Аналоги витамина d3, фармацевтическая композиция

Аналоги витамина d3, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Описываются новые производные витамина D₃ формулы I, где R - T, F или ОН, R₂ - Н, низший алкил, галоген, Х - = СН₂ или, когда R₂ - ОН, Х - (Н, Н) или = СН₂, и А обозначает -CC-, или - СН₂ -СН₂ -. Соединения индицируют дифференциацию и ингибируют пролиферацию линий клеток кожи и рака, в частности для лечения гиперпролиферативных заболеваний кожи, неопластических заболеваний, заболеваний сальных желез и состояний, связанных с повреждениями кожи световым излучением. 2 с. и 10 з.п.ф-лы, 6 табл.

Настоящее изобретение относится к аналогам витамина D₃, в частности к 20-эпи-16-ен-аналогам витамина D₃ формулы где R обозначает водород, фтор или гидрокси, R₂ обозначает водород, низший алкил или галоген, X обозначает = CH₂ или, когда R обозначает гидрокси, X обозначает (H,H) или =CH₂ и A обозначает -CC-, или -CH₂-CH₂-, при условии, что, когда A обозначает -CH₂-CH₂-, то R₂ обозначает водород или низший алкил.

Используемое в контексте настоящего описания понятие "низший алкил" означает алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, содержащую 1-4 атома углерода, например метил, этил, пропил, изопропил, бутил, трет-бутил и т. п. Предпочтительно низший алкил обозначает метил или этил. "Галоген" обозначает фтор, йод, бром или хлор, предпочтительно фтор.

Соединения формулы I индуцируют дифференциацию и ингибируют пролиферацию различных линий клеток кожи и рака. Следовательно, соединения формулы I пригодны в качестве средств для лечения гиперпролиферативных заболеваний кожи, таких, как псориаз. Соединения формулы I также пригодны для лечения неопластических заболеваний, таких, как лейкемия или рак молочной железы, и заболеваний сальных желез, таких, как угри или себорейные дерматиты. Соединения формулы I, в частности 1 -фтор-25-гидрокси -16,23E-диен-26,27-бисгомо-20-эпихолекальциферол, пригодны для лечения остеопороза.

Кроме того, местное нанесение на кожу пациента соединения формулы I приводит к реверсии состояний, вызванных повреждениями под воздействием светового излучения. Следовательно, при местном нанесении соединений формулы I на кожу пациентов, поврежденную в результате воздействия солнечного излучения, может быть осуществлена реверсия таких проявлений, как морщины, эластоз и преждевременное старение, что приводит к улучшению внешнего вида кожи. Другими словами, при местном применении соединений формулы I усиливается восстановление поврежденной кожи, что приводит к ее разглаживанию и омолаживанию.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы I и фармацевтически приемлемый носитель. Такие композиции могут быть использованы для индукции дифференцировки и ингибирования пролиферации линий клеток кожи и раковых клеток, в частности для лечения гиперпролиферативных заболеваний кожи, таких, как псориаз, неопластических заболеваний, таких, как лейкемия, и заболеваний сальных желез, таких, как угри, а также для реверсии состояний, вызванных повреждениями под воздействием светового излучения, в частности для местного лечения кожи, поврежденной вследствие воздействия солнечного излучения, приводящего к появлению морщин, эластозу и преждевременному старению. Изобретение также относится к применению соединений формулы I для изготовления лекарств, предназначенных для лечения вышеуказанных болезней и состояний. Изобретение также относится к способу получения соединений формулы I и промежуточных продуктов формулы XII.

В предпочтительном варианте R обозначает гидрокси. В соединении формулы I R₂ предпочтительно обозначает водород или фтор. Предпочтительными соединениями формулы I являются: 1,25-дигидрокси-16-ен-23-ин-20-эпихолекальциферол; 1,25-дигидрокси-16-ен-20-эпихолекальциферол; 1,25-дигидрокси-16-ен-23-ин-26,27-гексафтор-20-эпихолекальциферол; 1 -фтор-25-гидрокси-16,23Z-диен-26,27-гексафтор-20-эпихолекальциферол; 1 -фтор-25-гидрокси-16-ен-23-ин-26,27-гексафтор-20-эпихолекальциферол; 1,25-дигидрокси-16,23E-диен-26,27-гексафтор-20-эпихолекальциферол; 1,25-дигидрокси-16,23Z-диен-19-нор-26,27-гексафтор-20- эпихолекальциферол.

