Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат

Фракция кератансульфатолигосахаридов и содержащий ее фармацевтический препарат

Реферат

 

Фармацевтический препарат содержит фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и в качестве активного ингредиента - эффективное количество кератансульфатолигосахарида с двумя-пятью сахаридными звеньями, сульфатированными N-ацетилглюкозамином на своем редуцирующем конце, с сульфатированным N-ацетиллактозаминным звеном, необязательно содержащим сиаловую кислоту и/или фукозу, имеющего, по меньшей мере, две сульфатированных гидроксильных группы в молекуле, и/или его фармацевтически приемлемой соли. Предпочтительно кератансульфатолигосахарид содержит в качестве составного ингредиента, по меньшей мере, дисахарид формулы Gal(6S) - GlcNAc(6S), где Gal представляет галактозу, GlcN представляет глюкозамин, Ас представляет ацетильную группу и 6S представляет 6-О-сульфатный эфир. Фармацевтический препарат обладает противовоспалительным, противоаллергическим, иммуномодулирующим, индуцирующим апоптоз и клеточную дифференцировку действием. Технический результат заключается в реализации указанного назначения. 3 с. и 18 з.п.ф-лы, 11 табл., 22 ил.

Настоящее изобретение относится к противовоспалительному средству, противоаллергическому средству, иммуномодулятору, индуктору клеточной дифференцировки, индуктору апоптоза и кератансульфатолигосахариду, который может использоваться в качестве активного ингредиента в указанных фармацевтических препаратах.

Предпосылки создания изобретения Кератансульфат представляет собой гликозаминогликан, содержащий N-ацетиллактозамин в качестве основной структуры, у которой в положении C-6N-ацетилглюкозаминового остатка имеется О-сульфатированная гидроксильная группа. В частности, известно, что высокосульфатированный кератансульфат, который кроме положения C-6N-ацетилглюкозаминового остатка содержит сульфатировнную гидроксильную группу в структурном дисахаридном звене, содержится в хрящевых рыбах, таких как акулы, и в хрящах, костях и роговице млекопитающих, таких как киты и жвачные животные. Сообщается о способе получения кератансульфатолигосахарида, являющегося продуктом расщепления кератансульфата, который включает воздействие расщепляющего кератансульфат фермента (кератаназа II); выложенная заявка на патент Японии N 2-57182), полученного из микроорганизмов, относящихся к Bacillus, на кератансульфат.

Кроме того, есть сообщение (Biochemistry, 33, 4836-4846 (1994)), в котором дается анализ 25 видов олигосахаридных фракций, полученных путем фракционирования продуктов расщепления после расщепления кератаназой II кератансульфата, полученного из коровьих хрящей, и предлагается структура тетрасульфатированного N-ацетиллактозаминатетрасахарида, представленного следующей формулой (I) (называемого здесь далее также "кератансульфаттетрасахаридом (I)"), трисульфатированного N-ацетиллактозаминопентасахарида, представленного следующей формулой (II) (называемого здесь далее также "кератансульфатпентасахаридом (II)"), дисульфатированного N-ацетиллактозаминодисахарида, представленного следующей формулой (III) (называемого здесь далее также "кератансульфатдисахаридом (III)"), и т.п.: Gal(6S) 1-4 GlcNAc(6S) 1-3 Gal(6S) 1-4 GlcNAc(6S).....(I) NeuAc~Gal 1-4 GlcNAc(6S) 1-3 Gal(6S) 1-4 GlcNAc(6S)...(II) Gal(6S) 1-4 GlcNAc(6S)... (III) (В приведенных выше формулах Gal представляет галактозу, GlcN представляет глюкозамин, Neu представляет нейраминовую кислоту, Ac представляет ацетильную группу, и 6S представляет 6-O-сульфатный эфир. "~" представляет связь 2, 3 или связь 2, 6).

Однако до настоящего времени не было сообщений, относящихся к эффективному массовому получению чистого кератансульфатолигосахарида, в особенности кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) и кератансульфатдисахарида (III), без загрязнения примесями (например, эндотоксинами, нуклеиновыми кислотами, белками, протеазами, другими гликозаминогликанами, исключая кератансульфатолигосахарид и тому подобное). Загрязнение такими примесями рассматривается как серьезный недостаток, особенно в случае, когда кератансульфатолигосахариды используют в качестве фармацевтических препаратов. Кроме того, о фармакологическом действии кератансульфатолигосахаридов (в частности, противовоспалительном действии, противоаллергическом действии, иммуномодуляторном действии, индуцирующем клеточную дифференцировку действии и индуцирующем апоптоз действии) ничего не известно.

