Способы и композиции для диагностики и лечения рака

Способы и композиции для диагностики и лечения рака

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к биологии опухоли, а именно к способам и композициям лечения сквамозной (чешуйчатой) клеточной карциномы. Обеспечивается также животная модель для изучения микроскопических остаточных опухолей и опухолевого обсеменения в полостях тела, а также способы их лечения. Сущность изобретения: разработана экспрессионная конструкция, содержащая промотор, функциональный в эукариотических клетках, и полинуклеотид, кодирующий р53, причем полинуклеотид расположен в смысловой ориентации к промотору. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств против раковых опухолей. 2 с. и 41 з.п. ф-лы, 7 табл., 28 ил.

Изобретение относится, в основном, к области биологии опухоли. Более конкретно, изобретение относится к композициям и способам лечения сквамозной (чешуйчатой) клеточной карциномы. Обеспечивается также животная модель для изучения микроскопических остаточных опухолей и опухолевого обсеменения в полостях тела, а также способы их лечения.

Балансирование скоростями клеточной пролиферации и отмирания клеток является важным в поддержании гомеостаза нормальной ткани. Нарушение этого баланса может быть основным фактором в многоступенчатом процессе онкогенеза, а ингибирование апоптоза, или запрограммированного отмирания клеток, является одной из причин этого нарушения. Влияние таких дефектов является катастрофичным, вызывающим около полумиллиона смертей ежегодно в одних Соединенных Штатах.

Имеются существенные доказательства причастности мутаций p53 гена, опухолевого супрессора, в этиологии многих раковых заболеваний человека. Сообщения демонстрировали, что рост различных раковых клеточных линий человека, включающих представителей рака толстой кишки, глиобластому, рак груди, остеосаркому и рак легкого может функционально подавляться с помощью вирусно-опосредованного переноса p53 гена дикого типа. Было показано, что индуцирование экзогенной p53 экспрессии p53 дикого типа индуцирует апоптоз в раковых клеточных линиях толстой кишки и в легочных раковых сфероидах человека, наводя на мысль о роли p53 гена в запрограммированном отмирании клеток.

Пациенты со сквамозной клеточной карциномой головы и шеи (SCCHN) поражаются заболеванием, которое часто оказывает сильное влияние на речь, глотание и хирургическую операцию, затрагивающую внешность пациента. Кроме того, общая степень выживания среди этих пациентов, приблизительно 50%, остается неизменной в течение последних 30 лет, с тех пор как были основаны современная хирургия и радиационная терапия. Рецидивы являются преимущественно локальными и региональными в противоположность систематическим, указывая на то, что микроскопическая остаточная карцинома в первичном опухолевом участке является главной причиной смертности. Благодаря этим фактам, способность эффективно воздействовать на микроскопические остаточные заболевания в SCCHN является попыткой, которая может улучшить терапевтическую эффективность лечения рака.

Поэтому, задачей настоящего изобретения является создание улучшенных способов лечения сквамозной клеточной карциномы in vivo. Другой задачей настоящего изобретения является создание способа оценки развития и лечения микроскопической остаточной карциномы и микроскопического опухолевого обсеменения полостей тела.

Для решения этих задач предлагается способ лечения субъекта со сквамозной клеточной карциномой, включающий стадии (а) обеспечения экспрессионной конструкции, включающей промоторную функцию в эукариотических клетках и полинуклеотид, кодирующий p53, где полинуклеотид располагается в смысловой ориентации к промотору и находится под контролем промотора; (б) контактирования экспрессионной конструкции со сквамозной клеточной карциномой in vivo.

Сквамозная клеточная карцинома может быть карциномой головы и шеи. Эндогенный p53 сквамозной клеточной карциномы может быть, а может и не быть мутированным. Экспрессионная конструкция предпочтительно является вирусным вектором, таким как ретровирусный вектор, аденовирусный вектор и адено-ассоциированный вирусный вектор, с репликационно дефицитным аденовирусным вектором, который является наиболее предпочтительным. В конкретном варианте, p53 ген направляется таким образом, что может быть обнаружена экспрессия p53 из экспрессионного вектора. Предпочтительной мишенью является иммунологическая мишень, такая как секвенциальный эпитоп антитела.

