Иммунофилин-специфические лиганды в качестве антиастматических и иммунодепрессантных агентов и способ их получения, фармацевтически готовая форма, лекарственное средство и способ его получения

Иммунофилин-специфические лиганды в качестве антиастматических и иммунодепрессантных агентов и способ их получения, фармацевтически готовая форма, лекарственное средство и способ его получения

Реферат

 

Описываются новые иммунофилин-специфические лиганды общей формулы I, (I) где R₁ - остаток метилового эфира аминокислоты, выбранной из -NH₂-лизина, -Z-NH-лизина, фенилаланина, R₂ - водород, R-бутилоксикарбонил, карбоксибензил, остаток 4-пиперидинкарбоновой кислоты, 2-индолинкарбоновой кислоты, ₄ - водород, А - ароматическая группировка; -D = -СН = С-; Х = О, У = С. Они обладают антиастматическим и иммунодепрессантным действием и могут быть использованы в качестве исходных соединений для получения лекарственных средств. Описывается также способ их получения, фармацевтически готовая форма, лекарственное средство и способ его получения. 6 с. и 13 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

Изобретение относится к новым иммунофилин-специфическим лигандам формулы I: Группы R₁, R₂, R₃, R₄, X, Y, A, B и D имеют следующие значения: R₁ - остаток метилового эфира аминокислоты, выбранной из -NH₂-лизина, -Z-NH-лизина, фенилаланина, R₂ - водород, R₃ - бутилоксикарбонил, карбоксибензил, остаток 4-пиперидинкарбоновой кислоты, 2-индолинкарбоновой кислоты, R₄ - водород, A - ароматическая группировка; B-D = -CH=C-; X = O, Y = C.

Дальнейшее относится к изобретению физиологически совместимых солей соединений формулы I, способов получения соединений формулы I и их фармацевтическому применению.

Циклоспорин A (CsA) и FK 506 - природные соединения, выделенные из грибов, обладающие иммунодепрессантными свойствами, ингибируют Ca⁺²-зависимый путь передачи сигнала в некоторых типах клеток. В Т-клетках оба препарата ингибируют транскрипцию ряда генов, включая ген интерлейкина-2 (IL-2), который обычно активируется путем стимуляции Т-клеточных рецепторов (TCR). FK-506 и CsA связываются с высоким сродством с растворимыми рецепторными белками (G.Fischer et al., Nature 337, 476-478, 1989; M.W.Harding et al., Nature 341, 755-760, 1989). FK-506-рецептор носит название FKBP, CsA-рецептор называется циклофилин (Cyp). Оба белка катализируют изомеризацию цис- и транс-ротамеров амидной связи в пептидах, и в литературе часто описываются под названием иммунофилины.

Лиганд-рецепторные комплексы, CsA-Cyp и, соответственно, FK 506-FKBP, связывают кальцинейрин (CN) и тем самым ингибируют его фосфатазную активность. Известно, что внутриклеточной мишенью для CN является цитоплазматический фосфорилированный компонент фактора транскрипции NF-AT, который при отсутствии в клеточном ядре активного CN не дефосфорилируется и вследствие этого не может образовать активный транскрипционный комплекс на IL-2-промоторе (M. K.Rosen, S.L.Schreiber, Angew.Chem. 104 (1992), 413-430; G.Ficher, Angew. Chem.106 (1994), 1479-1501).

В основе аллергического заболевания, такого как астма, лежит воспалительная реакция, вызванная Т-клетками и соответствующими медиаторами. В качестве средства для лечения многих аллергических заболеваний все еще используются кортикостероиды. CsA и FK 506 также оказались эффективным терапевтическим средством в случае бронхиальной астмы и связанных с ней воспалительных реакций, правда только в опытах на животных и на стадии клинических испытаний. В опытах на животных была показана блокада различных цитокинов, таких как IL-2, IL-4 и IL-5, вызывающих развитие воспалительной реакции, индуцированной аллергией.

Несмотря на множество попыток, до настоящего времени не удалось найти новых ингибиторов иммунофилинов, превосходящих по активности CsA, FK 506 и рапамицин или, соответственно, их производные, синтезированные или выделенные из природных источников. Однако высокие ингибиторные свойства CsA, FK 506 и рапамицина в значительной степени обесцениваются из-за наличия у них разнообразного побочного действия, в особенности из-за действия на почки и нейротоксичности. В основе этого явления лежит неспецифичность взаимодействия иммунофилин-специфичных лигандов со специфическими клеточными белками. Вследствие этого, терапевтическое применение этих иммунодепрессантов носит ограниченный характер. Кроме того, из-за недостаточно высокой селективности, представляется проблематичным применение этих препаратов именно в случае долговременной терапии.

Целью изобретения является поиск новых соединений с ценными фармакологическими свойствами и их получение с помощью направленного синтеза.

Согласно формуле изобретения соединения по формуле I представляют совершенно новый класс соединений, способных с исключительно высокой специфичностью связываться с иммунофилинами и в высшей степени эффективно ингибировать IL-2-пролиферацию. Соединения этого класса и их фармацевтически приемлемые соли обладают высоким сродством к иммунофилинам, таким как CypA, CypB, CypC и FKBP12.

Те соединения по формуле I, которые содержат асимметрический атом углерода и поэтому, как правило, образуют рацематы, можно с помощью известных методов, например, в виде солей с оптически активной кислотой, разделить на оптически активные изомеры. Однако вполне возможно использовать на первой стадии синтеза оптически активные исходные соединения, причем в этом случае в качестве конечных продуктов будут получены соответствующие оптически активные диастереоизомерные соединения.

Изобретение включает также соединения по формуле I, содержащие асимметрический атом углерода, S-формы, R-формы, смеси S- и R-форм, а также в случае присутствия в молекуле нескольких асимметрических атомов углерода, диастереоизомерные формы.

