Химически модифицированный термостабильный фермент, способ его получения, способ амплификации содержащейся в образце нуклеиновой кислоты, реакционная смесь для его осуществления и набор для проведения цепной реакции

Химически модифицированный термостабильный фермент, способ его получения, способ амплификации содержащейся в образце нуклеиновой кислоты, реакционная смесь для его осуществления и набор для проведения цепной реакции

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии к области нуклеиновых кислот, касается амплификации последовательностей нуклеиновых кислот. Химически модифицированный фермент характеризуется тем, что термостабильная ДНК-полимераза или термостабильная лигаза обратимо инактивирована в водном буфере при щелочном значении рН, при температуре ниже приблизительно 25°С модифицирующим реагентом, что не приводит к существенному увеличению ферментативной активности в течение промежутка времени менее приблизительно 20 мин. Модифицирующим реагентом выбран ангидрид дикарбоновой кислоты. Инкубация химически модифицированного фермента в водном буфере, значение рН которого доведено до приблизительно 8-9 при 25°С, при температуре выше приблизительно 50°С приводит по крайней мере к двукратному увеличению ферментативной активности в течение промежутка времени менее приблизительно 20 мин. Химически модифицированную лигазу или ДНК полимеразу применяют для амплификации нуклеиновых кислот. Для чего активность инактивированного фермента восстанавливают путем инкубации реакционной смеси при повышенной температуре перед реакцией амплификации или этот процесс является составной частью реакции амплификации. Необратимо инактивированный термостабильный фермент, применяемый в ПЦР-амплификации, существенно снижает неспецифическую амплификацию и существенно увеличивает количество нужной амплифицированной последовательности-мишени. 5 с. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 6 табл.

Настоящее изобретение относится к области химии нуклеиновых кислот. В частности оно относится к способам амплификации последовательностей нуклеиновых кислот и к способам уменьшения неспецифической амплификации.

Метод с использованием полимеразной реакции синтеза цепи (называемой также полимеразной цепной реакцией или ПЦР) для амплификации последовательностей нуклеиновых кислот широко известен в данной области техники и описан в патентах США 4683202; 4683195 и 4965188. Торговые фирмы, такие, как Perkin Elmer, Norwalk, CT, продают реагенты для ПЦР и публикуют протоколы ПЦР.

В каждом цикле ПЦР-амплификации денатурируют двухцепочечную последовательность-мишень, для каждой цепи денатурированной мишени отжигают праймеры и праймеры удлиняют под воздействием ДНК-полимеразы. Специфичность амплификации зависит от специфичности гибридизации праймера. Праймеры выбирают так, чтобы они были комплементарными или практически комплементарны последовательностям, находящимся на 3'-конце каждой цепи полинуклеотидной последовательности-мишени. При повышенных температурах, применяемых при обычной ПЦР, праймеры гибридизируются только с нужной последовательностью-мишенью. Однако реакционные смеси для амплификации обычно готовят при комнатной температуре, значительно более низкой, чем температура, необходимая для обеспечения специфичности гибридизации праймера. При таких менее жестких условиях праймеры могут неспецифично связываться с другими только частично комплементарными полинуклеотидными последовательностями (или даже с другими праймерами) и инициировать синтез нежелательных продуктов удлинения, которые могут быть амплифицированы наряду с последовательностью-мишенью. Амплификация неспецифических продуктов удлинения праймера может конкурировать с амплификацией нужных последовательностей-мишеней и может в значительной степени снижать эффективность амплификации нужной последовательности. Проблемы, вызываемые неспецифической амплификацией, описаны, кроме того, у Chou и др., 1992, Nucleic Acids Research, 20(7): 1717-1723.

Неспецифическая амплификация может быть снижена путем уменьшения образования продуктов удлинения от праймеров, связанных до начала реакции с последовательностями, не являющимися мишенями. В одном из методов, названном протоколом "hot-start" (протоколом "горячей инициации"), один или несколько важных реагентов не добавляют в реакционную смесь до тех пор, пока температура не поднимется до уровня, достаточного для обеспечения необходимой специфичности гибридизации. Таким образом, в реакционной смеси не может осуществляться удлинение праймера в то время, когда условия реакции не гарантируют специфическую гибридизацию праймера.

