Композиции и способы доставки генетического материала

Композиции и способы доставки генетического материала

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины, а именно медицинской генетике. Сущность изобретения: в клетки индивидуума вводят генетический материал с усилителем функции полинуклеотида (например, бупивакаином), а также вводят молекулы нуклеиновой кислоты, не содержащей частиц ретровируса, молекула нуклеиновой кислоты включает такую последовательность, которая кодирует белок, в состав последнего входит по меньшей мере один эпитоп, идентичный или, по существу, аналогичный эпитопу антигена, против которого желателен иммунный ответ, причем нуклеотидная последовательность операбельно связана с регуляторными последовательностями. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств против ВИЧ. Изобретение описывает также фармацевтическую композицию и набор для осуществления способа. 3 с. и 45 з. п. ф-лы, 4 табл., 9 ил.

Изобретение относится к препаратам и способам для введения генетического материала в клетки индивидуума. Препараты и способы изобретения могут применяться для доставки защитных и/или лечебных агентов, в том числе и генетического материала, кодирующего белковые мишени для вакцинации и лечебных белков.

В качестве средства замены дефектной генетической информации рассматривалось непосредственное введение в живой организм нормально функционирующего гена. В отдельных исследованиях ДНК вводят непосредственно в клетки живого организма без применения вирусной частицы или иного инфекционного вектора. В работе Nabel E.G. и др. (1990) Science 249, 1285-1288 раскрыта cайт-специфичная генная экспрессия in vivo гена бета-галактозидазы, перенесенного непосредственно в стенку артерии мыши. В работе Wolfe J.A. и др. (1990) Science 247, 1465-1468 раскрыта экспрессия разнообразных генов-репортеров, перенесенных непосредственно в мышцы мыши in vivo. В работе Acsadi G. и др. (1991) Nature 352, 815-818, раскрыта экспрессия гена дистрофина человека у мыши после внутримышечной инъекции ДНК конструкции. Работа Wolfe J. A. и др. (1991) Biotechniques 11(4), 474-485 которая вводится здесь в качестве ссылки, относится к условиям, влияющим на прямой перенос гена в мышцы грызуна in vivo. В работе Felgner P.L. и G. Rhodes (1991) Nature 349, 351-352 раскрыта непосредственная доставка в качестве лекарственных средств выделенных генов без применения ретровирусов.

В качестве альтернативы способу противопатогенной вакцинации предложено применение прямого переноса гена. В качестве возможной стратегии вакцинации против ВИЧ предложено применение прямого переноса гена путем единственной инъекции. Имеются сообщения о наблюдаемой клеточной иммунной реакции на ВИЧ-gp120, возникающей при введении в клетку плазмидной ДНК, кодирующей указанный гликопротеин. РСТ Международная заявка под номером PCT/US 90/01515, опубликованная 4 октября 1990, раскрывает способы вакцинации индивидуума против патогенной инфекции прямой инъекцией одних только полинуклеотидов в клетки индивидуума применением одностадийной методики. Применение трансфецирующих агентов, отличных от липофектинов, специально исключено из раскрываемых способов. Стимулирование инокулированных клеток не раскрывается и не предполагается. Раскрыта ВИЧ вакцина, состоящая из введенных полинуклеотидов, кодирующих вирусный белок gp120. Свидетельств о действенности вакцины не приводится.

В работе Thomason D. B. и др. (1990) Cell Physiol, 27, 578-581 и РСТ заявке на патент N WO 91/12329 раскрыто введение в мышечные клетки бупивакаина (bupivacaina) с целью вызвать пролиферацию сателитных клеток в виде части методики поставки гена при участии ретровируса.