Описание изобретения На основе вышеуказанного осуществляют настоящее изобретение и его целью является применение кератансульфатолигосахарида, по существу не содержащего примеси, в качестве противовоспалительного средства, противоаллергического средства, иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки (называемых здесь далее также "индукторами дифференцировки") или индуктора апоптоза.

Чтобы достичь указанной выше цели, заявители провели кропотливые исследования фармакологического действия олигосахарида, который содержит от двух до пяти сахаридных звеньев, в частности дисахарида, тетрасахарида или пентасахарида, полученного из продуктов расщепления, которые получаются при расщеплении высокосульфатированного кератансульфата расщепляющим кератансульфат ферментом, и в результате обнаружили, что описанный выше олигосахарид и его соли обладают превосходным противовоспалительным действием, противоаллергическим действием и иммуномодулирующим действием, индуцирующим клеточную дифференцировку действием и индуцирующим апоптоз действием. Таким образом осуществляют настоящее изобретение.

А именно противовоспалительное средство, противоаллергическое средство, иммуномодулятор, индуктор дифференцировки и индуктор апоптоза по настоящему изобретению (называемые здесь далее также обобщенно "фармацевтические препараты по настоящему изобретению") содержат кератансульфатолигосахарид и/или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента. В настоящем описании "кератансульфатолигосахарид" означает продукт расщепления кератансульфата, который можно получить путем расщепления кератансульфата расщепляющим кератансульфат ферментом типа эндо- -N-ацетилглюкозаминидазы.

Примерами кератансульфатолигосахаридов, используемых для фармацевтических препаратов по настоящему изобретению, являются кератансульфатолигосахарид, который содержит сульфатированное N-ацетиллактозаминовое звено, необязательно содержащее сиаловую кислоту и/или фукозу, кератансульфатолигосахарид, который содержит олигосахарид с двумя-пятью сахаридными звеньями и имеет сульфатированный N-ацетилгликозамин на своем редуцирующем конце, и в молекуле которых сульфатированы, по меньшей мере, две гидроксильные группы, и, в частности, кератансульфатолигосахарид, описанный выше, который содержит в качестве структурного компонента, по меньшей мере, дисахарид, представленный формулой Gal(6S)-GlcNAc(6S) (где Gal представляет галактозу, GlcN представляет глюкозамин. Ac представляет ацетильную группу и 6S представляет 6-O-сульфатный эфир). Более того, предпочтительным примером кератансульфатолигосахарида, описанного выше, является тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный следующей формулой (I), трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой (II), дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой (III) и т. п.: Gal(6S) 1-4 GlcNAc(6S) 1-3 Gal(6S) 1-4 GlcNAc(6S)...(I) NeuAc~Gal 1-4 GlcNAc(6S) 1-3 Gal(6S) 1-4 GlcNAc(6S)...(II) Gal(6S) 1-4 GlcNAc(6S)... (III) (В приведенных выше формулах Gal представляет галактозу, GlcN представляет глюкозамин, Neu представляет нейраминовую кислоту. Ac представляет ацетильную группу и 6S представляет 6-O-сульфатный эфир. И ~ представляет связь 2, 3 или связь 2, 6).

Настоящее изобретение также относится к фракции кератансульфатолигосахарида, содержащей не менее 99% кератансульфатолигосахарида, который содержит олигосахарид с двумя-пятью сахаридными звеньями и сульфатированный N-ацетилгликозамин на своем редуцирующем конце, в молекулах которых сульфатированы, по меньшей мере, две гидроксильные группы, и обладающие следующими свойствами: (а) фракция по существу не содержит эндотоксин, а содержание нуклеиновых кислот, белков и протеаз во фракции меньше относительно пределов их обнаружения; и (б) фракция по существу не содержит гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфат, дерматансульфат, гепарансульфат и кератансульфат.

