Способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по вич, основанный на фенотипической лекарственной чувствительности человеческих штаммов вич

Способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по вич, основанный на фенотипической лекарственной чувствительности человеческих штаммов вич

Реферат

 

Изобретение относится к медицине. Сущность его состоит в том, что разработан способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по ВИЧ. Он состоит в том, что проводят трансфекцию линии клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ, нуклеотидной последовательностью, преимущественно кодирующей обратную транскриптазу и протеазу, из роl гена ВИЧ, выделенного у пациента, и сконструированной ДНК ВИЧ, из которой эта последовательность делетирована. Далее проводят культивацию трансфецированных клеток так, чтобы создать набор химерных вирусов, оценивают фенотипическую чувствительность химерных вирусов к ингибитору фермента, кодируемого роl геном ВИЧ, и определяют ее значение, конструируют набор данных, включающих величину чувствительности химерного вируса и соответствующую величину для химерного штамма ВИЧ дикого типа, отбирают оптимальный ингибитор на основании графического представления полученных таким образом данных. Технический результат: способ обеспечивает дешевое и быстрое получение большого объема фенотипической информации для индивидуальных ВИЧ-инфицированных пациентов. Способ практически применим ко всем доступным в настоящее время химиотерапевтическим режимам и, возможно, будет столь же применим к будущим химиотерапевтическим режимам. 3 с. и 21 з.п. ф-лы, 9 табл., 12 ил.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к способу определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ), а также к приспособлению для определения клинического курса, предназначенному для использования врачами в лечении таких пациентов, основанным на фенотипической лекарственной чувствительности человеческих штаммов ВИЧ к ингибиторам одного или более ферментов pol гена ВИЧ, а также к способу одновременного определения фенотипической лекарственной чувствительности одного или более из ферментов pol гена ВИЧ к их ингибиторам.

Уровень техники К настоящему времени для лечения ВИЧ-инфицированных пациентов разработаны несколько химиотерапевтических режимов. Некоторые из этих режимов были разрешены для клинического применения, а клинические испытания других продолжаются. Можно предположить, что число разрешенных химиотерапевтических режимов в ближайшем будущем будет постоянно возрастать. Из-за появления в ходе терапии устойчивых к лекарствам вариантов ВИЧ расширяется применение комбинационной терапии, т. е. режимов лечения набором нескольких лекарств. Хотя было показано, что эти химиотерапевтические режимы влияют на вирусологические (вирусемия), иммунологические и клинические показатели ВИЧ-заболевания, практический опыт свидетельствует, что эти эффекты кратковременны. Более того, было обнаружено, что штаммы ВИЧ, которыми инфицирован отдельный пациент, быстро начинают проявлять пониженную чувствительность к лекарству или комбинации лекарств, которыми лечат данного пациента. Степень утраты эффективности химиотерапии может варьировать в зависимость от пациента, лекарства или комбинации лекарств. Установлено, что потеря эффективности определенных типов химиотерапии может быть связана с генотипическим характером аминокислотных изменений в геноме штаммов ВИЧ, заразивших пациента. Это, по-видимому, делает эти штаммы ВИЧ менее чувствительными к химиотерапии. Если ВИЧ-инфицированного пациента подвергать воздействию нескольких химиотерапевтических схем в течение длительных периодов времени, возникает более сложный характер аминокислотных изменений в геноме инфицирующих штаммов ВИЧ, что препятствует плодотворному продолжению лечения инфицированного пациента. Из вышесказанного понятно, что обычно можно установить генотипические изменения, происходящие в штаммах ВИЧ, подвергавшихся воздействию различных химиотерапевтических режимов, включающих применение одного или нескольких анти-ВИЧ лекарств. Однако пока несомненно, что из этих данных очень трудно получить информацию, позволяющую врачу, прописывающему химиотерапию, определить, имеет ли смысл начинать или продолжать определенный химиотерапевтический режим. Другими словами, генотипическую информацию, доступную в весьма ограниченном объеме, обычно невозможно перевести в фенотипическую информацию, позволяющую лечащему врачу однозначно определить, какая химиотерапия предпочтительна для данного пациента. Подобная проблема существует и для не получавших лекарства пациентов, инфицированных устойчивыми к лекарствам штаммами ВИЧ.