Настоящее изобретение относится к способам введения в клетки индивидуума генетического материала. Способы включают стадии контактирования клеток индивидуума с усиливающим функцию полинуклеотида агентом, в качестве которого рекомендуется агент, облегчающий поглощение ДНК клеткой или усиливающий воспалительную реакцию, и введения в клетки молекул нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которая либо кодирует целевой пептид или белок, либо служит матрицей для молекул функциональной нуклеиновой кислоты. Вводимые молекулы нуклеиновой кислоты не содержат ретровирусных частиц. Целевой белок может быть представлен либо белком, функционирующим в организме индивидуума, либо белком, служащим мишенью для иммунной реакции.

Настоящее изобретение относится к способу вакцинации индивидуума против патогена. Способ включает стадии контактирования клеток индивидуума с усиливающим функцию полинуклеотида агентом, в качестве которого рекомендуется агент, облегчающий поглощение ДНК клеткой или усиливающий иммунный ответ, и введения в клетки молекул нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, имеющий по меньшей мере один эпитоп, который идентичен или по существу аналогичен эпитопу, имеющемуся на антигене патогена и операбельно связанному с регуляторными последовательностями. Молекула нуклеиновой кислоты способна экспрессироваться в клетках индивидуума.

Настоящее изобретение относится к способу вакцинации человека против ВИЧ. Способ состоит во введении человеку молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один пептид, в состав которого входит по меньшей мере один эпитоп, идентичный или по существу аналогичный эпитопу, имеющемуся на ВИЧ белке, операбельно связанном с регуляторными последовательностями.

Настоящее изобретение относится к способу вакцинации человека против ВИЧ. Способ состоит во введении молекул двух различных нуклеиновых кислот в различные клетки человека. Молекула каждой нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один пептид, в состав которого входит по меньшей мере один эпитоп, идентичный или по существу аналогичный эпитопу, имеющемуся на ВИЧ белке, операбельно связанном с регуляторными последовательностями. Каждая из молекул различных нуклеиновых кислот содержит различные нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере один отличный от другого пептид, и каждая нуклеиновая кислота способна экспрессироваться в клетках человека.

Настоящее изобретение относится к способу вакцинации индивидуума против гиперпролиферативного заболевания или аутоиммунных заболеваний. Способ состоит во введении в клетки индивидуума молекул нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, в состав которого входит по меньшей мере один эпитоп, идентичный или по существу аналогичный эпитопу, находящемуся в белке, связанном с гиперпролиферативным заболеванием, или белке, связанном с аутоиммунным заболеванием соответственно и операбельно связанном с регуляторными последовательностями, причем молекула нуклеиновой кислоты способна экспрессироваться в клетках.

Настоящее изобретение относится к способам лечения страдающего заболеванием индивидуума, включающим стадии контактирования клеток индивидуума с усиливающим функцию полинуклеотида агентом, в качестве которого рекомендуется агент, облегчающий поглощение ДНК клетками или усиливающий воспалительную реакцию, и введения в клетки индивидуума молекул нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, функционирующую вместо дефектного гена или кодирующую молекулу, создающую лечебный эффект в организме индивидуума и операбельно связанную с регуляторными последовательностями, причем молекулы нуклеиновой кислоты способны экспрессироваться в клетках.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам, содержащим нуклеиновую кислоту и усилитель функции полинуклеотида. Настоящее изобретение относится к фармацевтическому набору, включающему контейнер с нуклеиновой кислотой и контейнер с усилителем функции полинуклеотида.

Настоящее изобретение относится к профилактическим и лечебным ВИЧ вакцинам, содержащим фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несклько пептидов, каждый из которых имеет по меньшей мере один эпитоп, идентичный или по существу аналогичный эпитопу, находящемуся в по меньшей мере одном ВИЧ белке, операбельно связанном с регуляторными последовательностями, причем нуклеиновая кислота способна экспрессироваться в клетках человека.