Настоящее изобретение также относится к фракции кератансульфатолигосахарида, содержащей не менее 99% кератансульфатолигосахарида, который содержит в качестве структурного компонента, по меньшей мере, дисахарид, представленный формулой Gal (6S)-GlcNAc (6S), и обладающий свойствами (а) и (б), описанными выше. Также предпочтительным примером кератансульфатолигосахарида, содержащегося в описанных выше олигосахаридных фракциях, является тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминатетрасахарид, представленный формулой (I), трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой (II), дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой (III), и т.п. Кроме того, кератансульфатолигосахарид включает кератансульфатолигосахарид, полученный путем фракционирования продуктов расщепления высокосульфатированного кератансульфата, получаемого из хрящевых рыб, расщепляющим кератансульфаты ферментом типа эндо- -N-ацетилглюкозаминидазы.

Настоящее изобретение также относится к способу получения фракции кератансульфатолигосахарида, включающему стадии расщепления кератансульфата расщепляющим кератансульфаты ферментом, обладающим следующими физическими и химическими свойствами: (1) действие: расщепляющий фермент воздействует на кератансульфат и гидролизует его N-ацетилглюкозаминидную связь; (2) специфичность к веществу: расщепляющий фермент действует на кератансульфат I, кератансульфат II и кератанполисульфат и продуцирует сульфатированный кератансульфатдисахарид и сульфатированный кератансульфаттетрасахарид в качестве основных продуктов расщепления; и предпочтительно обладающий физическими и химическими свойствами: (3) оптимальный pH реакции: расщепляющий фермент имеет оптимальный pH реакции от 4,5 до 6 в 0,1М ацетатном буфере или в 10 мМ трис-ацетатном буфере при 37^oC; (4) pH стабильность: расщепляющий фермент обладает pH стабильностью от 6 до 7, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере или в 10 мМ трис-ацетатном буфере при 37^oC в течение часа; (5) оптимальная температура реакции: расщепляющий фермент имеет оптимальную температуру реакции от 50 до 60^oC, когда расщепляющий фермент реагирует в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение 10 мин; и (6) термоустойчивость: расщепляющий фермент устойчив, по меньшей мере, при 45^oC или ниже, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение часа; и фракционирования из продуктов расщепления фракции кератансульфатолигосахарида, обладающей следующими свойствами: (A) фракция содержит в качестве основного ингредиента кератансульфатолигосахарид, который содержит сульфатированный N-ацетиллактозамин в качестве основной структурной составляющей; (Б) фракция по существу не содержит эндотоксин, и содержание нуклеиновой кислоты, белка и протеазы во фракции является следовым или меньше относительно пределов их обнаружения; и (В) фракция по существу не содержит гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, гепарансульфата и кератансульфата.

Кроме того, при способе получения фракции кератансульфатолигосахарида, описанной выше, например применение высокосульфатированного кератансульфата в качестве соединения кератансульфата дает кератансульфатолигосахарид, содержащий тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный формулой (I), описанной выше, трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой (II), дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой (III), и т.п., в особенности кератансульфатолигосахариды, содержащие тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминотетрасахарид, представленный формулой (I) и дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой (III), в качестве основных ингредиентов.

В настоящем изобретении предпочтительным кератансульфатолигосахаридом, который содержит олигосахарид с двумя-пятью сахаридными звеньями, обычно является олигосахарид, который сульфатирован в двух-четырех позициях. Кроме того, предпочтительно, чтобы в кератансульфатолигосахариде, содержащем сиаловую кислоту, которая может использоваться по настоящему изобретению, сиаловая кислота включает N-ацетилнейраминовую кислоту и N-гликолилнейраминовую кислоту и N-ацетилнейраминовая кислота является предпочтительной. Кератансульфатолигосахарид, который может использоваться по настоящему изобретению, описанный выше, содержит олигосахариды, связывающие сиаловую кислоту по 2,3 связи и по 2,6 связи и, предпочтительно, связывающие сиаловую кислоту по 2,3 связи.

Настоящее изобретение подробно описано далее.

(1) Кератансульфатолигосахарид и фракция кератансульфатолигосахарида, используемые в настоящем изобретении Кератансульфат, который является исходным продуктом для кератансульфатолигосахарида, используемого по настоящему изобретению, содержит, главным образом, повторяющуюся структуру дисахарида галактозы или галактозо-6-сульфата и N-ацетилглюкозамино-6-сульфата, содержание сульфата в котором изменяется в зависимости от вида животного, ткани и т.д., и обычно добывается из такого сырья, как хрящи, кости и роговица хрящевых рыб, таких как акулы и млекопитающих, таких как киты и жвачные животные.