Мониторинг вирусемии становится обычным аспектом контроля ВИЧ. Однако на основе только показателя вирусемии невозможно решить, какие лекарства следует применять поодиночке или в комбинации.

Из химиотерапевтических режимов все чаще выбирают комбинационную терапию. Если при использовании комбинации лекарств исследовать неэффективность лекарств, оказывается невозможным определить, какое из лекарств в комбинации утратило активность. Невозможно просто заменить все лекарства из-за ограниченного количества доступных лекарств. Далее, если заменить весь химиотерапевтический курс, можно отбросить одно или несколько лекарств, активных для данного пациента. Кроме того, вирусы, устойчивые к определенному ингибитору, могут проявлять также в различной степени перекрестную устойчивость к другим ингибиторам.

Таким образом, в каждом случае, когда имеются результаты теста на вирусемию и зафиксировано возрастание вирусной нагрузки, в идеале следовало бы провести также тестирование лекарственной чувствительности/устойчивости. До тех пор, пока не определена эффективная исцеляющая терапия, для контроля за ВИЧ-заболеванием необходимо такое тестирование.

Существует общепринятый фенотипический метод, основанный на выделении вируса из плазмы в присутствии одноядерных клеток периферической крови донора (ОКПК) и последующем определении фенотипа указанных клеток (Japour A.J. а.о. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993. V. 37. N 5. P. 1095-1101). Этот метод совместной культивации, который пропагандирует Группа клинических испытаний СПИД (ACTG) - особенно для фенотипирования устойчивости к азидотимидину (синоним зидовудина/ретровира, ретровир - товарный знак), требует много времени, дорог и слишком сложен для постоянного использования.

Фенотипический анализ рекомбинатных вирусов для оценки лекарственной восприимчивости изолятов ВИЧ типа I к ингибиторам обратной транскриптазы (ОТ) (reverse transcriptase - RT) был разработан Kellam P. and Larger B.A. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1994. V. 38. N.1. P. 23-30). Этот метод позволяет создать жизнеспособный вирус путем гомологичной рекомбинации пула нуклеотидных последовательностей, кодирующих ОТ и полученных методом ПЦР, в неинфекционный провирусный клон с делецией по ОТ - pHIV RTBstEII. Анализ для двух пациентов в ходе курса терапии зидовудином показал, что такой путь позволяет получить вирусы, обладающие в точности такими же генотипом и фенотипом, как и у ДНК исходных инфицированных лейкоцитов периферической крови. Однако этот способ включает в себя выделение вируса пациента путем совместной культивации плазмы или ОКПК пациента с ОКПК донора. Такая предварительная культивация вируса может исказить состав исходного вируса. К тому же этот способ, хотя и позволяет определить чувствительность изолятов к различным ингибиторам, но не предоставляет врачу информацию о том, следует ли продолжать существующий химиотерапевтический режим или же изменить терапию.

Кроме того, если изучают только один фермент pol гена, этот способ сам по себе не позволяет быстро получить текущую фенотипическую оценку комбинационной терапии, которая стандартно состоит в использовании одного ингибитора протеазы и двух ингибиторов ОТ.

Методика ПЦР (полимеразной цепной реакции) с фланкированием нуклеотидных последовательностей, используемая в анализе рекомбинантных вирусов, может привести к ситуации, когда рекомбинантный вирус не отражает в точности состояние штаммов ВИЧ, инфицировавших обследуемого пациента. Эта проблема сводится к гомологии последовательностей ДНК и к минимальной протяженности гомологии, необходимой для гомологичной рекомбинации в клетках млекопитающих (Rubnitz J. and Subramini S. Molecular and Cellular Biology. 1984. V. 4. N. 11. P. 2253-2258). Соответственно, любой фенотипический анализ, основанный на использовании рекомбинантного вируса, должен стремиться обеспечить максимально возможную амплификацию материала пациента и максимальную рекомбинацию.

Таким образом, применяемые способы выделения РНК и ПЦР с фланкированием последовательностей должны гарантировать такую амплификацию вирусного генетического материала, чтобы амплифицированный материал максимально отражал генетическое разнообразие вирусов у обследуемого пациента.

Следовательно, в текущей клинической практике имеется настоятельная потребность (а) в быстром и рутинном определении фенотипической лекарственной чувствительности штаммов ВИЧ, инфицировавших данного пациента, (б) в преобразовании полученных таким образом данных в легко трактуемую информацию и (в) в начале, продолжении или видоизменении на основе указанной информации предписанной указанным определенным пациентам химиотерапии.