Соединения формулы I получают согласно приведенным ниже схемам I-V и способам, описанным в примерах.

Последняя стадия процесса получения соединений формулы I включает удаление защитных групп у соответствующих соединений, содержащих гидроксильные группы, защищенные силильной группой.

На приведенной в конце описания схеме I известное соединение формулы II (В.М. Trost, P.R. Bernstein, P.C. Funfschilling, J. American Chemical Society, 101. 4378 (1979)) превращают в соединение формулы III взаимодействием с уксусным ангидридом, пиридином и диметиламинопиридином в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как дихлорметан. Реакцию осуществляют при температуре от 0 до 50^oC, предпочтительно при комнатной температуре, предпочтительно в атмосфере аргона.

Соединение формулы III превращают в соединение формулы IV взаимодействием с основанием, таким, как карбонат натрия, в спиртовом растворителе, таком, как метанол, предпочтительно в атмосфере аргона.

Соединение формулы IV превращают в соединение формулы V взаимодействием с оксалилхлоридом и диметилсульфоксидом в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как дихлорметан, в атмосфере аргона.

Соединение формулы V превращают в соединение формулы VI взаимодействием с бензальацетоном, в присутствии в качестве катализатора палладия на угле.

Соединение формулы VI превращают в соединение формулы VII взаимодействием с 3-триметилсилилпропиналем и с кислотой Льюиса, такой, как диметилалюминийхлорид, в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как дихлорметан.

Соединение формулы VII превращают в соединение формулы VIII взаимодействием соответствующего фенилтионокарбоната с гидридом три-н-бутилолова и триэтилбораном в толуоле.

Соединение формулы VIII превращают в соединение формулы IX взаимодействием с основанием, таким, как, гидроксид натрия, в спиртовом растворителе, таком, как этанол. Реакцию осуществляют в диапазоне температур от 50 до 100^oC, предпочтительно при 80^oC.

Соединение формулы IX превращают в соединение формулы X взаимодействием с 1-(триметилсилил)имидазолом, в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как безводный метиленхлорид.

Соединение формулы X превращают в соединение формулы XI взаимодействием с соответствующим соединением формулы где R'₂ обозначает водород или низший алкил, в присутствии основания, такого, как н-бутиллитий. Реакцию предпочтительно осуществляют при температуре -78^oC.

Если получают соединения формулы I, в которых R₂ обозначает галоген, то соединение формулы X подвергают взаимодействию с галогенированным ацетоном, таким, как гексафторацетон, в присутствии основания, такого, как н-бутиллитий.

Соединение формулы XI превращают в соответствующее соединение формулы XII взаимодействием с тетрабутиламмонийфторидом в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран.

На приведенной в конце описания схеме II соединение формулы XII превращают в соответствующее соединение формулы XIII взаимодействием с окислителем, таким, как пиридинийдихромат, в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как безводный метиленхлорид.

Соединение формулы XIII превращают в соответствующее соединение формулы XIV взаимодействием с 1-(триметилсилил)имидазолом в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как безводный метиленхлорид.

Соединение формулы XIV превращают в соответствующее соединение формулы Iа, в котором R обозначает гидрокси и X обозначает = CH₂, взаимодействием с [3S-(1Z 3,5 )]-[2-[3,5-бис[[(1,1-диметилэтил) диметилсилил]окси]-2-метиленциклогексилиден] этил]дифенилфосфиноксидом в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии н-бутиллития в качестве основания.

В альтернативном варианте соединение формулы XIV превращают в соответствующее соединение формулы Iа, в котором R обозначает водород, взаимодействием с [(5S,Z)-2-[2-[2-метилен-5-[[(1,1-диметилэтил) диметилсилил]окси] циклогексилиден] этил] дифенилфосфиноксидом в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии н-бутиллития в качестве основания.

В альтернативном варианте соединение формулы XIV превращают в соответствующее соединение формулы Iа, в котором R обозначает фтор, взаимодействием с [3S-( 3,5 Z)-2-[2-метилен-3-фтор-5- [[(1,1-диметилэтил)диметилсилил] окси] циклогексилиден]этил] дифенилфосфиноксидом в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии н-бутиллития в качестве основания.