Используемый в качестве исходного вещества кератансульфат является обычно доступным материалом и не имеет особых ограничений, но предпочтителен высокосульфатированный кератансульфат (высокосульфатированный кератансульфат, содержащий от 1,5 до 2 молекул сульфатной группы на структурный дисахарид, упоминается здесь так же как кератанполисульфат), у которого сульфатирован входящий в структуру моносахарид, такой как галактозный остаток. Сульфатная группа, предпочтительно, располагается в положении 6 на галактозном остатке. Такой высокосульфатированный кератансульфат можно получить, например, из протеогликана хрящей хрящевых рыб, таких как акулы. Коммерчески доступный кератансульфат также можно использовать.

Кератансульфатолигосахарид по настоящему изобретению можно получить путем воздействия на кератансульфат расщепляющего кератансульфаты фермента типа эндо- -N-ацетилглюкозаминидазы, например, кератаназы II, получаемой из микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus (выложенная заявка на патент Японии N 2-57182), или нового расщепляющего кератансульфаты фермента, обнаруженного авторами настоящего изобретения в микроорганизме, принадлежащем к роду Bacillus, в буферном растворе и расщепления его, и последующего фракционирования полученных продуктов расщепления. Такую реакцию расщепления проводят, например, в буферном растворе, содержащем кератансульфат в концентрациях от 1,0 до 100 мг/мл при pH от 6,0 до 7,0 при от 25 до 40^oC в течение от 1 до 72 ч. При этой реакции концентрация буфера обычно находится в области от 0,01 до 0,2М. Вид буфера особенно не ограничивают, если его pH можно установить в указанных выше пределах, и к числу таких буферов относятся, например, ацетатный буфер, фосфатный буфер и трис-буфер. Количество фермента, используемого в реакции расщепления, находится, например, в интервале от 0,1 до 1,0 единицы на 1 г кератансульфата. Здесь одна единица означает количество фермента, которое продуцирует редуцирующий конец, соответствующий 1 мкмоль N-ацетилглюкозамина в минуту.

Новый, описанный выше расщепляющий кератансульфат фермент продуцируется микроорганизмом, принадлежащим Bacillus circulans, например Bacillus circulans KsT202, был выделен заявителями, и он обладает превосходной термоустойчивостью. Этот фермент получают путем культивирования Bacillus circulans KsT202 в подходящей среде и очистки фермента от среды и/или микробных клеток методами, принятыми для очистки ферментов. Bacillus circulans KsT202 депонирован в National Institute of Bioscience and Human-Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Япония) 5 сентября 1994 г. под инвентарным номером FERM Р-14516 и затем передан для международного депонирования, согласно Будапештскому договору, 6 ноября 1995 г. , и депонирован под инвентарным номером FERM ВР-5285.

Физические и химические свойства нового расщепляющего кератансульфат фермента, описанного выше, описаны далее.

(1) Действие Расщепляющий фермент действует на кератансульфат и гидролизует его N-ацетилглюкозаминидную связь.

(2) Специфичность к субстрату Расщепляющий фермент действует на кератансульфат I, кератансульфат II и кератанполисульфат и продуцирует сульфатированный кератансульфатдисахарид и кератансульфаттетрасахарид в качестве основных продуктов расщепления. Подтверждено также, что расщепляющий фермент продуцирует сульфатированный кератансульфатпентасахарид.

(3) Оптимальный pH реакции: Расщепляющий фермент имеет оптимальный pH реакции от 4,5 до 6 в 0,1М ацетатном буфере или в 10мМ трис-ацетатном буфере при 37^oC.

(4) pH Стабильность: Расщепляющий фермент обладает pH стабильностью от 6 до 7, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере или в 10мМ трис-ацетатном буфере при 37^oC в течение часа.

(5) Оптимальная температура реакции: Расщепляющий фермент имеет оптимальную температуру реакции от 50 до 60^oC, когда расщепляющий фермент реагирует в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение 10 мин.

