Способ нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, ее производных и полусинтетических полимеров

Способ нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, ее производных и полусинтетических полимеров

Реферат

 

Изобретение относится к способам нанесения на поверхность предметов покрытия на основе гиалуроновой кислоты, ее производных или других природных или полусинтетических полимеров для применения в области хирургии, охраны здоровья и диагностики. Способы позволяют соединить такие полимеры стабильно с поверхностью предметов, изготовленных из разнообразных материалов. Обработанные в соответствии со способами поверхности характеризуются высокой степенью смачиваемости и способны ингибировать адгезию клеток или бактерий, находящихся в биологических жидкостях. Изобретение заключается в способе нанесения на поверхность предмета покрытия на основе гиалуроновой кислоты или ее производного. Способ включает взаимодействие гиалуроновой кислоты или ее производного с алкоксисилановым агентом сочетания в водной среде или в органическом растворителе в присутствии конденсирующего или бифункционального агента с получением раствора, содержащего продукт реакции гиалуроновой кислоты или ее производного и алкоксисиланового агента сочетания, обработку поверхности предмета плазмой, нанесение на обработанную поверхность указанного раствора, содержащего продукт реакции гиалуроновой кислоты или ее производного и алкоксисиланового агента сочетания, удаление раствора с поверхности указанного предмета, тогда как указанный продукт реакции гиалуроновой кислоты или ее производного и алкоксисиланового агента сочетания реагирует с указанной поверхностью предмета. 4 с. и 30 з.п. ф-лы, 2 табл., 7 ил.

Изобретение относится к способам покрытия внешних поверхностей предметов гиалуроновой кислотой и ее производными или другими природными или полусинтетическими полимерами, может быть применено в области хирургии, медико-санитарной помощи и в диагностике. Согласно такому способу можно соединить полимер стабильно с поверхностями предметов, изготовленных из широкого круга материалов. Поверхности, обработанные способами, описанными в данном изобретении, характеризуются высокой смачиваемостью и скольжением в водной среде и улучшенными свойствами при взаимодействии с биологическими фазами. Например, они способны ингибировать адгезию клеток или бактерий, присутствующих в биологических жидкостях.

Гиалуроновая кислота является природным мукополисахаридом, присутствующим в различных концентрациях практически во всех тканях. Как известно любому специалисту, водные растворы гиалуроновой кислоты или ее солей, или производных, или вообще полисахаридов характеризуются значительной вязкостью, скольжением и способностью снижать трение, свойством, которое определяет наличие и функцию полисахаридов, относящихся к тому же семейству, что и гиалуроновая кислота, в организмах людей и животных (Michels R.G. et a1. Sodium hualuronate in anterior and posterior segment surgery. Physicochemical of Hyaluronic Acid, 1-15, 1989).

Благодаря этим качествам полисахариды, относящиеся к тому же семейству, что и гиалуроновая кислота (природные полисахариды и полисахариды, полученные химическим синтезом из природных соединений), были подробно изучены. В частности, значительные усилия были затрачены на идентификацию методов, при помощи которых тонкие слои гиалуроновой кислоты (eвропейский патент N 0138572) или ее производных (патент США N 4851521) могут быть закреплены на поверхности других материалов. Цель этого исследования состояла в получении предметов с улучшенными поверхностными свойствами при сохранении всех характеристик материала, из которого они изготовлены (этот материал далее будет называться субстратом). В частности, благодаря высокой степени гидрофильности гиалуроновая кислота и ее производные особенно пригодны для изготовления предметов, чье использование требует, чтобы их поверхности были стойкими к адгезии к клеткам, находящимся в тканях или биологических жидкостях. Такие поверхности представляют особый интерес в областях, где адгезия между материалом и клетками может причинить вред биологическим тканям (Kaufman Н.Е. et al.- Science, 189, 525, 1977).

Модификация поверхностей материалов гиалуроновой кислоты или ее производными оказалась затруднительной для многих исследователей.