Настоящее изобретение относится к профилактическим и лечебным ВИЧ вакцинам, содержащим два инокулята. Первый инокулят состоит из фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя и первой нуклеиновой кислоты. Молекула первой нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую один или несколько пептидов, каждый из которых содержит по меньшей мере один эпитоп, идентичный или по существу аналогичный эпитопу, имеющемуся в по меньшей мере одном ВИЧ белке, операбельно связанном с регуляторными последовательностями, причем молекула нуклеиновой кислоты способна экспрессироваться в клетках человека. Второй инокулят состоит из фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя и второй нуклеиновой кислоты. Молекула второй нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, кодирующую один или несколько пептидов, каждый из которых содержит по меньшей мере один эпитоп, идентичный или по существу аналогичный эпитопу, имеющемуся в по меньшей мере одном ВИЧ белке, операбельно связанном с регуляторными последовательностями, причем молекула нуклеиновой кислоты способна экспрессироваться в клетках человека. Молекулы первой и второй нуклеиновых кислот различны и кодируют различные пептиды.

На фиг. 1A приведена диаграмма, иллюстрирующая конструирование плазмиды pM160, созданной путем вставки образованного в ПЦР (полимеразной цепной реакции) фрагмента, кодирующего гликопротеин gp160 ВИЧ-НХВ2 в плазмиду pMAMneoBlue (Клонтех).

На фиг. 1B приведена фотография авторадиограммы вестерн блотинга полного клеточного лизата клеток, трансфецированных плазмидой pM160 (3G7 клетки), в сравнении с трансфецированными только вектором клетками (ТЕ671 клетки). Видно продуцирование gp120 и gp41 в 3G7 клетках, но не в ТЕ 671 клетках.

На фиг. 2 показана фотография авторадиограммы результатов иммуноосаждения при связывании антител сыворотки с ¹²⁵J-gp160.

На фиг. 3A-3E приведены графики, показывающие результаты ELISA (ФИСА) при связывании различных сывороток с различными белками, иммобилизованными на титрационных михропланшетах.

На фиг. 4A и 4B показаны фотографии МТ-2 клеток, инфицированных ТСID₅₀ВИЧ-1/III₈ бесклеточным вирусом, предварительно инкубированным в последовательных разбавлениях антисыворотки.

На фиг. 4C приведены графики, показывающие изменение величин нейтрализации (V_n/V_o) в зависимости от факторов разбавления и построенные на основании результатов с применением контрольной сыворотки (x = мыши, иммунизируемые pMAMneoBlue вектором) и испытуемой сыворотки (о = мыши, иммунизируемые pM160).

На фиг. 4D-4G показаны фотографии H9/III₈ клеток, применяемых в опытах с целью изучения синцитиального ингибирова- ния применением сыворотки от иммунизированных и контрольных животных.

На фиг. 5 приведена диаграмма, отражающая выживание иммунизированных и неиммунизированных мышей, контрольно зараженных gp160-мечеными и немечеными клетками опухоли. Мышей иммунизируют рекомбинантным gp160 белком только векторной ДНК или рекомбинантным вектором, включающим ДНК, кодирующую gp160. Мышам вводят SP2/0 клетки опухоли или SP2/0-gp160 клетки опухоли (SP2/0 клетки, трансфектированные ДНК, кодирующей gp160, и экспрессирующие gp160).

На фиг. 6 приведена карта плазмиды pGAGPOL.rev.

На фиг. 7 приведена карта плазмиды pENV.

На фиг. 8 показаны четыре макромолекулярных скелета (А, В, С и D), применяемых для построения генетического конструкта.

На фиг. 9 показаны четыре вставки (1, 2, 3 и 4), вставляемые в скелеты с получением генетических конструктов.

Настоящее изобретение относится к способу введения в клетки животного молекул нуклеиновой кислоты, чем обеспечивается высокий уровень поглощения и функционирования молекул нуклеиновой кислоты. Способ настоящего изобретения включает стадии введения в клетки индивидуума молекул нуклеиновой кислоты, не содержащих вирусных частиц, в частности ретровирусных частиц, в сочетании с введением ко-агента, усиливающего воспалительную реакцию и/или усиливающего экспрессию молекул нуклеиновой кислоты в тканях, и/или облегчающих поглощения клетками молекул нуклеиновой кислоты. Рекомендуемыми вариантами настоящего изобретения даются способы поставки в клетки индивидуума молекул нуклеиновой кислоты без применения инфекционных агентов.