В альтернативном варианте соединение формулы XIV превращают в соответствующее соединение формулы Iа, в котором R обозначает гидрокси и X, обозначает водород, взаимодействием с [3R-( 3,5 Z)-3,5-бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил]окси] циклогексилиден]этил]дифенилфосфиноксидом в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии н-бутиллития в качестве основания.

На приведенной в конце описания схеме III соединение формулы XII восстанавливают до соответствующего соединения формулы XV взаимодействием с водородом и катализатором Линдлара в органическом растворителе, таком, как комбинация этилацетата, гексана и этанола, в присутствии хинолина.

Соединение формулы XV превращают в соответствующее соединение формулы XVI взаимодействием с водородом в присутствии катализатора, такого, как 1,4-бис(дифенилфосфин)бутан-1,5- циклооктадиенродийтетрафторборат и ртуть, в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как метиленхлорид.

Соединение формулы XVI окисляют до соответствующего соединения формулы XVII взаимодействием с пиридинийдихроматом в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как метиленхлорид.

Соединение формулы XVII превращают в соответствующее соединение формулы XVIII взаимодействием с 1-(триметилсилил)имидазолом в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как безводный метиленхлорид.

Соединение формулы XVIII превращают в соответствующее соединение формулы Ib, в котором R обозначает гидрокси и X обозначает =CH₂, взаимодействием с [3S-(1Z, 3,5 )]-[2-[3,5-бис[[(1,1-диметилэтил) диметилсилил]окси]-2-метиленциклогексилиден] этил] дифенилфосфиноксидом в присутствии н-бутиллития в качестве основания при температуре -78^oC в безводном тетрагидрофуране в качестве растворителя.

В альтернативном варианте соединение формулы XVIII превращают в соответствующее соединение формулы Ib, в котором R обозначает гидрокси и X обозначает водород, взаимодействием с [3R-( 3,5 Z) -3,5-бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил] окси] циклогексилиден] этил] дифенилфосфиноксидом в присутствии н-бутиллития в качестве основания в безводном тетрагидрофуране в качестве растворителя.

В альтернативном варианте соединение формулы XVIII превращают в соответствующее соединение формулы Ib, в котором R обозначает фтор, взаимодействием с [3S-( 3,5 Z)-[2-2-[2-метилен-3-фтор-5- [[(1,1-диметилэтил)диметилсилил] окси]циклогексилиден]этил] дифенилфосфиноксидом в присутствии н-бутиллития в качестве основания в безводном тетрагидрофуране в качестве растворителя, при температуре -78^oC.

В альтернативном варианте соединение формулы XVIII превращают в соответствующее соединение формулы Ib, в котором R обозначает водород, взаимодействием с [(5S,Z)-2-[2-[2-метилен-5- [[(1,1-диметилэтил)диметилсилил]окси]циклогексилиден]этил] дифенилфосфиноксидом в присутствии н-бутиллития в качестве основания в безводном тетрагидрофуране в качестве растворителя, при температуре -78^oC.

На приведенной в конце описания схеме IV соединение формулы XII превращают в соответствующее соединение формулы XIX взаимодействием с восстановителем, таким, как алюмогидрид лития, в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии метоксида натрия в качестве основания.

Соединение формулы XIX превращают в соответствующее соединение формулы XX взаимодействием с оксилителем, таким, как пиридинийдихромат, в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как метиленхлорид.

Соединение формулы XX превращают в соответствующее соединение формулы XXI взаимодействием с 1-(триметилсилил)имидазолом в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как метиленхлорид.

Соединение формулы XXI превращают в соответствующее соединение формулы Ic, в котором R обозначает гидрокси и X обозначает =CH₂, взаимодействием с [3S-(1Z, 3,5]-[2-[3,5-бис[[(1,1-диметилэтил) диметилсилил]окси]-2-метиленциклогексилиден] этил] дифенилфосфиноксидом в растворителе, представляющим собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии основания, такого, как н-бутиллитий.

В альтернативном варианте соединение формулы XXI превращают в соответствующее соединение формулы Ic, в котором R обозначает гидрокси и X обозначает водород, взаимодействием с [3R-( 3,5 Z) -3,5-бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил] окси] циклогексилиден]этил] дифенилфосфиноксидом в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии основания, такого, как н-бутиллитий.