Одним из первых свойств, которые бросаются в глаза, является то, что растворы гиалуроновой кислоты имеют довольно большое поверхностное натяжение, равное или немного меньшее соответствующей величины для воды (F.Н. Silver et al. Journal of Applied Biomaterials, 5, 89, 1994). Хорошо известно, что для получения равномерного покрытия нанесением раствора наносимый материал должен иметь поверхностное натяжение, которое меньше поверхностного натяжения субстрата, чтобы покрытие было целым и ровным. Более того, почти все полимерные материалы, которые можно использовать в качестве субстратов, обладают поверхностным натяжением, которое меньше, чем у воды, свойством, которое препятствует образованию тонкого слоя гиалуроновой кислоты, равномерно покрывающего субстрат (Garbassi F. et al, Polimer Surfaces, from Physics to Technology, Wiley, Chichester, 304, 1994).

Следует отметить, что гиалуроновая кислота растворяется в воде, поэтому любые предметы, полученные путем покрытия их слоем раствора гиалуроновой кислоты, мгновенно теряют это покрытие при контакте с водными растворами, включая биологические жидкости. Производные гиалуроновой кислоты, даже те, которые не растворяются в воде, в любом случае являются чрезвычайно гидрофильными и сильно склонны разбухать в присутствии воды или водных растворов (Н. N. Joshi and Е.М. Topp, International J. of Pharm. 80 (1992) 213-225). В водных средах это свойство быстро вызывает ухудшение гидрофильного поверхностного слоя, нанесенного на субстрат просто путем использования раствора. По этим причинам исследовались методы, использующие химическую связь между поверхностью субстрата и гиалуроновой кислотой или ее производными. Наличие стабильной химической связи предотвращает растворение поверхностного слоя и придает прочность и долговременность поверхности предмета. Реализация химической связи между субстратом и поверхностным слоем требует наличия у обоих подходящих химических групп. В то время как химическая структура гиалуроновой кислоты обеспечивает наличие различных подходящих функций, поверхность большинства синтетических материалов не особенно подходит для этого типа реакции. По этой причине способы создания химической связи между поверхностным слоем гиалуроновой кислоты или ее производных и синтетическим субстратом обычно состоят из двух стадий. На первой стадии в поверхность вводятся подходящие химические группы, затем на второй стадии начинается реакция между химическими группами, введенными в поверхность субстрата, и гиалуроновой кислотой или ее производными. Например, в патентах США 4657820, 4663233, 4722867, 4801475, 4810586, 4959074, 5023114 и 5037677 описано использование промежуточного слоя между субстратом и покрытием на основе гиалуроновой кислоты. Этот промежуточный слой физически соединяется с субстратом и содержит химические группы, которые пригодны для образования связи с химическими группами гиалуроновой кислоты. Для облегчения распределения и обеспечения ровного покрытия гиалуроновой кислоты на субстрате, как описано в вышеуказанном патенте, используется альбумин, который при добавлении к гиалуроновой кислотe улучшает ее способность равномерно смачивать промежуточный слой.

В других источниках описано использование плазменной технологии для введения в субстрат реакционноспособных групп. Этот метод (Garbassi F. et a1. Polymer Surfaces, from Physics to Technology, Wiley, Chichester, 6, 1994) дает возможность модифицировать поверхность полимерных материалов быстро и эффективно. Например, в международной заявке WO 94/06485 описано введение функциональных групп в поверхность полимерного материала путем обработки плазмой метанола. Затем обработанный материал приводят в контакт с раствором эпихлоргидрина, что гарантирует присутствие групп, пригодных для реакции с полисахаридами.

Другая статья (Acta Phisiologica Scandinava Materials Research, 18, 953, 1984, Elan et al. ) описывает обработку кислородной плазмой с последующим нанесением 3- глицидоксипропилтриметоксисилана. Поверхности, обработанные таким образом, используют для образования ковалентных связей с полисахаридами.

Хотя вышеуказанные методы в общем являются удовлетворительными, они, тем не менее, каждый сталкивается при осуществлении с трудностями. В частности, использование промежуточного слоя требует, чтобы его состав был адаптирован к природе субстрата, чтобы как можно в большей степени увеличивать адгезию. В случае изготовления предметов, состоящих из новых материалов или редко используемых материалов для определения наиболее подходящего состава для промежуточного слоя требуется много времени и усилий. Если предметы, на которые нужно нанести покрытия, состоят из разных материалов, трудно нанести подходящий промежуточный слой на каждый компонент, при этом нужно избежать перекрывания и попадания промежуточных слоев в неподходящие места. Более того, может быть нежелательным использовать для улучшения смачиваемости субстрата альбумин, особенно в случае изделий, предназначенных для биомедицинских целей.