Молекулы нуклеиновых кислот, поставляемые по изобретению в клетки, могут служить: 1) генетическими матрицами для белков, действующих в качестве профилактических и/или лечебных иммунизирующих средств; 2) копиями, заменяющими дефектные, отсутствующие или нефункционирующие гены; 3) генетическими матрицами для лечебных белков; 4) генетическими матрицами для антисмысловых молекул или 5) генетическими матрицами для рибозимов. В том случае, если молекула нуклеиновой кислоты кодирует белок, рекомендуется, чтобы молекула нуклеиновой кислоты включала последовательности, необходимые для транскрипции и трансляции в клетках животного. В случае молекул нуклеиновой кислоты, служащей матрицей для антисмысловых молекул и рибозимов, рекомендуется, чтобы такие нуклеиновые кислоты были связаны с регуляторными элементами, необходимыми для продукции достаточного числа копий кодируемых ими антисмысловых молекул и рибозимов соответственно. Молекулы нуклеиновой кислоты не содержат ретровирусных частиц и предпочтительно даются как ДНК, имеющей вид плазмиды.

Ко-агент также называется "усилителем функции полинуклеотида" или "УФП". УФП является соединением или смесью соединений, усиливающих воспалительную реакцию и/или усиливающих экспрессию молекул нуклеиновой кислоты в тканях, и/или облегчающих поглощение клетками молекул нуклеиновой кислоты, предпочтительно обладающих несколькими из указанных свойств. Усилители функции полинуклеотида, облегчающие поглощение клетками ДНК и РНК и стимулирующие деление и репликацию клеток, называются также стимулирующими клетку агентами. Рекомендуемые для настоящего изобретения ко-агенты выбирают из группы, включающей эфиры и анилиды бензойной кислоты. В рекомендуемых вариантах УФП представлен бупивакаином.

В соответствии с некоторыми аспектами настоящего изобретения даются препараты и способы, которыми индивидуум профилактически и/или терапевтически вакцинируют против патогена или ненормальной, связанной с заболеванием клеткой. Генетический материал кодирует пептид или белок, разделяющий по меньшей мере один эпитоп с иммуногенным белком, обнаруживаемым в являющихся мишенями патогене или клетках. Генетический материал экспрессируется клетками индивидуума, и служит иммуногенной мишенью, против которой возникает иммунная реакция. Возникшая иммунная реакция имеет широкую основу: помимо гуморальной иммунной реакции вызываются также оба вида клеточной иммунной реакции. Способы настоящего изобретения применимы для придания профилактического или терапевтического иммунитета. Таким образом, способ включает как методы защиты индивидуума от заражения патогеном или возникновения, или пролиферации специфичных клеток, так и методы лечения индивидуума, страдающего от инфицирования патогеном, гиперпролиферативного заболевания или аутоиммунного заболевания.

Настоящее изобретение позволяет вызвать широкий спектр иммунных реакций против целевых белков, т.е. белков, специфично ассоциированных с патогенами или собственными "ненормальными" клетками индивидуума. Настоящее изобретение применимо для вакцинации индивидуумов против патогенных агентов или микроорганизмов таким образом, что иммунная реакция против патогена обеспечивает защитный иммунитет против патогена. Настоящее изобретение применимо для борьбы с гиперпролиферативными заболеваниями и нарушениями, например раком, путем создания иммунной реакции против целевого белка, специфично ассоциируемого с гиперпролиферативными клетками. Настоящее изобретение позволяет бороться с аутоиммунными заболеваниями и нарушениями путем создания иммунной реакции против целевого белка, специфично ассоциируемого с клетками, ответственными за аутоиммунное состояние.

Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к генной терапии, т. е. к препаратам нуклеиновой кислоты и способам их введения в клетки индивидуума в виде экзогенных ионий гена, который либо соответствует дефектному, отсутствующему, нефункционирующему или частично функционирующему гену индивидуума, либо кодирует лечебные белки, т.е. белки, присутствие которых в организме индивидуума компенсирует их дефицит в организме и/или присутствие которых создает лечебное действие на организм индивидуума. Таким образом, настоящим изобретением предусмотрены средства доставки белка альтернативным путем, отличным от простого введения белка.

Подразумевается, что в применяемом здесь значении термин "целевой белок" относится к пептидам и белкам, кодируемым генными конструкциями настоящего изобретения, которые либо служат белковыми мишенями для иммунной реакции, либо действуют в качестве терапевтических или компенсирующих белков в режимах генной терапии.

Согласно настоящему изобретению ДНК и РНК, кодирующую целевой белок, вводят в клетки индивидуума, где происходит ее экспрессия с продуцированием в результате целевого белка. ДНК или РНК, кодирующая целевой белок, связана с регуляторными элементами, необходимыми для экспрессии в клетках индивидуума. Регуляторные элементы для экспрессии ДНК включают промотор и сигнал полиаденилирования. В генетический конструкт могут быть также включены и другие элементы, например область Козака.

В применяемом здесь значении термин "генетический конструкт" относится к молекуле ДНК или РНК, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую целевой белок, и которая включает сигналы инициирования и терминирования, операбельно связанные с регуляторными элементами, в том числе промотором и сигналом полиаденилирования, способными направлять экспрессию в клетках вакцинированного индивидуума.

В применяемом здесь значении термин "экспрессируемая форма" относится к генному конструкту, содержащему необходимые регуляторные элементы, операбельно связанные с кодирующей последовательностью таким образом, что при их наличии в клетках индивидуума происходит экспрессия кодирующей последовательности. Кодирующая последовательность кодирует целевой белок.

В применяемом здесь значении термин "генетическая вакцина" относится к фармацевтическому препарату, содержащему генетический конструкт. Такой конструкт включает нуклеотидную последовательность, кодирующую целевой белок. В число таких препаратов входят и фармацевтические препараты, применимые для создания терапевтической иммунной реакции.

В применяемом здесь значении термин "генетический терапевтический (лечебный) препарат" относится к фармацевтическому препарату, содержащему генетический конструкт. Конструкт включает нуклеотидную последовательность, кодирующую терапевтический или компенсирующий белок.

В применяемом здесь значении термин "целевой белок" относится к белку, относительно которого может быть вызвана иммунная реакция. Целевой белок является иммуногенным белком, разделяющим по меньшей мере один эпитоп с белком из патогена или клетки нежелательного типа, например раковой клетки или клетки, участвующей в аутоиммунном заболевании, относительно которого требуется вакцинация. Иммунная реакция, направленная против целевого белка, способна защитить индивидуума от специфичных инфекции или заболевания, с которыми ассоциируется целевой белок, или вылечить от них.

В применяемом здесь значении выражение "разделять эпитоп" относится к белкам, содержащим по меньшей мере один эпитоп, который идентичен или по существу аналогичен эпитопу другого белка.

Имеется в виду, что в применяемом здесь значении выражение "по существу аналогичный эпитоп" относится к эпитопу, строение которого не идентично строению эпитопа белка, но тем не менее способному вызвать перекрестную клеточную или гуморальную иммунную реакцию.

В применяемом здесь значении термин "терапевтический (лечебный) белок" относится к белкам, присутствие которых оказывает лечебное действие на индивидуума.

Считается, что в применяемом здесь значении термин "компенсирующий белок" будет относится к белкам, присутствие которых компенсирует отсутствие в полной мере функционального, эндогенно продуцируемого белка, связанное с отсутствием, дефектом, нефункциональностью или частичной функциональностью эндогенного гена.