В альтернативном варианте соединение формулы XXI превращают в соответствующее соединение формулы Ic, в котором R обозначает водород, взаимодействием с [(5S,Z)-2-[2-[2-метилен-5-[[(1,1- диметилэтил)диметилсилил]окси] циклогексилиден] этил] дифенилфосфиноксидом в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии основания, такого, как н-бутиллитий.

В альтернативном варианте соединение формулы XXI превращают в соответствующее соединение формулы Ic, в котором R обозначает фтор, взаимодействием с [3S-( 3,5 Z)-2-[2-[2-метилен-3-фтор-5- [[(1,1-диметилэтил)диметилсилилтокси] циклогексилиден] этил] дифенилфосфиноксидом в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии основания, такого, как н-бутиллитий.

На приведенной в конце описания схеме V соединение формулы XII превращают в соответствующее соединение формулы XXII путем гидрирования с помощью катализатора Линдлара в присутствии хинолина в смеси растворителей, такой, как комбинация этилацетата, гексана и этанола.

Соединение формулы XXII превращают в соответствующее соединение формулы XXIII взаимодействием с оксилителем, таким, как пиридинийдихромат, в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как метиленхлорид.

Соединение формулы XXIII превращают в соответствующее соединение формулы XXIV взаимодействием с 1-(триметилсилил)имидазолом в хлорированном углеводородном растворителе, таком, как метиленхлорид.

Соединение формулы XXIV превращают в соответствующее соединение формулы Id, в котором R обозначает гидрокси и X обозначает CH₂, взаимодействием с [3S-(1Z, 3,5 )] -[2-[3,5-бис[[(1,1-диметилэтил) диметилсилил]окси]-2-метиленциклогексилиден] этил] дифенилфосфиноксидом в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии основания, такого, как н-бутиллитий.

В альтернативном варианте соединение формулы XXIV превращают в соответствующее соединение формулы Id, в котором R обозначает гидрокси и X обозначает водород, взаимодействием с [3R-( 3,5 , Z)-3,5-бис[[(1,1-диметилэтил)диметилсилил] окси] циклогексилиден]этил]дифенилфосфиноксидом в тетрагидрофуране, в присутствии основания, такого, как н-бутиллитий.

В альтернативном варианте соединение формулы XXIV превращают в соответствующее соединение формулы Id, в котором R обозначает водород, взаимодействием с [(5S,Z)-2-[2-[2-метилен-5-[[(1,1-диметилэтил) диметилсилил]окси] циклогексилиден] этил] дифенилфосфиноксидом в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии основания, такого, как н-бутиллитий.

В альтернативном варианте соединение формулы XXIV превращают в соответствующее соединение формулы Id, в котором R обозначает фтор, взаимодействием с [3S-( 3,5 Z)-2-[2-[2-метилен-3-фтор-5-[[(1,1- диметилэтил)диметилсилил]окси]циклогексилиден]этил] дифенилфосфиноксидом в растворителе, представляющем собой простой эфир, такой, как тетрагидрофуран, в присутствии основания, такого, как н-бутиллитий.

Соединения формулы I можно применять оральным введением, например, в форме таблеток, таблеток с покрытием, драже, желатиновых капсул с мягким или твердым покрытием, растворов, эмульсий или суспензий. Кроме того, введение можно осуществлять ректальным путем, например, в форме суппозиториев, либо парентерально, например, в форме растворов для инъекции.

Композиции по изобретению могут быть приготовлены с фармацевтически инертными, неорганическими или органическими эксципиентами, пригодными для изготовления таблеток, таблеток с покрытием, драже и желатиновых капсул с твердым покрытием. Лактоза, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновая кислота или ее соли и т.п. могут применяться в качестве таких эксципиентов, например для таблеток, драже и желатиновых капсул с твердым покрытием. Пригодными эксципиентами для желатиновых капсул с мягким покрытием являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиоли и т.п., что зависит от природы действующего вещества. Однако в случае желатиновых капсул с мягким покрытием обычно не требуется никаких эксципиентов. Пригодными эксципиентами для получения растворов и сиропов являются, например, вода, полиоли, сахароза, инвертный сахар, глюкоза и т.д.

Пригодными эксципиентами для растворов для инъекций являются, например, вода, спирты, полиоли, глицерин, растительные масла и т.п.

