-[(Z)-2-(2-амино-5-хлортиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)- ацетамидо] -3- [(метиламиноэтиламиноэтилтиометил)-1,2,3-тиадиазол-5-илтио]-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 23. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(2-фторэтоксиимино) ацетамидо]-3-(3-аминоэтилтиометилпирид-4-илтио)-3-цефем-4- карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 24. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино) ацетамидо] -3-[3-(глицил)аминоэтилтиометилпирид-4-илтио] -3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 25. (7R)-7-[(Z)-2-(аминотиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)ацетамидо] -3- (3-(N-формамидоил)аминоэтилтиометилпирид-4-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 26. (7R)-7-[(Z)-2-фенил-2-(гидроксиимино)ацетамидо] -3-(3- аминоэтилтиометилпирид-4-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 27. (7R)-7-[(Z)-2-(2-амино-5-хлоротиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)- ацетамидо] -3-[3-(3-аминопропил)тиометилпирид-4-илтио] -3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 28. (7R)-7-[(Z)-2-(2-амино-5-хлоротиазол-4-ил)-2-(2-фтороэтоксиимино) ацетамидо] -3-(метиламиноэтиламиноэтилтиометил)-1,2,3-тиадиазол-5-илтио]-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 29. (7R)-7-[(Z)-2-(2-амино-5-хлоротиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)- ацетамидо] -3-[3-(глицил)аминоэтилтиометилпирид-4-илтио]-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 30. (7R)-7-[(Z)-2-(2-амино-5-хлоротиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)- ацетамидо] -3-(3-аминоэтилтиопирид-4-илтио)-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 31. (7R)-7-[(Z)-2-(2-амино-5-хлоротиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино)- ацетамидо] -3-(3-(N-формамидиноил) аминоэтилтиометилпирид-4-илтио) -3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 32. (7R)-7-[(Z)-2-(2-амино-5-хлоротиазол-4-ил)-2-(гидроксиимино) -ацетамидо] -3-[3-(3-амино-2-гидроксипроп-1-илтиометил) пирид-4-илтио]-3-цефем-4-карбоксилат, соль трифторуксусной кислоты 33. (7R)-7-[(Z)-2-(2-амино-5-хлоротиазол-4-ил)-2-(2-фтороэтоксиимино) ацетамидо] -3-(3-аминоэтилтиометилпирид-4-илтио)-3-