Способ изготовления вакцинного препарата против инфекционных болезней бактериальной этиологии животных и птиц

Способ изготовления вакцинного препарата против инфекционных болезней бактериальной этиологии животных и птиц

Реферат

 

Изобретение относится к области ветеринарии. Суспензию культуры по меньшей мере одного возбудителя бактериальной инфекции подвергают инактивации аминоэтилэтиленимином (АЭЭТ). АЭЭТ вносят в культуру возбудителя до концентрации 0,5-4,0% и смесь инкубируют в течение 12-16 ч при 37-38°С. По окончании инактивации антиген осаждают центрифугированием и концентрат антигена разводят сахарозо-желатиновой средой. Затем антиген соединяют с масляным адъювантом в соотношении 1:1, при этом для получения вакцинного препарата антиген используют в количестве, достаточном для стимуляции активной иммунной реакции в организме животного и птицы при введении им целевого препарата. Способ позволяет повысить иммуногенную активность и специфическую безопасность препарата, а также снизить себестоимость его изготовления. 6 з.п.ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и производстве средств специфической профилактики инфекционных болезней бактериальной этиологии животных и птиц. При создании изобретения в качестве тест-модели использованы возбудители пастереллеза и сальмонеллеза животных и птиц, что не ограничивает объем изобретения.

Вакцины - специфические препараты, получаемые из различных микроорганизмов, отдельных компонентов микробов или продуктов их жизнедеятельности и используемые для активной иммунизации в целях профилактики инфекционных болезней животных и птиц. Выпускаемые в настоящее время инактивированные вакцины подразделяют на моновакцины - препараты, приготовленные из инактивированных культур возбудителей (антигенов) одной инфекции, и ассоциированные вакцины - препараты, содержащие смесь иммунизирующих компонентов нескольких возбудителей или разных серологических типов одного возбудителя. Как показывает мировой опыт, вакцинация является во многих случаях единственным средством борьбы с заразными болезнями, в том числе вызываемыми возбудителями пастереллеза и сальмонеллеза.

В нашей стране пастереллез и сальмонеллез сельскохозяйственных животных и птиц широко распространены и наносят сельскому хозяйству значительный ущерб. Для профилактики пастереллеза известно использование инактивированных сорбированных и эмульсионных моно- и ассоциированных вакцин, которые не лишены недостатков.

Известен способ изготовления сорбированной противопастереллезной моновакцины, включающий суспензионное выращивание производственных штаммов пастерелл, осаждение полученной культуры 10% раствором алюминиевых квасцов и ее инактивацию 0,16-0,18% раствором формалина в течение 6 суток (1).

Известен способ изготовления эмульсионной инактивированной противопастереллезной моновакцины, включающий получение суспензии инфекционного агента, осаждение возбудителя, его инактивацию 0,3 - 0,5% раствором формалина и соединение инактивированного антигена с масляным адъювантом (2).

Известен способ изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий, включающий раздельное выращивание в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы штаммов Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ N К-ДЕП, Pasteurella multocida ВГНКИ N 2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ N 1015 в течение 18-24 часов, замораживание - оттаивание полученных культур, отделение жидких фракций, инактивацию культур возбудителей 0,3 - 0,4% раствором формалина, объединение полученных антигенов в равных соотношениях по объему и последующее внесение адъювантов гидроокиси алюминия и сапонина (3).

Известен способ изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против пастереллеза и вирусной геморрагической болезни кроликов, включающий получение возбудителя геморрагической болезни кроликов из суспензии клеток печени кроликов, павших после инфицирования штаммом "Воронежский-87", возбудителя пастереллеза культивированием штамма Panteurella multocida N 5 на питательной среде по Хоттингеру, инактивацию полученных возбудителей, их смешивание в соотношении 1:3 соответственно и последующее добавление одного объема гидроокиси алюминия (4).

