Способ направления клеточного иммунного ответа против вич- инфицированной клетки млекопитающего, белковый мембранносвязанный химерный рецептор, днк

Способ направления клеточного иммунного ответа против вич- инфицированной клетки млекопитающего, белковый мембранносвязанный химерный рецептор, днк

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, генной инженерии и генной терапии. Способ заключается в направлении клеточного иммунного ответа против ВИЧ-инфицированной клетки млекопитающего. На ВИЧ-инфицированную клетку воздействуют эффективным количеством клеток, которые экспрессируют мембранносвязанный белковый химерный рецептор. Последний содержит (а) внеклеточную часть, которая включает в себя фрагмент CD4, способный специфически узнавать и связывать ВИЧ-инфицированную клетку, но не опосредует инфекцию ВИЧ, и (b) внутриклеточную часть, способную подавать сигнал указанной клетке для разрушения связанной с рецептором ВИЧ-инфицированной клетки. Белковый мембранносвязанный химерный рецептор содержит внеклеточную и внутриклеточную часть. Внеклеточная часть представляет фрагмент CD4. Аминокислотная последовательность приведена в описании. Внутриклеточная часть способна подавать сигнал клеткам, несущим указанный рецептор. Этот сигнал вызывает разрушение связанных рецептором ВИЧ или ВИЧ-инфицированных клеток. Внутриклеточный рецептор является передающей сигнал частью Т-клеточного рецептора, В-клеточного рецептора или Fc-рецептора. Фрагмент CD4 может быть отделен от внутриклеточной части трансмембранным доменом CD7, или CD5, или CD34. Структура трансмембранного домена приведена в описании. Представлена ДНК, кодирующая белковый мембранносвязанный химерный рецептор. Изобретение позволяет создать функциональные химеры, способные направлять иммунокомпетентные клетки на лизис инфицированных ВИЧ клеток. 3 с. и 12 з.п.ф-лы, 28 ил., 1 табл.

Изобретение было сделано при поддержке Правительства по Контракту N A1 27849, присужденному Национальными Институтами Здоровья. Правительство имеет определенные права в этом изобретении.

Данное изобретение касается функциональных химер между фрагментами CD4 и рецепторами иммунокомпетентных клеток (иммуноцитов), которые способны направлять иммунокомпетентные клетки на лизис инфицированных ВИЧ клеток, но не делают эти иммунокомпетентные клетки чувствительными к инфекции ВИЧ. Таким образом, это изобретение обеспечивает новое и эффективное терапевтическое средство против ВИЧ.

Предпосылки изобретения Узнавание T-клетками антигена через T-клеточный рецептор является основой ряда иммунологических феноменов. T-клетки управляют так называемым клеточно-опосредованным иммунитетом. Он включает в себя разрушение клетками иммунной системы чужеродных тканей или инфицированных клеток. Существуют различные T-клетки, в том числе "хелперные" и "супрессорные" клетки, которые модулируют иммунный ответ, и цитотоксические (или "убийцы") клетки, которые могут непосредственно убивать патологические клетки.

T-клетка, которая узнает и связывает уникальный антиген, обнаруживаемый на поверхности другой клетки, становится активированной; она может затем размножаться и, если она является цитотоксической клеткой, она может убить связанную ею клетку.

ВИЧ и иммунопатогенез В 1984 году было показано, что ВИЧ является этиологическим агентом СПИДа. С этого времени определение СПИДа пересматривали несколько раз в отношении того, какие критерии должны быть включены в диагноз. Однако, несмотря на неустойчивость в диагностических параметрах, простое общее название СПИДа - это инфекция ВИЧ и последующее развитие стойких конституциональных симптомов и определяющих СПИД заболеваний, таких как вторичные инфекции, неоплазмы и неврологическое заболевание. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12th ed., McGraw Hill (1991).

ВИЧ является человеческим ретровирусом группы лентивирусов. Четыре признанных человеческих ретровирусов принадлежат к двум различным группам: T-лимфотропные (или лейкозные) ретровирусы человека, HTLV-1 и HTLV-2, и вирусы иммунодефицита человека, HIV-1 и HIV-2 (ВИЧ-1 и ВИЧ-2). Первые являются трансформирующими вирусами, тогда как последние являются цитопатическими вирусами.

ВИЧ-1 был идентифицирован как наиболее общая причина СПИДа по всему миру. Гомология последовательности между ВИЧ-1 и ВИЧ-2 составляет приблизительно 40%, причем ВИЧ-1 более близок к некоторым членам группы вирусов иммунодефицита обезьян (SIV). CM. Curran, J. et al. Science, 329:1357- 1359 (1985); Weiss, R. et al. Nature, 324:572-575 (1986).