Сущность изобретения В соответствии с первым аспектом изобретения предложен способ определения оптимальной химиотерапии ВИЧ пациентов, серопозитивных по ВИЧ, состоящий в трансфекции линии клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ, нуклеотидной последовательностью из pol гена ВИЧ, кодирующей желательный целевой фермент и полученной выделением вирусной РНК из образца биологического материала пациента и обратной транскрипцией необходимой области указанного pol гена, и сконструированной ДНК ВИЧ, из которой указанная последовательность делетирована, культивации указанных трансфецированных клеток, так чтобы создать набор химерных вирусов, оценке фенотипической чувствительности указанных химерных вирусов к ингибитору указанного фермента, кодируемого pol геном ВИЧ, и определении ее значения, конструировании набора данных, включающих в себя указанную величину для чувствительности химерных вирусов и соответствующую величину для химерного штамма ВИЧ дикого типа, повторении определения чувствительности по крайней мере еще для двух ингибиторов и конструировании таким образом в целом по крайней мере трех таких наборов данных, представлении указанных наборов данных в двумерной или трехмерной графической форме, так чтобы разница между чувствительностями химерного вируса и вируса дикого типа в случае каждого набора данных давала наглядную картину устойчивости химерного набора к воздействию данного ингибитора, и отборе оптимального ингибитора(ов) на основании графического представления измеренных таким образом устойчивостей.

Способ по настоящему изобретению экономично и быстро дает большой объем фенотипической информации для индивидуальных ВИЧ-инфицированных пациентов. Способ применим для всех находящихся в обращении доступных химиотерапевтических режимов, и ожидается, что он будет в такой же степени применим для будущих химиотерапевтических режимов.

Способ по настоящему изобретению предоставляет врачу фенотипические данные для штаммов ВИЧ пациента, которые можно немедленно использовать для определения того, следует ли начать, продолжить или видоизменить данный химиотерапевтический режим.

Предпочтительно наборы данных представляются на многоугольной или квазициркулярной диаграмме, включающей: (а) несколько нормализованных осей, выходящих радиально из начала координат, причем каждая ось соответствует одному набору данных или ингибитору или их комбинации; (б) оси, нормализованные таким образом, что величины чувствительности для ВИЧ дикого типа к различным ингибиторам равны на каждой оси, причем отсчеты данных представлены произвольно, и соединены с образованием правильного многоугольника, вершины которого лежат на осях, а центр которого задан началом координат.

(в) на каждой оси отложен отсчет, представляющий величину чувствительности набора химерных ВИЧ к ингибитору, соответствующему данной оси, причем отсчеты химерных данных соединены произвольным образом с образованием правильного или неправильного многоугольника, форма которого представляет устойчивость химерного набора к ряду ингибиторов.

Многоугольная или квазициркулярная диаграмма удобна тем, что устойчивость пациента к большому количеству лекарств характеризуется степенью различия между многоугольником, соответствующим набору химерных ВИЧ пациента, и многоугольником, соответствующим штамму дикого типа. Области многоугольников, как правило, расходятся в некоторых областях больше, чем в других, указывая в каждом случае на большую или меньшую степень устойчивости к ингибитору, чья ось проходит через данную область.

Таким образом, способ в соответствии с данным изобретением использует набор химерных ВИЧ и дает карту устойчивости этого набора по всему ряду ингибиторов. При таком способе карта или диаграмма дает техническую характеристику особенности химерного набора, которую нельзя получить обычными измерениями.

В предпочтительном осуществлении нормализованные оси располагаются под равными углами относительно друг друга.

Далее, предпочтительно каждая ось имеет логарифмическую шкалу.

Далее, предпочтительно, если в химерном многоугольнике представлены эксцентрические отсчеты данных, это указывает на ингибиторы, применение которых предположительно будет мало полезным или бесполезным для пациента, тогда как отсчеты данных, лежащие внутри или очень близко вне многоугольника дикого типа, указывают ингибиторы, применение которых будет существенно полезным для пациента.