Для специфической профилактики сальмонеллеза у животных и птиц в нашей стране применяют живые и инактивированные моно- и ассоциированные вакцины. Те и другие вакцины имеют как положительные, так и отрицательные стороны. Живые вакцины создают неплохой иммунитет как по напряженности, так и по продолжительности. Однако они содержат живые бактерии, вызывающие хотя и легкое, но переболевание с бактерионосительством до 6-8 месяцев, а отсутствие у вакцинных штаммов надежных генетических маркеров затрудняет реальную диагностику сальмонеллеза. Инактивированные вакцины лишены этих недостатков, но им свойственна короткая продолжительность защиты (5). Известен способ изготовления инактивированной моновакцины против сальмонеллеза свиней, включающий получение культуры инфекционного агента, осаждение возбудителя, его инактивацию формалином и соединение бактериального антигена с адъювантом (6, 7).

Известен способ изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против сальмонеллеза овец, включающей раздельное получение суспензий клеток штаммов из сероваров Salmonella abortus ovis, Salmonella typhimurium, Salmonella dublin в физиологическом растворе, инактивацию возбудителей формалином, смешивание полученных антигенов и соединение полученной смеси с масляным адъювантом и иммуностимулятором (8).

Известен способ изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против сальмонеллеза телят, включающий раздельное получение суспензий клеток штаммов из сероваров Salmonella dublin, Salmonella typhimurium на физиологическом растворе, инактивацию возбудителей 0,4 - 0,5% об./об. формалина, смешивание полученных антигенов и соединение полученной смеси с масляным адъювантом и иммуностимулятором (9).

Известен способ изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против сальмонеллеза поросят, включающий раздельное получение суспензий клеток штаммов из сероваров Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium на физиологическом растворе, осаждение возбудителей, их разведение физраствором, инактивацию возбудителей 0,4 - 0,5% об./об. формалина, смешивание полученных антигенов и соединение полученной смеси с масляным адъювантом и иммуностимулятором (10).

Известен способ изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против хламидиоза, кампилобактериоза, сальмонеллеза и лептоспироза мелкого рогатого скота, включающий раздельное получение суспензий клеток лептоспир серогрупп Grippotyphosa, Pomona, Tarassovi, Serjoe, клеток сальмонелл видов Salmonella abortus ovis, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium, клеток кампилобактерий штамма Campilobacter fetus Sub. intestinalis N 30, хламидий из штамма Chlamydia psittaci N 8, инактивацию полученных культур клеток возбудителей формалином, смешивание полученных антигенов и соединение смеси с адъювантом (11).

Недостаток известных способов изготовления моно- и ассоциированных вакцин против инфекционных болезней бактериальной этиологии животных и птиц состоит, в основном, в том, что полученные препараты обладают сравнительно невысокой иммуногенной активностью. Это обусловлено жестким воздействием формалина на белковые антигены, их частичной денатурацией, приводящей к изменению их антигенных свойств и снижению иммуногенной активности в вакцинных препаратах.

Кроме того, моновакцины применяют для специфической профилактики только одного инфекционного заболевания, ассоциированные вакцины - против нескольких инфекций, антигены которых они содержат. Вместе с тем особенности конкретной эпизоотической обстановки, большое разнообразие инактивированных вакцин, изготовленных по различным технологиям и имеющих свои схемы и сроки введения животным создают значительные трудности практическим врачам при применении только моновакцин или ассоциированных препаратов четко оговоренного состава.

Комплексная иммунизация животных, основанная на одновременном введении нескольких вакцин в разные участки тела животного или же путем введения двух - трех заранее указанных вакцин, смешанных по определенной прописи, также не решает вышеназванных проблем (12, 13).

Известны способы инактивации вирусов при производстве вакцин против вирусных заболеваний животных, включающие воздействие на живой вирус этиленимином или его производными (14, 15, 16, 17).

Основной недостаток использования этиленимина заключается в его высокой токсичности и работа с ним требует самых строгих мер предосторожности.