(6) Термоустойчивость: Расщепляющий фермент устойчив, по меньшей мере, при 45^oC или ниже, когда расщепляющий фермент остается в 0,1М ацетатном буфере, pH 6,0, в течение часа.

Фракция кератансульфатолигосахарида по настоящему изобретению может быть получена также путем взаимодействия иммобилизованного фермента, расщепляющего кератансульфат, в том числе такого нового расщепляющего кератансульфат фермента и кератаназы II, указанных выше, которые иммобилизованы обычными способами.

В результате реакции расщепления ферментом, как описан выше, кератансульфат расщепляется до олигосахарида.

Затем полученный таким образом олигосахарид отделяют и очищают обычными способами, такими как осаждение этанолом и различные виды хроматографии, и можно получить нужный кератансульфатолигосахарид. Эта очистка будет подробно описана при описании очистки кератансульфатолигосахарида из дисахарида, тетрасахарида и пентасахарида. Описанный выше продукт расщепления обычно концентрируют сначала осаждением этанолом и гель-фильтрацией (интервал фракционированной молекулярной массы от 100 до 10000), чтобы грубо фракционировать сырой кератансульфатолигосахарид из дисахарида, тетрасахарида и пентасахарида. Затем грубые фракции разделяют и фракционируют анионообменной хроматографией соответственно с получением по существу чистых дисахарида, тетрасахарида и пентасахарида, которые по существу не содержат эндотоксина, а содержание нуклеиновых кислот, белков и протеаз в которых меньше пределов их обнаружения и которые по существу не содержат гиалуроновой кислоты, хондроитинсульфата, дерматансульфата, гепарансульфата и кератансульфата. В настоящем изобретении "по существу не содержат" означает такое содержание, которое может быть обнаружено чувствительными методами обнаружения, но не влияет на фармакологические функции кератансульфатолигосахарида, такие как противовоспалительная функция, противоаллергическая функция, иммуномодуляторная функция, функция индуцирования клеточной дифференцировки и функция индуцирования апоптоза.

Кератансульфатолигосахарид по настоящему изобретению получают из кератансульфата в качестве исходного продукта путем расщепления кератансульфата эндо- -N-ацетилглюкозаминидазой и фракционирования олигосахарида из дисахаридных-пентасахаридных звеньев, который по существу не содержит кератансульфата и является для него исходным материалом.

Кератансульфатолигосахарид можно также получить из продуктов расщепления кератансульфата, расщепленного химическим способом, при котором предпочтительно или специфически разрушается связь между галактозой или галактозо-6-сульфатом и N-ацетилглюкозамин-6- сульфатом, которые составляют кератансульфат.

Кератансульфатолигосахарид, особенно тетрасульфатированный N-ацетиллактозаминатетрасахарид, представленный формулой (I), описанной выше, трисульфатированный N-ацетиллактозаминопентасахарид, представленный формулой (II), дисульфатированный N-ацетиллактозаминодисахарид, представленный формулой (III), и т.п., получают, как описано выше. В описанных далее примерах даны спектры ядерного магнитного резонанса (¹H-ЯМР и ¹³C-ЯМР) и результаты масс-спектрометрического анализа при бомбардировке быстрыми атомами веществ, представленных формулами (I), (II) и (III).

Кератансульфатолигосахарид по настоящему изобретению также включает ионизованное вещество, протонированное вещество и фармацевтически приемлемую соль из числа солей с неорганическими основаниями, такими как щелочные металлы (натрий, калий, литий и т.п.), щелочноземельные металлы (кальций и т. п. ), аммоний и т. п., или солей с органическими основаниями, такие как соль диэтаноламина, соль циклогексиламина и соль аминокислоты.

Фармацевтическая композиция, содержащая кератансульфатолигосахарид и/или его соль, применяемые по настоящему изобретению, и носители, разбавители и другие добавки, обычно используемые в фармацевтических препаратах, также является новой и может вводиться с целью противовоспалительного, противоаллергического, иммуномодулирующего действия, с целью индуцирования клеточной дифференцировки, индуцирования апоптоза и т.п.

Фракция кератансульфатолигосахарида по настоящему изобретению содержит по меньшей мере 99% кератансульфатолигосахарида, который получают из продуктов ферментативного расщепления кератансульфата, удаляя из них эндотоксин, нуклеиновую кислоту, белок, протеазу и другие гликозаминогликаны, за исключением нужного кератансульфатолигосахарида, особенно из продуктов расщепления высокосульфатированного кератансульфата, следуя описанному выше способу.