Способ может далее включать хирургическую резекцию опухоли с дополнительным контактированием опухолевого ложа или "искусственной полости тела" с экспрессионной конструкцией после резекции. Объем, используемый для контакта с опухолевым ложем, составляет от около 3 мл до около 10 мл. Там, где применяется аденовирусный вектор, количество аденовируса, введенного в каждый процесс контактирования, составляет 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ или 10¹² pfu.

Рассматривается также непрерывная перфузия экспрессионной конструкции. Количество конструкции, доставленное в процессе непрерывной перфузии, будет определяться исходя из количества, доставленного путем инъекций, так чтобы аппроксимировать ту же самую полную дозу в течение данного периода времени, хотя могут быть достигнуты несколько большие общие дозы с использованием непрерывной перфузии.

В другом варианте экспрессионная конструкция вводится в виде инъекции в естественную полость тела, такую как рот, глотка, трахея, плевральная полость, перитонеальная полость, или полости полых органов, включающие мочевой пузырь, толстую кишку или другие висцеральные органы.

Также заявляется способ определения эффективности терапии на микроскопический остаточный рак, включающий (а) обеспечение грызуна с рассечением в подкожной ткани; (б) обсеменение рассечения опухолевыми клетками; (с) лечение грызуна терапевтическим способом; (д) оценка воздействия режима на развитие опухоли. Рассечение может быть изолировано после стадии (б) и до стадии (с). Кроме того, режим может включать введение терапевтической композиции в рассечение, которое повторно открывается после изоляции и повторно изолируется после введения указанной терапевтической композиции.

Другие задачи, черты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего детального описания. Должно быть, однако, понятно, что детальное описание и конкретные примеры, в то время как они указывают на предпочтительные варианты изобретения, даются исключительно с целью иллюстрации, так как различные изменения и модификации в пределах сути и объема изобретения станут очевидны специалисту в этой области из этого детального описания.

Следующие чертежи являются частью настоящего описания и включаются для дальнейшей демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть лучше понято со ссылкой на один или большее количество этих чертежей вместе с детальным описанием конкретных вариантов, представленных здесь.

Фиг. 1 - эффективность трансдукции SCCHN клеточных линий Tu-138 (сплошные треугольники) и Tu-177 (сплошные квадраты). Был использован рекомбинантный -гал аденовирус для инфицирования клеток при различных MOI областях от 10 до 100. Процентное содержание -гал-позитивных клеток было получено из подсчета 500 клеток, находящихся на каждой чашке для репликации.

Фиг. 2A и 2B - ингибирование роста SCCHN клеток in vitro. Фиг. 2A - кривая роста mock-зараженных Tu-138 клеток (сплошные кружки), d-1312-зараженных клеток (сплошные треугольники) и Ad5CMV-p53-зараженных клеток (сплошные квадраты). Фиг. 2B - кривая роста mock-зараженных Tu-177 клеток (открытые кружки), d1312-зараженных клеток (открытые треугольники), Ad5CMV-p53-зараженных клеток (открытые квадраты). В каждый указанный момент времени три чашки клеток были подвергнуты трипсинизации и подсчитаны. Значение SEM подсчитанных клеток на тройные лунки после заражения представляли в виде зависимости от времени (количества суток) с момента заражения.

Фиг. 3A, 3B, 3C и 3D - составная кривая роста четырех SCCHN клеточных линий. Фиг. 3A - Tu-138. Фиг. 3B - Tu-177. Фиг. 3C - MDA 686-LN. Фиг. 3D - MDA 886. Mock-зараженные клетки (сплошные кружки), d1312-зараженные клетки (сплошные треугольники) и Ad5CMV-p53 зараженные клетки (сплошные квадраты). Значение подсчитанных клеток на тройные лунки после заражения представляли в виде зависимости от количества суток с момента заражения; bars, SEM (сканирующая электронная микроскопия).

Фиг. 4 - кривая роста клеточной линии нормальных фибробластов. Mock-зараженные клетки (сплошные кружки), d1312-зараженные клетки (сплошные треугольники) и Ad5CMV-p53 зараженные клетки (сплошные квадраты).