Недостатки производных этиленимина (ацетилэтиленимина, этилэтиленимина, димера этиленимина) состоят в том, что их концентрации, используемые для инактивации вирусов, не пригодны для инактивации возбудителей и бактериальных инфекций.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления эмульсионной инактивированной моновакцины против инфекционных болезней животных и птиц, включающий получение суспензии клеток, по меньшей мере, одного возбудителя болезни, осаждение инфекционного агента, разведение концентрата 1/15 М фосфатно-буферным раствором, инактивацию инфекционного агента 0,3 - 0,5% раствором формалина, соединение инактивированного антигена с масляным адъювантом для получения целевого препарата (2).

Недостаток способа-прототипа состоит в том, что полученный препарат обладает сравнительно невысокой иммуногенной активностью. Это обусловлено жестким химическим воздействием формалина на белковые антигены, их частичной денатурацией, приводящей к снижению их антигенной и иммуногенной активности.

В задачу создания изобретения входили поиск нового химического реагента для инактивации возбудителей инфекционных болезней животных и птиц, разработка на его основе способа изготовления новых стандартных моновакцин, обладающих высокой иммуногенной активностью, специфической безопасностью и низкой себестоимостью производства, создание на их основе комплексного препарата, ассоциированной вакцины, которую можно было бы приготовить непосредственно перед применением из тех моновакцин, антигены возбудителей которых актуальны в данной конкретной эпизоотической обстановке.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении иммуногенной активности и специфической безопасности препарата путем сохранения исходных свойств белковых антигенов микробов и бактерий при инактивации, а также в снижении себестоимости изготовления препарата путем стандартизации и оптимизации его дозы и объема введения и получения возможности создания высокоиммуногенного комплексного препарата из любой комбинации антигенов возбудителей, актуальных для конкретной эпизоотической обстановки, в виде отдельных моновакцин, изготовленных по единой стандартной технологии.

Указанный технический результат достигается созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: 1) способ изготовления вакцинного препарата против инфекционных болезней бактериальной этиологии животных и птиц; 2) получение суспензии культуры, по меньшей мере, одного возбудителя инфекции; 3) инактивация полученной культуры; 4) в качестве инактиванта используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ); 5) АЭЭИ вносят в суспензию культуры возбудителя до концентрации 0,5 - 4%; 6) инактивацию возбудителя ведут в течение 12-16 ч при 37 - 38^oC; 7) осаждение полученного антигена: 8) разведение концентрата антигена стабилизирующей средой для сохранения антигена от разрушения при хранении после инактивации; 9) в качестве стабилизирующей среды используют сахарозо-желатиновую среду: 10) соединение антигена с адъювантом для получения вакцинного препарата; 11) антиген и адъювант соединяют в соотношении 1:1; 12) в качестве адъюванта используют масляный адъювант; 13) для получения вакцинного препарата антиген используют в количестве, достаточном для стимуляции активной иммунной реакции в организме животного или птицы при введении им целевого препарата; 14) антиген используют в количестве, по крайней мере, 15 ИмД₅₀ на одну иммунизирующую дозу вакцинного модуля; 15) объем одной иммунизирующей дозы вакцинного препарата составляет 0,2-0,4 см³; 16) объем одной иммунизирующей дозы вакцинного препарата составляет предпочтительно 0,3 см³.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана: 1) способ изготовления вакцинного препарата против инфекционных болезней бактериальной этиологии животных и птиц: 2) получение суспензии культуры, по меньшей мере, одного возбудителя инфекции; 3) инактивация полученной культуры; 4) в качестве инактиванта используют АЭЭИ; 5) АЭЭИ вносят в суспензию культуры возбудителя до концентрации 0,5 - 4%; 6) осаждение полученного антигена; 7) разведение концентрата антигена стабилизирующей средой; 8) соединение антигена с масляным адъювантом для получения вакцинного препарата; 9) антиген берут в количестве, достаточном для стимуляции активной иммунной реакции в организме животного или птицы при введении им целевого препарата.