В зависимости от условий синтеза и исходных веществ соединения по формуле I могут быть получены в свободной форме или в форме солей. Полученные соли с помощью известных методов, например, действием кислот, щелочей, или с помощью ионообменников могут быть переведены в свободные основания или, соответственно, в свободные кислоты.

Соединения по формуле I в свободной форме с помощью неорганических или органических кислот или оснований могут быть переведены в соответствующие физиологически совместимые кислые соли.

Соединения биологически активны, как в форме свободных оснований, так и в форме солей. Соединения по формуле I как в свободной форме, так и в форме соли могут поставляться с физиологически совместными солями и основаниями. Применение может быть пероральным, парэнтеральным, внутривенным, подкожным или путем ингаляции.

Далее изобретение относится к фармацевтическим готовым формам с включением, по крайней мере, одного соединения по формуле I или их солей с физиологически совместимыми неорганическими или органическими кислотами и/или основаниями, и в данном случае фармацевтически приемлемых носителей и вспомогательных веществ.

Возможны любые готовые формы препаратов, например, таблетки или драже, капсулы, растворы, соответственно, ампулы, суппозитории, пластыри, или формы для введения путем ингаляции.

Дозировка вышеупомянутых фармацевтически готовых форм зависит от состояния пациентов и от формы применения. Суточная действующая доза составляет 0,01-100 мг на кг веса тела.

Приготовить соединения по формуле I можно, например, методом твердофазного синтеза по Б.Меррифильду, предпочтительно, на нерастворимых полимерах, как например, на набухающем в органическом растворителе полистироле в форме сферических гранул (например, сополимере полистирола и 1% дивинилбензола), по стандартным методикам получения пептидов методом твердофазного синтеза.

Соединения общей формулы I синтезируют таким образом, что сначала закрывают защитными группами функциональные группировки (-амино-, -амино- или -карбоксильную группу), а затем подходящим образом модифицируют свободную третью функциональную группу. В данном случае можно также, если это дает лучший результат, на первой стадии ввести промежуточную защитную группу, которую после второй стадии заменить на необходимую функциональную группу. Подходящие защитные группы и способы их введения известны. Примеры защитных групп приведены в литературе: "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag 1984; "Solid Phase Peptide Synthesis" J.M.Stewart and J.D.Young, Pierce Chem. Company, Rockford, III, 1984; G.Barany and R.B.Merrifield "The Peptides", Ch. 1, S.1-285, 1979, Academic Press Inc.

Ступенчатый синтез ведут, например, таким образом, что сначала C-концевую аминокислоту с защищенной -аминогруппой ковалентно связывают с нерастворимой матрицей, отщепляют защитную группу, по свободной аминогруппе присоединяют карбоксильную группу следующей аминокислоты, также защищенной по аминогруппе. Таким образом к синтезируемому пептиду присоединяют одну аминокислоту за другой в необходимой последовательности, отщепляют имеющиеся дополнительные функциональные и защитные группы, и после присоединения последней аминокислоты исследуют эффективность связывания иммобилизованного лиганда с рецептором (Cyp или FKBP). Ступенчатая конденсация представляет из себя обычный пептидный синтез из соответствующих защищенных аминокислот. Синтез можно также проводить на автоматическом пептидном синтезаторе, например, типа Labortec SP 650 (Бахем, Швейцария), с использованием имеющихся в продаже защищенных аминокислот.

В качестве примеров соединений по формуле I приводятся следующие: Пример 1: N-[1-Boc-пиперидил-4-карбонил]-индолин-2-(R,S)карбоновая кислота-[S-(N--Boc]-лизинметиловый эфир]-амид Пример 2: N-[1-пиперидил-4-карбонил]-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота-[S-(-NH₂)-лизинметиловый эфир]-амид Пример 3: N-[1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбонил]-индолин-2-(R,S)- карбоновая кислота-[S-(N--Boc)-лизинметиловый эфир]-амид Пример 4: N-[индoлин-2-(R,S)-кapбoнил]-индoлин-2-(R,S)-карбоновая кислота-[S-(--NH₂)-лизинметиловый эфир]-амид Пример 5: N-[1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбонил]-индолин-2-(R,S)- карбоновая кислота-(S-(N--Z)-лизинметиловый эфир)-амид Пример 6: 1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота-(S-(N--Z)-лизинметиловый эфир)-амид Пример 7: 1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота-(8-фенилаланинметиловый эфир)-амид Пример 8: Метиловый эфир N-[N'-(4-метоксифенилацетил)-пиперидил-4-карбонил] -индолин-2-(R, S)-карбоновой кислоты (как предварительная стадия для получения амидов с общей формулой I) Пример 9: Метиловый эфир N-(4-метоксифенилацетил)-индолин-2-(R,S)-карбоновой кислоты (как предварительная стадия для получения амидов с общей формулой I) Пример 10: N-Boc-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота-4-пиперидил-амид Пример 11: N-Boc-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота-[пиперазиноуксусная кислота-морфолид]-амид Пример 12: N-[1-Boc-пиперидил-4-карбонил] -индолин-2-(R,S)- карбоновая кислота-[пиперазиноуксусная кислота-морфолид]-амид Пример 13: N-[N'-(4-метоксифенилацетил)-пиперидил-4-карбонил]-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота-[S-(N--Z)-лизинметиловый эфир]-амид В соответствии с настоящим изобретением соединения по формуле могут быть также синтезированы по схеме.