С учетом других вышеуказанных примеров предпочтительно избегать использования эпихлоргидрина и 3-глицидоксипропилтриметоксисилана, так как известно, что эти два соединения очень вредны для здоровья. В действительности, согласно классификации вредных веществ, выпущенных Европейским Союзом, эти соединения кодируются как "R45" и "R40" соответственно, что означает риск для здоровья, как сообщается в большинстве каталогов на химические продукты и реагенты. Это обозначение указывает, что в первом случае продукт может вызвать рак, и во втором случае, что есть опасность возникновения необратимых эффектов.

В общем число реакций с участием функциональных групп, иммобилизованных на поверхности больших молекул, таких как полисахариды, очень ограничено явлением, общеизвестным как пространственное затруднение. Большой размер молекул полисахарида предотвращает контакт или препятствует контакту между реакционноспособными группами, поэтому вероятность эффективного протекания реакции очень мала.

Другие способы, описанные в уровне техники, включают реакцию между полисахаридами и аминогруппами. Японский патент JP 04126074 раскрывает применение обработки аммониевой плазмой для введения аминогрупп на поверхность полимерных субстратов. Затем аминогруппы реагируют с гиалуроновой кислотой или другими полисахаридами при использовании агента конденсации. В патенте США N 4810784 поверхности предмета, изготовленного из полимерного материала, обрабатывают реакционноспособными растворами, так чтобы ввести отрицательные электростатические заряды в саму поверхность. Обработанную таким способом поверхность приводят в контакт с водным раствором полиэленимина (ПЭИ), полимера, характеризующегося наличием аминогрупп и положительного электростатического заряда. Взаимодействие между различными зарядами связывает ПЭИ с модифицированной поверхностью с получением поверхности, обогащенной аминогруппами. Гепарин и другие полисахариды связывают с аминированной поверхностью после обработки растворами нитритов. В органической химии известен тот факт, что действие нитратов вызывает образование альдегидных групп. Эти группы реагируют с аминированной поверхностью, необратимо связывая полисахарид с самой поверхностью. Ту же реакцию используют, когда вводят альдегидные группы путем слабого окисления периодатом (C. Brink et al.- Coloids and Surfaces, 149, 66, 1992).

Более того, реакция между ПЭИ и любыми альдегидными группами, находящимися или введенными в полисахарид, иногда используется для связывания полисахарида в различных конформациях с поверхностью предмета (Е. Ostenberg et al., Journal of Biomedical Materials Research, 29, 741 (1995)). В патенте US N 5409696 описана модификация поверхности материалов плазмой, содержащей пары воды, и последующая реакция обработанной поверхности ПЭИ. Полученная таким образом поверхность обогащена аминогруппами и способна связывать гепарин и другие полисахариды необратимо при действии конденсирующих агентов. Обычно реакция между карбоксильными группами полисахарида и аминогруппами поверхности промотируется этилдиметиламинопропилкарбодиимидом (ЭДК). Использование этого способа для покрытия внутренней поверхности трубок, которые предназначены для контактирования с кровью, описано Р.V. Narayanan (Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 6, 181, 1994).