Предлагаемый способ характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования: 1) инактивацию ведут в течение 12-16 ч при 37-38^oC; 2) в качестве стабилизирующей среды используют сахарозо-желатиновую среду; 3) антиген и адъювант соединяют в соотношении 1:1; 4) для получения вакцинного модуля антиген используют в количестве, по крайней мере, 15 ИмД₅₀ на одну иммунизирующую дозу вакцинного препарата; 5) объем одной иммунизирующей дозы вакцинного препарата составляет 0,2 - 0,4 см³; 6) объем одной иммунизирующей дозы вакцинного модуля составляет предпочтительно 0,3 см³.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются: 1) способ изготовления вакцинного препарата против инфекционных болезней бактериальной этиологии животных и птиц; 2) получение суспензии культуры, по меньшей мере, одного возбудителя инфекции; 3) инактивация полученной культуры; 4) осаждение антигена; 5) разведение концентрата антигена; 6) соединение антигена с масляным адъювантом для получения вакцинного препарата; По сравнению со способом - прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются: 1) в качестве инактиванта используют АЭЭИ; 2) АЭЭИ вносят в суспензию культуры возбудителя инфекции до концентрации 0,5 - 4,0%; 3) после осаждения концентрат антигена разводят стабилизирующей средой; 4) для получения вакцинного препарата антиген используют в количестве, достаточном для стимуляции активной иммунной реакции в организме животного или птицы при введении им целевого препарата.

Предлагаемый способ характеризуется другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования: 1) инактивацию ведут в течение 12-16 ч при 37-38^oC; 2) в качестве стабилизирующей среды используют сахарозо-желатиновую среду; 3) антиген и масляный адъювант соединяют в соотношении 1:1; 4) для получения вакцинного препарата антиген берут в количестве, по крайней мере, 15 ИмД₅₀ на одну иммунизирующую дозу вакцинного препарата; 5) объем одной иммунизирующей дозы вакцинного препарата составляет 0,2 - 0,4 см³; 6) объем одной иммунизирующей дозы вакцинного препарата составляет предпочтительно 0,3 см³.

Благодаря использованию предлагаемого способа получен вакцинный препарат против инфекционных болезней бактериальной этиологии животных и птиц, обладающий по сравнению с прототипом более высокой иммуногенной активностью, специфической безопасностью и низкой себестоимостью его изготовления.

Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что для инактивации возбудителей инфекционных болезней животных и птиц используют АЭЭИ, который, разрушая РНК или ДНК инфекционного агента, не изменяют его белковую структуру и сохраняет его исходные антигенные свойства и иммуногенную активность, что позволило снизить концентрацию специфического антигена в одной прививной дозе вакцинного препарата, по крайней мере, до 15 ИмД₅₀ (пятнадцать пятидесятипроцентных иммунизирующих доз), т. е. в 5 раз без потери эффективности, а использование масляных адъювантов дало возможность резко снизить объем одной прививной дозы до уровня 0,2 - 0,4 см³. Кроме того, стало возможным готовить ассоциированные эмульсионные инактивированные вакцины не на предприятии биологической промышленности, а непосредственно практическими ветеринарными врачами на местах путем простого смешивания отдельных вакцинных препаратов, изготовленных предлагаемыми способом по единой стандартной технологии и актуальных для данной эпизоотической обстановки. При этом объем одной прививной дозы ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцины слагается из суммы объемов прививных доз смешанных моновакцин, который одинаков для всех вакцинных препаратов.

Таким образом, решением проблемы комплексной иммунизации животных является ассоциированная эмульсионная инактивированная вакцина, представляющая из себя отдельные вакцинные препараты в виде инактивированных моновакцин, изготовленных по единой стандартной технологии предлагаемым способом, имеющих расчетную концентрацию специфического антигена, позволяющую их смешивать (при необходимости) перед применением и имеющих унифицированное наставление по применению вакцин для иммунизации определенных групп животных: молодняка свиней, молодняка крупного рогатого скота, беременных маток, взрослого поголовья свиней и т.д.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого способа, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого способа. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в предлагаемом способе, изложенных в формуле изобретения.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого способа условно патентноспособности "изобретательский уровень" заявителем проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее.