Согласно изобретению соединения по формуле I, у которых R₁, R₂, R₃, R₄, A, B, D, X и Y имеют указанные значения, синтезируются таким образом, что производные индола формулы II, где R₄, A, B, D, X и Y имеют указанные значения, взаимодействуют со спиртами III с углеводородной цепью C₁-C₁₂ с образованием сложных индольных эфиров IV, у которых R₄, A, B, D, X и Y имеют указанные значения; эфиры IV вводят в реакцию с соединениями Y, у которых R₃, X и Y имеют указанные значения, в результате которой образуются соединения VI, у которых R₃, R₄, A, B, D, X и Y имеют указанные значения; наконец, соединения VI подвергаются омылению с образованием соединений VII, где R₃, R₄ A, B, D, X и Y имеют указанные значения, а затем соединения VII взаимодействуют с соединениями VIII, где R₁ и R₂ имеют указанные значения, с образованием целевого продукта I.

Физиологически совместимые соли соединений по формуле I получают известным способом по реакции с неорганическими или органическими кислотами, например, с соляной, бромистоводородной, фосфорной, серной, уксусной, винной, лимонной, фумаровой, малеиновой, молочной или эмбоновой кислотами, с неорганическими или неорганическими основаниями.

Фармацевтические готовые формы содержат, по крайней мере, одно соединение общей формулы I или его соль с физиологически совместимыми неорганическими или органическими кислотами или основаниями и, в данном случае, фармацевтически приемлемые наполнители и вспомогательные вещества.

Соединения по формуле I могут применяться как в свободной форме, так и в форме солей с физиологически совместимыми кислотами или основаниями, перорально, парэнтерально, внутривенно, подкожно или путем ингаляции.

Возможны любые готовые формы препаратов, например, таблетки или драже, капсулы, растворы и/или ампулы, суппозитории, пластыри, или для введения путем ингаляции.

Дозировка вышеупомянутых фармацевтических готовых форм зависит от состояния пациентов и от формы применения. Суточная действующая доза составляет 0,01-100 мг на 1 кг веса тела.

Согласно изобретению соединения по формуле I обладают свойством связываться с иммунофилинами и ингибировать их изомеразную активность. Пролил-изомеразную активность определяют по общепринятой методике: G.Fischer, H. Bang, A.Schellenberger, Biochim.Biophys. Acta, 791, 87-97, 1984; D.H.Rich et al, J.Med.Chem. 38, 4164-4170, 1995.

Кроме воздействия в каждом случае на пептидил-цис-транс-изомеразную активность иммунофилинов, эти соединения чрезвычайно специфическим образом ингибируют IL-2-пролиферацию у тучных клеток, макрофагов и у активированных Т-клеток. Соединения согласно формуле I могут, подобно циклоспорину A (Sandimmun, CsA), FK 506 и рапамицину (Tacrolimus), назначаться в качестве иммунодепрессантов (R.Y.Calne et al., Br.Med.J. 282, 934-936, 1981), для лечения аутоиммунных заболеваний (R.H.Wiener et al., Hepatology 7, 1025, Abst. 9, 1987; L.Fry, J.Autoimmun. 5, 213-240, 1992; G.J. Feutren J.Autoimmun. 5, 183-195, 1992; EP 610743), для лечения аллергических воспалительных реакций (P. Zabel et al, Lancet 343, 1984), лечения астмы (C.Bachert, Atemw. - Lungenkrkh. 20, 59, 1994), инсулин-зависимого диабета (Diabetes Mellitus) (C.R. Stiller, Science, 223, 1362-1367, 1984), сепсиса, а также применяться в сочетании с известными лигандами иммунофилинов, такими как CsA, FK 506 или рапамицином (M.J.Wyvratt, N.H.Sigal, Perspectives in Drug Discovery and Design, Immunosuppression, 2, 1, 1994; WO 92/21313, US 5330993).

Сущность изобретения подтверждается следующими примерами.

Список использованных сокращений: AcOEt - этилацетат Boc -трет-бутилоксикарбонил (Boc)₂O- трет-бутилоксикарбонил-ангидрид CN - кальцинейрин CsA - циклоспорин A Cyp - циклофилин DMAP - N,N-диметиламинопиридин EA - элементный анализ ЕЕ - сложный эфир уксусной кислоты FKBP - белок-рецептор препарата FK 506 HPLC - высокоэффективная жидкостная хроматография i.OPV - в вакууме, создаваемом масляным насосом Lsg. - раствор MeOH - метанол PPIase - пептидил-пролин-цис-транс-изомераза i.RV - на роторном испарителе i.V. - в вакууме RT - комнатная температура rac - рацемический ent - энантио TFA - трифторуксусная кислота Z - бензилоксикарбонил Пример 1 Синтез N-[1-Boc-пиперидил-4-карбонил] -индолин-2-(R, S)-карбоновая кислота-[S-(N--Boc]-лизинметиловый эфир]-амида Стадия 1: (R,S)-индолин-2-карбоновая кислота, метиловый эфир, хлоргидрат В трехгорлой колбе объемом 100 мл растворяют 5,3 г (32,5 ммоль) (R,S)-2-индолинкарбоновой кислоты в 70 мл абсолютного метанола и смешивают при комнатной температуре с 4,25 г (35,75 ммоль) тионилхлорида. Реакционную смесь желтого цвета нагревают с обратным холодильником в течение 5 ч и после охлаждения растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе (i.V. i. RV). После высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) (i. OPV) получают сырой продукт в виде твердого кристаллического материала, который промывают диэтиловым эфиром и отфильтровывают.

Выход: 5,4 г (78%) Стадия 2: Boc-пиперидин-4-карбоновая кислота B одногорлой колбе объемом 250 мл растворяют 7 г (54 ммоль) пиперидин-4-карбоновой кислоты в 50 мл диоксана и 40,5 мл 2 N NaOH и охлаждают до 0^oC. Затем в течение 30 мин добавляют по каплям раствор 12,99 г (59,4 ммоль) (Boc)₂O в 30 мл диоксана. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч. Выпадает белый осадок. Диоксан удаляют в вакууме на роторном испарителе и осадок обрабатывают насыщенным раствором KHSO₄. Водную фазу экстрагируют два раза EE. Органическую фазу промывают один раз насыщенным раствором NaCl и высушивают над MgSO₄. После удаления растворителей в вакууме на роторном испарителе получают 11,93 г (96%) порошка белого цвета.