"Hot-start" - методы могут быть осуществлены вручную открытием реакционной пробирки после начальной стадии высокотемпературной инкубации и добавления недостающих реагентов. Однако осуществляемые вручную "hot start" - методы являются трудоемкими и увеличивают риск загрязнения реакционной смеси. "Hot-start" - методы, в которых применяют легкоплавкий материал, такой, как воск, для разделения или секвенирования реакционных компонентов, описаны в патенте США 5411876 и у Chou и др., 1992, см. выше. В этих методах высокая температура инкубации до начала реакции плавит легкоплавкий материал, позволяя, таким образом, реагентам смешиваться.

Другой способ уменьшения образования продуктов удлинения от праймеров, связанных до начала реакции с последовательностями, не являющимися мишенями, основан на ингибировании ДНК-полимеразы за счет использования соединения, которое нековалентно связывается с ДНК-полимеразой термообратимым образом. В патенте США 5338672 описано применение антител, специфичных в отношении термостабильной ДНК-полимеразы, для ингибирования ДНК-полимеразной активности. Антитела необходимо инкубировать с помощью ДНК-полимеразы в буфере при комнатной температуре до составления реакционной смеси, чтобы обеспечить образование комплекса антитело-ДНК-полимераза. Ингибирование антителом ДНК-полимеразной активности инактивируют путем высокотемпературной инкубации до начала реакции. Недостатком этого метода является то, что получение антител, специфичных в отношении ДНК-полимеразы, особенно в больших количествах, является дорогостоящим и требует значительных затрат времени. Кроме того, добавление антител в реакционную смесь может потребовать повторного планирования реакции амплификации.

Образование продуктов удлинения также можно ингибировать путем добавления соединения, которое нековалентно связывается с праймерами термообратимым образом, тем самым препятствуя гибридизации праймеров с любой последовательностью, как с мишенью, так и с какой-либо другой. Например, одноцепочечный связывающий протеин, добавленный в реакционную смесь, будет связывать праймеры, препятствуя, таким образом, гибридизации праймера и ингибируя удлинение праймера. Улучшение выхода продуктов ПЦР при использовании гена белка 32 описаны у Schwartz и др., 1990, Nucleic Acids Research 18(4): 10.

Неспецифическую амплификацию можно уменьшить путем разложения продуктов удлинения, образованных от праймеров, связанных до начала реакции с последовательностями, не являющимися мишенями, например, с применением способов, описанных в патенте США 5418149 и в Международной заявке WO 92/01814. Разложение вновь синтезированных продуктов удлинения достигают путем включения в реакционную смесь дУТФ и урацил-ДНК-гликозилазы (UNG) и инкубации реакционной смеси при 45-60^oC до осуществления реакции амплификации. Недостатком этого метода является то, что разложение продукта удлинения конкурирует с образованием продукта удлинения, и удаление неспецифического продукта удлинения праймера, вероятно, будет менее полным.

Обычные методы молекулярной биологии, химии белка и химии нуклеиновых кислот, известные в данной области техники, достаточно полно описаны в литературе. См., например, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (Sambrook и др., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ред., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames и S.J. Higgins, ред-ы, 1984); Chemical Reagents for Protein Modification (CRC Press); и в сериях Methods in Enzymology (Academic Press, Inc. ). Все упомянутые в заявке патенты, заявки на патент и публикации, указанные как выше, так и ниже, включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Настоящее изобретение относится к способам и реагентам для амплификации нуклеиновой кислоты с использованием реакции амплификации, основанной на применении праймера, как это более конкретно указано в прилагаемой формуле изобретения. Эти способы и реагенты обеспечивают простое и экономичное решение проблемы неспецифической амплификации. В способах используют обратимо инактивированный термостабильный фермент, который может быть реактивирован путем инкубации в реакционной смеси для амплификации при повышенной температуре. Неспецифическая амплификация заметно уменьшается вследствие того, что реакционная смесь не поддерживает удлинение праймера до тех пор, пока температура реакционной смеси не поднимется до уровня, который гарантирует специфичность гибридизации праймера.