(2) Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению Кератансульфатолигосахарид и/или его фармацевтически приемлемая соль, описанные выше, могут широко применяться в качестве противовоспалительного средства, противоаллергического средства, иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки, индуктора апоптоза и фармацевтических препаратов для другого применения.

Противовоспалительное средство по настоящему изобретению эффективно при многих заболеваниях, связанных с воспалением, и характерные показания для которого включают хронический ревматоидный артрит, системную красную волчанку, спондилитные изменения, остеоартрит, люмбаго, ремиссию воспаления и гипертрофию после операций и травм, периартериит лопатки, височно-нижечелюстной артроз, тендовагинит, обволакивающее воспаление сухожилий, воспаление мыщелока плечевой кости (теннисный локоть), миалгию, кератоконъюнктивит и подобные воспаления. Противовоспалительное средство настоящего изобретения обладает противовоспалительным действием, таким как аналгезирующее действие, противовоспалительное действие и жаропонижающее действие, при заболеваниях и симптомах, при которых действует кератансульфатолигосахарид и/или его фармацевтически приемлемая соль.

Противовоспалительное средство по настоящему изобретению эффективно при любом заболевании, связанном с аллергией, и конкретные показания для которого включают аллергический ринит, аллергический кератоконъюнктивит, весенний конъюнктивит, экзему, дерматит, крапивницу, атопический дерматит и подобные заболевания.

Иммуномодулятор по настоящему изобретению эффективен при любом заболевании, связанном с иммунным нарушением, и конкретными показаниями для которого являются аутоиммунный лимфопролиферативный синдром человека (Cell 81, 935-946 (1995), Science 268, 1347-1349 (1995)), лимфопролиферативное нарушение (Leukemia and Lymphoma 16, 363-368 (1995), ангиоиммунобластная лимфаденопатия (Blood 85(10), 2862-2869 (1995)), иммунобластная лимфаденопатия (The American Journal of Medicine 63, 849-851 (1977)), хронический ревматоидный артрит, системная красная волчанка, дискоидная красная волчанка, дерматомиозит (дерматомиома), склеродермия, смешанная диффузная болезнь соединительной ткани, хронический тиреоидит, первичная микседема, тиреотоксикоз, пернициозная анемия, сочетание пневмопатии с тяжелой анемией, острый прогрессирующий гломерулонефрит, миастения gravis, обыкновенная пузырчатка, буллезный пемфигоид, инсулиннезависимый сахарный диабет, ювенильный сахарный диабет, болезнь Адиссона, атрофический гастрит, мужская стерильность, климактерический прекокс (precox), факогенный увеит, симпатический ангиит, рассеянный склероз, прогрессирующий системный склероз, воспалительное заболевание кишечника (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и т.п.), первичный билиарный цирроз, хронический активный гепатит, аутоиммунная гемолитическая анемия, пароксизмальная гемоглобинурия, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, синдром Шегрена, синдром антифосфолипидных антител и подобные заболевания.

Индуктор дифференцировки по настоящему изобретению эффективен при любом заболевании, вызванном недостаточностью физиологической клеточной дифференцировки, иммунным нарушением, злокачественной опухолью и т.п., и конкретными показаниями для которого являются аутоиммунный лимфопролиферативный синдром человека, лимфопролиферативное нарушение, ангиоиммунобластная лимфаденопатия, иммунобластная лимфаденопатия, хронический ревматоидный артрит, системная красная волчанка, воспалительное заболевание кишечника (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и т.п.), прогрессирующий системный склероз, дерматомиозит (дерматомиома), синдром Шегрена, карцинома, лейкоз, лимфома, задержка карциномного метастаза, предупреждение гиперплазии (лечение против псориаза и т.п.), заживление ран, синдром остеомиелофиброза, склеродермия и подобные заболевания.

