Иммуноанализ растворимых фибриновых полимеров

Иммуноанализ растворимых фибриновых полимеров

Реферат

 

Изобретение относится к иммунологии. Способ определения в условиях in vitro присутствия или количества растворимых поперечно сшитых фибриновых полимеров DesААВВ и поперечно не сшитых фибриновых полимеров DesААВВ в образце, полученном от млекопитающего, включает в себя контактирование указанного образца с антителом или его иммунореактивным фрагментом. При этом последние не связываются специфически а) с фибриногеном, в) с продуктами распада фибриногена, с) с фибриновыми мономерами DesАА, d) с фибриновыми полимерами DesАА, е) с фибриновыми мономерами DesААВВ, f) с поперечно сшитым фибриногеном, g) с комплексом фибриновый мономер DesАА - фибриноген и h) с продуктами распада фибрина. Способы оценки предрасположенности к тромботическому состоянию, подтверждения диагноза наличия тромботического состояния и мониторинга тромботического состояния у млекопитающего включают в себя определение количества растворимых поперечно сшитых фибриновых полимеров DesААВВ и растворимых поперечно не сшитых фибриновых полимеров DesААВВ в образце, полученном у млекопитающего. Предложены наборы для определения in vitro присутствия или количества растворимых поперечно сшитых фибриновых полимеров DesAАВВ и растворимых поперечно не сшитых фибриновых полимеров DesААВВ в образце для определения предрасположенности к тромботическому состоянию у млекопитающего, для подтверждения диагноза наличия тромботического состояния и для определения стадии тромботического состояния у млекопитающего. Изобретение позволяет достоверно определить предрасположенность к тромботическому состоянию у млекопитающего. 8 с. и 26 з.п. ф-лы, 12 табл., 8 ил.

1. Область техники Изобретение относится к способу получения моноклональных антител. В этом способе используются вакцинированные стерильные животные. В изобретении заявляется также использование указанных моноклональных антител и поликлональных антител, полученных от вакцинированных стерильных животных, для клинической диагностики в условиях in vitro и in vivo и в терапии. Целью изобретения является также фибрин-специфичное моноклональное антитело.

2. Предпосылки изобретения Общепризнанно, что Kohler и Milstein разработали методику, которая с успехом привела к получению первой гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела (G.Kohler and C. Mistein, 1975, Nature 256, 495-497; 1976, Eur. J. Immun. , 6, 511-519). Сливая клетки, продуцирующие антитела (B-лимфоциты селезенки), с миеломными клетками (злокачественными клетками первичных опухолей костного мозга), они получили линию гибридных клеток, возникающих из единственного слитого клеточного гибрида (называемого гибридомой или клоном). Гибридома унаследовала некоторые свойства как лимфоцитов, так и линий миеломных клеток. Как и лимфоциты, гибридома секретирует один тип иммуноглобулинов; более того, подобно миеломным клеткам, гибридома способна к неограниченному делению клеток. Сочетание этих двух свойств предоставляет несомненные преимущества перед обычными антисыворотками.

Антисыворотки, полученные от вакцинированных животных, представляют собой меняющиеся по составу смеси поликлональных антител, которые невозможно идентично воспроизвести. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными иммуноглобулинами единственного типа. Один тип иммуноглобулинов, секретируемых гибридомой, является специфичным для одной и только одной антигенной детерминанты, или эпитопа, в антигене - сложной молекуле, включающей множество антигенных детерминант. Так, если антиген представляет собой белок, то антигенной детерминантой может быть одна из многих пептидных последовательностей (обычно длиной в 6-7 аминокислот; M.Z. Atassi. 1980. Molec. Cell. Biochem. 32, 21-43) в молекуле белка. Таким образом, моноклональные антитела, продуцированные против одного антигена, могут отличаться друг от друга в зависимости от детерминанты, которая инициирует их образование; однако для любой гибридомы все производимые ею антитела идентичны. Более того, клеточная линия гибридомы легко размножается в условиях in vitro и in vivo и позволяет получить антитела с чрезвычайно высокой концентрацией.

Моноклональные антитела могут использоваться в качестве зонда для обнаружения их антигена. Так моноклональные антитела использовали для диагностики в условиях in vitro, например в радиоиммунных анализах и ферментных иммуносорбентных анализах (ELISA), и для диагностики в условиях in vivo, например для визуализации в условиях in vivo с помощью содержащего метку моноклонального антитела. Моноклональное антитело может также использоваться в качестве носителя для доставки лекарства к подобному антигену антитела.