ВИЧ имеет обычные ретровирусные гены , а также шесть экстрагенов, участвующих в репликации и других биологических активностях этого вируса. Как утверждалось ранее, общим определением СПИДа является глубокая иммуносупрессия преимущественно клеточно-опосредованного иммунитета. Эта иммуносупрессия (супрессия иммунного ответа) приводит к различным заболеваниям, вызываемым условно-патогенными микроорганизмами, в частности некоторым инфекциям и неоплазмам.

В качестве основной причины иммунной недостаточности в СПИДе была идентифицирована количественная и качественная недостаточность в субпопуляции образуемых тимусом (Т) лимфоцитов, популяции T4. Эта субпопуляция клеток определяется фенотипически присутствием поверхностной молекулы CD4, которая, как было показано, является клеточным рецептором ВИЧ. Dalgleish et al. Nature 312:763 (1984). Хотя T4-клетка является основным клеточным типом, инфицируемым ВИЧ, по существу любая клетка человека, экспрессирующая молекулу CD4 на ее поверхности, способна связываться с ВИЧ и инфицироваться ВИЧ.

Традиционно, CD4⁺Т-клеткам приписывают роль хелпера/индуктора, что указывает на их функцию в обеспечении активирующего сигнала для B-клеток или в индуцировании T-лимфоцитов, несущих соответствующий CD8-маркер, с превращением их в цитотоксичные/супрессорные клетки. Reinherz and Schlossman, Cell 19:821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68: 5-42 (1982).

ВИЧ связывается специфически и с высокой аффинностью, через участок аминокислот в оболочке вируса (gp120), с частью района VI молекулы CD4, расположенной вблизи ее N-конца. После связывания вирус сливается с клеточной мембраной-мишенью- и интернализуется. После интернализации он использует фермент обратную транскриптазу для транскрибирования его геномной РНК в ДНК, которая интегрируется в клеточную ДНК, где и существует в течение жизни этой клетки в виде "провируса".

Провирус может оставаться латентным или активироваться для транскрибирования мРНК и геномной РНК, что ведет к синтезу, сборке белка, образованию новых вирионов и активной репликации вируса (бадинга) в результате проникновения из клеточной поверхности в клетку. Хотя точный механизм, при помощи которого вирус индуцирует смерть клетки, не был установлен, считают, что основным механизмом является массированный вирусный бадинг из клеточной поверхности, приводящий к разрушению плазменной мембраны и к нарушению осмотического баланса.

Во время процесса инфицирования организм хозяина вырабатывает антитела против вирусных белков, в том числе против основных гликопротеинов gp120 и gp41 оболочки. Несмотря на этот гуморальный иммунитет, болезнь прогрессирует, приводя к летальной иммуносупрессии, характеризующейся множественными инфекциями, вызываемыми условно-патогенными микроорганизмами, паразитемией, деменцией и смертью. Неспособность антивирусных антител хозяина остановить прогрессирование заболевания является одним из наиболее неприятных и тревожных аспектов этой инфекции и дает плохие прогнозы для усилий по вакцинации, основанной на общепринятых подходах.

Два фактора могут играть роль в эффективности гуморального ответа на вирусы иммунодефицита. Во-первых, подобно другим РНК-вирусам (и, в частности, подобно ретровирусам) вирусы иммунодефицита обнаруживают высокую скорость мутации в ответ на иммунологический контроль хозяина. Во-вторых, сами гликопротеины оболочки являются сильно гликозилированными молекулами, предоставляющими немного эпитопов, пригодных для высокоаффинного связывания антител. Бедная антигенами мишень, которую представляет вирусная оболочка, дает малую возможность хозяину для ограничения вирусной инфекции посредством продуцирования специфических антител.

Клетки, инфицированные вирусом ВИЧ, экспрессируют на их поверхности гликопротеин gp120. gp120 медиирует события слияния среди CD4⁺-клеток посредством реакции, сходной с реакцией, при помощи которой вирус входит в неинфицированные клетки, что приводит к образованию короткоживущих многоядерных гигантских клеток. Образование синцития зависит от прямого взаимодействия гликопротеина оболочки gp120 с белком CD4. Dalgleish et al., supra; Klatzman, D. et al., Nature; 312:763 (1984); McDougal, J.S. et al., Science 231: 382 (1986); Sodroski, J. et al. Nature 322:470 (1986); Lifson J.D. et al. Nature 323:725 (1986); Sodroski, J. et al., Nature 321:412 (1986).