Одним предметом настоящего изобретения являются обратимо инактивированные термостабильные ферменты, которые получают в результате реакции между термостабильным ферментом, который катализирует реакцию удлинения праймера, и модифицирующим реагентом. Реакция приводит к значительному, предпочтительно практически полному, снижению ферментативной активности. Инкубация модифицированного фермента в водном буфере при щелочном значении pH при температуре ниже приблизительно 25^oC практически не приводит к увеличению ферментативной активности в течение промежутка времени менее приблизительно 20 минут. Инкубация модифицированного фермента в водном буфере, значение pH которого доведено до 8-9 при 25^oC, при температуре выше приблизительно 50^oC приводит по крайней мере к двукратному увеличению активности удлинения праймера в течение промежутка времени менее приблизительно 20 минут. Обратимо инактивированные термостабильные ферменты по изобретению в их активном состоянии либо катализируют удлинение праймера, либо необходимы для того, чтобы происходило удлинение праймера. Предпочтительные ферменты включают термостабильные ДНК-полимеразы и лигазы.

Предпочтительными модифицирующими реагентами являются ангидриды дикарбоновых кислот общей формулы: где R₁ и R₂ обозначают водород или органические радикалы, которые могут быть связаны, или общей формулы где R₁ и R₂ обозначают органические радикалы, которые могут быть связаны, и атомы водорода находятся в цис-положении. Органические радикалы могут быть непосредственно присоединены к кольцу через связь углерод-углерод или через связь углерод-гетероатом, такую, как связь углерод-кислород, углерод-азот или углерод-сера. Органические радикалы также могут быть связаны друг с другом с образованием циклической структуры, как, например, в случае 3,4,5,6-тетрагидрофталевого ангидрида.

Предпочтительные реагенты включают малеиновый ангидрид; замещенные малеиновые ангидриды, такие, как цитраконовый ангидрид, цис-аконитовый ангидрид и 2,3-диметилмалеиновый ангидрид; экзо-цис-3,6-эндоксо-^{4 4}-тетрагидрофталевый ангидрид и 3,4,5,6-тетрагидрофталевый ангидрид. В частности цитраконовый ангидрид и цис-аконитовый ангидрид предпочтительны для получения обратимо инактивированных ДНК-полимераз для использования в ПЦР-амплификациях.

Другим предметом настоящего изобретения являются способы проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты с использованием обратимо инактивированного термостабильного фермента по настоящему изобретению. В настоящем изобретении предложен способ амплификации содержащейся в образце нуклеиновой кислоты-мишени, включающий следующие стадии: (а) введение образца в контакт с реакционной смесью для амплификации, содержащей праймер, комплементарный нуклеиновой кислоте-мишени, и модифицированный термостабильный фермент, где модифицированный термостабильный фермент получают путем реакции смеси термостабильного фермента, который катализирует реакцию удлинения праймера, с модифицирующим реагентом, причем реакцию проводят при щелочном значении pH и температуре менее приблизительно 25^oC, и указанная реакция приводит к химической модификации фермента, являющейся причиной практически полной инактивации ферментативной активности, и причем инкубация модифицированного фермента в водном буфере, значение pH которого доведено до 8-9 при 25^oC, при температуре выше приблизительно 50^oC приводит по крайней мере к двукратному увеличению ферментативной активности в течение промежутка времени менее приблизительно 20 минут; и (б) инкубацию образовавшейся на стадии (а) смеси при температуре выше приблизительно 50^oC в течение промежутка времени, достаточного для реактивации фермента и позволяющего образовать продукты удлинения праймера.

В качестве предпочтительного способа в настоящем изобретении предложен способ амплификации содержащейся в образце нуклеиновой кислоты-мишени, включающий: (а) введение образца в контакт с реакционной смесью для амплификации, содержащей праймер, комплементарный нуклеиновой кислоте-мишени, и модифицированный термостабильный фермент, где модифицированный термостабильный фермент получают путем реакции смеси термостабильного фермента с ангидридом дикарбоновой кислоты общей формулы: где R₁ и R₂ обозначают водород или органические радикалы, которые могут быть связаны, или общей формулы: где R₁ и R₂ обозначают органические радикалы, которые могут быть связаны, и атомы водорода находятся в цис-положении, причем реакция приводит к практически полной инактивации ферментативной активности; и (б) инкубацию образовавшейся на стадии (а) смеси при температуре выше приблизительно 50^oC в течение промежутка времени, достаточного для реактивации фермента и позволяющего образовать продукты удлинения праймера.