Фиг. 5A и 5B - составная кривая роста SCCHN клеточных линий. Фиг. 5A - Tu-138. Фиг. 5B - MDA 686LN. Mock-зараженные клетки (открытые квадраты), d1312-зараженные клетки (открытые треугольники) и Ad5CMV-p53 зараженные клетки (открытые кружки). В каждый указанный момент времени три чашки клеток были подвергнуты трипсинизации и подсчитаны. Значение подсчитанных клеток на тройные лунки представляли в виде зависимости от количества часов после заражения; bars, SEM.

Фиг. 6A и 6B - мечение ДНК разрывов в апоптотических клетках биотинилированным dUTP с помощью TUNEL способа. После заражения, проточный цитометрический анализ для апоптоза проводили в процессе исследования. Фиг. 6A - Tu-138 клетки, которые заражали d1312, репликационно-дефицитным аденовирусом (панель 1 - панель 4), Tu-138 клетки, зараженные p53 аденовирусом дикого типа (панель 5 - панель 8). Фиг 6B - MDA 686LN клетки, которые заражали d1312, репликационно-дефицитным аденовирусом (A-D), MDA 686LN клетки, зараженные p53 аденовирусом дикого типа (E-H). Ap стенды (Ap stands) для апоптоза.

Фиг. 7A и 7B - составная кривая роста SCCHN клеточной линии. Фиг. 7A - Tu-138. Фиг. 7B - MDA 686LN. Mock-зараженные клетки (открытые кружки), d1312-зараженные клетки (закрытые треугольники) и Ad5CMV-p53 зараженные клетки (закрытые квадраты). В каждый указанный момент времени три чашки клеток были подвергнуты трипсинизации и подсчитаны. Значение подсчитанных клеток на тройные лунки представляли в виде зависимости от времени (количества часов) после заражения; bars, SEM.

Информация доступных данных предполагает, что одним из первичных недостатков лечения SCCHN является неспособность к полной ликвидации заболевания в первичном опухолевом участке, или в непосредственных локальных или региональных тканях, поэтому настоящее изобретение направлено на обеспечение методологий генной терапии, которые позволяют проводить более полное и эффективное лечение SCCHN, особенно за счет воздействия на микроскопическую остаточную карциному. Эта методология может быть использована сама по себе или вместе с более обычными методами лечениями, такими как химио- и радиотерапия или хирургическое вмешательство. Кроме того, использование животной модели конкретно направленной на лечение микроскопической остаточной карциномы, а также микроскопического опухолевого обсеменения полостей тела, настоящее изобретение демонстрирует эффективность этих способов. Детали изобретения описываются более полно ниже.

Обычно наблюдали, что p53 генная терапия рака может быть эффективной независимо от статуса p53 опухолевой клетки. Неожиданно терапевтические эффекты наблюдали, когда вирусный вектор, несущий p53 ген дикого типа, использовался для лечения опухолевых заболеваний, клеток, которые экспрессировали p53 молекулу. Этот результат не был предсказуемым на основании существующего понимания как функционируют опухолевые супрессоры. Неожиданным также является факт, что нормальные клетки, которые также экспрессируют функциональную p53 молекулу, явно не затрагиваются экспрессией высоких уровней p53 из вирусной конструкции. Это увеличивает возможность того, что p53 генная терапия может быть более широко применима для лечения раковых заболеваний, чем первоначально ожидали.

A. P53 белки и полинуклеотиды.

Во всем тексте этой заявки термин "p53" относится к служащим примером p53 молекулам, а также ко всем p53 гомологам из других видов. "Дикого типа" и "мутантный" p53 относится соответственно к p53 гену, экспрессирующему нормальную опухолевую супрессорную активность, и к p53 гену, испытывающему недостаток или имеющему пониженную супрессорную активность и/или обладающему трансформирующей активностью. Таким образом, "мутантные" p53's являются скорее просто вариантами последовательности, а не вариантами, показывающими измененные функциональные профили.

p53 в настоящее время признается как опухолевый супрессорный ген (Montenarh, 1992). Были найдены высокие уровни гена во многих клетках, трансформированных с помощью химического карциногенеза, ультрафиолетового облучения и некоторыми вирусами, включая SV40. p53 ген является частой мишенью мутационной инактивации в широком разнообразии опухолей человека и является уже документированным как являющийся наиболее часто-мутированным геном в обычных человеческих опухолевых раковых заболеваниях (Mercer, 1992). Ген мутируется в около 50% человеческих NSCLC (Hollestein et. al., 1991) и широком спектре других опухолей.