Доказательство, что связывание CD4-gp120 ответственно за вирусную инфекцию клеток, несущих антиген CD4, включает в себя открытие, что между gp120 и CD4 образуется специфический комплекс. McDougal et al., supra. Другие исследователи показали, что клеточные линии, которые были неинфицируемыми для ВИЧ, превращались в инфицируемые клеточные линии после трансфекции и экспрессии кДНК-гена CD4 человека. Maddon et al. Cell 46:333-348 (1986).

Были предложены и успешно продемонстрированы in vitro рядом групп терапевтические программы, основанные на растворимом CD4 в качестве пассивного агента для противодействия вирусного поглощения и опосредованной синцитием клеточной передачи вируса (Deen et al. Nature 331:82-84 (1988); Fisher et al. Nature 331:76- 78 (1988); Hussey et al. Nature 331:78-81 (1988); Smith et al. Science 238: 1704-1707 (1987); Traunecker et al. Nature 331:84-86 (1988)); и впоследствии были обеспечены слитые белки CD4-иммуноглобулина с увеличенными полупериодами жизни и умеренной биологической активностью (Capon et al. Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al. Nature 339:68-70 (1989); Byrn et al., Nature 344:667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9: 347-353 (1990)). Хотя конъюгаты CD4-иммунотоксин или слитые белки обнаруживают сильную цитотоксичность для инфицированных клеток in vitro (Chaudary et al. Nature 335: 369-372 (1988); Till et al. Science 242:1166-1168 (1988)), латентное состояние синдрома иммунодефицита делает маловероятным, что какая-либо одного типа терапия будет эффективной в устранении вирусной нагрузки, и антигенность чужеродных слитых белков, по-видимому, ограничивает их приемлемость в лечении, требующем повторяющегося дозирования. Испытания на мартышках, пораженных вирусом иммунодефицита обезьян (SIV) показали, что растворимый CD4 при введении без заметной CD4 цитопении может снижать титр SIV и улучшать измерения in vitro миелоидного потенциала (Watanabe et al. Nature 337:267-270 (1989)). Однако после прерывания обработки наблюдали незамедлительное повторное появление вируса, что заставляет предполагать, что для предотвращения прогрессивного истощения иммунной системы может быть необходимым введение в течение всей жизни.

T-клеточные и Fc-рецепторы Экспрессия клеточной поверхностью наиболее обильной формы T-клеточного рецептора антигенов (TCR) требует одновременной экспрессии по меньшей мере 6 отличающихся полипептидных цепей (Weiss et al., J. Exp. Med. 160:1284-1299 (1984); Orloffhashi et al. Nature 316:606-609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem. 263:8528-8536 (1988); Sussman et al. Cell 52:85-95 (1988)), / антиген связывающих цепей, трех полипептидов комплекса CD3 и . Если любая из этих цепей отсутствует, то стабильная экспрессия остальных членов комплекса не происходит. является лимитирующим полипептидом поверхностной экспрессии полного комплекса (Sussman et al. Cell 52:85-95 (1988)), и считают, что эта цепь медиирует по меньшей мере часть клеточной программы активации, запускаемой узнаванием лиганда рецептором (Weissman et al., EМBO J. 8: 3651-3656 (1989); Frank et al. Science 249:174-177 (1990)). Интегральный мембранный гомодимер 32 кДа типа 1, (дзета), имеет внеклеточный домен из 9 остатков без сайтов для добавления (присоединения) N-связанного гликана и внутриклеточный домен из 112 остатков (мышь) или 113 остатков (человек) (Weissman et al. Science 238:1018-1020 (1988); Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9709-9713 (1988)). Изоформа , названная (эта) (Baniyash et al. , J. Biol. Chem. 263:9874-9878 (1988); Orloff et al., J. Biol. Chem. 264: 14812-14817 (1989)), которая возникает из чередующегося пути сплайсинга мРНК (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3233 (1990)), присутствует в уменьшенных количествах в клетках, экспрессирующих рецептор антигена. Гетеродимеры -, как считают, опосредуют образование инозитфосфатов, а также инициируемую рецептором программированную смерть клеток, называемую апоптозом (Mercep et al. Science 242:571-574 (1988); Mercep et al., Science 246:1162-1165 (1989)).