Если для химерных ВИЧ и ВИЧ дикого типа представить наихудшие значения, то неправильный многоугольник, как правило, окружает многоугольники и химерный, и дикого типа. Смысл термина "эксцентрический", использованного выше, означает отсчет данных, лежащий относительно близко к границе наихудшего случая и относительно далеко от многоугольника дикого типа. Аналогично, термин "близко вне многоугольника дикого типа" означает относительную близость к многоугольнику дикого типа в сравнении с расстоянием от границы наихудшего случая.

Способ, определенный здесь выше, ограничен в том смысле, что измеряемая устойчивость к ингибитору зависит от выбора концентраций применяемого ингибитора. Необходимо также стараться снизить эффекты биологической вариабельности. Поэтому желательно получить отсчет для максимальной устойчивости - наихудшего случая - там, где ожидается, что данный ингибитор неэффективен. Эта концентрация, например 100 М, обычно является максимальной концентрацией, которую практически можно измерить, но ее можно установить также, например, в фармакологических, токсикологических или фармакокинетических исследованиях. Сравнение уровня устойчивости для обследуемого пациента с максимальной измеряемой устойчивостью определяет, каков достоверный уровень устойчивости для данного пациента. Максимальную измеряемую устойчивость и реальную устойчивость можно удобно представить гистограммой, как описано ниже.

В еще одном предпочтительном осуществлении изобретения каждый из указанных трех или более наборов данных содержит величину измеряемой устойчивости наихудшего случая к данному ингибитору, причем указанные значения наихудшего случая представлены на указанных графических изображениях таким образом, что отсчет данных для химерного набора можно сравнить как с ВИЧ дикого типа, так и с ВИЧ наихудшего случая, что дает таким образом оценку относительного значения для данного ингибитора.

В экспериментах с образцами от более чем 150 пациентов была установлена хорошая корреляция между развитием устойчивости и историей терапии, как будет проиллюстрировано ниже в примерах. Хорошая корреляция была найдена у данных, полученных в соответствии с изобретением, с результатами применения классических методов выделения вируса и фенотипирования.

Итак, способ в соответствии с данным изобретением можно использовать для индивидуализированного и более рационального определения оптимальной химиотерапии ВИЧ. Таким образом, использование способа в соответствии с данным изобретением в комбинации с правильным применением анти-ВИЧ лекарств должно в конечном итоге привести к улучшению лечения и повышению выживаемости пациентов, инфицированных ВИЧ.

Способ в соответствии с изобретением имеет особое применение, когда определенный пациент получал много различных лекарств и характер мутаций его вируса лечащим врачам трудно определить.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предлагается способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по ВИЧ, включающий в себя следующие этапы: (а) периодическую оценку фенотипической чувствительности штаммов ВИЧ пациента способом, описанным выше; (б) проведение химиотерапии выбранным ингибитором, если штаммы ВИЧ пациента остаются восприимчивыми к выбранной химиотерапии; в) выбор другого ингибитора, в том случае, когда чувствительность к первоначальному ингибитору снижается.

Приспособление для определения клинического курса в соответствии с данным изобретением названо "Антивирограмма", и этот термин будет использоваться далее в описании изобретения. Это приспособление дает врачам ясное представление об относительных изменениях и восприимчивости к различным ингибиторам, которые используются или могут быть использованы в клиническом курсе отдельных пациентов.

Под термином ВИЧ в контексте настоящего изобретения в основном понимается ВИЧ-1. Однако настоящее изобретение применимо также и к ВИЧ-2.

Предпочтительно одновременно определяют фенотипическую чувствительность указанных химерных вирусов к ингибиторам по крайней мере двух ферментов, кодируемых pol геном ВИЧ.

В следующем аспекте изобретения предлагается способ определения фенотипической лекарственной чувствительности индивидуальных штаммов ВИЧ пациента к ингибиторам по крайней мере двух ферментов, кодируемых pol геном ВИЧ, заключающийся в трансфекции линии клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ, нуклеотидной последовательностью из pol гена ВИЧ, кодирующей указанный фермент и полученной выделением вирусной РНК из образца биологического материала пациента и обратной транскрипцией необходимой области указанного pol гена, и сконструированной ДНК ВИЧ, из которой указанная последовательность делетирована, культивации указанных грансфецированных клеток, так чтобы создать набор химерных вирусов и оценку фенотипической чувствительности указанных химерных вирусов к ингибиторам указанных ферментов, кодируемых pol геном ВИЧ.