Известно использование АЭЭИ для инактивации вируса ящура (17). Для инактивации пастерелл и сальмонелл АЭЭИ использован авторами впервые. АЭЭИ инактивирует пастереллы и сальмонеллы также по реакции первого порядка. Однако проведенными исследованиями установлено, что концентрации АЭЭИ, используемые для инактивации вируса ящура, не приемлемы для инактивации пастерелл и сальмонелл. Для инактивации инфекционных агентов авторами предложено использовать АЭЭИ в концентрации 0,5 - 4%, преимущественно 1-2%, что выходит далеко за пределы значений концентраций АЭЭИ, используемых для инактивации вируса ящура. В этом состоит существенное отличие предлагаемого способа от изобретения по патенту РФ N 594771.

Другое существенное отличие предлагаемого способа заключается в том, что сразу после инактивации и осаждения авторами предложено разводить концентрат антигена в стабилизирующей среде, в качестве которой целесообразно использовать сахарозо-желатиновую смесь. Необходимость введения этой операции обусловлена тем, что в результате проведенных исследований авторами установлено, что при хранении в жидкой среде антигены пастерелл и сальмонелл быстро разрушаются под действием ферментов, теряя свои антигенные свойства и иммуногенную активность. Разведение полученного антигена в сахарозо-желатиновой среде позволяет предотвратить его разрушение и хранить сколь угодно долго до использования в вакцинном препарате. Операция по разведения антигена в стабилизирующей среде при изготовлении вакцинного препарата предложена авторами впервые.

Третье существенное отличие предлагаемого способа состоит в том, что авторами предложена впервые расчетная концентрация специфического антигена в одной иммунизирующей дозе в составе вакцинного препарата, равная, по меньшей мере, 15 ИмД₅₀ и способная индуцировать напряженный иммунитет в организме животного или птицы при введении им целевого препарата, что позволяет смешивать отдельные вакцинные препараты для изготовления модульных ассоциированных вакцин непосредственно на месте их применения в хозяйствах в зависимости от конкретной эпизоотической обстановки.

Результаты поиска показывают, что предлагаемый способ не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующим разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого способа), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого способа преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

ПРИМЕР 1. Для изготовления вакцинного препарата против пастереллеза свиней в каждую ампулу с сухой культурой производственных штаммов пастерелл трех сероваров вносят 2-3 см³ питательной среды. В качестве питательной среды используют бульон по Хоттингеру с pH 7,5-7,8 и показателем аминного азота 200-250 мг%. Полученной равномерной взвесью пастерелл каждого серовара в объеме 0,3-0,5 см³ засевают по 2-3 флакона емкостью 100 см³, содержащих по 40-50 см³ питательной среды. Одновременно производят контрольные высевы каждой культуры в пробирки с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом. Посевы культивируют в течение 12-16 ч при 37-38^oC. В результате получают культуру микроорганизмов первой генерации. Культуры первой генерации проверяют микроскопически. Для получения культуры второй генерации чистую культуру первой генерации каждого серовара засевают по 5-15 см³ каждого серовара на питательную среду в трех-, пяти- или десятилитровые бутыли с содержанием среды 1/2 объема бутыли с одновременным проведением контрольного высева в пробирки с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и в бактериологические чашки с МПА.