Подобно и , ассоциированная с рецептором Fc -цепь, экспрессируется в комплексах клеточной поверхности с дополнительными полипептидами, некоторые из которых медиируют узнавание лиганда, а другие имеют неопределенную функцию. (гамма) имеет гомодимерную структуру и общую организацию, очень похожую на структуру и организацию , и является компонентом высокоаффинного рецептора IgE мастоцитов/базофилов, FceRI, который состоит по меньшей мере из трех отличающихся полипептидных цепей (Blank et al. Nature 337:187-189 (1989); Ra et al. Nature 241:752-754 (1989)), а также компонентом рецепторов низкой аффинности для IgG, представленных в мышах Fc RII (Ra et al., J. Biol. Chem. 264: 15323-15327 (1989)), в человеке экспрессией подтипа CD16 макрофагами и природными клетками-убийцами, CD16_TM (CD16 трансмембранный) (Lanier et al. Nature 342:803-805 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990)) и полипептидом неидентифицированной функции (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990)). Недавно сообщалось, что экспрессируется мышиной T-клеточной линией, CTL, в которой он образует гомодимеры, а также гетepoдимepы - и - (Orloff et al. Nature 347:189-191 (1990)).

Fc-рецепторы медиируют фагоцитоз иммунных комплексов, трансцитоз и зависимую от антител клеточную цитотоксичность (ADCC) (Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Unkeles et al., Annu. Rev. Immunol. 6: 251-281 (1988); и Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). Недавно было показано, что одна из мышиных изоформ рецептоpa Fc низкой аффинности, FcR IIIBl, медиирует интернализацию покрытых Ig мишеней в покрытые клатрином углубления и что другой рецептор низкой аффинности, Fci lllA, медиирует ADCC посредством его связывания с одним или более членами небольшого семейства "триггерных молекул" (Miettinen et al., Cell 58:317-327 (1989); и Huziker and Mellman, J. Cell Biol. 109:3291-3302 (1989)). Эти триггерные (запускающие) молекулы, T-клеточный рецептор (TCR), -цепь, -цепь TCR и -цепь рецептора Fc, взаимодействуют с доменами узнавания лигандов различных рецепторов иммунной системы и могут автономно инициировать клеточные эффекторные программы, в том числе цитолиз, после агрегации (Samelson et al. Cell 43: 223-231 (1985); Weissman et al. Science 239:1018-1020 (1988); Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990); Blank et al. Nature 337: 187-189 (1989); Lanier et al. Nature 342:803-805 (1989); Kurosaki and Ravetch, Nature 342: 805-807 (1989); Hibbs et al. Science 246:1608-1611 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990); и Irwing and Weiss, Cell 64:891-901 (1991)).

Однако при проведении параллелей между семействами рецепторов Fc низкой аффинности мышей и человека становится ясно, что FcR IIA и C-изоформы человека не имеют копии в мышах. Отчасти вследствие этого их функция еще должна быть определена.

Вследствие того, что гуморальные агенты на основе одного CD4 имеют ограниченную применимость in vivo, предшествующие исследования выясняли возможность увеличения клеточного иммунитета к ВИЧ. Были идентифицированы препараты белковых химер, в которых внеклеточный домен CD4 слит с трансмембранным и/или внутриклеточным доменами T-клеточного рецептора, рецептора Fc lgG или элементами трансдукции сигнала B-клеточного рецептора (U.S.S.N. 07/847566 и 07/665961). Цитолитические T-клетки, экспрессирующие химеры, которые включают в себя внеклеточный домен CD4, обнаруживают сильную MHC-независимую деструкцию клеточных мишений, экспрессирующих белки оболочки ВИЧ. Чрезвычайно важным и новым компонентом этого подхода была идентификация отдельных цепей T-клеточного рецептора, рецептора Fc и B-клеточного рецептора, агрегация которых достаточна для инициации клеточного ответа. Одним из особенно ценных приложений этого подхода было изобретение химер между CD4 и ,, или , которые нацеливают цитолитические T-лимфоциты на узнавание и убивание клеток, экспрессирующих gp120 ВИЧ (U.S.S.N. 07/847 566 и 07/665 961).

Краткое изложение существа изобретения В общем, данное изобретение описывает способ направления клеточного иммунного ответа против инфицированной ВИЧ клетки в млекопитающем. Способ предусматривает введение млекопитающему эффективного количества терапевтических клеток, экспрессирующих мембрано-связанный белковый химерный рецептор, содержащий (а) внеклеточную часть, которая включает в себя фрагмент CD4, способный специфически узнавать и связывать инфицированную ВИЧ клетку, но не медиирующий инфекцию ВИЧ, и (b) внутриклеточную часть, которая способна давать сигнал терапевтической клетке о разрушении связанной рецептором инфицированной ВИЧ клетки.