В предпочтительных примерах осуществления способов по изобретению применяют обратимо модифицированные ферменты, модифицированные с использованием предпочтительных модифицирующих реагентов. В некоторых примерах осуществления изобретения стадию инкубации, т. е. стадию (б), проводят до начала реакции амплификации. В других примерах осуществления изобретения инкубация, которая приводит к реактивации фермента, является составной частью процесса амплификации. Например, стадия денатурации, которую осуществляют в каждом цикле ПЦР, может одновременно выполнять функцию реактивации модифицированной ДНК-полимеразы.

В предпочтительном примере осуществления изобретения реакция амплификации представляет собой полимеразную реакцию синтеза цепи (ПЦР) и в ней используют обратимо инактивированную термостабильную ДНК-полимеразу. Реакционную смесь инкубируют до проведения реакции амплификации при температуре выше, чем температура отжига в реакции амплификации. Таким образом, ДНК-полимеразу инактивируют до тех пор, пока температура остается выше той температуры, которая гарантирует специфичность реакции амплификации, тем самым снижая неспецифическую амплификацию.

Следующим предметом изобретения являются реакционные смеси для амплификации, которые содержат обратимо инактивированный термостабильный фермент по настоящему изобретению наряду с реагентами, необходимыми для проведения реакции амплификации. В предпочтительном примере осуществления реакционная смесь для амплификации содержит олигонуклеотидные праймеры для проведения ПЦР.

Еще одним предметом изобретения являются наборы, содержащие обратимо инактивированный термостабильный фермент по изобретению и один или несколько реагентов для амплификации.

На фиг. 1 показана структура цитраконового ангидрида, цис-аконитового ангидрида и 2,3-диметилмалеинового ангидрида и реакция между цитраконовым ангидридом и лизином.

На фиг. 2 показаны результаты амплификаций, проведенных с использованием цитраконилированной ДНК-полимеразы Taq, как описано в примере 4.

На фиг. 3 показаны результаты амплификаций, проведенных с использованием цитраконилированных ДНК-полимераз, как описано в примере 6.

На фиг. 4 показаны результаты изменения времени предреакционной инкубации при амплификациях, проведенных с использованием цитраконилированных и цис-аконитилированных ДНК-полимераз, как описано в примере 9.

На фиг. 5 показаны результаты изменения количества циклов амплификации при амплификациях, проведенных с использованием цитраконилированных и цис-аконитилированных ДНК-полимераз, как описано в примере 10.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже даются определения некоторых терминов.

Термины "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" относятся к праймерам, зондам и олигомерным фрагментам, подлежащим обнаружению, и должны включать полидезоксирибонуклеотиды (содержащие 2-дезокси-D-рибозу), полирибонуклеотиды (содержащие D-рибозу) и любой другой тип полинуклеотида, который представляет собой N-гликозид пуринового или пиримидинового основания или модифицированного пуринового или пиримидинового основания. Термины "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" не подразумевают различия в длине этих нуклеотидов и могут использоваться взаимозаменяемо. Эти термины относятся только к первичной структуре молекулы. Таким образом, эти термины включают двух- и одноцепочечную ДНК, а также двух- и одноцепочечную РНК. Олигонуклеотиды могут быть получены любым приемлемым способом. Обзор методов синтеза приведен у Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165-187.

Термин "гибридизация" относится к образованию двойной структуры в результате спаривания комплементарных оснований двух одноцепочечных нуклеиновых кислот. Гибридизация может происходить между полностью комплементарными цепями нуклеиновых кислот или между "практически комплементарными" цепями нуклеиновых кислот, которые содержат минорные области ошибочного спаривания. Условия, при которых будет происходить гибридизация только полностью комплементарных цепей нуклеиновых кислот, называются "жесткими условиями гибридизации" или "специфичными в отношении последовательности условиями гибридизации". Стабильные дуплексы практически комплементарных последовательностей могут быть получены в менее жестких условиях гибридизации. Специалисты в области технологии нуклеиновых кислот могут определить стабильность дуплекса эмпирически, анализируя различные параметры, в том числе, например, длину и концентрацию пар оснований олигонуклеотидов, ионную силу и частоту ошибочно спаренных пар оснований, следуя руководству в этой области (см., например, Sambrook и др., 1989, выше).