Матриксную культуру второй генерации в количестве, необходимом для засева в реактор, выращивают в термостате в течение 6-8 ч при 37-38^oC с 2-3 перемешиваниями культуры в течение 1-2 мин. Из вырощенной культуры делают посевы в пробирки с питательными средами, чашки Петри с МПА, проводят микроскопию и определяют концентрацию микробных клеток, которая должна быть не менее чем 10⁹ КОЕ/см³. Для получения бактериальной массы матриксную культуру микроорганизмов каждого серовара вносят в отдельный реактор с питательной средой. Матриксную культуру вносят в объеме 5-10% от рабочего объема реактора. Культивирование ведут при 37-38^oC и pH 7,4-7,7 в течение 12 ч до получения суспензии с концентрацией микробных клеток 2-410¹⁰ КОЕ/см³. Для регулирования pH используют растворы Na₂HPO₄ и NaH₂PO₄. Вырощенные культуры микроорганизмов каждого серовара с помощью забуференного физиологического раствора приводят к единой концентрации, смешивают в равных пропорциях, перекачивая в стерильный реактор. Полученную микробную суспензию подвергают инактивации АЭЭИ. Для этого в микробную суспензию вносят АЭЭИ до концентрации 0,5-4,0%, преимущественно 1-2%, и инактивируют до 12 ч в условиях перемешивания при 50-80 об/мин и 37-38^oC. По окончании инактивации антиген оставляют при комнатной температуре в стационарных условиях на 18-24 ч. Контроль полноты для инактивации осуществляют путем высева содержимого реактора на бульон и агар по Хоттингеру и инкубирование посевов при 37-38^oC в течение 18-24 ч. Роста бактериальной микрофлоры на питательных средах не должно быть. Полученный антиген освобождают от среды культивирования путем осаждения на проточной центрифуге. Концентрат антигена ресуспендируют в сахарозо-желатиновой среде до концентрации 10¹⁰КОЕ/см³ по оптическому стандарту ГИСК им. Тарасевича. После этого антиген соединяют в равных пропорциях с масляным адъювантом, содержащим эмульгатор. Смесь эмульгируют в коллоидной мельнице и получают эмульсионную инактивированную моновакцину против пастереллеза свиней. Полученный вакцинный препарат представляет собой эмульсию белого или белого с желтоватым оттенком цвета слегка вязкой консистенции, pH 7,2-7,6. При длительном хранении возможно незначительное отслоение минерального масла над не расслаивающейся однородной эмульсией. При тщательном встряхивании вакцина приобретает вид гомогенной массы. Полученный препарат подвергают контролю на стерильность, безвредность, реактогенность и иммуногенную активность.

Одна иммунизирующая доза полученного препарата должна содержать антиген в количестве, по меньшей мере, 15 ИмД₅₀ в объеме 0,2-0,4 см³ предпочтительно 0,3 см³.

ПРИМЕР 2. Для изготовления вакцинного препарата против сальмонеллеза свиней используют сухие культуры производственных штаммов сальмонелл двух сероваров. Вакцинный препарат готовят и контролируют так, как описано в примере 1.

ПРИМЕР 3. Для приготовления ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцины используют отдельные эмульсионные инактивированные моновакцины, полученные так, как описано в примере 1 или 2, актуальных для данной эпизоотической обстановки и изготовленных по единой стандартной технологии, которые смешивают непосредственно перед применением. Например, вакцину против сальмонеллеза свиней эмульсионную инактивированную, полученную предлагаемым способом, смешивают с равным количеством вакцины против пастереллеза свиней эмульсионной инактивированной, также полученной предлагаемым способом. Оба препарата изготовлены по единой технологии. В результате смешивания получают ассоциированную вакцину.

ПРИМЕР 4. Бактериологический контроль стерильности ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцины, полученной так, как описано в примере 1, осуществляют путем проведения бактериологического контроля стерильности отдельных эмульсионных инактивированных моновакцин.

Контроль проводят следующим образом: пробы моновакцин высевают на сывороточный бульон и агар, жидкую и плотную среду Сабуро, МПА, МПБ - по 3 пробирки, на МППБ - по 2 пробирки и 2 флакона, среду Эндо - по 3 чашки. Для выявления аэробов высевают по 0,5 см³ вакцины в одну пробирку и 2 см³ в один флакон, а для выявления анаэробов - соответственно по 1 и 5 см³. Пробирки, бактериологические чашки, флаконы с посевами на всех средах, кроме Сабуро выдерживают в термостате при (37,0 0,5)^oC, на среде Сабуро при (21,0 0,5)^oC в течение 7 суток. По истечении указанного срока делают пересев, за исключением посевов на МПА, среду Эндо, агар Сабуро и сывороточный агар. Пересевают пробы на те же питательные среды и в тех же объемах, что и при посеве. Вторичные посевы выдерживают 7 суток. Одновременно проводят контроль стерильности питательных сред. Результаты первичного и повторного посевов оценивают путем микроскопического исследования посевов. Рост микроорганизмов на питательных средах должен отсутствовать.