Пригодными эксципиентами для суппозиториев являются, например, природные или гидрогенизированные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиоли и т.п.

Кроме того, фармацевтические композиции могут содержать консерванты, растворители, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, подслащивающие вещества, красители, корригенты, соли для изменения осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты.

Для лечения неопластических заболеваний, таких, как лейкемия, соединения формулы I, как они описаны выше, могут применяться путем орального введения или инъекции теплокровным животным, нуждающимся в таком лечении. В частности, соединения формулы I, как они описаны выше, могут применяться для лечения неопластических заболеваний, таких, как лейкемия или рак молочной железы, путем орального введения взрослому человеку в дозах, составляющих от приблизительно 0,25 до 50 мкг/день.

Для лечения гиперпролиферативных заболеваний кожи, таких, как псориаз, карциномы базальных клеток, нарушения кератинизации и кератоз, соединения формулы I, как они описаны выше, могут применяться путем орального введения теплокровным животным, нуждающимися в таком лечении. В частности, соединения формулы I, как они описаны выше, могут применяться для лечения гиперпролиферативных заболеваний кожи, таких, как псориаз, карциномы базальных клеток, нарушения кератинизации и кератоз, путем орального введения взрослому человеку в дозах, составляющих приблизительно 0,25-50 мкг/день. Эти соединения могут применяться орально для лечения угрей у людей в дозах, составляющих приблизительно 0,25-50 мкг/день, предпочтительно от 0,5 до 5 мкг/день.

Для лечения гиперпролиферативных заболеваний кожи, таких, как псориаз, карцинома базальных клеток, нарушения кератинизации и кератоз, соединения формулы I, как они описаны выше, могут использоваться для местного применения на теплокровных животных, нуждающихся в таком лечении. В частности, соединения формулы I, как они описаны выше, могут использоваться для местного применения в суточных дозах, составляющих от приблизительно 0,5 до приблизительно 100 мкг/г композиции для местного применения, при лечении гиперпролиферативных заболеваний кожи, таких, как псориаз, карцинома базальных клеток, нарушения кератинизации и кератоз.

Соединения формулы I, как они описаны выше, могут использоваться для местного применения при лечении заболеваний сальных желез, таких, как угри или себорейный дерматит.

Соответствующая активность соединений формулы I в качестве средств для лечения неопластических заболеваний может быть проиллюстрирована на примере следующих экспериментов.

Дифференциация клеток HL-60 Индукцию дифференциации клеток HL-60 определяли путем измерения импульсной активности их окислительного потенциала при восстановлении NBT (нитросинего тетразолия).

Клетки HL-60 выращивали в среде RPMI 1640, дополненной 10%-ной фетальной телячьей сывороткой (ФТС), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот, 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (RPMI/ФТС). Клетки HL-60 (30000 клеток/90 мкл дополненной среды RPMI) высевали в плоскодонные лунки для микротитрования. Сразу после посева в лунки одновременно добавляли по 10 мкл исследуемых соединений, растворенных в дополненной среде RPMI, для получения конечных концентраций в диапазоне от 10^-11 до 10^-6 М (используя в качестве исходных маточные растворы с концентрацией 10^-2 М в этаноле, хронившиеся при -20^oC в защищенном от света месте). Через 3 дня среду удаляли из лунок с помощью многоканальной пипетки и замещали 100 мкл раствора NBT (1 мг/мл забуференного фосфатом физиологического раствора ((ЗФР) с 200 нМ форболмиристатацетата (ФМА)). После дополнительной инкубации в течение 1 ч при 37^oC раствор NBT удаляли и добавляли 100 мкл 10%-ного раствора додецилсульфата натрия (ДСН) в 0,01н. HCl. Количество восстановленного NBT определяли фотометрически при 540 нм с использованием автоматического планшет-ридера. Вычисляли средние значения по 3 лункам. Среднеквадратическая ошибка составляла 5-10%. Данные выражали в виде процента от максимальной дифференциация клеток, достигаемой с использованием 100-1000 нМ кальцитриола в таком же эксперименте. Концентрацию (нМ), дающую 50% от этого максимального значения, определяли графически, и она приведена в виде ED₅₀ в таблице I.