Исследования показали, что способы, описанные в указанных патентах и статьях, не вполне удовлетворяют требованиям, предъявляемым к изготовлению предметов с поверхностями, модифицированными гиалуроновой кислотой или ее производными. В действительности введение функциональных групп аминного типа при помощи аммонийной плазмы, как описано в японском патенте JP 04126074, является не очень используемым на практике. Специалисты в этой области знают, что плотность функциональных групп, введенных этим методом в поверхность субстрата, сравнительно невелика и зависит в значительной степени от точной геометрии реактора, используемого для обработки плазмы, от природы субстрата, от наличия добавок и/или загрязняющих веществ на его поверхности и внутри него и от условий хранения субстрата до и после его обработки. По этой причине метод трудно применять в промышленности. Этот отрицательный аспект признается всеми специалистами в данной области и в вышеуказанных патентах США N 4810874 и 5409696 он преодолевается путем использования ПЭИ, который позволяет получать высокую плотность аминогрупп. Хотя эти способы эффективно решают проблемы, связанные с первой стадией процесса, то есть с введением реакционноспособных групп в поверхностный слой материала, они не так эффективны на второй стадии, которая включает связывание гиалуроновой кислоты или ее производных с поверхностью. В действительности, как ранее указано, в патенте США N 4810874 рекомендуется активация гепатина или других полисахаридов химической обработкой. Следовательно, нельзя использовать полисахарид, а необходимо вначале модифицировать его химическим способом, что требует лишних расходов по времени, реагентам, трудозатратам на переработку отходов. Более того, в отличие от других полисахаридов гиалуроновая кислота только слегка чувствительна к реакциям частичного окисления, которое позволяет ввести в полисахарид реакционноспособные группы типа альдегидных (J.Е. Scott and М.J. Tigwell, Biochem. J., 173, 103, 1978; B.J. Kvam et al., Carbohydrate Research, 230, 1, 1992). Что касается патента США 5409696, то когда осуществляют процесс, описанный в нем, он не приводит к получению поверхностной структуры, способной в наибольшей степени использовать свойства, свойственные гиалуроновой кислоте. С другой стороны, когда используют способ, описанный в патенте США 5409696, как показано в сравнительном опыте, приведенном в данном описании, нельзя получить поверхностные структуры, способные ингибировать адгезию клеток. Похожие результаты наблюдаются, когда вместо самой гиалуроновой кислоты используют ее водорастворимые полусинтетические эфиры (EPA 0216453). Очевидно, когда используют этот процесс, способ, по которому образуется связь между аминированной поверхностью и полисахаридом, не позволяет наиболее полно использовать гидрофильные свойства гиалуроновой кислоты или ее производных.

Не следует пренебрегать и тем, что способ, являющийся предметом патента США 5409696, можно применить только при поверхностной модификации полимерных материалов, как указано в его названии "Обработанные плазмой с радиочастотой полимерные поверхности, содержащие иммобилизованные антитромбогенные агенты" и как следует из указаний, содержащихся в патенте. В общей биомедицинской и хирургической практике часто используются керамические или металлические материалы, поэтому полагают, что процессы модификации можно применить также к таким субстратам. Данное описание показывает, что должен быть создан метод, согласно которому может быть образована просто и надежно химическая связь между субстратами любой природы и гиалуроновой кислотой или ее производными, таким образом, что присущие им характеристики могут быть реализованы наиболее полно.

Сущность изобретения Данное изобретение касается способов покрытия биомедицинских предметов тонким слоем гиалуроновой кислоты, ее производного или полусинтетического полимера, причем тонкий слой стабильно связан с подложкой. Таким образом, получают композиционную структуру, основа которой характеризуется свойствами материала, используемого для изготовления предмета, а свойства поверхности определяются тонким слоем гиалуроновой кислоты, ее производного или указанного полусинтетического полипептида. Указанные свойства могут придать высокую степень гидрофильности поверхностям материалов, обработанных согласно способам по изобретению. Например, поверхности предметов, обработанных способами по изобретению, способны предотвращать адгезию клеток, присутствующих в биологических жидкостях и снижать адгезию бактерий. Более того, покрытие предмета материалом природного происхождения согласно настоящему изобретению обеспечивает лучшие свойства при взаимодействии с биологическими фазами.

Данное изобретение станет более понятным из подробного описания, приведенного ниже, и сопутствующих чертежей, которые даны только для иллюстрации и не ограничивают данное изобретение и на которых представлено следующее.

Фиг. 1а - ЭСХА-спектр образца 1, пример 1.

Фиг. 1b - ЭСХА-спектр образца 2, пример 1.

Фиг. 2а - пик C1, полученный методом ЭСХА образца стали, помещенного в раствор ПЭИ.

Фиг. 2b - пик C1, полученный методом ЭСХА образца стали, модифицированного гиалуроновой кислотой, как описано в примере 4.

Фиг. 3а - изображение, полученное при помощи оптического микроскопа, показывающее отсутствие адгезии L-929 фибробластов к поверхности образца A, пример 6 (200х увеличение).

Фиг. 3b - изображение, полученное при помощи оптического микроскопа, показывающее адгезию L-929 фибробластов к поверхности образца B, пример 6 (200х увеличение).

Фиг. 4а - изображение, полученное при помощи оптического микроскопа, показывающее отсутствие адгезии L-929 фибробластов к поверхности образца D, пример 6 (200х увеличение).

Фиг. 4b - изображение, полученное при помощи оптического микроскопа, показывающее адгезию L-929 фибробластов к поверхности образца F, пример 6 (200х увеличение).