Однако прежде чем моноклональное антитело сможет быть использовано для указанных целей, необходимо чтобы моноклональное антитело могло бы связываться с представляющим интерес антигеном, т.е. антигеном-мишенью. Подобная процедура отбора может быть очень утомительной, поскольку может потребоваться отобрать множество, например предположительно несколько тысяч, моноклональных антител, прежде чем будет идентифицирована гибридома, продуцирующая антитело, способное связываться с антигеном-мишенью. Следовательно, необходимо разработать способ получения моноклональных антител, который превышает вероятность того, что гибридома продуцирует антитело для антигена-мишени.

3. Краткое описание изобретения В настоящем изобретении заявляется способ получения моноклональных антител к антигену, включающий: a) иммунизацию стерильного животного указанным антигеном с целью позволить продуцирующим антитело клеткам воспроизвести антитела к указанному антигену, b) выделение по крайней мере части указанных продуцирующих антитело клеток из указанного стерильного животного, c) получение гибридомы слиянием одной из указанных продуцирующих антитело клеток с иммортализующей клеткой, при этом указанная гибридома способна продуцировать моноклональное антитело к указанному антигену, d) выращивание указанной гибридомы, и e) выделение моноклональных антител, продуцированных указанной гибридомой.

В настоящем изобретении заявляются также способы использования моноклонального антитела и поликлонального антитела, полученного от стерильного животного. В настоящем изобретении заявляется также фибрин-специфичное моноклональное антитело и способы использования подобного моноклонального антитела.

Краткое описание чертежей Фиг. 1(A) - определение иммунореактивности MH1 с фибриновым мономером DesAABB с помощью аффинной хроматографии.

Фиг. 1(B) - контрольный эксперимент для подтверждения связывающей способности матрицы фибринового мономера на сефарозе с использованием фибриноген-специфичного антитела 45J.

Фиг. 2 - иммунореактивность несшитых фибриновых полимеров DesAABB и сшитых фибриновых полимеров DesAABB в in vitro анализах для растворимых фибриновых полимеров DesAABB с использованием MH1.

Фиг. 3 - образование фибрина DesAA при обработке плазмы фибриногена батроксобином.

Фиг. 4 - иммунореактивность растворимых фибриновых полимеров DesAA в in vitro аналитической системе для растворимых фибриновых полимеров DesAABB с использованием MH1.

Фиг. 5 - иммунореактивность антитела MH1 с фибриногеном, обработанным активированным фактором XIII (фактором XIIIa).

Фиг. 6 - определение образования растворимого фибринового полимера DesAABB в условиях in virto с использованием анализа на растворимый фибрин MH1.

Фиг. 7 - демонстрация очистки растворимого фибрина из плазмы с использованием колонки сефароза-MH1.

Фиг. 8 - определение содержания растворимых фибриновых полимеров DesAABB в крови пациентов с болями в груди и установленным инфарктом миокарда.

4. Подробное описание изобретения 4.1. Стерильные животные Настоящее изобретение относится к использованию стерильных животных для получения моноклональных антител. Стерильные животные были впервые получены в конце 19-го столетия и с тех пор интенсивно используются.

Стерильное животное является гнотобиотом, который свободен от связей со всеми возможными формами жизни, включая бактерии, вирусы, грибки, простейшие и другие формы сапрофитов и паразитов. Гнотобиот представляет собой животное или вид, полученный при асептическом кесаревом сечении или стерильном выведении яиц, которое выращивают и за которым постоянно наблюдают, используя стерильные методы в условиях изолятора, и у которого состав любой связанной с ним фауны и флоры, если она есть, полностью определяется действующей методологией. (Следует отметить, что все мыши содержат латентный лейкемогенный вирус, а потому мышь, которая безмикробна за исключением этого лейкемогенного вируса, следует рассматривать как стерильное животное для целей настоящего изобретения).

Суть безмикробной системы заключается в создании барьера по отношению к проникновению нежелательных микробных оккупантов. Помимо физического барьера из пластмассы, металла, резины и стекла, за который помещается животное, система требует операционных барьеров для фильтрации воздуха, стерилизации пищи и воды, манипуляции с помощью перчаток, которые составляют неотъемлемую часть барьерной системы. Кроме того, подача провианта в изолятор должна осуществляться в стерильных условиях.

Мы полагаем, что по настоящему изобретению может использоваться любое стерильное животное. Самыми распространенными стерильными животными являются мышь, свинья, крыса, кролик, морская свинка, коза, овца, приматы и домашняя птица, при этом мышь является предпочтительной, особенно мышь Balb/c.