В родственном способе изобретение описывает использование терапевтических клеток, экспрессирующих мембрано-связанный белковый химерный рецептор, включающий в себя (а) внеклеточную часть, содержащую фрагмент CD4, который способен специфически узнавать и связывать инфицированную ВИЧ клетку, но не медиирует инфекцию ВИЧ, и (b) внутриклеточную часть, которая способна давать сигнал терапевтической клетке для разрушения связанной рецептором инфицированной ВИЧ клетки, в приготовлении лекарственного средства для лечения родственных ВИЧ заболеваний.

Во втором аспекте, изобретение описывает клетку, которая экспрессирует белковый мембрано-связанный химерный рецептор, который содержит (а) внеклеточную часть, которая включает в себя фрагмент CD4, который способен специфически узнавать и связывать инфицированную ВИЧ клетку, но не медиирует инфекцию ВИЧ, и (b) внутриклеточную часть, которая способна давать сигнал терапевтической клетке для разрушения связанной рецептором инфицированной ВИЧ клетки.

В предпочтительных вариантах обоих аспектов фрагмент CD4 представляет собой аминокислоты 1-394 CD4 или аминокислоты 1-200 CD4; этот фрагмент CD4 отделен от внутриклеточной части трансмембранным доменом CD7, показанным на фиг. 26, или шарнирной областью, CH2, и доменами CH3 молекулы lgGl человека, показанными на фиг. 25; рецептор включает в себя трансмембранную часть CD7; рецептор включает в себя трансмембранную часть CD5; рецептор включает в себя трансмембранную часть CD34; фрагмент CD4 отделен от мембраны терапевтической клетки одной или более белковыми - спиралями; фрагмент CD4 отделен от мембраны терапевтической клетки по меньшей мере 48 ангстремами (10^-10 м) или по меньшей мере 72 ангстремами; внутриклеточная часть является трансдуцирующей сигнал частью белка T-клеточного рецептора (например, ) белка B-клеточного рецептора или белка рецептора Fc; и терапевтические клетки выбраны из группы, состоящей из: (а) T- лимфоцитов; (b) цитотоксических T-лимфоцитов; (c) природных клеток-убийц; (d) нейтрофилов; (e) гранулоцитов; (f) макрофагов; (g) мастоцитов; (h) HeLa клеток; и (i) эмбриональных стволовых клеток (ES).

В других аспектах, изобретение описывает ДНК, кодирующую химерный рецептор данного изобретения; и вектор, включающий в себя ДНК химерного рецептора.

Хотя характерным вариантом данного изобретения является химера между CD4 и дзета, любая цепь рецептора, имеющая функцию, подобную функции этих молекул, например, в гранулоцитах или B- лимфоцитах, могла бы быть использована для описанных здесь целей. Отличительные признаки желаемой триггерной молекулы иммунокомпетентной клетки включают в себя способность автономной экспрессии (т. е. в виде отдельной цепи), способность сливаться с внеклеточным доменом CD4, так что полученная химера присутствует на поверхности терапевтической клетки, и способность инициировать клеточные эффекторные программы при вторичной агрегации для столкновения с лигандом-мишенью.

В настоящее время наиболее удобным способом доставки химерных белков к клеткам иммунной системы является использование формы генной терапии. Однако реконституирование клеток иммунной системы с химерными рецепторами смешиванием этих клеток с солюбилизированным подходящим образом очищенным химерным белком привело бы также к образованию популяции сконструированных клеток, способных отвечать на ВИЧ-инфицированные мишени. Подобные подходы использовали, например, для введения молекулы CD4 в эритроциты для терапевтических целей. В этом случае популяция сконструированных клеток не была бы способна к самообновлению.

Данное изобретение касается функциональных и упрощенных химер между фрагментами CD4 и T-клеточным рецептором, B-клеточным рецептором и субъединицами рецептора Fc, которые способны направлять иммунокомпетентные клетки для узнавания и лизиса ВИЧ- инфицированных клеток. Способ направления клеточного ответа в млекопитающих предусматривает введение эффективного количества терапевтических клеток (например, цитотоксических T-лимфоцитов) млекопитающему, причем эти клетки способны узнавать и разрушать ВИЧ-инфицированную клетку.