Фиг. 5а - изображение, полученное при помощи оптического микроскопа, показывающее адгезию L-929 фибробластов к поверхности титана (200х увеличение).

Фиг. 5b - изображение, полученное при помощи оптического микроскопа, показывающее отсутствие адгезии L-929 фибробластов к поверхности титана, модифицированной эфиром гиалуроновой кислоты, как описано в примере 8 (200х увеличение).

Фиг. 6а - изображение, полученное при помощи оптического микроскопа, показывающее отсутствие адгезии L-929 фибробластов к поверхности внутриглазной линзы, модифицированной кислотой, как описано в примере 10 (50х увеличение).

Фиг. 6b - изображение, полученное при помощи оптического микроскопа, показывающее адгезию L-929 фибробластов к поверхности немодифицированной внутриглазной линзы (50х увеличение).

Фиг. 7а - изображение, полученное при помощи оптического микроскопа, показывающее отсутствие адгезии L-929 фибробластов к поверхности внутриглазной линзы, модифицированной гиалуроновой кислоты, как описано в примере 10 (200х увеличение).

Фиг. 7b - изображение, полученное при помощи оптического микроскопа, показывающее адгезию L-929 фибробластов к поверхности немодифицированной внутриглазной линзы (200х увеличение).

Подробное описание изобретения Другие цели и области применения настоящего изобретения станут очевидны из последующего подробного описания. Однако следует иметь в виду, что подробное описание и конкретные примеры, показывающие предпочтительные формы воплощения изобретения, приведены только для иллюстрации, поскольку из данного описания будет ясно, что в объеме данного изобретения возможны различные изменения и модификации.

В общем использование данного изобретения обеспечивает покрытие предмета слоем гиалуроновой кислоте или ее производного (например, такого, как полисахарид, содержащий карбоксильные группы) или полусинтетического полимера, такого, как описанный ниже, путем образования химической связи с поверхностью субстрата. Авторы предложили два различающихся способа, которые являются преимущественными и составляют часть данного изобретения. Ниже их обозначают как "Способ A" и "Способ B", соответственно.

Как в Способе A, так и в Способе B согласно данному изобретению как альтернативу гиалуроновой кислоте или ее производным (таким как ее неполные производные (EPA 0216453) или полисахариды, содержащие карбоксильные группы) можно использовать полусинтетические полимеры, такие как эфиры многоатомных спиртов и гиалуроновой кислоты (EP 0265116), внутренние эфиры кислых полисахаридов (EPA 0341745), эфиры карбоксиметилцеллюлозы, карбоксиметилхитин и карбоксиметиламид (EP 0342557), активные эфиры карбоксиполисахаридов (заявка на патент Италии N PD 94A000043), сульфированные эфиры гиалуроновой кислоты (заявка на патент Италии N PD 94000054), эфиры альгиновой кислоты (EP0251905), эфиры геллана (EPA 0518710), внутренние эфиры геллана (WO 94/03499), эфиры хитина и хитозана (EPA 0603264), эфиры пектовой и пектиновой кислот (УЗФ 0621877).

Способ A Способ A согласно данному изобретению предусматривает покрытие предмета слоем гиалуроновой кислоты или ей производного или полусинтетического полимера путем образования химической связи с поверхностью субстрата. В противоположность известным и ранее описанным способам, которые включают реакцию функциональных групп макромолекулы полисахарида и функциональных групп, находящихся на поверхности, и, как было ранее указано, приводят к низким выходам, данное изобретение представляет собой способ, который может быть осуществлен в две стадии и позволяет избежать проблем, связанных с известными и описанными способами.

На первой стадии Способа A гиалуроновая кислота, ее производные или полусинтетический полимер реагируют с подходящим соединением, которое представляет собой алкоксисилановый агент сочетания, обязательно в растворе. Исключив на этой первой стадии необходимость реакции с функциональными группами, закрепленными на поверхности субстрата (и, следовательно, практически неподвижными), можно уменьшить отрицательное влияние пространственного затруднения молекулы полисахарида на первой стадии процесса.