В то время как опухоли, содержащие мутированный p53 ген, являются предпочтительной мишенью согласно настоящему изобретению, пригодность заявленных p53 векторов экспрессии простирается на лечение опухолей, имеющих p53 дикого типа или функциональный p53. Хотя механизм является не полностью понятным, в настоящем изобретении установлено, что p53 экспрессия может ограничивать рост опухолей экспрессирующих функциональный p53 продукт и даже индуцировать апоптоз в таких клетках. Таким образом, p53 статус опухоли, хотя потенциально полезный в диагностических целях, не является необходимым для практики настоящего изобретения. Это явление не ограничивается SCCHN опухолями, но может быть применимо к широкому разнообразию злокачественного развития болезней, включающих глиомы, саркомы, карциномы, лейкемии, лимфомы и меланому, включая опухоли кожи, печенки, яичек, кости, мозга, поджелудочной железы, головы, шеи, желудка, печени, легкого, яичника, груди, слепой кишки, простаты и мочевого пузыря.

p53 Полипептиды.

p53 ген кодирует 375-аминокислотный фосфопротеин, который может образовывать комплексы с вирусными белками такими, как большой T антиген E1B. Белок находится в нормальных тканях и клетках, но при концентрациях, которые являются минимальными при сравнении с многими трансформированными клетками или опухолевой тканью. Интересно, что появляется p53 дикого типа, который является важным в регулировании клеточного роста и деления. В некоторых случаях была показана сверхэкспрессиия p53 дикого типа, которая является антипролиферативной в человеческих опухолевых линиях клеток. Таким образом, p53 может выступать в качестве отрицательного регулятора клеточного роста (Weinberg, 1991) и может непосредственно вызывать супрессию неконтролированного клеточного роста или косвенно активировать гены, которые подавляют этот рост. Таким образом, отсутствие или инактивация p53 дикого типа может способствовать трансформации. Однако некоторые исследования указывают на то, что присутствие мутантного p53 может быть необходимым для полной экспрессии, трансформирующей потенциал гена.

Хотя p53 дикого типа признается в качестве центрально важного регулятора роста во многих клеточных типах, его генетические и биохимические черты также, по-видимому, имеют значение. Мис-сенс мутации являются обычными для p53 гена и являются существенными для трансформирующей способности онкогена. Единичное генетическое изменение, вызванное за счет точечной мутации, может создать карциногенный p53. Известно, что в отличие от других онкогенов, однако, p53 точечные мутации происходят по крайней мере в 30 четких кодонах, часто создавая доминантные аллели, которые производят сдвиги в клеточном фенотипе без восстановления гомозиготности. Кроме того, многие из этих доминантных отрицательных аллелей оказываются толерантными в организме и передаются в зародышевую линию. Различные мутантные аллели проявляются в области от минимально дисфункциональных до сильно проникающих, доминантных отрицательных аллелей (Weinberg, 1991).

Casey с коллегами сообщали, что трансфекция ДНК, кодирующей p53 дикого типа, в двух раковых клеточных линиях человеческой груди восстанавливает контроль супрессии роста в таких клетках (Casey et al., 1991). Аналогичный эффект был также продемонстрирован на трансфекции дикого типа, но не мутантного p53, в раковых клеточных линиях человеческого легкого (Takahasi et al. , 1992). p53 дикого типа оказывается доминантным в пределах мутантного гена и будет селективным по отношению к пролиферации, когда трансфекцируется в клетки с мутантным геном. Экспрессия трансфекцированного p53 не влияет на рост нормальных клеток с эндогенным p53. Таким образом, такие конструкции могут поглощаться нормальными клетками без отрицательных эффектов.

Таким образом, становится возможным то, чтобы лечение p53-ассоциированных раковых заболеваний с помощью p53 дикого типа могло снижать количество злокачественных клеток. Однако исследования, такие как те, которые описаны выше, являются далеки от достижения такой цели по крайней мере, но не потому, что ДНК трансфекция не может быть применена для введения ДНК в раковые клетки внутри тела пациента.

р53-кодирующие полинуклеотиды.

Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут кодировать полный p53 ген, функциональный p53 белковый домен или любой p53 полипептид. "Комплементарные" полинуклеотиды являются такими, которые являются способными к спариванию оснований согласно стандартным правилам комплементарности Watson-Crick. Таким образом, пара оснований с большим количеством пуринов будет парой оснований с меньшим количеством пиримидинов для образования комбинаций гуанина, спаренного с цитозином (G:C), и аденина, спаренного с простым эфиром тимина (A:T) в случае ДНК, или аденина, спаренного с урацилом (A: U) в случае РНК. Включение меньшего количества оснований таких, как инозин, 5-метилцитозин, 6-метиладенин, гипоксантин и других, в гибридизующие последовательности не является помехой спариванию.

Термин "комплементарные последовательности", как он использован здесь, обозначает полинуклеотидные последовательности, которые являются, по существу, комплементарными в пределах всей их длины и имеют очень небольшое количество ошибочных спариваний оснований. Например, последовательности пятнадцати оснований в длину могут быть названы комплементарными, когда они имеют комплементарный нуклеотид в тринадцати или четырнадцати положениях. Естественно, последовательности, которые являются "полностью комплементарными", будут являться последовательностями, которые являются полностью комплементарными по всей их полной длине и не содержат ошибочных спариваний оснований.

Рассматриваются также другие последовательности с более низкими степенями гомологии. Например, может быть сконструирована антисмысловая конструкция, которая содержит ограниченные области высокой гомологии, но также содержит негомологичную область (например, рибозим). Эти молекулы, хотя и имеющие менее 50% гомологии, будут связываться с последовательностями мишенями при соответствующих условиях.

Полинуклеотиды могут быть получены из геномной ДНК, т.е. клонированы непосредственно из генома или конкретного организма. В других вариантах, однако, полинуклеотиды могут быть комплементарными ДНК (кДНК). кДНК представляет ДНК, полученную с использованием информационной (матричной) РНК (мРНК) в качестве матрицы. Таким образом, кДНК не содержит каких либо нарушенных кодирующих последовательностей и содержит обычно почти исключительно кодирующую область(ти) для соответствующего белка. В других вариантах полинуклеотид может быть получен синтетически.

Может оказаться удобным комбинировать белки геномной ДНК с кДНК или синтетическими последовательностями для генерирования специфических конструкций. Например, там где желательным является интрон в последней конструкции, будет необходимо использование геномного клона. Интроны могут быть получены из других генов дополнительно к p53. кДНК или синтезированный полинуклеотид могут обеспечивать более убедительные сайты рестрикции для остающихся частей конструкции и поэтому могут быть использованы для остатка последовательности.

Человеческая или мышиная ДНК последовательность для p53 обеспечивается в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3 соответственно с соответствующими аминокислотами, которые обеспечиваются в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4 соответственно.

Рассматривается также, что существуют природные (дикие) варианты p53, которые содержат последовательности, отличающиеся от тех, которые раскрываются здесь. Таким образом, настоящее изобретение не ограничивается применением предусматриваемой полинуклеотидной последовательности p53, а скорее включает применение любых вариантов природного происхождения. Настоящее изобретение включает также химически полученные мутанты этих последовательностей.

Другой тип варианта последовательности возникает из кодоновой вариации. Так как существует несколько кодонов для большинства 20 нормальных аминокислот, многие различные ДНК могут кодировать p53. Табл. 1 позволяет идентифицировать такие варианты.

Учитывая дегенерацию генетического кода, последовательности, которые находятся между около 50% и около 75% или между около 76% и около 99% нуклеотидов, являющихся идентичными нуклеотидам, раскрытым здесь, будут предпочтительными. Последовательности, которые находятся внутри диапазона "p53 кодирующего полинуклеотида", являются такими, которые способны к спариванию оснований с сегментом полинуклеотида, представленным выше при внутриклеточных условиях.

Как установлено выше, хотя p53 кодирующие последовательности могут быть копиями полной длины или кДНК копиями, или большими фрагментами, настоящее изобретение может также применять более короткие олигонуклеотиды p53. Последовательности длиной в 17 оснований способны появляться лишь однажды в геноме человека, и поэтому являются достаточными для определения уникальной последовательности-мишени. Хотя более короткие олигомеры должны более легко получаться и повышать in vivo доступность, множество других факторов вовлекаются в определение специфичности спаривания оснований. И связывающее сродство и специфичность последовательности олигонуклеотида к его комплементарной мишени возрастают с увеличением длины. Предполагается, что олигонуклеотиды 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 пар оснований будут использоваться, например, в приготовлении p53 мутантов и в PCR реакциях.