Обычно условия жесткой гибридизации выбирают так, чтобы они были приблизительно на 5^oC ниже, чем термическая точка плавления (Т_пл) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и значении pH. Т_пл представляет собой температуру (при определенных ионной силе и pH), при которой происходит разъединение 50% пар оснований. Снижение жесткости условий гибридизации будет допускать появление в некоторых пределах ошибочных спариваний последовательности; степень допустимых ошибочных спариваний может контролироваться путем соответствующей регулировки условий гибридизации.

Термин "праймер" относится к олигонуклеотиду естественного происхождения или синтетическому, способному действовать в качестве точки инициации синтеза ДНК в таких условиях, в которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеиновой кислоты, т.е. в присутствии четырех различных нуклеозидтрифосфатов и агента полимеризации (например, ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы) в соответствующем буфере и при приемлемой температуре. Аналоги олигонуклеотидов, такие, как "пептидные нуклеиновые кислоты", могут действовать в качестве праймеров и подпадают под область значений термина "праймер", как он используется в контексте настоящего описания. Предпочтительно праймер представляет собой одноцепочечный олигодезоксирибонуклеотид. Приемлемая длина праймера зависит от предполагаемого применения праймера, но обычно составляет от 6 до 50 нуклеотидов. Для праймеров с короткими молекулами обычно требуются более низкие температуры для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей. Нет необходимости в том, чтобы праймер отражал точную последовательность матричной нуклеиновой кислоты, но он должен быть в достаточной степени комплементарным, чтобы гибридизироваться с матрицей.

Термин "удлинение праймера", как он используется в контексте настоящего описания, относится как к синтезу ДНК, происходящему вследствие полимеризации отдельных нуклеозидтрифосфатов с использованием праймера в качестве точки инициации, так и к присоединению к праймеру дополнительных олигонуклеотидов с целью удлинения праймера. Термин "удлинение примера", как он используется в настоящем описании, включает лигирование (сшивание) двух олигонуклеотидов для образования более длинного продукта, который далее может служить в качестве мишени в последующих циклах амплификации. Термин "праймер", как он используется в настоящем описании, включает олигонуклеотиды, используемые в опосредуемых лигированием процессах амплификации, которые удлиняются с помощью лигирования второго олигонуклеотида, гибридизирующегося в соседнем положении.

Праймеры могут включать дополнительные элементы, способствующие обнаружению или иммобилизации праймера, но не изменяющие основное свойство праймера, а именно, его действие в качестве точки инициации синтеза ДНК. Например, праймеры могут содержать дополнительную полинуклеотидную последовательность на 5'-конце, которая не гибридизируется с нуклеиновой кислотой-мишенью, но которая облегчает клонирование амплифицированного продукта. Область праймера, комплементарная матрице в достаточной для гибридизации степени, обозначают в данном описании областью гибридизации.

Термины "область-мишень" и "нуклеиновая кислота-мишень" относятся к области или последовательности нуклеиновой кислоты, которая должна быть амплифицирована. Сайт праймерной гибридизации может рассматриваться как область-мишень для гибридизации праймера.

Олигонуклеотидный праймер, как это используется в настоящем описании, является "специфичным" в отношении последовательности-мишени, если число ошибочных спариваний, присутствующих между олигонуклеотидом и последовательностью-мишенью, меньше, чем число ошибочных спариваний, присутствующих между олигонуклеотидом и последовательностями, не являющимися мишенями, которые могут присутствовать в образце. Могут быть выбраны такие условия гибридизации, при которых стабильные дуплексы образуются только в том случае, если число имеющихся ошибочных спариваний не превосходит числа ошибочных спариваний, присутствующих между олигонуклеотидом и последовательностью-мишенью. При таких условиях олигонуклеотид может образовывать стабильный дуплекс только с последовательностью-мишенью. Таким образом, использование специфичных в отношении мишени праймеров в приемлемых жестких условиях амплификации дает возможность осуществлять специфическую амплификацию тех последовательностей-мишеней, которые содержат сайты, связывающие праймеры-мишени. Использование специфичных в отношении последовательности условий амплификации дает возможность осуществлять специфическую амплификацию тех последовательностей-мишеней, которые содержат сайты, связывающие строго комплементарные праймеры.