На второй стадии Способа A продукт реакции между гиалуроновой кислотой, ее производным или полусинтетическим полимером и алкоксисилановым сочетающим агентом наносится в виде раствора на поверхность субстрата в соответствии в обычными физическими методами нанесения покрытия. Затем образуется связь между фрагментами алкоксисилана в указанном продукте реакции и субстратом во время удаления растворителя из раствора для нанесения покрытия, когда указанный раствор находится в контакте с субстратом, и вероятность протекания реакции очень высока. Опыты показывают, что эффективность Способа A неожиданно выше, когда его осуществляют в две вышеописанные стадии, по сравнению с тем, когда используют традиционные методы, описанные в уровне техники, а именно методы, включающие реакцию между функциональными группами, иммобилизованными на поверхности, и функциональными группами, имеющимися в макромолекуле полисахарида.

Соответственно в Способе A по изобретению гиалуроновая кислота, ее производное или полусинтетический полимер реагирует в водном растворе или обычно в подходящем растворителе с молекулой алкоксисиланового агента сочетания, который может присоединяться к гиалуроновой кислоте, ее производному или указанному полусинтетическому полимеру одним концом и к субстрату - другим.

Как уже отмечалось, в Способе A по изобретению гиалуроновая кислота, ее производные или полусинтетический полимер реагирует с соединением, относящимся к классу алкоксисиланов. Эти соединения известны специалистам в области химии как агенты сочетания, которые могут быть использованы для улучшения адгезии между органическими или неорганическими материалами (Silane Coupling Agents, E.P. Plueddemann, Plenum Press, New York, 1982). Примерами таких алкоксисилановых агентов сочетания являются соединения, содержащие атомы галогена, такие как хлорпропилтриметоксисилан, соединения, содержащие ненасыщенные органические группы, такие как винилтриэтоксисилан и метакрилоксипропилтриметоксисилан, соединения, содержащие аминогруппы, такие как аминопропилтриметоксисилан и аминоэтиламинопропилтриметоксисилан. Однако способ по изобретению не ограничивается такими типами алкоксисилановых агентов сочетания.

В Способе A по изобретению реакция между гиалуроновой кислотой, ее производным или полусинтетическим полимером может требовать применения одной или нескольких молекул, которые позволяют протекание реакции между функциональными группами гиалуроновой кислоты, ее производного или полусинтетического полимера и функциональными группами алкоксисилана.

Этот класс соединений включает, наряду с другими, соединения, содержащие диимидные группы, которые подпадают под общее определение агентов конденсации, такие как циклогексилкарбодиимид и этилдиаминопропилкарбодиимид, и такие соединения, как карбонилдиимидазол и дикарбонилдиимидазол, которые считаются бифункциональными агентами, известными специалистам в области синтеза протеиновых соединений. В способе по изобретению также могут быть использованы соединения, которые катализируют или способствуют реакции между функциональными группами гиалуроновой кислоты или ее производного и функциональными группами алкоксисилана. Такими примерами являются N-гидроксисукцинимид, гидроксисульфосукцинимид, 1-гидроксибензотриазола гидрат и подобные соединения, выполняющие ту же самую функцию. Использование таких соединений предусмотрено также в Способе B по изобретению, описанном ниже.

В Способе A субстрат, на который нужно нанести покрытие, адаптируют путем плазменной обработки для того, чтобы облегчить взаимодействие с продуктом реакции, содержащим гиалуроновую кислоту, ее производное или полусинтетический полимер. Не ограничиваясь какой-либо теорией, можно предположить, что обработка субстрата плазмой приводит к увеличению поверхностного натяжения субстрата таким образом, что облегчается смачиваемость раствором, содержащим гиалуроновую кислоту и алкоксисилан и другие молекулы. Более того, она позволяет ввести на поверхность субстрата функциональные группы, способные облегчить реакцию с алкоксисиланом. В частности, это методы обработки, которые позволяют ввести гидроксильные, карбоксильные группы и в общем такие функциональные группы, которые называются кислыми в общепринятой химической терминологии. Поскольку существует много химических функциональных групп, способных облегчить взаимодействие между поверхностью субстрата и силановым агентом сочетания, условия обработки плазмой являются значительно менее строгими, чем в случае способов обработки, описанных в уровне техники. Некоторыми примерами подходящих способов обработки являются способы, использующие плазму кислорода, воздуха, азота, аргона и других редких газов, воды, спиртов и смесей указанных газов или паров. Природа субстрата не ограничена и определяется только возможностью генерирования после обработки плазмой ненужных функциональных групп, способных облегчить реакцию с силаном.