Изобретение также включает в себя химерные рецепторные белки, которые направляют цитотоксические T-лимфоциты для узнавания и лизиса ВИЧ-инфицированных клеток, клетки-хозяева, трансформированные вектором, содержащим эти химерные рецепторы, и антитела, направленные против химерных рецепторов.

Эти и другие нелимитирующие варианты данного изобретения будут очевидны специалистам в этой области из следующего далее подробного описания изобретения.

В следующем далее подробном описании будут сделаны ссылки на различные методологии, известные специалистам в области молекулярной биологии и иммунологии. Публикации и другие материалы, представляющие такие известные методологии, на которые делается ссылка, включены здесь в виде полных ссылок.

Стандартные справочные работы, излагающие основные принципы технологии рекомбинантных ДНК, включают в себя Watson et al. Molecular Biology of the Gene, Volumes I and II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menio Park, CA (1987); Darnell et al. Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin, Genesll, John Wiley & Sons, publishers, New York, N.Y. (1985); Old et al. Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Ergineering, 2d edition. University of California Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); и Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, N.Y. (1989).

ОПРЕДЕЛЕНИЯ Под "клонированием" имеют в виду использование способов рекомбинации in vitro для встраивания определенного гена или другой последовательности ДНК в векторную молекулу.

Под "кДНК" подразумевают комплементарную или копию-ДНК, продуцируемую из РНК-матрицы под действием РНК-зависимой ДНК- полимеразы (обратной транскриптазы). Таким образом, "клон кДНК" обозначает дуплексную последовательность ДНК, комплементарную представляющей интерес молекуле РНК, переносимую в клонирующем векторе.

Под "библиотекой кДНК" подразумевают коллекцию рекомбинантных молекул ДНК, содержащих встроенные кДНК, которые содержат ДНК, являющиеся копиями мРНК, экспрессируемыми клеткой при создании этой библиотеки кДНК. Такая библиотека кДНК может быть получена способами, известными специалистам в этой области и описанными, например, в Ausubel et al., supra и Maniatis et al. , supra. В общем виде, РНК сначала выделяют из клеток организма, из генома которого желательно клонировать конкретный ген. Для целей данного изобретения предпочтительны клеточные линии лимфоцитов млекопитающего и, в частности, человека. В настоящее время предпочтительным вектором для этой цели является штамм WR вируса коровьей оспы.

"Вектором" называют молекулу ДНК, полученную, например, из плазмиды, бактериофага или вируса млекопитающего или насекомого, в которую могут быть встроены или клонированы фрагменты ДНК. Вектор должен содержать один или более уникальных сайтов рестрикции и может быть способным автономно реплицироваться в определенном организме хозяина или переносчика, так что клонированная последовательность может размножаться. Таким образом, под "экспрессирующим ДНК-вектором" подразумевают любой автономный элемент, способный управлять синтезом рекомбинантного пептида. Такие экспрессирующие ДНК- векторы включают в себя бактериальные плазмиды и фаги и плазмины и вирусы млекопитающих и насекомых.

"Фактически чистым" называют соединение, например белок, полипептид или антитело, которые фактически не содержат компонентов, сопровождающих их в природе. В общем виде, соединение является фактически чистым, если по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% всего материала в пробе представляют собой целевое соединение. Чистота может быть измерена любым подходящим способом, например колоночной хроматографией, электрофорезом в полиакриламидном геле или анализом ЖХВР (HPLC). В связи с последовательностью нуклеиновой кислоты "фактически чистая" означает последовательность нуклеиновой кислоты, сегмент или фрагмент которой не является непосредственно смежным (т.е. ковалентно связанным) с обеими кодирующими последовательностями, с которыми он непосредственно связан (т.е. с одной при 5'-конце и с другой при 3'-конце) в природно существующем геноме организма, из которого получена ДНК изобретения.

Под "фрагментом" молекулы, такой как любая из последовательностей кДНК данного изобретения, подразумевают любую часть смежных нуклеотидов этой молекулы. "Аналог" молекулы обозначает неприродную молекулу, существенно сходную либо с целой молекулой, либо с ее фрагментом. О молекуле говорят, что она "существенно сходна" с другой молекулой, если последовательность аминокислот в обеих молекулах по существу одинакова. Существенно сходные аминокислотные молекулы будут обладать сходной биологической активностью. В применении здесь, молекулу называют "химическим производным" другой молекулы, когда она содержит химические части молекулы, не являющиеся обычно частью этой молекулы. Такие части молекулы могут улучшать растворимость молекулы, абсорбцию, биологический полупериод жизни и т.п. Эти части молекулы могут, альтернативно, уменьшать токсичность молекулы, исключать или аттенюировать нежелательное побочное действие молекулы и т.д. Молекулярные части, способные медиировать такие эффекты, описаны, например, в Remington's Phanmaceutical Sciences, 16th ed. Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