ПРИМЕР 5. Контроль безвредности и реактогенности ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцины, полученной предлагаемым способом, осуществляют путем проведения контроля безвредности и реактогенности как отдельных вакцинных препаратов, так и их смеси. Берут по три флакона с 50 см³ двух разных препаратов: "Вакцина против пастереллеза свиней эмульсионная инактивированная" и "Вакцина против сальмонеллеза свиней эмульсионная инактивированная" - смешивают в стерильной емкости. Полученную при этом ассоциированную вакцину вводят: 5 кроликам массой 1,5-2 кг по 1 см³ внутримышечно из расчета 0,5 см³ в каждое бедро; 5 белым мышам массой 16 - 18 г по 0,5 см³ подкожно в области спины и 5 морским свинкам массой 350 - 400 г, по 1 см³ внутримышечно в бедро. Наблюдение за животными ведут в течение 10 суток. Все животные должны остаться живы.

Реактогенность ассоциированной вакцины проверяют на 3 подсвинках, которым вводят по 5 см³ смешанного, готового к применению препарата внутримышечно за ухом. Через 14 дней после введения вакцины у поросят на месте инъекции препарата сохраняются местные изменения в виде уплотнения тканей в глубине величиной от 1 до 3 см. Уплотнения однородны, без размягчения, безболезненны. При вскрытии поросят в толще мышечного слоя обнаружены светло-желтого цвета гранулемы, содержащие внутри нерассосавшуюся вакцину.

ПРИМЕР 6. Для испытания иммуногенной активности ассоциированной модульной эмульсионной инактивированной вакцины, полученной предлагаемым способом, используют кроликов, на которых оценивают специфическую активность пастереллезного препарата из расчета 10 кроликов на серовар.

Кроликам вакцину вводят внутримышечно в бедро в объеме 0,2 см³ однократно. Через 21 день после иммунизации 30 вакцинированных и 30 интактных кроликов заражают в бедро предварительно оттитрованной смертельной дозой пастерелл соответствующего серовара (10 ЛД₅₀) (десять пятидесятипроцентных смертельных доз).

Серовар В - контрольные животные должны пасть в течение 16-36 часов. Вакцинированные должны остаться живы в течение 10 суток наблюдения после гибели контроля.

Серовар А - контрольные животные должны пасть в течение 2-3 суток. Вакцинированные должны остаться живы в течение 10 суток наблюдения после гибели контроля.

Серовар Д - контрольные животные должны пасть в течение 7-10 суток. Вакцинированные должны остаться живы в течение 10 суток наблюдения после гибели контроля.

ПРИМЕР 7. Для испытания иммуногенной активности модульной ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцины, полученной предлагаемым способом, используют морских свинок, на которых оценивают специфическую активность сальмонеллезного препарата из расчета 10 животных на серовар.

Вакцину вводят морским свинкам внутримышечно в бедро в объеме 0,2 см³. Через 21 день после иммунизации 20 вакцинированных и 20 интактных морских свинок заражают подкожно предварительно оттитрованной смертельной дозой сальмонелл соответствующего серовара (10 ЛД₅₀).

Серовар Salmonella choleraesuis - 50% контрольных животных должны пасть через 7 суток. Вакцинированные морские свинки должны остаться живы в течение 10 суток наблюдения после гибели 50% контроля.

Серовар Salmonella typhimurium - 50% контрольных животных должны пасть через 6 суток. Вакцинированные морские свинки должны остаться живы в течение 10 суток наблюдения после гибели 50% контроля.

ПРИМЕР 8. Для испытания иммуногенной активности ассоциированной вакцины, полученной предлагаемым способом, на свиньях используют 40 поросят 1,5-2 месячного возраста, иммунизированных ассоциированной вакциной однократным введением 0,5 см³ препарата внутримышечно в области шеи. Через 21 день после иммунизации опытных - по 6 животных на каждый серовар пастерелл и сальмонелл и по 2 интактных контрольных подсвинка заражают предварительно оттированной смертельной дозой пастерелл и сальмонелл. Против пастереллеза внутримышечно в бедро в дозе 1000 ЛД₅₀. Против сальмонеллеза внутрибрюшинно, в дозе 40 млрд. микробных клеток в объеме 1 см³.