4.2. Выведение, забота и уход за стерильными животными Появилось много публикаций, посвященных вопросам выведения, заботы и ухода за стерильными животными. Например. B.S. Wostmann, Ed., "Gnotobiotes: Standards and Guidelines for the Breeding, Care and Management of Laboratory Animals", National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C. 1970; M.E. Coates et al., "The Germfree Animal in Research", Academic Press, London, 1968; J.R. Pleasants, "Gnotobiotics", in: Handbook of Laboratory Animal Science", Vol. 1 (E.C. Melby et al., Eds.). CRC Press, Boca Raton, Fla., 117 (1974), которые приводятся здесь для справок.

Далее приводятся выдержки из публикации B. S. Wostmann, Ed. (1970) "Gnotobiotes: Standards and Guidelines for the Breeding, Care and Management of Laboratory Animals", National Research Council, National Academy of Sciences, Washington. D.C., в которой описывается выведение, забота и уход за стерильными крысами и мышами. Следует отметить, что подобные методики выведения, заботы и ухода аналогичны и для других животных.

Внешняя лабораторная Среда Помещения, оборудование и методики разведения должны готовиться и осуществляться таким образом, чтобы обеспечить максимальный контроль за окружающими условиями и оптимальные комфортные условия для животных. Клетки, кормушки и поилки должны быть сконструированы и изготовлены таким образом, чтобы животные чувствовали себя максимально комфортно, пища и вода были легко доступны, а уборка и стерилизация были легко осуществимы и эффективны.

Желательный план помещения для проведения интенсивных исследований в стерильных условиях должен предусматривать: 1) рабочую зону для сборки я стерилизации изоляторов, 2) зону для поддержания жизнедеятельности животных в изоляторах, и 3) лабораторную зону для осуществления контроля за состоянием гнотобиологической среды.

В план помещения может также включаться офис и зона приготовления пищи.

Лабораторные условия для обслуживания гнотобиологических изоляторов должны удовлетворять стандартам, установленным для строительства обычных лабораторных питомников. Конструкция должна защищать от проникновения насекомых, а стены и пол должны быть влагонепроницаемыми. Освещение должно быть равномерным с одинаковыми циклами светлое время - темное время в течение всего года. Вентиляция должна быстро удалять любые запахи, возникающие при химической стерилизации, а климатические условия должны контролироваться так, как указано далее.

Температура. Наиболее приемлемая температура в помещении, где размещаются животные, составляющая 21-27^oC, может быть в случае необходимости изменена таким образом, чтобы температура в изоляторе составляла от 22 до 26^oC.

Влажность. Относительная влажность должна поддерживаться на комфортном для человека уровне, составляющем 40-60%. Однако если для вентиляции изолятора используется комнатный воздух, то рекомендуемый уровень относительной влажности составляет 40-50%.

Вентиляция. Смена воздуха в помещении должна быть достаточной для быстрого удаления любых запахов, возникающих при химической стерилизации. Рекомендуемая кратность обмена воздуха в помещении составляет от десяти до пятнадцати объемов в час. Персонал должен иметь противогазы с подачей свежего воздуха для защиты от опасных уровней концентраций паров химических реагентов.

Стерильное оборудование (см. E.Sacquiet 1968, "Equipment design and management: General technique of maintaining germ-free animals", p. 1-22, in: M. E. Coates (Ed.) "The germ-free animals in research", Academic Press, London; P.C. Trexler 1968, "Equipment design and management: Transport of germ-free animals and current developments in equipment design, p. 23-35, in: M. E. Coates (Ed.) "The germ-free animals in research", Academic Press, London).

Полное исключение попадания микробов из внешней Среды требует создания абсолютного барьера. Успешное проведение операции зависит от постоянного поддержания целостности указанного барьера. Существуют два основных типа изоляторов - из металла и пластмассы. Некоторые конструкции из металла разрабатываются таким образом, чтобы они выдерживали внутри действие водяного пара с давлением 20 фунтов на квадратный дюйм (1406 г/кв.см). (См. J.A. Reyniers. 1959. "Design and operation of apparatus for rearing germ-free animals", Ann. N.Y. Acad. Sci. 78:37). Другие конструкции размещают внутри большого автоклава для проведения первичной стерилизации (см. B.E.Gustafsson, 1959. "Lightweight stainless steel systems for rearing germ-free animals", Ann N.Y. Acad. Sci. 78:17).