¹H-ЯМР (ДМCO-d₆, 270 MHz): 1,25-1,5 (m, 11, Boc, 2-Pip); 1,8 (m, 2 Pip); 2,4 (m, 1, H-C4); 2,8 (t, 2, H-C3, H-C5); 3,8 (d, 2, H-C2, H-C6); 12,25 (s, 1, COOH).

Элементный анализ: рассчитано для C₁₁H₁₉N₁O₄ (229,1): C 57,62; H 8,29; N 6,11, найдено: C 57,89; H 8,36; N 5,86 Стадия 3: N-[1-Boc-пиперидил-4-карбонил]-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота, метиловый эфир 4,6 г (22 ммоль) хлоргидрата(R,S)-индолин-2-карбоновой кислоты и 7,4 г (32 ммоль) Boc-пиперидин-4-карбоновой кислоты растворяют в 50 мл CH₂Cl₂ и прикапывают в течение 30 мин при комнатной температуре к суспензии, содержащей 9,27 г (36 ммоль) 2-хлор-1-метилпиридинийиодида и 8,06 мл (58 ммоль) триэтиламина в 40 мл CH₂Cl₂. Затем реакционную смесь нагревают с обратным холодильником в течение 8 ч. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе, остаток обрабатывают 200 мл ЕЕ и органическую фазу промывают один раз водой, два раза водным полунасыщенным раствором KHSO₄, два раза водным 2N NaOH и один раз водным насыщенным раствором NaCl. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе и остаток подвергают очистке путем хроматографии на 400 г кизельгеля с использованием в качестве элюента смеси CH₂Cl₂/MeOH, 95: 5. После удаления растворителя в вакууме на роторном испарителе и высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 4,61 г (54%) порошка светло-коричневого цвета.

Т. пл. 54-56^oC ТСХ: CH₂Cl₂/MeOH, 95:5 R_f = 0,61 ¹H-ЯМР (ДМСО-d⁶ 270 MHz): 1,35-1,85 (m, 15, Boc, 6 Pip); 2,7-2,8 (m, 2, H-C3, H-C5); 3,25 (m, 1, H-C3-lnd); 3,65 (m, 1, H-C3'-Ind); 3,8 (s, 3, COOCH₃); 3,95 (m, 2, H-C6-Pip); 5,45 (d, 1, H-C2-Ind); 7,05 (m, 1, Ar); 7,1-7,3 (m, 2, Ar); 8,1 (d, 1, Ar).

Элементный анализ: рассчитано для C₂₁H₂₈N₂O₅ (388,47): C 64,92; H 7,27; N 7,21, найдено: C 65,20; H 7,49; N 7,38.

Масс-спектрометрия: (ESI+): рассчитано 388,3, найдено 389,2 Стадия 4: N-[1-Boc-пиперидил-4-карбонил] -индолин-2-(R, S)-карбоновая кислота B одногорлой колбе объемом 50 мл растворяют 3,3 г (8,51 ммоль) метилового эфира N-[1-Boc-пиперидил-4-карбонил]-индолин-2- (R,S)-карбоновой кислоты в 25 мл MeOH, добавляют 2,14 г (51 ммоль) LiOHH₂O и перемешивают при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Раствор подкисляют полунасыщенным водным раствором KHSO₄ до pH 5 и два раза экстрагируют ЕЕ. Органическую фазу промывают один раз насыщенным раствором NaCl, высушивают над MgSO₄ и растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе. После высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 3,09 г (97%) порошка светло-коричневого цвета.

Т пл. 118-119^oС ТСХ: CH₂Cl₂/MeOH, 95:5 R_f = 0,14 ¹H-ЯМР (DMCO-d₆, 270 MHz): 1,35-1,85 (m, 15, Boc, 6 Pip); 2,7-2,85 (m, 2, H-C3, H-C5); 3,2 (m, 1, H-C3-Ind); 3,65 (m, 1, H-C3'-Ind); 3,95 (m, 2, H-C6-Pip); 5,45 (d, 1, H-C2-Ind); 7,05 (m, 1, Ar); 7,1-7,3 (m, 2, Ar); 8,1 (d, 1, Ar); 13,0-13,3 (s, 1, COOH).

Масс-спектрометрия: (ESI+): рассчитано 374,3; найдено 375,1.

Стадия 5: N-[1-Boc-пиперидил-4-карбонил]-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота-[S-(N--Boc)-лизинметиловый эфир]-амид.

2 г (5,35 ммоль) N-[1-Boc-пиперидил-4-карбонил]-индолин-2- (R,S)-карбоновой кислоты и 1,59 г (5,35 ммоль) хлоргидрата метилового эфира N--Boc-лизина растворяют в 20 мл CH₂Cl₂ и прикапывают в течение 30 мин при комнатной температуре к суспензии, содержащей 2,81 г (11 ммоль) 2-хлор-1-метилпиридинийиодида и 1,62 г (16 ммоль) триэтиламина в 30 мл CH₂Cl₂. Затем реакционную смесь нагревают с обратным холодильником в течение 8 ч. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе, остаток обрабатывают 200 мл ЕЕ и органическую фазу промывают один раз водой, два раза полунасыщенным водным раствором KHSO₄, два раза водным раствором 2N NaOH и один раз насыщенным водным раствором NaCl. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе и остаток подвергают очистке путем хроматографии на 400 г кизельгеля с использованием в качестве элюента CH₂Cl₂/MeOH, 95:5. После удаления растворителей в вакууме на роторном испарителе и высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 2,61 г (79%) порошка светло-коричневого цвета.