"Функциональным производным" химерного гена рецептора данного изобретения называют "фрагменты" или "аналоги" этого гена, которые "существенно сходны" по нуклеотидной последовательности и кодируют молекулу, обладающую сходной активностью, например, с химерой рецептора T-клетки, B-клетки или Fc. Наиболее предпочтительно, чтобы это производное имело 90%, более предпочтительно 70%, и предпочтительно 40% активности химеры рецептора дикого типа. Активность функционального производного химерного рецептора включает в себя специфическое связывание (с его внеклеточной частью CD4) с ВИЧ-инфицированной клеткой и в конечном счете разрушение этой клетки; кроме того, химерный рецептор не делает несущую рецептор клетку восприимчивой к инфекции ВИЧ. Активность химерного рецептора может определяться, например, любым из описанных здесь способов.

Последовательность ДНК, кодирующая рецепторную химеру CD4 данного изобретения или ее функциональное производное, может быть рекомбинирована с векторной ДНК в соответствии с общепринятыми способами, включающими в себя затупленные или ступенчатые концы для лигирования, расщепление рестриктазами для обеспечения подходящих концов, заполнение в "липкие" концы, обработку щелочной фосфатазой во избежание нежелательного соединения и лигирование подходящими лигазами. Способы для таких манипуляций описаны Maniatis, Т., et al., supra и хорошо известны в этой области.

О молекуле нуклеиновой кислоты, такой как ДНК, говорят, что она "способна экспрессировать" полипептид, если она содержит нуклеотидные последовательности, которые включают в себя регуляторную информацию для транскрипции и трансляции, и такие регуляторные последовательности "оперативно соединены" с нуклеотидными последовательностями, кодирующими данный полипептид. "Оперативным соединением" является такое соединение, в котором регуляторные последовательности ДНК и последовательности ДНК, которые должны быть экспрессированы, соединены таким образом, чтобы сделать возможной экспрессию гена. Точная природа регуляторных районов, необходимых для генной экспрессии, может варьировать от организма к организму, но в общем виде будет включать в себя промотор (который управляет инициацией транскрипции РНК), а также последовательности ДНК, которые при транскрибировании в РНК будут сигнализировать об инициации синтеза белка. Такие районы обычно включают в себя 5'-некодирующие последовательности, участвующие в инициации транскрипции и трансляции, такие как TATA-блок, кэпирующие последовательность, последовательность CAAT и т.п.

Если желательно, некодирующий район 3 (справа) от генной последовательности, кодирующей белок, может быть получен описанными выше способами. Этот район может быть сохранен для его регуляторных последовательностей терминации транскрипции. Так, путем сохранения этого 3'-района, в природе смежного с последовательностью ДНК, кодирующей белок, могут быть обеспечены сигналы терминации транскрипции. В случае, если эти сигналы терминации транскрипции не функционируют удовлетворительно в экспрессирующей клетке-хозяине, вместо них может быть введен 3'- район, функциональный в клетке-хозяине.

Две последовательности ДНК (такие, как последовательность промоторного района и последовательность, кодирующая химерный рецептор CD4) называют оперативно соединенными, если природа соединения между этими двумя последовательностями ДНК (1) не приводит к введению мутации сдвига рамки, (2) не мешает способности последовательности промоторного района направлять транскрипцию последовательности гена рецепторной химеры или (3) не мешает способности последовательности гена химеры рецептора транскрибироваться последовательностью промоторного района. Промоторный район будет оперативно соединен с последовательностью ДНК, если промотор способен инициировать транскрипцию этой ДНК. Таким образом, для экспрессии белка необходимы сигналы транскрипции и трансляции, узнаваемые соответствующим хозяином.

Данное изобретение включает в себя экспрессию химерного белка рецептора CD4 (или его функционального производного) в прокариотических или эукариотических клетках, хотя предпочтительна эукариотическая экспрессия (и, в частности, в лимфоцитах человека).

Антитела в соответствии с данным изобретением могут быть получены любым из множества способов. Например, клетки, экспрессирующие химерный белок рецептора CD4 или его функциональное производное, могут быть введены животному для индуцирования образования сыворотки, содержащей поликлональные антитела, способные связывать эти химерные белки.