Наибольшее распространение в настоящее время получили гибкие пленочные изоляторы (см. P.C.Trexler and L.I.Reynolds 1957. "Flexible film appararus for rearing and use of germ-free animals", Appl Microbiol. 5:406). Их обычно изготавливают из гибких многослойных пленок виниловых полимеров и подвергают химической стерилизации; при этом они легко могут быть приспособлены для конкретного назначения. Стерилизаторы другого типа, которые изготавливают из больших нейлоновых труб, состыкованных друг с другом, можно стерилизовать в автоклаве. (См. M.Lev 1962. "An autoclavable plastic unit for rearing animals under germ-free conditions". J.Appl. Bacteriol. 25:30). Разработаны также изоляторы из органического стекла и одноразовые гибкие пленочные блоки. Многие из них являются достаточно легкими, так что их можно разместить друг над другом на одной стойке, что позволяет сэкономить пространство внутри помещения.

Для изоляторов, чувствительных к действию тепла, используют специальный цилиндр для стерилизации пищи и питания. Изоляторы должны быть разработаны таким образом, чтобы у них был большой узел фильтрации, из которого можно было бы отвести воздух в автоклав с глубоким вакуумом (см. P.C. Trexler 1963, "An isolator system for control of contamination", Lab. Anim. Care 13: 572). В качестве альтернативы цилиндр можно снабдить дренажной рубкой, связанной с атмосферой, позволяющей удалять воздух и конденсат в процессе стерилизации без использования вакуума. (См. N.E.Jaworski and C.E.Miller 1963. "Refinement of cylinder technique for supplying germ-free isolators", Lab. Anim. Care 13:591).

Стерилизация Все оборудование, пища, подстилка, вода и воздух, используемые в изоляторе, должны быть абсолютно стерильны. Применяемые для этого методики и условия определяются в каждом случае индивидуально.

Использование водяного пара, подаваемого под давлением, является наилучшим из известных методов стерилизации. Он особенно удобен для пористых веществ, которые устойчивы к действию тепла. Каждая зона, которая предположительно может служить приютом микробам, должна подвергнуться прямому контакту с водяным паром. Время воздействия зависит от применяемой температуры. Рекомендуют, чтобы наименее доступная часть загружаемых компонентов (середина упаковки) обрабатывалась как минимум 15 минут при температуре 121^oC. Более высокие температуры и более короткие времена обработки могут применяться после тщательного исследования на предмет полноты стерилизации. Стандартный размер упаковки и плотность пищи, подстилки и других материалов имеет первостепенное значение для того, чтобы время проникновения водяного пара было бы постоянным и предсказуемым.

Для стерилизации подаваемого в изолятор воздуха используют сухое тепло (см. M. Miyakawa 1959. "The Miyakawa remote-control germfree rearing unit", Ann. N.Y.Acad. Sci., 78:37; B.E.Gustafsson 1959. "Lightweight stainless steel systems for rearing germ-free animals", Ann. N.Y.Acad. Sci. 78:17).

Надуксусная кислота (CH₃COOOH) широко используется в случае чувствительных к действию тепла непористых материалов, особенно гибких пленочных боксов. Эту кислоту применяют в виде 2%-ного раствора вместе со смачивателем (детергентом) (см. P.C.Trexler and L.I.Reynolds 1957. "Flexible film apparatus for the rearing and use of hermfree animals" Appl. Microbiol. 5:406). В специфических случаях могут применяться другие химические реагенты, в частности гипохлориты, йодофоры или четвертичные аммониевые соединения для заполнения жидких сепараторов, в которые помещают новорожденных после проведения экстирпации матки, или хлорид ртути для размещения яиц в стерильных условиях перед высиживанием.

Для стерилизации несмачивающихся чувствительных к действию тепла боксов можно использовать оксид этилена. Время стерилизации зависит от температуры, влажности, давления и концентрации оксида этилена. Оксид этилена может химически взаимодействовать с подстилкой и компонентами пищи с образованием токсичных или нежелательных соединений. Поскольку он является горючим и вредным соединением, то использование оксида этилена в обычных случаях должно быть ограничено выпускаемыми промышленностью газовыми смесями, содержащими не более 20% оксида этилена.

Для стерилизации поступающего воздуха используют фильтры из стекловолокна. Они должны функционировать как абсолютные фильтры.

Чтобы не подергать жидкости воздействию тепла, можно применять мембранные фильтры, при условии, что указанные мембраны являются абсолютными фильтрами, например фильтрами, не пропускающими частицы с диаметром более 0,22 микрона.

Для стерилизации пиши или других специальных компонентов могут использоваться источники гамма-излучения или электронов. Используемые дозы варьируют от 2,5 до 610⁶ рад.