Необходимую нуклеотидную последовательность pol гена выделяют из образца биологического материала, полученного от пациента, чью фенотипическую лекарственную чувствительность определяют. Для выделения нужной последовательности могут быть использованы разнообразные биологические материалы.

Так, биологический материал может быть отобран из плазмы, сыворотки или бесклеточной жидкости, отобранной из семени или вагинальной жидкости. Плазма в особенности предпочтительна и особенно удобна для использования ОКПК в соответствии с предыдущими приемами, описанными выше.

В качестве альтернативы биологическим материалом может быть цельная кровь, к которой добавлен стабилизатор РНК.

В следующем варианте осуществления биологическим материалом может быть плотный материал ткани, отобранный из ткани мозга или ткани лимфатического узла, или другой ткани, полученной биопсией.

Как продемонстрировано ниже, если для выделения требуемой последовательности используют такой биологический материал, как плазма, достаточен минимальный объем плазмы, обычно около 100-250 мкл, чаще около 200 мкл.

Далее, предпочтительно из ОТ, протеазы и интегразы ВИЧ отбирают два избранных фермента.

Вирусную РНК удобно выделять в соответствии с изобретением методами, известными per se, например методом Boom R. et al. (Journal of Clinical Microbiology. 1990. V. 28. N 3. P. 495-503).

В случае плазмы, сыворотки и бесклеточных жидкостей тела можно также использовать набор для вирусной РНК "QlAamp", производимый группой компаний "Qiagen".

Предпочтительно линией клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ, является линия Т-клеток CD4⁺.

Далее, предпочтительно линией Т-клеток CD4⁺ является линия клеток МТ4 или линия клеток HeLa CD4⁺.

Обратная транскрипция может быть осуществлена с помощью коммерческого набора, как, например, набора обратной транскриптазы GeneAmp, производимого фирмой Perkin Elmer.

Необходимую область pol гена пациента предпочтительно транскрибировать с использованием нисходящего праймера.

В том случае, когда последовательностью, подлежащей обратной транскрипции, является последовательность, кодирующая обратную транскриптазу или обратную транскриптазу и протеазу, нисходящим праймером предпочтительно является OUT3: 5'-CAT TGC TCT, CCA, ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-3' (SEQ ID NO: 1).

В особенно предпочтительном осуществлении ген ОТ ВИЧ пациента и ген протеазы ВИЧ подвергают обратной транскрипции с использованием специфического для ВИЧ-1 праймера OUT3 и геноинженерной обратной транскриптазы, лишенной активности РНКазы Н, так чтобы транскрибируемую валовую РНК превратить в кДНК без деструкции. Такую геноинженерную, обратную транскриптазу "Expand" можно получить от фирмы Boehringer Mannheim GmbH.

Обратная транскриптаза "Expand" представляет собой РНК-зависимую ДНК-полимеразу. Этот фермент - геноинженерная версия обратной транскриптазы вируса мышиной лейкемии Молони (M-MuLV-RT). Точечная мутация в последовательности для РНКазы Н снижает активность РНКазы Н до значений ниже уровня чувствительности ее обнаружения. Использование этой геноинженерной обратной транскриптазы позволяет получать транскрипты кДНК полной длины.

После обратной транскрипции транскрибированную ДНК амплифицируют методом ПЦР.

Предпочтительно продукт обратной транскрипции амплифицируют с использованием метода ПЦР с фланкированием последовательностей.

Предпочтительно в случае, когда рассматриваемая область - это область ОТ, используют метод ПЦР с фланкированием последовательностей с применением внутренних и внешних праймеров, как описано Kellam P. and Larger B.A. (1994) (см. выше). Если рассматриваемая область перекрывает гены ОТ и протеазы, то используемые специфические праймеры - предпочтительно комбинация OUT3/IN3 (нисходящий) и RVP5 (восходящий).

Праймер RVP5 (Maschera В. а.о. Journal of Virology. V. 69. P. 5431-5436) имеет последовательность 5'-GGGAAGATCTGGCC TTCCTACAAGGG-3' (SEQ ID NO: 2).

Амплификация схематически представлена графой 4 на фиг. 3 и более подробно описана в примере 2.

Амплификация кДНК протеазы фактически включает методику ПЦР с полуфланкированием, как будет ясно из фиг. 3.