Любая последовательность 17 оснований в длину должна иметь место только однажды в человеческом геноме и поэтому достаточна для специфичной уникальной последовательности-мишени. Хотя более короткие олигомеры легче получаются и повышают in vivo доступность, множество других факторов вовлекаются в определение специфичности гибридизации. Оба параметра, связывающее сродство и специфичность последовательности олигонуклеотида к его комплементарной мишени, возрастают с увеличением длины.

В определенных вариантах каждый может применять конструкции, которые включают другие элементы, например те, которые включают C-5 пропиновые пиримидины. Олигонуклеотиды, которые содержат C-5 пропиновые аналоги уридина и цитидина, связывают РНК с более высоким сродством (Wagner et al., 1993).

Специалисту в этой области также понятно, что неотъемлемой в определении биологически функционального эквивалентного белка или пептида является концепция, которая накладывает ограничение на количество изменений, которые могут быть проведены внутри определенной части молекулы и еще привести к молекуле с приемлемым уровнем эквивалентной биологической активности. Биологически функциональные эквивалентные пептиды определяются, таким образом, здесь как такие пептиды, в которых определенные, но наибольшая их часть или все аминокислоты могут быть замещенными. В частности, что касается N-терминуса p16 белка, рассматривается, что только около 16 или более, предпочтительно около 5 аминокислот могут быть изменены внутри данного пептида. Конечно, множество четких белков/пептидов с различными замещениями могут быть легко изготовлены и использованы в соответствии с изобретением.

Аминокислотные замещения обычно основываются на относительном подобии аминокислотных боковых заместителей, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и им подобных свойствах. Анализ размера, формы и типа аминокислотных боковых заместителей показывает, что аргинин, лизин и гистидин все являются положительно заряженными остатками; что аланин, глицин и серин все имеют аналогичный размер; и что фенилаланин, триптофан и тирозин все имеют обычно аналогичную форму. Поэтому на основании этих рассмотрений аргинин, лизин и гистидин; аланин, глицин и серин; фенилаланин, триптофан и тирозин; определяются здесь как биологически функциональные эквиваленты.

При проведении изменений, может быть рассмотрена степень гидропатичности (hydropathic) аминокислот. Каждой аминокислоте приписывается степень гидропатичности на основании ее гидрофобности и характеристик заряда, которые представляют: изолейцин (+4.5); валин (+4.2); лейцин (+3.8); фенилаланин (+2.8); цистеин/цистин (+2.5); метионин (+1.9); аланин (+1.8); глицин (-0.4); треонин (-0.7); серин (-0.8); триптофан (-0.9); тирозин (-1.3); пролин (-1.6); гистидин (-3.2); глутамат (-3.5); глутамин (-3.5); аспартат (-3.5); аспарагин (-3.5); лизин (-3.9); и аргинин (-4.5).

Роль степени гидропатичности аминокислоты в обсуждении биологической функции взаимодействия на белке обычно понятна специалисту (Kyte and Doolittle, 1982, которая вводится здесь ссылкой). Известно, что определенные аминокислоты могут быть замещены на другие аминокислоты, обладающие подобной степенью гидропатичности или меткой и еще сохраняют подобную биологическую активность. При проведении изменений на основании степени гидропатичности замещение аминокислот, чья гидропатичность находится в пределах +/-2, является предпочтительной, аминокислоты, которые имеют степень гидропатичности в пределах +/-1, являются особенно предпочтительными, а аминокислоты, которые имеют степень гидропатичности в пределах +/-0.5, являются даже более предпочтительными.

Понятно, что аминокислота может быть замещена на другую, обладающую подобной величиной гидрофильности, при этом еще получается биологически эквивалентный белок. Как детально описано в патенте США 4554101, следующие величины гидрофильности были приписаны аминокислотным остаткам: аргинин (+3.0); лизин (+3.0); аспартат (+3.0 +/-1); глутамат (+3.0 +/-1); серин (+0.3); аспарагин (+0.2); глутамин (+0.2); глицин (0); треонин (-0.4); пролин (-0.5 +/-1); аланин (-0.5); гистидин (-0.5); цистеин (-1.0); метионин (-1.3); валин (-1.5); лейцин (-1.8); изолейцин (-1.8); тирозин (-2.3); фенилаланин (-2.5); триптофан (-3.4).