Внутренняя среда Температура. Температура внутри изолятора зависит от комнатной температуры и должна поддерживаться в интервале 22-26^oC.

Влажность. В случае перегрузки, недостаточной вентиляции или при действии обоих этих факторов в изоляторе может образовываться конденсат влаги. Воздух, поступающий в изолятор, должен иметь относительную влажность менее 50 процентов и предпочтительно не ниже 40 процентов.

Подача воздуха. Кратность обмена воздуха в изоляторе должна составлять от 12 до 20 объемов в час, а избыточное давление - 3-5 дюймов (8-13 см) водяного столба. Воздух может поступать централизованно или из индивидуального для каждого бокса натекателя. В качестве системы централизованной подачи воздуха рекомендуется применять воздушный компрессор турбинного типа, поскольку масляные насосы имеют тенденцию выделять аэрозоли масла в линии подачи воздуха.

Изолятор с диффузией воздуха (см. P.C.Trexler 1968. "Equipment design and management: Transport of germ-free animals and current developments in equipment design", p. 23-35. in: M.E.Coates (Ed.) "The germ-free animal in research", Academic Press, London) нечувствителен к потерям в вентиляции при отключении электропитания. Однако этот тип имеет тот недостаток, что позволяет осуществлять меньшую кратность обмена воздуха за час и не может создать защитное избыточное давление, которое могло бы предотвратить попадание загрязнений в случае небольших повреждений в барьере.

Защитные меры на случаи чрезвычайных обстоятельств.

На случай прекращения подачи воздуха на период не более нескольких минут (при отключении энергии или при механическом повреждении) следует предусмотреть соответствующие меры безопасности для подержания давления воздуха внутри изолятора. Выход из строя не обеспеченных должной аварийной поддержкой пленочных изоляторов может в конце концов привести к удушью животных, однако непосредственная опасность заключается в том, что животные могут добраться до пленки или перчаток и повредить их. Это можно предотвратить, временно закупорив воздухопроводы с помощью резиновой пробки. Функционирование источников воздуха для отдельных изоляторов требует лишь аварийного источника питания. Централизованная система подачи воздуха должна иметь второй турбинный компрессор для резервной подачи воздуха.

Рекомендуется ввести графическую запись температуры и давления. В централизованной системе подачи воздуха должна быть установлена система аудиовизуального оповещения, которая приводится в действие в случае падения давления в линии как вследствие потери мощности, так и в случае механических повреждений. Аналогичные системы оповещения должны указывать на нежелательные отклонения в температуре подаваемого воздуха. Для системы индивидуальной подачи воздуха рекомендуется проводить непрерывную графическую регистрацию условий внутри помещения.

Клетки и расположенное внутри оборудование Оборудование. Перечень основного оборудования для лаборатории может включать клетки с защитными крышками, бутылки с водой, кормушки, защитные матерчатые перчатки для резиновых перчаток, дополнительное уплотнение дверей или колпачковые прокладки, длинные покрытые резиной пинцеты, кровоостанавливающие зажимы, ножницы, полотенца, марлевые тампоны, бидоны емкостью в две кварты для хранения инструментов, бидоны с покрытием емкостью в четыре кварты для хранения пищи, ложки, пробирки, бумажные пакетики и непромокаемые пакеты для грязной подстилки.

Клетки должны быть изготовлены из гладкого коррозиестойкого материала. Они должны быть непроницаемыми для жидкостей и легко подвергаться стерилизации. Приемлемыми материалами считаются пластические массы, нержавеющая сталь и стекло. Металлы с гальваническим покрытием корродируют и их не рекомендуется использовать, поскольку загрязнение следами металлов может оказать влияние на результаты эксперимента.

Размеры клеток обычно ограничены размером загрузочного отверстия. Минимальная площадь, необходимая для одной самки мыши и соломенной подстилки для нее, составляет 50 кв.дюймов (970 кв.см). В большинстве случаев для одного животного может потребоваться больше места.

В Таблице А представлены рекомендуемые площади для одного животного при размещении мышей и крыс в зависимости от весовой группы.

Другие рекомендации С целью обеспечения целостности барьерной системы рекомендуется провести испытание па наличие течей с использованием фреона.

Для каждого бокса должен вестись свой протокол проведения операций с целью регистрации в хронологическом порядке всех мероприятий, проводимых в боксе с момента его сборки и стерилизации. Подобные записи обычно хранят в виде картотеки на металлических стеллажах с указанием номера изолятора. Они должны также содержать отметки о проведении обычных операций по обслуживанию, в частности по замене перчаток. На том же стеллаже могут храниться записи о выведении потомства.