Индуктор апоптоза по настоящему изобретению эффективен при любом заболевании, вызванном недостаточностью физиологического апоптоза, иммунным нарушением, злокачественной опухолью и т.п., и конкретными показаниями для которого являются аутоиммунный лимфопролиферативный синдром человека, лимфопролиферативное нарушение, ангиоиммунобластная лимфаденопатия, иммунобластная лимфаденопатия, хронический ревматоидный артрит, системная красная волчанка, неспецифический язвенный колит, прогрессирующий системный склероз, дерматомиозит (дерматомиома), синдром Шегрена, карцинома, лейкоз, лимфома, задержка карциномного метастаза, предупреждение гиперплазии (лечение против псориаза и т. п.), синдром остеомиелофиброза, склеродермия, апоптозное индуцирование аномальных мезангиальных клеток (лечение против гломерулонефрита) и подобные заболевания.

Эффекты снижения массы лимфатических узлов, индуцирования дифференцировки и индуцирования апоптоза наблюдали на мышах MRL-lpr/lpr. Патогенез аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома человека считается таким же нарушением Fas-гена, как у мышей MRL-lpr/lpr, а патология синдрома имеет заметное сходство с патологией мышей MRL-lpr/lpr, как например, в отношении припухлости лимфоузлов. Мышей MRL-lpr/lpr можно принять в качестве подходящей модели аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома человека. Следовательно, наиболее предпочтительным показанием применения фармацевтических препаратов в иммуномодуляторе, индукторе дифференцировки и индукторе апоптоза настоящего изобретения является аутоиммунный лимфопролиферативный синдром человека.

Фармацевтические препараты по настоящему изобретению могут быть изготовлены с учетом способа введения, таким как инъекция (внутримышечная, подкожная, интрадермальная, внутривенная, интраартикулярная, внутриглазная, внутрибрюшинная и т.д.), закапывание в глаза, инстилляция, чрезкожное введение, пероральное введение и ингаляция. Лекарственные формы включают формы для инъекции (растворы, суспензии, эмульсии, твердые препараты для инъекций, растворимые перед применением и т.п.), таблетки, капсулы, гранулы, порошки, растворы, липосомные включения, мази, гели, порошки для наружного применения, спреи, порошки для ингаляций, глазные капли, глазные мази и тому подобное. При получении фармацевтических препаратов можно применять ингредиенты, обычно используемые в лекарственных средствах, такие как традиционные носители, связующие, смазывающие вещества, красители и разрыхлители. В фармацевтических препаратах по настоящему изобретению кератансульфатолигосахарид может использоваться одновременно с другими противовоспалительными ингредиентами, противоаллергическими ингредиентами, иммуномодулирующими ингредиентами, ингредиентами, индуцирующими дифференцировку, ингредиентами, индуцирующими апоптоз и т.п.

В табл. 1 указаны предпочтительные способы введения и лекарственные формы противовоспалительного и противоаллергического средства. В табл. 2 указаны предпочтительные способы введения и лекарственные формы иммуномодулятора, индуктора клеточной дифференцировки и индуктора апоптоза.

Эффективная доза противовоспалительного средства и противоаллергического средства по настоящему изобретению составляет от 30 до 300 мг/пациент/сутки кератансульфатолигосахарида при введении в организм и от 1 до 10 мг/пациент/сутки при наружном введении. Эффективная доза иммуномодулятора, индуктора дифференцировки и индуктора апоптоза находится в интервале от 30 до 6000 мг/пациент/сутки кератансульфатолигосахарида.

На фиг. 1 представлена хроматограмма гель-фильтрации с помощью ВЭЖХ тетрасульфатированного N-ацетиллактозаминотетрасахарида (кератансульфаттетрасахарид (I)), полученного в примере 1.

На фиг. 2 представлена хроматограмма гель-фильтрации с помощью ВЭЖХ трисульфатированного N-ацетиллактозаминопентасахарида (кератансульфатпентасахарид (II)), полученного в примере 1.

На фиг. 3 представлена хроматограмма гель-фильтрации с помощью ВЭЖХ дисульфатированного N-ацетиллактозаминодисахарида (кератансульфатдисахарид (III), полученного в примере 1.

Фиг. 4 демонстрирует спектр ¹H-ЯМР при 400 МГц кератансульфатпентасахарида (II), полученного в примере 1.

Фиг. 5 представляет диаграмму, показывающую объем синовиальной жидкости у кроликов в случае модели артрита, вызванного папаином, которым вводили кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) или кератан сульфатдисахарид (III).