Методика ПЦР с фланкированием имеет преимущество перед известными простыми методиками ПЦР, т.к. позволяет получать наиболее специфический продукт ПЦР.

Однако, чтобы при ПЦР получить еще большие эффективность прочтения и выход, можно использовать смесь термостабильных полимераз (Barnes W.M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 2216-2220). Такую смесь полимераз можно получить от фирмы Boehringer Mannheim GmbH под названием "Высокоэффективная система ПЦР "Expand". С помощью этой системы удалось повысить эффективность в 10 или более раз в сравнении с эффективностью обычной ПЦР методики с применением одной полимеразы Taq.

Если область pol гена перекрывает гены ОТ и протеазы, предпочтительно, чтобы сконструированная ДНК ВИЧ была такой, из которой делетированы гены ОТ и протеазы, и это была бы плазмида pGEMT3-PRT, депонированная в бельгийской координационной коллекции микроорганизмов 8 ноября 1996 г. под номером LMBP3590.

Тем не менее можно разными способами создать плазмиду, содержащую провирус ВИЧ-1 с делецией генов протеазы и ОТ. Одна из возможностей состоит во введении необходимой делеции мутагенезом под действием олигонуклеотидов. Однако избранная далее в примере 2 методика состоит в создании необходимой конструкции с применением специфических рестриктаз и субклонирования, как описано ниже. Хотя конечный результат зависит от наличия необходимых сайтов рестрикции, главное достоинство этой методики заключается в быстроте получения конечных результатов.

Чтобы обеспечить наиболее эффективную трансфекцию, ПЦР-продукт, подлежащий трансфекции, в идеале следует очистить на ионообменных центрифужных колонках известным per se способом. Группа компаний "Qiagen" выпускает подходящий набор под названием "QlAquick PCR Purification Kit".

Трансфекцию можно осуществить методом электропорации или с использованием липидов, в особенности катионных, ДЭАЭ-декстрана, CaHPO₄ и т.д.

При трансфекции с липидами можно использовать набор "PERFECT" фирмы "Invitrogen" (Лик, Нидерланды).

Итак, для трансфекции используют сконструированную ДНК ВИЧ, в которой делетированы необходимые ген или гены из системы pol гена, вместе с продуктом амплификации.

ДНК-конструкцией может быть плазмида pHIVRT фирмы "Medical Research Council (MRC)", если нужно делетировать только ген ОТ. Если делетированы гены и ОТ, и протеазы, удобно использовать в качестве ДНК-конструкции описанную здесь плазмиду pGEMTЗ-PRT, которая является высокопийным вектором. Такие плазмиды перед трансфекцией линеаризуют известными per se методами.

Особенное преимущество в использовании конструкции, кодирующей более чем один фермент pol гена, например конструкции PRT, состоит в том, что в этом случае можно включить большее количество исходного материала пациента, чем в случае использования одного гена, так что амплифицированный материал более полно отражает генетическое разнообразие штаммов данного обследуемого пациента.

Следует подчеркнуть желательность того, чтобы специфические праймеры для ПЦР с фланкированием располагались снаружи базовых последовательностей целевых ферментов, подлежащих амплификации и анализу. Кроме того, комбинация ОТ и протеазы предпочтительна и дает лучшие результаты в исследовании ОТ, чем система только с ОТ, из-за того, что в этом случае еще 40 аминокислот исходят от пациента. Для изучения протеазы следует удостовериться, что первые 9 аминокислот протеазы происходят из базовой последовательности дикого типа конструкции pGEMT3-PRT.

Если трансфекцию клеток осуществляют электропорацией, для хорошего роста клеток и выхода вируса требуется оптимизация определенных параметров. Удобно проводить электропорацию при приблизительно 250 мкФ и 300 В. Предпочтительно проводить электропорацию в присутствии около 10 мкг линеаризованной плазмиды, например pHIVRTBstEII, и около 5 мкг продукта ПЦР, например продукта ОТ ПЦР. В случае эффективной внутриклеточной гомологичной рекомбинации новый химерный ВИЧ образуется в течение 5-10 дней. При использовании обычных методик для образования химерного ВИЧ требуется культивация в течение 12-14 дней. Аликвоты культуральной надосадочной жидкости хранят при температуре -70^oC или ниже.