Вследствие ограниченности доступного пространства внутри изолятора для пищи и подстилки, а также для транспортировки животных между изоляторами, соединенными стерильными проходами, рекомендуется использовать бумагу и складные пакеты. Внутри изолятора нельзя использовать эфир, поскольку он может взорваться при возникновении статического разряда. В качестве летучего негорючего анестезирующего средства рекомендуется использовать флуотан (бромхлортрифторэтан).

Пища, подстилка и вода Общие рекомендации Необходима полная формула для выпускаемой промышленностью пищи с указанием всех ингредиентов и их содержания, в том числе консервантов, антиоксидантов и других добавок. Должна быть отчетливо обозначена дата изготовления. Изготовитель должен гарантировать, что пища: 1) имеет нормальные приемлемые границы естественной гормональной активности; 2) не содержит добавок, содержащих стимуляторы, гормоны, антибиотики или другие вещества, которые создают ненормальные физиологические условия или вступают в конфликт с экспериментальными методиками; 3) не содержит сальмонеллу по данным анализа статистически выбранных образцов; 4) не содержит загрязнений от грызунов или паразитов; 5) свободна ото всех непревращаемых остатков мясных или рыбных продуктов, которые могут содержать патогены.

Обогащение пищи К пище стерильных животных предъявляются повышенные требования по содержанию определенных питательных веществ, с целью компенсировать потери витаминов, вызванные тепловой обработкой при стерилизации (особенно некоторых витаминов группы B, а также витамином A и D), и потери питательной ценности белков (сокращение количества доступного лизина, метионина, аргинина и триптофана). Пища должна также содержать необходимые питательные вещества, которые обычные животные получают за счет синтеза микробами в желудочно-кишечном тракте (см. B. S. Reddy, B. S. Wostman and J.R.Pleasants 1968. "Nutritionally adequate diets for germ-free animals", p. 87-111, in: M.E.Coates (Ed. ) "The germ-free animal in research", Academic Press, London). Примером подобной пищи является L-485 - недорогая пища, которая прошла интенсивные испытания (см. T.F.Kellogg and B.S.Wostman 1969. "Rat and mouse stock diet L-485", Lab.Anim.Care) и выпускается промышленно (см. Таблицу Б). Для компенсации потерь в качественном составе белков следует не увеличивать общее содержание белков, а добавлять конкретные аминокислоты. Увеличение общего содержания белков в пище приведет к большему потреблению и выделению воды, что ведет к повышению влажности и тем самым ограничивает количество животных данного размера, которые могут быть размещены в изоляторе.

Стерилизация водяным паром (см. B.S.Reddy, B.S. Wostman and J.R.Pleasants 1968. "Nutritionally adequate diets for germ-free animals", p. 87-111, in: M. E. Coatcs (Ed.) "The germ-free animal in research", Academic Press, London).

Конкретная методика будет зависеть от имеющегося под рукой оборудования. Как правило, важную роль играют три фактора: 1. Предварительный вакуум но крайней мере 20 дюймов (508 мм) ртутного столба способствует проникновению водяного пара внутрь нищи в автоклаве или цилиндре, соединенном с атмосферой. Если цилиндр для подачи нищи не соединен с атмосферой, то рекомендуется вакуум 28 дюймов (711,2 мм) ртутного столба или более.

2. Использование минимальной фазы стерилизации, которая гарантирует общую стерильность, плюс безопасные границы, определяемые оборудованием и опытом экспериментатора. Температура, измеряемая во внутренних частях пищи, должна достигать по крайней мере 121^oC. При этой температуре реальная фаза стерилизации должна составлять как минимум 15 минут. При более высоких температурах стерилизации время стерилизации будет несколько короче.

3. Вакуум после стерилизации ускоряет остывание пищи. Это приводит к предотвращению нежелательного разложения питательных веществ. Однако разработанное и изготовленное устройство должно быть таким, чтобы можно было избежать утечек во время этой стадии операции.

В процессе стерилизации пищи водяным паром цель заключается в том, чтобы избежать как неполной стерилизации, так и нежелательного разрушения питательных веществ, вызванного чрезмерно длительным нагреванием. Хотя потерь некоторых питательных веществ трудно избежать, вполне удовлетворительные результаты могут быть получены при контроле за следующими факторами: (a) Техническими параметрами, такими как температура предварительной стерилизации и вакуум после стерилизации, а также размер таблетки.