При проведении изменений на основании подобия величин гидрофильности замещение аминокислот, чьи величины гидрофильности находятся в пределах +/-2, являются предпочтительными, и аминокислоты, которые имеют величины гидрофильности в пределах +/-1, являются особенно предпочтительными, а аминокислоты, которые имеют величины гидрофильности в пределах +/-0.5, являются даже более предпочтительными.

B. Экспрессионные векторы.

В пределах этого применения термин "экспрессионные конструкции" обозначает включение любого типа генетической конструкции, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую генный продукт, в которой часть или вся кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты является способной транскрибироваться. Транскрипт может быть транслирован в белок, но в этом нет нужды. Таким образом, в определенных вариантах, экспрессия включает и транскрипцию гена p53 и трансляцию p53 мРНК в p53 генный продукт. В других вариантах экспрессия включает только транскрипцию нуклеиновой кислоты, кодирующей p53 или его комплемент.

Для того чтобы конструкция оказывала влияние на экспрессию, по крайней мере p53 транскрипта, полинулкеотид, кодирующий p53 полинуклеотид, должен находиться под транскрипциональным контролем промотора. "Промотор" относится к последовательности ДНК, узнаваемой синтетическим механизмом клетки-хозяина, или введенным синтетическим механизмом, который требуется для инициации специфической транскрипции гена. Фраза "под транскрипциональным контролем" означает, что промотор находится в правильном положении по отношению к полинуклеотиду для контроля инициирования РНК полимеразы и экспрессии полинуклеотида.

Термин "промотор" может быть использован здесь для применения к группе модулей транскрипционального контроля, которые являются кластеризованными вокруг инициирующего сайта РНК полимеразы II. Большая часть размышлений о том, как промоторы организованы, исходит из анализов нескольких вирусных промоторов, включая HSV тримидин киназу (tk) и SV40 единицы ранней транскрипции. Эти исследования, наиболее дополненные недавней работой, показали, что промоторы составляются из дискретных функциональных модулей, каждый из которых состоит приблизительно из 7-20 bp ДНК, и содержат один или больше узнаваемых сайтов для транскрипционального активатора или репрессорных белков.

По крайней мере один модуль в каждом промоторе функционирует к позиции стартового сайта для синтеза РНК. Наиболее известным примером этого является TATA box, но в некоторых промоторах, в которых отсутствует TATA box, таких как промотор для терминального деоксинуклеотидильного трансферазного гена млекопитающего, и промотор SV40 поздних генов, дискретный элемент, покрывающий стартовый сайт, сам помогает фиксировать место инициации.

Дополнительные элементы промотора регулируют частоту транскрипциональной инициации. Обычно они располагаются в области 30-110 bp перед стартовым сайтом, хотя недавно было показано, что ряд промоторов содержит также функциональные элементы после стартового сайта. Пространство между промоторными элементами является часто гибким, так что функция промотора сохраняется, когда элементы инвертируются или передвигаются друг относительно друга. В tk промоторе пространство между промоторными элементами может увеличиваться до 50 bp независимо от того, что активность до этого начала убывать. В зависимости от промотора становится очевидным, что индивидуальные элементы могут функционировать или совместно, или независимо для активации транскрипции.

Конкретный промотор, который применяется для контролирования экспрессии полинуклеотида p53, не рассматривается как важный, поскольку он является способным экспрессировать полинуклеотид в нацеленной клетке (клетке-мишени) с достаточными уровнями. Таким образом, когда клетка человека является нацеленной, является предпочтительным располагать кодирующую область полинуклеотида рядом и под контролем промотора, который способен экспрессироваться в клетке человека. В общем, такой промотор может включать либо человеческий, либо вирусный промотор.

В различных вариантах промотор прямых ранних генов человеческого цитомегаловируса (CMV), ранний промотор SV40 и длинный терминальный повтор вируса саркомы Rous могут использоваться для получения высокоуровневой экспрессии p53 полинуклеотида. Рассматривается также применение других вирусных промоторов или клеточных промоторов млекопитающего или бактерильных фаговых промоторов, которые хорошо известны в данной области для достижения экспрессии полинуклеотидов, при условии, что уровни экспрессии являются достаточными для продуцирования ингибиторного эффекта роста.