Фиг. 6 представляет графики, показывающие изменение времени развития отека стоп у крыс, у которых вызвано воспаление, когда кератансульфаттетрасахарид (I) или различные испытываемые соединения вводят крысам за пять минут до индуцирования воспаления.

Фиг. 7 представляет графики, показывающие изменение времени развития отека стоп у крыс, у которых вызвано воспаление, когда кератансульфаттетрасахарид (I) или различные испытываемые соединения вводят крысам за три часа до индуцирования воспаления.

На фиг. 8 приведена диаграмма, показывающая объем плеврального выпота у крыс в случае модели каррагининового (carrageenin) плеврита, которым вводили кератансульфаттетрасахарид (I) или дексаметазонацетат.

На фиг. 9 дается диаграмма, показывающая число лейкоцитов в плевральном выпоте у крыс в случае модели каррагининового плеврита, которым вводили кератансульфаттетрасахарид (I) или дексаметазонацетат.

На фиг. 10 представлена диаграмма, показывающая ингибирующее действие на генерацию активного кислорода (O^-₂) кератансульфаттетрасахарида (I), кератансульфатпентасахарида (II) и кератансульфатдисахарида (III) для нейтрофилов морских свинок, которая стимулируется N-формил-Met-Leu-Phe (FMLP).

На фиг. 11 дается диаграмма, показывающая оценку степени развития конъюнктивита в случае модели аллергического конъюнктивита у морских свинок, которым вводят или не вводят кератансульфаттетрасахарид (I).

Фиг. 12 представляет диаграмму, показывающую оценку степени развития конъюнктивита в случае модели аллергического конъюнктивита у морских свинок, которым вводят или соответственно не вводят кератансульфаттетрасахарид (I), кератансульфатпентасахарид (II) или кератансульфатдисахарид (III).

Фиг. 13 представляет диаграмму, показывающую оценку степени развития конъюнктивита в случае модели аллергического конъюнктивита у морских свинок, которым вводят кератансульфаттетрасахарид (I) в различных концентрациях.

На фиг. 14 приводится диаграмма, показывающая массу подчелюстных лимфатических узлов у мышей MRL, которые являются моделью аутоиммунного заболевания, которым в течение 28 дней повторно вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).

На фиг. 15 приводится диаграмма, показывающая массу мезентериальных лимфатических узлов у мышей MRL, которым в течение 56 дней повторно вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).

Фиг. 16 представляет диаграмму, показывающую массу подчелюстных лимфатических узлов у мышей MRL, которым в течение 56 дней повторно вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).

Фиг. 17 является диаграммой, на которой даются результаты анализа концентраций окрашивания образцов срезов мезентериальных лимфатических узлов (НЕ-окрашивание) у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).

Фиг. 18 является диаграммой, на которой даются результаты анализа концентраций окрашивания образцов срезов подчелюстных лимфатических узлов (Не - окрашивание) у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).

Фиг. 19 является диаграммой, показывающей соотношение (%) CD3 и CD4 позитивных клеток для лимфоцитов у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).

Фиг. 20 является диаграммой, показывающей соотношение (%) CD3 и CD8a позитивных клеток для лимфоцитов у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).

Фиг. 21 является диаграммой, показывающей соотношение (%) CD3 и В220 позитивных клеток для лимфоцитов у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).

Фиг. 22 является диаграммой, показывающей число апоптозных клеток в подчелюстных лимфатических узлах у мышей MRL, которым вводили различные дозы кератансульфатдисахарида (III).

Предпочтительные варианты осуществления изобретения Настоящее изобретение подробно описано далее с помощью приведенных ниже примеров. В примере продуцирования описывается продуцирование нового расщепленного кератансульфат фермента, получаемого из микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus. В примере 1 описывается получение фракций кератансульфатолигосахаридов, а в примере 2 описывается острая токсичность и различные фармакологические свойства кератансульфатолигосахаридов. Кроме того, в примерах 3-6 даются примеры фармацевтических препаратов.

Пример продуцирования. Продуцирование фермента, расщепляющего кератансульфат (1) Выделение Bacillus circulans KsT202 Небольшое количество почвы добавляют к 5 мл жидкой среды, содержащей источник азота, неорганические соли и кератансульфат и культивируют при встряхивании при 45^oC в течение трех суток. После культивирования 10 мкл с