Термин "неспецифическая амплификация" относится к амплификации полинуклеотидных последовательностей, отличных от последовательности-мишени, которые образуются вследствие гибридизации праймеров с последовательностями, отличными от последовательности-мишени, и затем служат субстратом для удлинения праймера. Гибридизация праймера с последовательностью, не являющейся мишенью, рассматривается как "неспецифическая гибридизация" и может осуществляться при менее жестких предреакционных условиях, характеризующихся более низкой температурой.

Термин "термостабильный фермент" относится к ферменту, относительно стабильному при нагревании. Термостабильные ферменты могут выдерживать без необратимой потери активности инкубацию при высокой температуре, обычно превышающей 50^oC, применяемую для удаления модифицирующих групп. Модифицированные термостабильные ферменты, применяемые в способах по настоящему изобретению, включают термостабильные ДНК-полимеразы и термостабильные лигазы.

Термин "термостабильная ДНК-полимераза" относится к ферменту, относительно стабильному при нагревании и катализирующему полимеризацию нуклеозидтрифосфатов для образования продуктов удлинения праймера, которые являются комплементарными одной из полинуклеотидных цепочек последовательности-мишени. Фермент инициирует синтез на 3'-конце праймера и продолжает его в направлении к 5'-концу матрицы до тех пор, пока не закончится синтез. Очищенные термостабильные ДНК-полимеразы описаны в патенте США 4889818; патенте США 5352600; патенте США 5079352; в заявках WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202; патенте США 5491086; в заявке WO 92/09689 и патенте США 5210036.

Фермент, "происходящий" из организма, в контексте настоящего описания относится к ферменту, который выделяют и очищают из организма, или к рекомбинантной форме фермента, который выделяют и очищают из организма, и этот термин включает ферменты, в которых аминокислотная последовательность была модифицирована с использованием методов молекулярной биологии.

Термин "обратимо инактивированный", как это используется в настоящем описании, относится к ферменту, который был инактивирован путем реакции с соединением, приводящей к ковалентной модификации (также включающей и химическую модификацию) фермента, при которой модифицирующее соединение может быть удалено при соответствующих условиях. Реакция, которая приводит к удалению модифицирующего соединения, не должна быть обратной к реакции модификации. В том случае, если существует реакция, которая приводит к удалению модифицирующего соединения и к восстановлению функции фермента, фермент рассматривают как обратимо инактивированный.

Термин "реакционная смесь" относится к раствору, содержащему реагенты, необходимые для проведения данной реакции. Термин "реакционная смесь для амплификации" относится к раствору, содержащему реагенты, необходимые для проведения реакции амплификации, и эта смесь обычно содержит олигонуклеотидные праймеры и ДНК-полимеразу или лигазу в приемлемом буфере. "Реакционная смесь для ПЦР" обычно содержит олигонуклеотидные праймеры, термостабильную ДНК-полимеразу, дНТФ и двухвалентный катион металла в приемлемом буфере. Реакционную смесь рассматривают как полную, если она содержит все реагенты, необходимые для проведения реакции, и как неполную, если она содержит только часть набора необходимых реагентов. Для специалиста в данной области техники очевидно, что для удобства, стабильности при хранении и для обеспечения независимого регулирования концентрации компонентов в зависимости от применения компоненты реакции обычно хранят в виде отдельных растворов, каждый из которых содержит часть полного набора компонентов, а затем реакционные компоненты объединяют перед реакцией для получения полной реакционной смеси.

Способы по настоящему изобретению включают проведение реакции амплификации с использованием активированного нагреванием термостабильного фермента, где активный фермент необходим для удлинения праймера. Перед высокотемпературной инкубацией, которая активирует фермент, реакционная смесь для амплификации не поддерживает удлинение праймера и в ней не образуются неспецифические или какие-либо другие продукты удлинения. После высокотемпературной инкубации, которая реактивирует фермент, реакцию амплификации поддерживают при повышенных температурах, которые обеспечивают специфичность реакции. Таким образом, продукты удлинения праймера образуются только в условиях, которые обеспечивают специфичность амплификации.