Т. пл. 83-84^oС ТСХ: CH₂Cl₂/MeOH, 95:5 R_f = 0,48 ИК-спектрометрия (FT-IR) (KBr): 3365 сл.(N-H): 2976 сл. (C-H); 1744 ср. (C= O); 1684 с. (CONH); 1540 сл. (C-O); 1407 ср. (C-H); 1170 с. (C-O); 755 ср. (C=C).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 270 MHz): 1,25-1,9 (m, 28, 18 Boc+3 CH₂-Lys+4 Pip); 2,7-3,05 (m, 5, -CH₂-Lys + H-C3-lnd + 2 Pip); 3,55-3,7 (m, 3, COOMe); 3,9-4,1 (m, 2, Pip); 4,15-4,3 (m, 1, H-C3-Ind); 5,15 (m, 1, H-C2-Ind); 6,8 (m, 1, Ar-Ind); 7,0 (m, 1, Ar-Ind); 7,1-7,3 (m, 2, Ar-Ind+ -NHCO); 8,1 (d, 1, Ar-Ind); 8,7-8,9 (dd, 1, NHCO-Boc).

Масс-спектрометрия: (ESI+): рассчитано 616,4, найдено 617,5.

ВЭЖХ: два пика с временами удерживания 24,25 и 24,63 мин.

Элементный анализ: рассчитано для C₃₂H₄₈N₄O₈ (616,4): C 62,34; H 7,47; N 9,09, найдено: C 62,08; H 7,67; N 8,86.

Пример 2 Синтез N-[1-пиперидил-4-карбонил] -индолин-2-(R, S)-карбоновая кислота- [S-(-NH₂-лизинметиловый эфир]-амида В одногорлой колбе объемом 25 мл растворяют 500 мг (0,812 ммоль) N-[1-Boc-пиперидил-4-карбонил] -индолин-2-(R, S)-карбоновая кислота-[S-(N--Boc)-лизинметиловый эфир]-амида в 2,8 мл CH₂Cl₂. К полученному раствору добавляют 15 эквивалентов (0,0122 моль, 0,93 мл) трифторуксусной кислоты и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. К раствору добавляют 10 мл диэтилового эфира, при этом выпадает белый осадок, который отфильтровывают и промывают 6 раз диэтиловым эфиром. После высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 513 мг (98%) порошка белого цвета.

Т. пл.: 164-165^oС ТСХ (обратно-фазная): CH₃CN/H₂O, 1:1, 1% ТФУ, R_f = 0,61.

ИК-спектрометрия (KBr): 3435 сл. (N-H); 3049 сл. (C-H); 1740 сл. (C=O); 1676 c. (CONH); 1420 ср. (C-H); 1205 ср., 1135 с. (C-O).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 270 MHz): 1,2-2,05 (m, 10, 3CH₂, -Lys + 4Pip); 2,7-3,15 (m, 5, -CH₂ - Lys + H-C3-Ind + 2Pip); 3,55-3,7 (m, 3, COOMe); 4,1 - 4,25 (m, 1, C3-Ind); 5,15 (d, 1, H-C2-lnd); 6,95 (m, 1, Ar-Ind); 7,1-7,3 (m, 2, Ar-Ind); 7,7-7,85 (s, 3, NH₃⁺); 8,1 (d, 1, Ar-Ind); 8,7-8,9 (m, 2, NH₂⁺).

Масс-спектрометрия: (ESI+): рассчитано 418,2, найдено 417,3 и 209,1 для m/2.

ВЭЖХ: 2 пика с временами удерживания 11,54 и 12,65 мин.

Пример 3 Синтез N-[1-Boc-индолин-2-(R, S)-карбонил] -индолин-2-(R,S)- карбоновая кислота-[S-(N---Boc)-лизинметиловый эфир]-амида Стадия 1: Boc-(R,S)-индолин-2-карбоновая кислота B одногорлой колбе объемом 250 мл растворяют 5 г (30,8 ммоль) (R,S)-индолин-2-карбоновой кислоты в 30 мл диоксана и 23 мл 2N NaOH и охлаждают до 0^oC. К полученному раствору добавляют по каплям в течение 30 мин раствор 7,39 г (33,9 моль) (Boc)₂O в 20 мл диоксана и перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч. Выпадает белый осадок. Диоксан удаляют в вакууме на роторном испарителе, остаток обрабатывают насыщенным раствором KHSO₄ и экстрагируют два раза ЕЕ. Органическую фазу промывают один раз насыщенным раствором NaCl и высушивают над MgSO₄. После удаления растворителя в вакууме на роторном испарителе и высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 7,76 г (96%) порошка коричневого цвета.

ТСХ: CH₂Cl₂/MeOH, 95:5 + 1% NEt₃ R_f = 0,91 ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 270 MHz): 1,4-1,7 (s, 9, Boc); 3,1 (m, 1, H-C3); 3,5 (m, 1, H-C3'); 4,9 (m, 1, H-C2); 7,0 (m, 1, Ar); 7,1-7,3 (m, 2, Ar); 7,5-7,9 (m, 1, Ar); 11,5 (m, 1, COOH).

Элементный анализ: рассчитано для C₁₄H₁₇N₁O₄ (263,2) C 63,88; H 6,46; N 5,32, найдено: C 64,05; H 6,53; N 5,41.