Согласно одному особенно предпочтительному варианту Способа A по изобретению реакция между гиалуроновой кислотой или ее производным и алкоксисилановым агентом сочетания происходит в водном растворе, причем гиалуроновая кислота или ее производное присутствует в количестве между 0.01 и 2%, предпочтительно между 0.1 и 1.2%. Алкоксисиланом предпочтительно является аминосилан, присутствующий в стехиометрическом количестве или в небольшом избытке. В таких предпочтительных случаях реакционный раствор предпочтительно также содержит этилдиаминопропилкарбодиимид в стехиометрическом количестве, рассчитанном согласно реакции между карбоксильными группами, имеющимися в гиалуроновой кислоте или ее производном, и аминогруппой аминоксисилана, или в небольшом избытке. Реакции способствует наличие N-гидроксисукцинимида в количестве между 10 и 100% в расчете на мольную концентрацию карбодиимида. Через несколько часов протекания реакции при комнатной температуре раствор наносят на поверхность предмета, который только что был обработан плазмой в соответствии с методами, обычно используемыми для нанесения тонких поверхностных слоев из раствора. Обработку предпочтительно осуществлять плазмой кислорода или воздуха с энергией заряда 1-400 Вт и предпочтительно 10-150 Вт, при давлении 10 мторр - 10 торр и временем обработки 1 с - 1 ч, предпочтительно 10 с - 30 мин. Растворитель испаряют под вакуумом или без него и при нагревании или без него. Параметры процесса на этой стадии определяются необходимостью создания условий, нужных для реакции между реакционноспособными концевыми группами алкоксисиланового агента сочетания и функциональными группами, содержащимися на поверхности субстрата после обработки плазмой. В конце любые остатки и соединения, которые не связаны, можно удалить путем промывки или подобных методов.

Способ B Согласно другому варианту данного изобретения материал субстрата любого вида обрабатывают плазмой воздуха, кислорода, аргона, азота или других газов или паров, способных ввести оксигенирированные функциональные группы на поверхности и/или вызвать эффект очистки и удаления органических загрязнений. Однако использование плазмы, содержащей водяной пар, как заявлено в патенте США 5409696, в способах по изобретению не требуется.

Поверхность материала, обработанная таким образом, подвергается обработке водным раствором ПЭИ (или другого поликатионного вещества, такого как полилизин и т.п.) для создания высокой поверхностной концентрации аминогрупп. Полученный материал реагирует с гиалуроновой кислотой, ее производным или полусинтетическим полимером (например, другими полисахаридами, содержащими карбоксильные группы, в присутствии агентов конденсации, таких как ЭДК, в водном растворе или дициклогексилкарбодиимида (ДЦК) в органических растворителях). Соединение, способное ускорить реакцию, промотируемую ЭДК, также содержится. Этот класс соединений включает, но не ограничен ими, N-гидроксисукцинимид (NГC), гидроксисульфосуцинимид, гидроксибензотриазола гидрат и подобные соединения.

Способ B согласно данному изобретению основан на удивительном наблюдении, что соединения, такие как NГC, могут способствовать реакции конденсации, промотируемой ЭДК, также в случае, когда группы связаны с поверхностью в отсутствиe молекулярных структур, известных специалистам как "плечи спейсера".