В способах по настоящему изобретению активированный нагреванием фермент в своем активном состоянии катализирует реакцию удлинения праймера. Для применения в обычной реакции амплификации, например, в ПЦР, активированный нагреванием термостабильный фермент в своем активном состоянии обладает ДНК-полимеразной активностью. Для применения в системах амплификации, опосредуемых лигазой, активированный нагреванием термостабильный фермент в своем активном состоянии обладает ДНК-лигазной активностью.

В системах амплификации, опосредуемых лигазой, "продукт удлинения" образуется путем лигирования первого олигонуклеотида (в настоящем описании подпадающего под термин "праймер") со вторым олигонуклеотидом, который гибридизируется вблизи 3'-конца первого олигонуклеотида. Второй олигонуклеотид может быть гибридизирован непосредственно вблизи праймера, в этом случае необходимо только лигирование, или может быть гибридизирован с одним или несколькими основаниями вдали от праймера, в этом случае необходима полимеразная активность для удлинения праймера перед лигированием. В любом случае соединение двух олигонуклеотидов, которые гибридизируются с соседними областями ДНК-мишени, рассматривается в настоящем описании как подпадающее под термин "удлинение праймера".

Обратимо инактивированные термостабильные ферменты по изобретению получают путем реакции между ферментом и модифицирующим реагентом, которая приводит к обратимой химической модификации фермента и в результате которой наблюдается полная или практически полная потеря активности фермента. Модификация заключается в ковалентном связывании модифицирующей группы с протеином. Модифицирующее соединение выбирают так, чтобы инкубация при повышенной температуре в буфере для реакции амплификации делала модификацию обратимой. Пригодные для этой цели ферменты и модифицирующие группы описаны ниже.

Обратимо инактивированные ферменты, обладающие в своем активном состоянии ДНК-полимеразной активностью, получают из термостабильных ДНК-полимераз. Применяемые в реакциях амплификации термостабильные ДНК-полимеразы хорошо известны в данной области техники и могут иметь происхождение из различных источников, таких, как некоторые виды термофильных эубактерий или архебактерий, относящиеся к родам Thermus, Thermogota, Thermococcus, Pyrodictium, Pyrococcus и Thermosipho. Характерные виды, из которых могут быть выделены термостабильные ДНК-полимеразы, пригодные для ПЦР-амплификации, включают Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Pyrodictium occultum, Pyrodictium abyssi и Thermosipho africanus. Термостабильные ДНК-полимеразы описаны в патенте США 4889818; патенте США 5352600; патенте США 5079352; Международных заявках WO 91/09950; WO 92/03556; WO 92/06200; WO 92/06202; патенте США 5491086; в заявке WO 92/09689 и патенте США 5210036. Термостабильные ДНК-полимеразы поставляются на рынок фирмой Perkin Elmer, Norwalk, CT.

Обратимо инактивированные термостабильные ферменты, пригодные для применения в других процессах амплификации, таких, как опосредуемые лигазой амплификации, получают из термостабильных ферментов, описанных в приведенных ниже ссылках, в которых представлены различные способы амплификации.

Способы по настоящему изобретению не ограничены применением ферментов, приведенных в качестве примеров. Например, любая описанная в литературе для применения в реакциях амплификации термостабильная ДНК-полимераза может быть модифицирована в соответствии с описанием настоящего изобретения для получения обратимо инактивированного фермента, пригодного для использования в настоящих способах. В целом любой фермент, который катализирует удлинение праймера или необходим для того, чтобы произошло удлинение праймера, и который является достаточно термостабильным, чтобы противостоять реактивации при высокотемпературной инкубации, не становясь при этом необратимо инактивированным, и который может быть модифицирован, как описано в настоящем изобретении, для получения обратимо инактивированного фермента, может быть применен в способах по настоящему изобретению. Специалист в данной области техники может оптимальным образом подобрать условия реакции модификации и реакции амплификации для любого конкретного фермента, руководствуясь настоящим описанием.