Антипролиферативная активность в отношении T47-D- и MCF-7- клеток карциномы молочной железы Данные о двух линиях клеток, использованных в этих экспериментах, и условия, необходимые для их роста, приведены ниже.

1. Клетки карциномы молочной железы T47-D выращивали в среде RPMI 1640, дополненной 10 мкг/мл бычьего инсулина и 10%-ной фетальной бычьей сывороткой.

2. Клетки карциномы молочной железы MCF-7 выращивали в среде MEM (модифицированная среда Игла), дополненной заменимыми аминокислотами, 1 мМ пирувата натрия, 10 мкг/мл бычьего инсулина и 10%-ной фетальной бычьей сывороткой.

Клетки выращивали в соответствующей среде до поздней логарифмической фазы (~ 80%-ное слияние). Затем клетки T47-D и MCF-7 подвергали действию трипсина и высевали в концентрации 4000 или 2000 клеток на лунку соответственно. Через 24 ч после посева готовили серийные разбавления растворенных в этаноле лекарств в этой же самой среде и добавляли в лунки в трех повторностях в конечных концентрациях от 1000 до 0,1 нМ и 0,1%-ном этаноле. Через 3-7 дней после добавления лекарства в каждую лунку добавляли 50 мкл раствора МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий-бромид в забуференном aосфатом физиологическом растворе] в концентрации 5 мг/мл и инкубирование продолжали при 37^oC в течение 2,5 ч. Затем планшеты подвергали центрифугированию в течение короткого промежутка времени при 800xg в течение 5 мин, путем аспирации удаляли среду из лунок и добавляли 50 мкл этанола на лунку для того, чтобы растворить формазановый продукт, образовавшийся во время инкубирования с МТТ. После встряхивания в течение 15 мин для каждой лунки определяли оптическую плотность с помощью автоматического планшет-ридера при 570 и 660 нм. Процент ингибирования роста клеток оценивали путем сравнения оптических плотностей клеток, обработанных исследуемыми соединениями, и плотностей клеток, обработанных только 0,1%-ным этанолом. Значения IC₅₀ определяли на основе формулы Reed и Muench (Reed L.J. и H. Muench, A simple method of estimating fifty percent endpoint. Am. J. Hyg. 27: 493-497 (1938)), а полученные при этом результаты представлены ниже в таблице II.

Соответствующая активность соединений формулы I в качестве средств для лечения гиперпролиферативного заболевания кожи может быть проиллюстрирована следующим образом.

Ингибирование пролиферации кератиноцитов Линия клеток НаСаТ: использовали иммортализованную линию клеток человека НаСаТ. Включение ³H-тимидина измеряли в экспоненциально растущих культурах через 6 дней после начала культивирования в присутствии исследуемого соединения.

Культура клеток: клетки НаСаТ культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) и питательной смеси Хама F-12 (F-12), в соотношении 3:1 (объем/объем, ICN), содержащей 4,5 г/л глюкозы и дополненной 10%-ной фетальной телячьей сывороткой (ФТС, фирма Gibco), L-глютамином (2 мМ, фирма Gibco), пенициллином (50 МЕ/мл, фирма Gibco), стрептомицином (50 мкг/мл, фирма Gibco), эпидермальным фактором роста (EGF) (10 нг/мл), гидрокортизоном (400 нг/мл), холерным токсином (8,5 нг/мл) и инсулином (5 нг/мл). Клетки выращивали в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO₂ и 95% воздуха, и пассировали каждые 3-4 дня.

Ингибирование поглощения ³H-тимидина: клетки НаСаТ (250 клеток в полной среде для культивирования) высевали в 96-луночные планшеты для культивирования и инкубировали в течение 6 дней при 37^oCв атмосфере, содержащей 5% CO₂ и 95% воздуха. Ингибиторы, растворенные в 10-кратной концентрации в 1%-ном этаноле, добавляли непосредственно в начале опыта. ³H-тимидин (5 Ки/ммоль, фирма Amersham) добавляли в концентрации 1 мкКи на лунку и клетки импульсно метили в последние 6 ч периода роста. Затем клетки обрабатывали трипсином в течение 10 мин при 37^oC при интенсивном перемешивании и собирали на 96-луночный фильтровальный планшет типа GF/C (Uni Filter, фирма Packard), используя харвестер клеток типа Micro Mate 196 (фирма Packard). После сушки при 40^oC в вакууме в течение 20-30 мин добавляли 20 мкл сцинтиллятора Micro Scint 0 (фирма Packard) и с помощью TOP COUNT (фирма Packard) подсчитывали радиоактивность, связанную с фильтрами. Результаты приведены в таблице III.