Очевидно, что можно использовать эти методики для выделения и амплификации других генов ВИЧ, например гена интегразы, или нескольких генов ВИЧ, например генов ОТ и интегразы вместе, и трансфекции Т-клеток CD4⁺ соответствующими продуктами ПЦР интегразы или ОТ/интегразы вместе с подходящей конструкцией ДНК ВИЧ, из которой делетирован нужный ген (или гены).

Новообразованные химерные вирусы титруют и анализируют на фенотипическую чувствительность (или восприимчивость) к различным ингибиторам ферментов ро1 гена, предпочтительно с помощью автоматизированных клеточных тестов.

Предпочтительно выражать фенотипическую лекарственную чувствительность химерных вирусов и штамма ВИЧ дикого типа - соответствующего рекомбинантного штамма ВИЧ дикого типа к одному или более ингибиторам величиной ингибирующей концентрации (значением IC).

Восприимчивость химерных вирусов и штамма ВИЧ дикого типа к одному или более ингибиторам ОТ и/или одному или более ингибиторам протеазы можно выражать, например, величиной концентрации при 50% или 90% ингибировании (IC₅₀ или IC₉₀).

Предпочтительно ингибиторы ОТ выбирают среди нуклеозидных ингибиторов ОТ, как, например, азидотимидин (АЗТ), ddl (диданозин - "Videx"), ddC (зальцитабин), 3ТС (ламивудин), d4T (ставудин), таких ненуклеозидных ингибиторов ОТ, как делавиридин (U 9051125 (ВМАР) -"Rescriptor"), ловирид (АРА), невирапин (B1-RG-587 - "Viramune") и тивирапин (8-CI-TIBO(R86183)), таких ингибиторов протеазы, как сагинавир, индинавир и ритонавир, и таких ингибиторов интегразы, как фенилэтиловый эфир кофеиновой кислоты (САРЕ).

Подходящие ингибиторы ОТ и/или интегразы выбирают из нуклеозидных ингибиторов ОТ - как, например, АЗТ, ddl, ddC, 3ТС, d4T, 1592U89 и др., таких ненуклеозидных ингибиторов ОТ, как ловирид, невирапин, делавиридин, атевиридин, тивирапин (8-CI-TIBO) и др., таких ингибиторов протеазы, как сагинавир, индинавир, ритонавир и др., и таких ингибиторов интегразы, как фенилэтиловый эфир кофеиновой кислоты (САРЕ), а также ингибиторов интегразы ВИЧ типа описанных в патентной заявке WO 95/08540 и патенте GB 2,271,566.

Способ по настоящему изобретению включает этап сравнения фенотипической лекарственной чувствительности штаммов ВИЧ пациента к одному или более ингибиторам ОТ и/или одному или более ингибиторам протеазы и/или одному или более ингибиторам интегразы с чувствительностью штамма дикого типа. Для более наглядного представления относительных изменений в восприимичивости к различным испытываемым лекарственным соединениям (или их комбинациям) сконструирована диаграмма "Антивирограмма".

Диаграмму следует интерпретировать следующим образом: эксцентрические отсчеты на антивирограмме указывают на химиотерапевтические режимы, дальнейшее применение которых для ВИЧ-инфицированного пациента бесполезно, тогда как значения внутри референсного многоугольника или на нем, или только немного за границей референсного многоугольника указывают химиотерапевтические режимы, перспективные для применения.

Способы по настоящему изобретению в сочетании с применением правильных анти-ВИЧ лекарств должны в конце концов привести к повышению эффективности лечения, улучшению состояния и снижению смертности ВИЧ-инфицированных пациентов вследствие того, что таким образом можно предотвратить или прервать лечение, неэффективное из-за присутствия или возникновения устойчивых штаммов ВИЧ, и в нужный момент можно применить эффективную химиотерапию.