Стадия 2: Метиловый эфир N-[Boc-индолин-2-(R,S)-карбонил]-индолин-2-(R, S-карбоновой кислоты 5 г (0,023 моль) хлоргидрата метилового эфира (R,S)-индолин-2-карбоновой кислоты и 12,11 г (46 ммоль) Boc-индолин-2(R,S)-карбоновой кислоты растворяют в 40 мл CH₂Cl₂ и полученный раствор добавляют по каплям в течение 30 мин при комнатной температуре к суспензии, содержащей 12,92 г (51 ммоль) 2-хлор-1-метилпиридинийиодида и 10,23 мл (74 ммоль) триэтиламина в 40 мл CH₂Cl₂. Затем реакционную смесь нагревают с обратным холодильником в течение 8 ч. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе и остаток обрабатывают 200 мл ЕЕ, органическую фазу промывают один раз водой, два раза полунасыщенным водным раствором KHSO₄, два раза водным 2N NaOH и один раз насыщенным водным раствором NaCl. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе и остаток подвергают очистке путем хроматографии на 400 г кизельгеля с использованием в качестве элюента CH₂Cl₂/MeOH, 95:5. После удаления растворителей в вакууме на роторном испарителе и высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 5,01 г (51%) порошка темно-коричневого цвета.

Т. пл.: 86^oC ТСХ: CH₂Cl₂/MeOH, 95:5 R_f = 0,67 и 0,7 ИК-спектрометрия: (KBr): 3448 сл. (N-Н); 2976 сл. (C-Н); 1751 с., 1707 c. (C = O); 1680 c.(CONH): 1485 c. (C-H): 1168 cp. (C-O): 1020 cp. (C-O); 752 c. (C=C).

Масс-спектрометрия: (ESI+) рассчитано 422,4, найдено 423,3.

Элементный анализ: рассчитано для C₂₄H₂₆N₂O₅ (422,4): C 68,25; H 6,16; N 6,64, найдено: C 67,96; H 6,17; N 6,4.

Стадия 3: N-[1-Вос-индолин-2-(R,S)-карбонил]-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота В одногорлой колбе объемом 50 мл растворяют 2,84 г (6,77 ммоль) метилового эфира N-[1-Вос-индолин-2-(R,S)-карбонил]-индолин-2-(R,S)-карбоновой кислоты в 20 мл MeOH. К полученному раствору добавляют 1,71 г (41 ммоль) LiOHH₂O и перемешивают при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Затем раствор подкисляют полунасыщенным раствором KHSO₄ pH 5 и экстрагируют два раза ЕЕ. Органическую фазу промывают один раз насыщенным раствором NaCl, высушивают над MgSO₄ и удаляют растворитель в вакууме на роторном испарителе. После высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 2,71 г (98%) порошка темно-коричневого цвета.

Т. пл.: 118-119^oC ТСХ: CH₂Cl₂/MeOH, 95:5 R_f = 0,14 Масс-спектрометрия: (ESI+) рассчитано 408,2, найдено 409,3.

Стадия 4: N-[1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбонил]-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота-[S-(N--Boc)-лизин-метиловый эфир]-амид 2 г (4,9 ммоль) N-[1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбонил]-индолин-2- (R,S)-карбоновой кислоты и 1,45 г (4,9 ммоль) хлоргидрата метилового эфира N--Boc-S-лизина растворяют в 20 мл CH₂Cl₂ и прикапывают при комнатной температуре в течение 30 мин к суспензии, содержащей 2,51 г (9,8 ммоль) 2-хлор-1-метилпиридинийиодида и 2,04 мл (14,7 ммоль) триэтиламина в 30 мл CH₂Cl₂. Затем нагревают с обратным холодильником в течение 8 ч. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе, остаток обрабатывают 200 мл ЕЕ и органическую фазу промывают один раз водой, два раза полунасыщенным водным раствором KHSO₄, два раза водным раствором 2N NaOH и один раз водным насыщенным раствором NaCl. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе и остаток подвергают очистке путем хроматографии на 400 г кизельгеля с использованием в качестве элюента CH₂Cl₂/MeOH, 95:5. После удаления растворителя в вакууме на роторном испарителе и высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 2,21 г (69%) порошка коричневого цвета.

Т.пл.: 78-80^oC ТСХ: CH₂Cl₂/MeOH, 95:5 R_f = 0,51 ИК-спектрометрия: (KBr) 3504 сл. (N-H); 2975 сл. (C-H); 1749 с., 1690 c. (CONH, C=O); 1490 c.(C-H); 1407 cp. (C-H); 1170 c. (C-O); 757 ср. (C-C).

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 270 MHz): 1,2-1,8 (m, 24, 18 Boc, 3 CH₂-Lys); 2,8-3,0 (m, 3, -CH₂-Lys, H-C3-Ind); 3,0-3,2 (m, 1, H-C3-Ind); 3,4-3,5 (m, 1, H-C3-Ind); 3,5-3,7 (m, 3, COOMe); 4,2-4,3 (m, 1, H-C3-Ind); 4,7-4,9 (m, 1, H-C2-Ind); 5,0-5,5 (m, 1, H-C2-Ind); 6,7-6,8 (m, 1, Ar-Ind); 6,85-7,3 (m, 6, Ar-Ind); 7,7-8,9 (m, 3, NHCO, Ar-Ind, -NHCO).

Масс-спектрометрия: (ESI+) рассчитано 650,2, найдено 651,4.

ВЭЖХ: 4 пика с временами удерживания 24,82 мин, 29,9 мин, 30,3 мин, 31,2 мин.

Пример 4 Синтез N-[индолин-2-(R, S)-карбонил] -индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота-[S-(-NH₂)-лизинметиловый эфир]-амида В одногорлой колбе объемом 25 мл растворяют 500 мг (0,812 ммоль) N-[1-Boc-индолин-2-(R, S)-карбонил] -индолин-2-(R, S)-карбоновая кислота-[S-(N--Boc)-лизинметиловый эфир] -амида в 2,8 мл CH₂Cl₂. К полученному раствору добавляют 15 эквивалентов (0,0122 моль, 0,93 мл) трифторуксусной кислоты и перемешивают два часа при комнатной температуре. К раствору добавляют 10 мл диэтилового эфира, выпадает белый осадок, который отфильтровывают и промывают 6 раз диэтиловым эфиром. После высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 513 мг (98%) порошка белого цвета.