Контрольные подсвинки должны пасть: от пастереллеза серовара А - в течение 3-5 суток, серовара В - в течение 36-48 часов, серовара Д - через 5 суток.

Вакцинированные животные должны остаться живы в течение 10 суток наблюдения после гибели контроля.

Контрольные подсвинки от сальмонеллеза должны пасть в течение 72 часов. Вакцинированные животные должны остаться живы в течение 10 суток наблюдения после гибели контроля.

ПРИМЕР 9. Проведены опыты по сравнительному изучению эффективности: 1) двух препаратов, полученных предлагаемым способом: "Вакцина против пастереллеза свиней эмульсионная инактивированная" и "Вакцина против сальмонеллеза свиней эмульсионная инактивированная"; 2) ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцины против пастереллеза и сальмонеллеза свиней, приготовленной также предлагаемым способом; 3) ассоциированной вакцины против пастереллеза и сальмонеллеза свиней эмульсионной инактивированной, приготовленной способом-прототипом технологии (контроль).

Результаты сравнительного изучения эффективности перечисленных вакцин на белых мышах, морских свинках, кроликах и подсвинках представлены в таблице 1.

ПРИМЕР 10. В неблагополучном по пастереллезу и сальмонеллезу свинокомплексе проведены сравнительные испытания опытной ассоциированной эмульсионной инактивированной вакцины против пастереллеза и сальмонеллеза свиней, приготовленной предлагаемым способом, и ассоциированной вакцины, изготовленной по способом-прототипом. Всего вакцинировано 400 поросят в возрасте 20-25 дней. Опытную ассоциированную вакцину готовили непосредственно на месте путем смешивания двух вакцинных препаратов: "Вакцины против пастереллеза свиней эмульсионной инактивированной" и "Вакцина против сальмонеллеза свиней эмульсионной инактивированной". Реактогенность и иммуногенную активность сравниваемых препаратов оценивали в виде процента сохранности поголовья поросят в контрольной (привитой традиционной вакциной) и опытной (привитой опытной ассоциированной вакциной) группах. На месте введения опытной ассоциированной вакцины через 2-3 дня у некоторых из привитых животных наблюдалось образование разлитой плотной припухлости, сохраняющейся до 2 недель". Каких либо выраженных изменений общего состояния организма животных не наблюдалось. За период наблюдения ни одно из привитых животных не проявило клинических признаков пастереллеза и сальмонеллеза. Результаты испытаний приведены в таблицах 2 и 3.

Полученные данные свидетельствуют, что опытная ассоциированная вакцина против пастереллеза и сальмонеллеза свиней является безвредной и создает иммунитет против инфекций, вызываемой пастереллами и сальмонеллами. Обеспечение хозяйств средствами профилактики пастереллеза и сальмонеллеза в виде отдельных вакцинных препаратов представляется очень удобным, так как можно их использовать как отдельно, так и в форме ассоциированной вакцины, если это требует эпизоотическая обстановка.

Таким образом, изложенные сведения свидетельствуют о выполнении при использовании предлагаемого способа следующей совокупности условий: способ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в области микробиологии и биотехнологии; для предлагаемого способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов; способ, воплощающий предлагаемое изобретение, при его осуществлении обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата: повышение иммуногенной активности, специфической безопасности препарата и снижение себестоимости его изготовления.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации 1. Авт. свид. СССР N 94044; 30 h, 6; 17.02.51 г.

2. Авт. свид. СССР N 1839092; A 61 K 39/102, 39/39; 30.12.93 г. (прототип).

3. Пат. РФ N 2099083; A 61 K 39/116, 39/09, 39/102; C 12 N 1/20 (C 12 N 1/20, C 12 R 1/46).

4. Пат. РФ N 2071662; A 61 K 39/295, 39/102, 39/125; 10.01.97 г.

5. Емельяненко П.А., Дунаев Г.В. и др. Ветеринарная микробиология. М., Колос, 1982, 152-173.

6. Наставление по при