В предпочтительных примерах осуществления изобретения обратимую инактивацию термостабильного фермента выполняют с помощью обратимой блокады остатков лизина путем химической модификации --аминогруппы в остатках лизина. Модификация лизина в активной области протеина приводит к инактивации протеина. Кроме того, модификация лизина вне активной области может оказать влияние на инактивацию протеина посредством пространственного взаимодействия или конформационных изменений. В литературе описано большое количество соединений, которые взаимодействуют с аминогруппами обратимым образом. Например, аминогруппы обратимо модифицировали путем трифторацетилирования (см. Goldberger и Anfinsen, 1962, Biochemistry 1: 410), амидирования (см. Hunter и Ludwig, 1962, J. Amer. Chem. Soc. 84: 3491), малеилирования (см. Butler и др. , 1967, Biochem. J. 103: 78), ацетоацетилирования (см. Marzotto и др., 1967, Biochem. Biophys. Res. Commun. 26: 517; и Marzotto и др., 1968, Biochem. Biophys. Acta 154: 450), тетрафторсукцинилирования (см. Braunitzer и др. , 1968, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 349:265) и цитраконилирования (см. Dixon и Perham, 1968, Biochem. J. 109: 312-314; и Habeeb и Atassi, 1970, Biochemistry 9 (25): 4939-4944).

Предпочтительными реагентами для химической модификации --аминогруппы в остатках лизина являются ангидриды дикарбоновых кислот общей формулы где R₁ и R₂ обозначают водород или органические радикалы, которые могут быть связаны, или общей формулы где R₁ и R₂ обозначают органические радикалы, которые могут быть связаны, и атомы водорода находятся в цис-положении. Органические радикалы могут быть непосредственно присоединены к кольцу через связь углерод-углерод или через связь углерод-гетероатом, такую, как связь углерод-кислород, углерод-азот или углерод-сера. Органические радикалы также могут быть связаны друг с другом с образованием циклической структуры, как, например, в случае 3,4,5,6-тетрагидрофталевого ангидрида.

Ангидриды дикарбоновых кислот взаимодействуют с аминогруппами протеинов, давая соответствующие ацилированные продукты, как показано на фиг. 1 для цитраконового ангидрида. Обратимость вышеуказанных ангидридов дикарбоновых кислот, как полагают, должна усиливаться в присутствии либо двойной связи цис-углерод-углерод, либо атомов водорода в цис-положении, что поддерживает концевую карбоксильную группу ацилированных остатков в пространственной ориентации, пригодной для взаимодействия с амидной группой и последующего деацилирования. Описание возможных механизмов реакций как ацилирования, так и деацилирования см. у Palacian и др., 1990, Mol. Cell. Biochem. 97: 101-111. Другие заместители могут аналогичным образом ограничивать вращение вокруг 2,3-связи ацильного остатка в ацилированном продукте, и можно ожидать, что такие соединения будут иметь функциональное значение в способах по настоящему изобретению.

Примеры предпочтительных реагентов включают малеиновый ангидрид; замещенные малеиновые ангидриды, такие, как цитраконовый ангидрид, цис-аконитовый ангидрид и 2,3-диметилмалеиновый ангидрид; экзо-цис-3,6-эндоксо- ⁴ -тетрагидрофталевый ангидрид и 3,4,5,6-тетрагидрофталевый ангидрид. Реагенты являются коммерчески доступными и поставляются, например, фирмами Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI), Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) или Spectrum Chemical Mfg. Corp. (Gardena, CA). Модификации термостабильных ДНК-полимераз с использованием в качестве реагентов замещенных малеиновых ангидридов, в частности цитраконового ангидрида и цис-аконитового ангидрида, описаны в примерах.

Относительная стабильность ацилированных аминогрупп снижается в следующем порядке при использовании вышеуказанных реагентов: малеиновый ангидрид; экзо-цис-3,6-эндоксо-⁴-тетрагидрофталевый ангидрид; цитраконовый ангидрид; 3,4,5,6-тетрагидрофталевый ангидрид; цис-аконитовый ангидрид; и 2,3-диметилмалеиновый ангидрид (см. Palacian и др., выше). Оптимальные условия ингибирующей активации для ферментов, модифицированных конкретным реагентом, определяют эмпирическим путем, как описан