Соответствующая активность соединений формулы I в качестве средств для лечения заболеваний сальных желез может быть проиллюстрирована следующим образом.

Ингибирование пролиферации себоцитов человека in vitro Жировые клетки выделяли из сальных желез взрослого человека с помощью комбинации ферментативных и механических методов (Doran и др., Characterization of Human Sebaceous Cell In Vitro, J. Invest. Dermatol. 96: 341-8 (1991)). Клетки культивировали в среде Искова, содержащей 10%-ную фетальную телячью сыворотку и 4 мкг/мл дексаметазона на слое ЗТЗ-фибробластов мышей с замедленным ростом. Клетки высевали в среду без исследуемого соединения и затем через 24-48 ч после первоначального посева вводили исследуемое соединение в свежей среде. В культуры каждые 48 ч добавляли свежую среду, содержащую исследуемое соединение. В день сбора культуры промывали 0,03%-ной ЭДТК (этилендиаминотетрауксусная кислота) в ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) для удаления только ЗТЗ-фибробластов с последующей инкубацией в 0,05%-ном трипсине/0,03%-ной ЭДТК. Клетки суспендировали, интенсивно перемешивали для получения суспензии одиночных клеток и подсчитывали с помощью гемоцитометра.

Маточные растворы соединений готовили в виде 10 ^-2 М растворов в дегазированном 100%-ном этаноле и хранили в темноте при -20^oC. Во время эксперимента растворы, взятые в аликвотных количествах, доводили до комнатной температуры и применяли, непосредственно разбавляя до соответствующей концентрации в полной среде.

Способность соединений ингибировать in vitro рост пролиферации жировых клеток изучали в концентрациях 10^-6, 10^-7 и 10^-8 М.

Результаты представлены в таблице IV в виде количества соединения, необходимого для ингибирования пролиферации жировых клеток на 50% (ED₅₀) (в нМ) по сравнению с культурой, обработанной только носителем.

Тест на толерантность мышей к кальцию Выраженные изменения в гомеостазе кальция оказывают сильные воздействия на прибавление веса у мышей.

Мышам (весом 25-30 г) ежедневно подкожно вводили соединение в течение 4 последовательных дней. Вес тела регистрировали непосредственно перед обработкой и в конце пятого дня периода обработки. "Наиболее высокая доза, к которой еще проявляется толерантность" (ВТД), представляет собой дозу, которая приводит к нулевому прибавлению веса в течение этого периода обработки. Результаты приведены ниже в таблице V.

Соединения формулы I при местном нанесении на кожу приводят к реверсии состояний, обусловленных повреждениями под воздействием светового излучения, уменьшая и замедляя повреждение кожи, вызванное солнечным излучением. Повреждение, вызванное солнечным излучением, может включать преждевременное старение, эластоз и образование морщин. Это повреждение более выражено у пожилых пациентов. В результате местного нанесения соединений формулы I на кожу в количестве, эффективном для реверсии состояний, обусловленных повреждениями под воздействием светового излучения, происходит ускоренное восстановление кожи, что приводит к ее разглаживанию и омолаживанию. Соединения формулы I следует наносить на те участки кожи, которые подвержены повреждению, вызванному световым излучением, или на те участки кожи, которые требует такого лечения. Применение соединений формулы I в соответствии с настоящим изобретением может оказывать благоприятные воздействия в отношении предотвращения процесса старения кожи и образования морщин, а также усиливать восстановление кожи, поврежденной солнечным излучением.

Соединение формулы I или комбинация соединений формулы I в соответствии с настоящим изобретением могут быть нанесены на кожу человека в виде традиционных композиций, предназначенных для местного применения. Эти композиции могут использоваться для нанесения соединений формулы I на кожу тела, в частности лица, ног, рук и кистей рук. Для достижения наилучших результатов местное применение соединений формулы I предпочтительно начинать при возрасте пациента от 30 до 55 лет, т.е. когда эластоз начинает проявляться и становится более выраженным. Впоследствии эта композиция может постоянно применяться пациентами для снижения воздействий и повреждений, связанных с солнечным излучением. В целом лечение предпочтительно начинать, когда пациент достигнет приблизительно 30-летнего возраста, и продолжать лечение в течение всей его жизни с целью уменьшить проявление эластоза и дальнейшее развитие любого повреждения, связанного с воздействием светового излучения.