Т. пл.: 164-165^oC ТСХ (обращенно-фазовая): CH₃CN/H₂О, 1:1, 1% ТФУ, R_f = 0,61 ИК-спектроскопия: (KBr) 3435 сл. (N-H); 3049 сл. (C-H); 1740 сл. (C=O); 1676 c. (CONH); 1420 ср. (C-H); 1205 ср., 1135 с. (C-O).

¹H-ЯМР (ДМСО-d⁶, 270 MHz): 1,2-2,05 (m, 10, 3 CH₂-Lys + 4 Pip); 2,7-3,15 (m, 5, -CH₂-Lys + H-C3-Ind + 2 Pip); 3,55-3,7 (m, 3, COOMe); 4,1-4,25 (m, 1, C3-Ind); 5,15 (d, 1, H-C2-Ind); 6,95 (m, 1,Ar-Ind); 7,1-7,3 (m, 2, Ar-Ind); 7,7-7,85 (s, 3, NH₃⁺); 8,1 (d, 1, Ar-Ind); 8,7-8,9 (m, 2, NH₃⁺).

Масс-спектрометрия: (ESI+) рассчитано 418,2, найдено 417,3 и 209,1 для m/2.

ВЭЖХ: 2 пика с временами удерживания 11,54 мин и 12,65 мин.

Пример 5 Синтез N-[1-Boc-индолин-2-(R, S)-карбонил] -индолин-2-(R, S)-карбоновая кислота-(S-(N--Z)-лизинметиловый эфир)-амида 2,5 г (6,13 ммоль) N-[1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбонил]-индолин-2-(R,S)-карбоновой кислоты и 2,03 г (6,13 ммоль) хлоргидрата метилового эфира N--Z-лизина растворяют в 20 мл CH₂Cl₂ и добавляют при комнатной температуре в течение 30 мин к суспензии, содержащей 2,35 г (9,2 ммоль) 2-хлор-1-метилпиридинийиодида и 2,13 мл (15 ммоль) триэтиламина в 30 мл CH₂Cl₂. Затем смесь кипятят с обратным холодильником в течение 8 ч. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе, остаток обрабатывают 200 мл ЕЕ и органическую фазу промывают один раз водой, два раза полунасыщенным раствором KHSO₄, два раза раствором 2N NaOH и один раз насыщенным раствором NaCl. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе и остаток подвергают очистке путем хроматографии на 400 г кизельгеля с использованием в качестве элюента CH₂Cl₂/MeOH, 95:5. После удаления растворителя в вакууме на роторном испарителе и высушивании в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 2,57 г (61%) порошка коричневого цвета.

Т.пл.: 68^oС ТСХ: CH₂Cl₂/MeOH, 95:5 R_f = 0,48.

ИК-спектрометрия: (KBr) 3329 сл. (N-H); 2935 сл. (C-H); 1701 с. (C=O); 1485 с. (C-H); 1260 ср. (C-O); 1149 ср., 1020 ср. (C-O); 753 ср. (C=C).

Масс-спектрометрия: (ESI+) рассчитано 684,5, найдено 685,4 Элементный анализ: (рассчитано для C₃₈H₄₄N₄O₈ (684,5): C 66,67; H 6,43; N 8,19, найдено: C 64,15; H 6,5; N 7,88.

Пример 6 Синтез 1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота-(S-(N--Z)- лизинметиловый эфир)-амида 6,36 г (0,0242 моль) 1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбоновой кислоты и 8,0 г (24,2 ммоль) хлоргидрата метилового эфира N--Z-лизина растворяют в 70 мл CH₂Cl₂ и прикапывают в течение 30 мин при комнатной температуре к суспензии, содержащей 9,27 г (36,3 ммоль) 2-хлор-1-метилпиридинийиодида и 8,41 мл (60,4 ммоль) триэтиламина в 60 мл CH₂Cl₂. Затем реакционную смесь нагревают с обратным холодильником в течение 8 ч. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе, остаток обрабатывают 200 мл ЕЕ и органическую фазу промывают один раз водой, два раза полунасыщенным водным раствором KHSO₄, два раза водным раствором 2N NaOH и один раз насыщенным водным раствором NaCl. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе и остаток подвергают очистке путем хроматографии на 400 г кизельгеля с использованием в качестве элюента CH₂Cl₂/MeOH, 95: 5. После удаления растворителей в вакууме на роторном испарителе и высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 10,91 г (84%) порошка светло-коричневого цвета.

ТСХ: CH₂Cl₂/MeOH 95:5, R_f = 0,74 ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 270 MHz): 1,3-1,75 (m, 15, 9 Boc + 6 CH₂ - Lys); 2,8-3,0 (m, 3, CH₂ - Lys + H-C3-Ind); 3,4-3,55 (m, 1, H-C3'-Ind); 3,65 (s, 3, COОCH₃), 4,2 (m, 1, H-C-Lys); 4,8 (m, 1, H-C2-Ind); 5,0 (s, 2, CH₂-Z); 6,85 (m, 1, Ar-Ind); 7,15 (t, 2, Ar-Ind); 7,2-7,4 (m, 5, Ph-Z); 7,7 (m, 1, NHCO); 8,4 (m, 1, Ar-Ind).

Элементный анализ: рассчитано для C₂₉H₃₇N₃O₇ (539,4): C 64,56; H 6,86; N 7,79, найдено: C 64,61; H 7,06; N 7,67.

Масс-спектрометрия: (ESI+) рассчитано: 539,4, найдено: 540,3.