В случае гиалуроновой кислоты известно, что в растворе в отсутствие NГС образуются промежуточные продукты реакции, относящиеся в общем к N-ацилмочевинам, которые препятствуют завершению реакции (X. Xu et al., Trans IV World Biom. Cong. , 170, 1992). Когда аминогруппы связаны с поверхностью, должны использоваться "плечи спейсера", для того чтобы придать им достаточную реактивность. "Плечо спейсера" представляет собой ряд атомов углерода, который отделяет реакционноспособную группу от поверхности, придавая ей большую свободу и увеличивая ее реакционноспособность. Например, продукт COVALINK (Nunc) представляет собой полистирол, содержащий аминогруппы, отделенные от поверхности плечом спейсера с девятью атомами углерода (К. Gregorins et a1. , J. Immunol. Meth. , 181, 65, 1995) NГC оказывается эффективным при увеличении выхода реакции, промотируемой ЭДК (J.V. Staros et a1., Anal. Biochem., 156, 220, 1986). Очевидно, стоимость создания сложенных молекулярных структур на поверхности, таких как функциональные группы, подкрепленные "плечами спейсера", очень высока и ограничивает процесс производства. В Способе B по изобретению аминогруппы связаны с поверхностью и находятся внутри структуры ПЭИ, использования "плеч спейсера" не требуется, как и наличия других структур. Обнаружение того факта, что NГC способен облегчать реакцию конденсации поверхностных аминогрупп, привнесенных ЭДК, даже в отсутствие "плеча спейсера", и при этом не надо обращать особенное внимание на другие молекулярные аспекты поверхности, является удивительным и решающим фактором в Способе B по изобретению. Еще более удивительным и непредвиденным, исходя из известных знаний, является обнаружение того, что присутствие NГC в реакционной смеси оказывает решающее влияние на антиадгезионные по отношению к клеткам свойства поверхностей с нанесенным на них слоем гиалуроновой кислоты или ее производных. В действительности, когда работают в отсутствие NГC, как описано в патенте США N 5409696, невозможно придать поверхностям, покрытым гиалуроновой кислотой или ее производными, антиадгезионные свойства по отношению к клеткам, чтобы предотвратить их адгезию. С другой стороны, при использовании способов по изобретению получают поверхности, которые обладают превосходной стойкостью к заселению клетками. Хотя авторы не обязаны объяснять причины достижения результата и не намерены ограничиться какой-то одной теорией, считается, что различие можно приписать одной из следующих причин: или в отсутствие NГC выход реакции слишком низкий, и хотя гиалуроновая кислота связывается с поверхностью, это происходит в количестве, которого недостаточно для полного покрытия нижележащего материала; или связь возникает в отсутствие NГC, меняет свойства гиалуроновой кислоты, связанной с поверхностью. Полученная структура не сохраняет свойства, которые обычно ожидаются от этого вида полимера исходя из общих химических знаний.

Согласно одной особенно предпочтительной форме осуществления изобретения полимерный, металлический или керамический материал обрабатывают плазмой воздуха или кислорода с энергией заряда между 1 и 400 Вт, предпочтительно между 10 и 150 Вт, при давлении между 10 мторр и 10 торр и времени обработки между 1 с и 1 ч, предпочтительно между 10 с и 30 мин. Однако условия обработки не являются критическими и зависят от формы продукта. Обработка длится дольше, если она включает модификацию внутренней поверхности труб или других недоступных частей, в то время как плоские или наружные поверхности требуют меньшего времени.

Обработанный материал помещают в водный раствор ПЭИ с концентрацией между 0.01 и 10%, предпочтительно между 0.5 и 2%. Время реакции ограничено и составляет от 10 мин до 1 ч. В конце этой стадии материал промывают и помещают в раствор гиалуроновой кислоты или ее производного или другого полисахарида, содержащего карбоксильные группы. Концентрация полисахарида составляет 0.005-5%, предпочтительно 0.05-1%. В раствор добавляют NГC и ДНК с концентрацией 0.001-1%. Реакция протекает при комнатной температуре или при слегка повышенной температуре и может длиться от 10 мин до 48 ч. Если типы полисахарида и субстрата являются подходящими, реакция может протекать в органическом растворителе с использованием ДНК и NГС, введенных в ранее указанных концентрациях.

Значение данного изобретения (Способы A и B) будет очевидным любому специалисту в данной области. В действительности, способом согласно данному изобретению можно получить предметы с благоприятными поверхностными свойствами благодаря наличию гиалуроновой кислоты или ее производного, причем эти свойства остаются стабильными во времени, что обусловлено химическими связями между покрытием и субстратом. Более того, поверхности таких предметов обладают антиадгезионными свойствами по отношению к клеткам и бактериям, присутствующим в биологических жидкостях. Ниже приводится несколько иллюстративных предметов, и любые изменения, очевидные для специалиста в данной области, входят в объем данного изобретения.

Пример 1 Образец полистирола отбирают из бактериологической чашки Петри (Corning) и обрабатывают плазмой в реакторе с параллельными пластинами (Gambetti Kenologia). Обработку проводят при давлении кислорода 100 мторр, энергии заряда 50 Вт, скорости потока 20 см³/мин и времени обработки 30 с. Обработанные образцы погружают на 2 ч в 0.5%-ный раствор ПЭИ (Aldrick) в воде. Затем они вынимаются, промываются водой и погружаются в проби