(b) Содержанием воды в пище. Увеличение содержания воды приводит к лучшему сохранению витаминов группы В после стерилизации (см. D.R.Zimmerman and B.S. Wostmann 1963. "Vitamin stability in diets for germ-tree animals", J. Nutr. 79:318). Для твердой пищи рекомендуемое содержание воды составляет до 25 процентов или может быть таким, чтобы не ухудшать качество пищи при хранении. Изменение в содержании воды в пище должно сопровождаться новым испытанием быстроты, с которой пища достигает температуры стерилизации.

Стерилизация под действием радиации.

(См. B. S. Reddy, B. S. Wostman and J.R.Pleasants 1968. "Nutritionally adequate diets for germ-free animals", p. 87-111, in: M.E.Coates (Ed.) "The germ-free animal in research", Academic Press, London; F.J.Ley, J.Bleby, M. E. Coates and J.S. Paterson 1969. "Sterilization of laboratory animals using gamma radiation", Lab. Anim. 3:221).

Методики и доза зависят от оборудования и типа применяемого излучения. Хотя в общем случае считается, что стерилизация с применением радиации приводит к меньшему разрушению питательных веществ, в настоящее время рекомендуют, чтобы пища проходила стерилизацию водным паром.

Испытания на стерильность Для контроля за степенью стерилизации, которая достигается с применением конкретной методики стерилизации, рекомендуется использовать индикаторную бумагу со спорами Bacillus stearothermophilus. Полоски индикаторной бумаги опускают внутрь пищи. Периодически микробиологическому мониторингу подвергают также изолятор и животных. Указанный контроль необходим для определения случайных загрязнений в результате разрушения барьеров изолятора или неправильной стерилизации изолятора или его содержимого. Указанную процедуру проводят как описано B.S.Wostmann, Ed., "Gnotobiotes: Standards and Guidelines for the Breeding, Care and Management of Laboratory Animals". National Research Council, National Academy of Sciences, Washington, D.C. 1970. pp. 28-39.

Оценка степени потери питательных веществ в процессе стерилизации В качестве полезной проверки степени потери жизненно важных питательных веществ рекомендуется использовать определение количества экстрагируемого тиамина как индикатора количества выделения тиамина, добавленного к пище (см. B.S.Wostmann and P.L. Knight 1960. "The effect of methyl alcohol on the convercion of thiamine to thiochrome", Experientia 16:500). Выделение менее 25% указывает на значительное ухудшение общей питательной ценности пищи. При использовании соответствующего оборудования и должных мер предосторожности должно быть выделено 50% или более.

Хранение твердой пищи Поскольку проведение экспериментов в стерильных условиях обычно стоит очень дорого, то следует принять дополнительные меры предосторожности и никогда не использовать пищу, которая в значительной степени потеряла свои питательные свойства. Рекомендуется, чтобы (а) нестерилизованная пища всегда хранилась в холодильнике и ни в коем случае не более одного месяца и (б) время хранения стерилизованной пищи внутри изолятора должно составлять одну неделю или менее и никогда не превышать десяти дней.

Подстилка Подстилку следует менять по крайней мере один раз в неделю. Рекомендуется, чтобы материал подстилки можно было легко стерилизовать и чтобы он с трудом поглощался животными. Он не должен выделять в результате стерилизации токсичные вещества. Рекомендуется использовать обеспыленные белые сосновые щепки (опилки) и стружки. Приемлемы стружки американской липы или тополя или измельченные початки кукурузы. Не рекомендуется применять продукты переработки диатомовой земли, кедр, деревья смолистых пород и деревья твердых пород. Стерилизацию с помощью оксида этилена не следует использовать до тех пор, пока не будет прояснен вопрос о возможном образовании вредных веществ.

Вода Питьевая вода должна быть стерилизована. Ее обрабатывают в автоклаве в квадратных упаковочных емкостях, сосудах Мейсона или баках, прикрепленных к боксу. Внутри каждого контейнера должно быть оставлено небольшое пространство.

Принципы получения гнотобиотов с применением кесарева сечения Частично ключ к успеху любой операции кесарева сечения заключается в том, чтобы беременность полностью подошла к своему сроку. Это особенно важно для животных с короткими периодами беременности, когда утробный плод может прибавить 20% своего веса в последние 24 часа до родов. Планирование времени спаривания несомненно полезно, однако для животных, дающих большой приплод (крысы и мыши), полезно бывает подождать, чтобы до проведения операции самка дала первое потомство. Для морских свинок наиболее удовлетворительный метод заключается в отборе самок для проведения операции путем измерения степени растяжения лобковых костей (см. B. P. Philihs, P.A.Wolfe and H.A. Gordon 1959. "Studies on rearing the guinea pig germ-free", Ann.N.Y.Acad.Sci 78: 183).