Перечень фигур графических материалов Фиг. 1 - схема конструирования плазмиды pGEMT3-PRT; Фиг. 2 - более подробная дополнительная схема конструирования плазмиды pGEMT3-PRT; Фиг. 3 - схема области нуклеотидных последовательностей ВИЧ-НХВ2D, содержащей гены протеазы и ОТ; Фиг. 4 А-Н - полная нуклеотидная последовательность области нуклеотидных последовательностей ВИЧ-НХВ2D, содержащей гены протеазы и ОТ; Фиг. 5 - антивирограмма для пациента, у которого обнаружены устойчивые к 3ТС штаммы ВИЧ, как описано в примере 5; Фиг. 6 - антивирограмма для не получавшего лечения пациента, у которого обнаружены штаммы ВИЧ, подобные дикому типу, как описано в примере 6; Фиг. 7А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 7; Фиг. 7Б - антивирограмма для пациента из примера 7; Фиг. 8А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 8; Фиг. 8Б - антивирограмма для пациента из примера 8; Фиг. 9А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 9; Фиг. 9Б - антивирограмма для пациента из примера 9; Фиг. 10А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 10; Фиг. 10Б - антивирограмма для пациента из примера 10; Фиг. 11А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 11; Фиг. 11Б- антивирограмма для пациента из примера 11; Фиг. 12А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 12; Фиг. 12Б - антивирограмма для пациента из примера 12; Далее изобретение будет иллюстрировано примерами.

Примеры осуществления изобретения Пример 1 Протокол 1. Выделение и амплификация вирусной РНК.

РНК выделяли из 100 мкл плазмы по методу, описанному Boom R. а.о. (1990) (см. выше) и транскрибировали с помощью набора обратной транскриптазы GeneAmp фирмы Perkin Elmer в соответствии с указаниями производителя и с использованием специфического для ВИЧ-1 нисходящего праймера (OUT3: 5'-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA ТТТ CTC ATC-3'; SEQ ID NO: 1). На обратно транскрибированной РНК проводили ПЦР с внутренним и внешним праймерами, как описано Kellam P. and Larger B.A. (1994) (см. выше). После экстракции хлороформом и центрифугирования через колонки Centricon 100 или через анионообменные центрифужные колонки (Quiagen) выделенный продукт ПЦР был готов к использованию в реакциях трансфекции.

2. Конструирование и выделение плазмиды.

Продукцию плазмиды pHIVRT (MCR) осуществляли в Е. coli. Плазмидную ДНК выделяли из суточных культур с использованием колонок Qiagen в соответствии с рекомендациями производителя. Выход выделенной плазмиды определяли спектрофотометрически на основании измерений А260/280 (измерений оптической плотности при = 260 и 280 нм). Из 500 мл бактериальной культуры получали около 250 мкг сверхчистой плазмидной ДНК. Идентичность выделенной плазмиды подтверждали рестрикционным анализом. Затем выделенную плазмидную ДНК линеаризовали рестриктазой BstEII и снова очищали классической экстракцией смесью фенол/хлороформ.

3. Трансфекция клеток.

Клетки МТ4 субкультивировали для трансфекции до концентрации 250000 клеток/мл (экспоненциальная фаза роста). Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в буферном фосфатно-солевом растворе (PBS) при концентрации 3,110⁶ клеток/мл. Для каждой трансфекции использовали порцию 0,8 мл (2,510⁶ клеток/мл). Трансфекцию осуществляли с помощью импульсного источника напряжения фирмы "Bio-Rad Gene" в 0,4 см электродных кюветах. Электропорацию клеток проводили в присутствии 10 мкг линеаризованной плазмиды pHIVRT и около 5 мкг продукта ПЦР ОТ при 250 мкФ и 300 В, после чего инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем к клеточной суспензии добавляли 10 мл свежей культуры и проводили инкубацию при 37^oC во влажной атмосфере 5% CO₂.

4. Культивирование и использование трансфецированных клеток.

В течение 7-10 дней после трансфекции клетки проверяли на наличие цитопатогенного эффекта. При его отсутствии клетки субкультивировали в отдельных флаконах. Затем культуральную надосадочную жидкость трансфецированных клеток использовали для создания набора рекомбинантных вирусов и хранили в аликвотах по 1,5 мл при -70^oC.

5. Анализ рекомбинантного вируса, полученного из вирусной РНК пациента.

После титрования новых вирусов их наборы использовали для антивирусных опытов в присутствии последовательных разведений различных ингибиторов ВИЧ. Титры в отобранных надосадочных жидкостях определяли предельным титрованием вируса в последовательных разведениях в клетках МТ4.

В антивирусных опытах использовали вирусы с подходящим титром. С этой целью планшеты для титрования с 96 ячейками заполняли 100 мкл полной культуральной среды. Затем в серии ячеек с дублированием добавляли рабочие растворы соединений в объеме 25 мкл.