В предпочтительном способе антитела в соответствии с данным изобретением являются моноклональными антителами. Такие моноклональные антитела могут быть получены с применением технологии гибридом (Kohler et al. Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Haimnerling et al. In: Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas, Else-vier, N.Y., pp. 563-684 (1981)). В общем виде, такие процедуры включают в себя иммунизацию животного антигеном химеры рецептора CD4. Спленоциты таких животных экстрагируют и сливают с подходящей линией миеломных клеток. Любая подходящая линия миеломных клеток может быть использована в соответствии с данным изобретением. После слияния полученные гибридомные клетки селективно поддерживают в HAT-среде и затем клонируют серийным разведением, как описано Wands et al. (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Гибридомные клетки, полученные таким отбором, затем анализируют для идентификации клонов, которые секретируют антитела, способные связывать химеры.

Антитела согласно данному изобретению также могут быть поликлональными или предпочтительно район-специфическими поликлональными антителами.

Антитела против химеры рецептора CD4 в соответствии с данным изобретением могут быть использованы для мониторинга количества химерного рецептора (или клеток, несущих химерный рецептор) в больном. Такие антитела очень удобны для использования в стандартном иммунодиагностическом тесте, известном в этой области, включающем в себя такие иммунометрические или "сэндвич" анализы, как прямой сэндвич, обратный сэндвич и одновременные сэндвич- тесты. Эти антитела могут быть применены в любом количестве комбинаций, что может быть определено специалистами без чрезмерного экспериментирования для проведения иммунотестов приемлемой специфичности, чувствительности и точности.

Стандартные работы, излагающие общие принципы иммунологии, включают в себя Roitt, Essential Immunology, 6th ed., Blackwell Scientific Publications, Publisher, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2d ed., Macrnillan Publishing Co., Publisher, New York (1986); Roitt et al. Immunology, GoWer Medical Publishing Ltd. , Publisher, London (1985); Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", in Burdon et al., eds. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier, Publisher, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, Publisher, New York (1982); и Kennet et al., eds. , Monoclonal Antibodies, Nyb-ridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, Publisher, New York (1980).

Под "обнаружением" ("детектированием") подразумевают определение присутствия или отсутствия вещества или определение количества вещества. Термин, следовательно, относится к применению материалов, композиций и способов данного изобретения для качественных и количественных определений.

Антитела и фактически очищенный антиген данного изобретения идеально пригодны для изготовления кита (набора). Такой кит может содержать носитель (держатель), в котором размещены один или несколько контейнеров, таких как флаконы, пробирки и т.п., причем каждый из контейнеров содержит отдельные элементы анализа, который должен быть выполнен.

Многие типы тестов могут быть включены в киты, например конкурентный и неконкурентный анализы. Типичными примерами анализов, которые могут использовать антитела этого изобретения, являются радиоиммуноанализ РИА (RIA), ферментные иммуноанализы (EIA), твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) и иммунометрические, или сэндвич, иммуноанализы.

Под термином "иммунометрический анализ" (количественный иммуноанализ), или "сэндвич-иммуноанализ", подразумевают одновременный сэндвич-, прямой сэндвич-, обратный сэндвич-иммуноанализ. Эти термины хорошо понятны специалистам в данной области. Им также понятно, что антитела в соответствии с данным изобретением будут применимы в других вариациях и формах анализов, которые известны в настоящее время и которые могут быть разработаны в будущем. Подразумевается, что они входят в объем данного изобретения.

Фраза "специфически узнает и связывает" означает, что антитело узнает и связывает химерный рецепторный полипептид, но фактически не узнает и не связывает другие, не относящиеся к этому полипептиду молекулы в пробе, например в биологической пробе.

"Терапевтической клеткой" называют клетку, которая была трансформирована химерой рецептора CD4 этого изобретения таким образом, что она способна узнавать и разрушать ВИЧ-инфицированную клетку; предпочтительно такие терапевтические клетки являются клетками гемопоэтической системы.

Термин "внеклеточный" означает, что по меньшей мере часть молекулы экспонирована на поверхности клетки. "Внутриклеточный" означает имеющий по меньшей мере часть молекулы, находящуюся в цитоплазме терапевтической клетки. "Трансмембранный" означает, что по меньшей мере часть молекулы находится в мембране плазмы. "Внеклеточная часть", "внутриклеточная часть" и "трансмембранная часть" могут включать в себя фланкирующие аминокислотные последовательности, которые простираются в прилегающие клеточные компартменты.