Полученные кесаревым сечением детеныши должны быть перенесены в безмикробную среду прежде, чем они сделают свой первый глоток воздуха. Их можно непосредственно взять у матери путем рассечения матки и перенести в стерильный изолятор через вырез в мембране стерильного барьера или перенести в стерильный изолятор через бактерицидную ловушку путем экстирпации матки. Обычная хирургическая подготовка самки перед проведением операции кесаревого сечения включает удаление шерсти на брюхе, очистку и дезинфекцию оперируемого места. Анестезию проводят предпочтительно путем смещения шейных позвонков крысы или мыши, хотя можно провести анестезию по средней линии брюха или применить общий наркоз, не вызывая при этом значительного ослабления или смертности плода. В случае морских свинок операцию обычно проводят после предварительного воздействия седативным средством и под местным наркозом.

Перенос детенышей после кесаревого сечения через мембрану барьера требует специального оборудования для проведения изоляции. Хирургический бокс Рейнье из нержавеющей стали (см. J.A.Reyniers 1965. "Germ-free life methodology (gnotobiotics) and experimental nutrition", p. 458-466, in: Proc. 3rd Intertat. Congr. Biochem., Bruxelles) имеет встроенную горизонтальную металлическую перегородку, которая разделяет верхнее и нижнее отделение бокса. Перегородка имеет круглое отверстие, покрытое пленкой из майлара, сохраняющей целостность верхнего отделения. Самку, подготовленную к операции, помещают в нижнем отделении таким образом, что ее брюхо оказывается прижатым к майлару. Все хирургические инструменты размещаются в верхнем отделении, и операцию проводят в этой стерильной зоне. Рассечение проводят через пластик и кожу с помощью электрокаутера или скальпеля. Для рассечения кожи предпочтительнее использовать самостерилизующее лезвие электрокаутера. Края кожи и майлара прижимают друг к другу и отгибают. На брюхо кладут стерильную хирургическую салфетку, покрывая разрезанные края кожи, и открытые соединительные ткани перед вскрытием брюшной полости обрабатывают теплым дезинфицирующим раствором (хлорид бензалкония 1:1000). Следует проявить особую осторожность и не повредить кишечник. Полезным может оказаться размещение пары кровоостанавливающих зажимов между брюшной стенкой и внутренними органами. Затем раскрывают матку и вынимают детенышей, оболочки плода удаляют, пуповину пережимают и отрезают. Детенышей осторожно обтирают и массажируют, чтобы стимулировать дыхание. Их переносят в отделение для выращивания, где их вскармливает кормилица или же их кормят вручную. Другим листом майлара можно закрыть хирургическое отверстие и процедуру повторяют для 5 или 6 самок без особого риска внести загрязнения. Роды кесаревым сечением можно провести также, используя в качестве операционной пластиковый изолятор или бокс с перчатками. Внешнюю поверхность пола изолятора предварительно подвергают стерилизации, а затем к нему прижимают брюхо животного так, что он играет ту же роль, что и описанный ранее лист майлара. После проведения операции разрез в пластиковом барьере может быть закрыт стерильной лентой и хирургическую процедуру повторяют для других беременных самок.

Роды иссечением матки чаще проводят в пластиковых изоляторах (см. H.Foster 1959. "A procedure for obtaining nucleus srock for a pathogen-free animal colony", Lab. Anim. Care 9:135). Матку обнажают в асептических условиях и пережимают непосредственно перед шейкой. Иссеченную матку переносят в безмикробное отделение через ловушку с бактерицидной жидкостью. Как только матка окажется в изоляторе, как можно скорее проводят роды детенышей, так чтобы они не надышались отделяемыми при родах водами. Детенышей обычно обтирают и стимулируют им дыхание, а затем пережимают пуповину и отрезают ее. Далее детенышей передают кормилице или кормят вручную.

Иссечение матки может быть с успехом проведено для мышей, крыс и свиней. Однако для морских свинок предпочтительным является рассечение матки, поскольку большая смертность наблюдается в том случае, если с момента отделения от источника материнской крови и до момента размещения внутри изолятора проходит более двух минут.

Системы выращивания в гнотобиологических колониях Инбредные породы Обычные системы выращивания, в которых возможно спаривание брат x сестра, также могут использоваться для получения гнотобиологических колоний.

Неинбредные семьи Истинный случайный отбор при выращивании потомст