Путем применения промотора с хорошо известными свойствами уровень и структура экспрессии p53 полинуклеотида может быть оптимизирована после трансфекции. Например, выбор промотора, который является активным в специфических клетках, таких как тирозиназа (меланома), альфа-фетопротеин и альбумин (опухоль печени), CC10 (опухоль легкого) и простато-специфический антиген (опухоль простаты), будет способствовать ткань-специфический экспрессии p53 полинуклеотидов. Табл. 2 дает перечень нескольких элементов/промоторов, которые могут применяться в контексте настоящего изобретения, для регулирования экспрессии p53 конструкций. Этот перечень не претендует на то, чтобы быть исчерпывающим для всех возможных элементов, вовлеченных в ускорение p53 экспрессии, но лишь содержит в себе примеры.

Энхансеры были первоначально обнаружены в виде генетических элементов, которые повышали транскрипцию из промотора, расположенного на некотором расстоянии на той же молекуле ДНК. Эта способность действовать на большие расстояния имеет мало прецедентов в классических исследованиях прокариотических транскрипциональных регуляций. Последующие работы показали, что области ДНК с активностью энхансеров организованы в значительной степени подобно промоторам. То есть они состоят из многих индивидуальных элементов, каждый из которых связывается с одним или большим числом транскрипциональных белков.

Основное различие между энхансерами и промоторами заключается в способе действия. Область энхансера как целое может быть способна стимулировать транскрипцию на расстоянии; не обязательно, чтобы она точно соответствовала области промотора или его составляющим элементам. С другой стороны, промотор должен иметь один или большее количество элементов, которые непосредственно инициируют синтез РНК при конкретном сайте и в конкретной ориентации, тогда как энхансеры не имеют таких особенностей. Промоторы и энхансеры часто перекрываются и являются смежными, часто создавая видимость, что они имеют сходную модульную организацию.

Кроме того, любая комбинация промотор/энхансер (согласно банку данных эукариотического промотора EPDB) может также использоваться, чтобы привести в действие экспрессию p53 конструкции. Применение T3, T7 или SP6 цитоплазматической экспрессионной системы является другим возможным вариантом. Эукариотические клетки могут поддерживать цитоплазматическую транскрипцию от определенных бактериальных промоторов, если обеспечивается соответствующая бактериальная полимераза, либо в виде части освобождаемого комплекса, либо как дополнительный генетический экспрессионный вектор.

Кроме того, выбор промотора, который регулируется в ответ на специфические физиологические сигналы, может позволять индуцируемую экспрессию p53 конструкции. Например, с полинуклеотидом под контролем человеческого PAI-1 промотора: экспрессия индуцируется фактором опухолевого некроза. Табл. 3 иллюстрирует некоторые комбинации промотор/индуктор.

В определенных вариантах изобретения доставка экспрессионного вектора в клетку может быть идентифицирована in vitro или in vivo введением маркера в экспрессионный вектор. Маркер может приводить к идентифицируемому изменению в трансфекцированной клетке, позволяя легкую идентификацию экспрессии. Обычно введение селективного лекарственного маркера помогает в клонировании и в подборе трансформантов. Альтернативно могут использоваться ферменты, такие как (tk) тимидин киназа герпесного простого вируса (эукариотическая) или хлорамфеникольная ацетилтрансфераза (CAT) (прокариотическая). Могут использоваться также иммунологические маркеры. Применяемый селектируемый маркер, не рассматривается как имеющий важное значение, поскольку он является способным экспрессироваться вместе с полинуклеотид кодирующим p53. Другие примеры селективно способных маркеров хорошо известны специалистам в данной области.

Обычно пример будет включать сигнал полиаденилирования для осуществления соответствующего полиаденилирования транскрипта. Нет оснований верить, что природа сигнала полиаденилирования является решающей для успешного применения изобретения, и может быть использована любая такая последовательность. В изобретении был использован сигнал полиаденилирования SV40 в том смысле, что он был стандартным и известным для успешного функционирования в клетках-мишенях, которые использовались. Рассмотренным также в качестве элемента экспрессионной конструкции является терминатор. Эти элементы могут служить для повышения уровней послания и для минимизации считывания непосредственно из конструкции в других последовательностях.

В предпочтительных вариантах изобретения экспрессионная конс