Пример 7 Синтез 1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбоновая кислота-(3-фенилаланинметиловый эфир)-амида Стадия 1: Хлоргидрат метилового эфира S-фенилаланина B одногорлую колбу объемом 100 мл прикапывают 5,3 мл (72,6 ммоль) тионилхлорида в течение 30 мин при комнатной температуре к суспензии, содержащей 8,0 г (48,4 ммоль) S-фенилаланина в 50 мл MeOH. Затем смесь нагревают с обратным холодильником в течение 3 ч. Метанол и избыточный тионилхлорид отгоняют сначала на водоструйном насосе, а затем на роторном испарителе. Остаток растворяют в 50 мл MeOH и смешивают с 800 мл диэтилового эфира. Выпадает белый осадок, который отфильтровывают.

Получают 7,93 г (75%) порошка белого цвета.

¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 270 MHz): 3,0-3,2 (m, 2, CH₂); 3,65 (s, 3, COOMe); 4,35 (m, 1, H-C); 7,2-7,4 (m, 5, Ph); 8,5-8,7 (m, 3, NH₃⁺).

Стадия 2: N-[1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбонил]-(S-фенилаланинметиловый эфир)-амид 3,5 г (16,2 ммоль) хлоргидрата метилового эфира S-фенилаланина и 4,27 г (0,0162 ммоль) 1-Boc-индолин-2-(R,S)-карбоновой кислоты растворяют в 70 мл CH₂Cl₂ и прикапывают в течение 30 мин при комнатной температуре к суспензии, содержащей 6,21 г (24,3 ммоль) 2-хлор-1-метилпиридинийиодида и 5,32 мл (40,5 ммоль) триэтиламина в 60 мл CH₂Cl₂. Затем реакционную смесь нагревают с обратным холодильником в течение 8 ч. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе, остаток обрабатывают 200 мл ЕЕ и органическую фазу промывают один раз водой, два раза полунасыщенным водным раствором KHSO₄, два раза водным раствором 2N NaOH и один раз насыщенным водным раствором NaCl. Растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе и остаток подвергают очистке путем хроматографии на 400 г кизельгеля с использованием в качестве элюента CH₂Cl₂/MeOH, 95:5. После удаления растворителей в вакууме на роторном испарителе и высушивания в высоком вакууме (с использованием масляного насоса) получают 7,71 г (62%) порошка светло-желтого цвета.

ТСХ: CH₂Cl₂/MeOH, 95:5 R_f = 0,87 ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆, 270 MHz): 1,2-1,5 (m, 9, Boc); 2,3-2,45 (m, 0,5, H-C3-Ind); 2,8-3,5 (m, 3,5, C3-Ind + CH₂); 3,65 (d, 3, COOMe); 4,4-4,65 (m, 1, C2-Ind); 4,8 (m, 1, H-C); 6,8-7,3 (m, 8,5 Ph + 3 Ar-Ind); 7,7 (m, 1, Ar-Ind); 8,55 (m, 1, NH).

Элементный анализ: рассчитано для C₂₄H₂₈N₂O₅ (424,3) C 67,92; H 6,6; N 6,6? найдено: C 67,94; H 6,79; N 6,59.

Масс-спектрометрия: (ESI+): рассчитано 424,4, найдено 425,2.

Пример 8 Синтез метилового эфира N-[N'-(4-метоксифенилацетил)-пиперидил-4-карбонил] -индолин-2-(R, S)-карбоновой кислоты (это соединение может быть использовано в качестве исходного для получения амидов с общей формулой I) 1,2 г (3,0 ммоль) метилового эфира N-[1-Boc-пиперидил-4-карбонил]-индолин-2-(R, S)-карбоновой кислоты растворяют в 30 мл CH₂Cl₂ при комнатной температуре, смешивают с 1,14 г (10 ммоль) ТФУ и перемешивают в течение 24 ч. Реакционную смесь упаривают в вакууме на роторном испарителе, обрабатывают 100 мл ЕЕ и промывают 3 раза насыщенным водным раствором NaHCO₃ и 1 раз насыщенным водным раствором NaCl. Органическую фазу сушат над MgSO₄ и растворитель удаляют в вакууме на роторном испарителе. Остаток растворяют в 30 мл CH₂Cl₂, смешивают с 1,01 г (10 ммоль) триэтиламина и 366 мг (3,0 ммоль) 4-диметиламинопиридина, охлаждают до 0^oC и смешивают с раствором 606 мг (3,3 ммоль) 4-метоксифенилацетилхлорида в 10 мл CH₂Cl₂. После перемешивания в течение 24 ч реакционную смесь упаривают на роторном испарителе, обрабатывают 100 мл эфира уксусной кислоты и промывают два раза раствором 1 н. HCl, два раза насыщенным водным раствором NaHCO₃ и один раз насыщенным водным раствором NaCl. Затем растворители отгоняют в вакууме на роторном испарителе и остаток хроматографируют на 80 г Flashgel (кизельгеля Flash) с использованием в качестве элюента н-гексан/AcOEt. Соответствующие фракции собирают и упаривают на роторном испарителе с последующим высушиванием в высоком вакууме (с использованием масляного насоса). Получают 1,1 г продукта в виде пены белого цвета.

ТСХ: AcOEt, R_f = 0,22 ¹H-ЯМР (ДМСО-d₆ 270 MHz): 1,35-1,85 (m, 13, Boc, 4 Pip); 2,7-2,8 (m, 4, H-C(3), H-C(5)); 3,25 (m, 1, H-C(3)-Ind); 3,65 (m, 1, H-C(3')-Ind); 3,8 (s, 3, COОCH₃); 3,95 (m, 1, H-C(4)-Pip); 5,45 (d, 1, H-C(2)-Ind); 7,05 (m, 1, Ar); 7,1-7,3 (m, 2, Ar); 8,1 (d, 1, Ar).

Элементный ана