Соединения формулы I могут применяться в соответствии с настоящим изобретением в виде любой традиционной, пригодной для местного применения препаративной формы, т.е. в сочетании с любым традиционным носителем, пригодным для местного применения. Таким образом, соединения формулы I могут применяться в соответствии с настоящим изобретением в виде любой пригодной для местного применения композиции, такой, как крем, мазь, мыло, раствор, лосьон, эмульсия, шампунь и т.п. В целом для получения наиболее эффективных результатов эти композиции для местного применения содержат от приблизительно 0,00001 мас.% до приблизительно 0,1 мас.% по отношению к общей массе композиции соединения формулы I, причем количества от приблизительно 0,0001 мас. % до приблизительно 0,1 мас.% по отношению к общей массе композиции являются особенно предпочтительными. При необходимости могут использоваться более высокие концентрации в зависимости от природы и степени эластоза.

При изготовлении таких композиций может быть использовано любое традиционное нетоксичное, приемлемое с дерматологической точки зрения основание или носитель, в котором соединение формулы I стабильно. Предпочтительными композициями для применения согласно настоящему изобретению являются традиционные косметические композиции, которые могут содержать активный в косметическом отношении ингредиент, который местно наносят на кожу человека для получения косметического эффекта. Традиционными активными в косметическом отношении веществами, которые могут применяться в этой композиции, являются солнцезащитные вещества, усилители проникновения, увлажнители, поверхностно-активные вещества, смягчающие вещества, красители, кондиционеры, бактерициды, вяжущие средства, детергенты и т.п. Композиции для местного применения по настоящему изобретению могут при необходимости содержать пригодные солнцезащитные агенты. Для приготовления композиций, содержащих соединения формулы I, которые могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, может применяться любой традиционный солнцезащитный агент.

Такие композиции для местного применения, которые содержат соединения формулы I, могут содержать любые традиционные эксципиенты и добавки, обычно используемые при изготовлении композиций для местного применения. Традиционные добавки или эксципиенты, которые могут применяться при изготовлении этих косметических композиций по настоящему изобретению, включают консерванты, загустители, отдушки и т.п. Кроме того, в эти композиции могут быть включены традиционные антиоксиданты, такие, как бутилированные гидроксианизолы (БГА), аскорбилпалмитат, пропилгаллат, лимонная кислота, бутилированный гидрокситолуол (БГТ), этоксиквин, токоферол и др. подобные соединения, которые могут быть включены в эти композиции. Эти композиции для местного применения могут содержать традиционные приемлемые носители для местных применений, которые обычно используются в таких композициях. Эти композиции могут содержать загустители, увлажнители, эмульгирующие агенты и стабилизаторы вязкости, т.е. такие, которые обычно используются на практике. Кроме того, эти композиции могут содержать корригенты, красители и отдушки, которые традиционно используются для изготовления косметических композиций.

Композиции для местного применения, содержащие соединения формулы I, могут наноситься на кожу и предпочтительно должны наноситься на кожу один раз в день. Для обеспечения реверсии эластоза и разглаживания и омолаживания кожи композиции для местного применения должны наноситься предпочтительно в течение 6 месяцев. После этого применение композиции, содержащей соединения формулы I, должно быть продолжено, чтобы поддерживать кожу более молодой и гладкой. Эти препараты могут наноситься в соответствии с особенностями каждого конкретного пациента, что определяется лечащим врачом. В любом случае конкретный режим применения этой композиции пациентом обычно должен зависеть от возраста, веса и состояния кожи индивидуума.

Соответствующая активность соединения формулы I для реверсии повреждения кожи световым излучением при инсоляции кожи может быть проиллюстрирована следующим образом.

Восстановление с помощью соединений формулы I, вызванного УФ-излучением повреждения кожи у лишенных шерсти мышей Лишенных шерсти мышей (самки, линия HRS/J, фирма Jackson Labs, возраст которых к началу эксперимента составлял 5-7 недель) содержали в