Генетические конструкты включают нуклеотидную последовательность, кодирующую целевой белок, операбельно связанный с необходимыми для генной экспрессии регуляторными элементами. Соответственно, введение в живую клетку молекулы ДНК или РНК приводит к экспрессии ДНК или РНК, кодирующей целевой белок, с продуцированием тем самым целевого белка.

При усвоении клеткой генетический констуркт, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую целевой белок, операбельно связанный с регуляторынми элементами, может остаться в клетке в виде функционирующей внехромосомной молекулы или может быть интегрирован в хромосомную ДНК клетки. ДНК может быть введена в клетку, где и будет оставаться в виде отдельного генетического материала в форме плазмиды. Или же в клетку может быть введена линейная ДНК, способная интегрироваться с хромосомой. При введении ДНК в клетку могут быть добавлены реагенты, способствующие интеграции ДНК с хромосомами. В молекулу ДНК могут быть также включены ДНК последовательности, способные промотировать интеграцию. Или же в клетку может быть введена РНК. Не исключено также создание генетического конструкта в виде линейной минихромосомы, включающей центромер, теломеры и ориджин репликации.

Молекула, кодирующая целевой белок, может представлять собой ДНК или РНК, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую целевой белок. Такие молекулы могут быть представлены кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК или их гибридом, или молекулой РНК, например мРНК. Соответственно, считается, что в применяемом здесь значении термины "ДНК конструкт", "генетический конструкт" и "нуклеотидная последовательность" относятся к молекулам как ДНК, так и РНК.

Регуляторные элементы необходимые для генной экспрессии молекулы ДНК, включают: промотор, инициирующий кодон, терминирующий кодон и сигнал полиаденилирования. Кроме того, для генной экспрессии часто требуются усилители. Необходимо, чтобы такие элементы были операбельно связаны с кодирующей целевые белки последовательностью и чтобы регуляторные элементы были операбельны в организме индивидуума, которому они вводятся Обычно считают, что инициирующий кодон и терминирующий кодон являются частью нуклеотидной последовательности, кодирующей целевой белок. Однако необходимо, чтобы указанные элементы были функциональны в организме индивидуума, которому вводят генный конструкт. Инициирующий и терминирующий кодоны должны находиться в одной рамке с кодирующей последовательностью.

Промоторы и сигналы полиаденилирования, которые применяют, должны быть функциональны в пределах клетки индивидуума.

Примеры промоторов, применимых в практике настоящего изобретения, особенно при получении генетической вакцины для человека, включают (но без ограничения только ими) промоторы из обезьяньего вируса 40 (ОВ40), вируса опухоли молочной железы мыши (ВОМЖМ) промотор, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), например ВИЧ длинного концевого повтора (ДКП) промотор, вирус Молони, ALV, цитомегаловируса (ЦМВ), например ЦМВ непосредственно ранний промотор, вируса Эпштейна-Барра (ВЭБ), вируса саркомы Рауса (ВСР), а также промоторы из генов человека, например актина человека, миозина человека, гемоглобина человека, мышечного креатина человека и металлотионеина.

Примеры сигналов полиаденилирования, применимых в практике настоящего изобретения, особенно при получении генной вакцины для человека, включают (во без ограничения только ими) ОВ40 сигналы полиаденилировавия и ДКП сигналы полиаденилирования. В частности, применяют ОВ40 сигнал полиаденилирования, являющийся рСЕР4 плазмидой (Инвитроген, Сан Диего, КА), называемый ОВ40 сигналом полиаденилирования.

Помимо регуляторных элементов, необходимых для экспрессии ДНК, в молекулу ДНК могут быть также включены и другие элементы. Также дополнительные элементы включают усилители. Усилитель может быть выбран из группы, включающей (но без ограничения только ими) актин человека, миозин человека, гемоглобин человека, мышечный креатин человека и вирусные усилители, например усилители из ЦМВ, ВСР и ВЭБ.

Генетические конструкты могут быть обеспечены ориджином репликации млекопитающего, цель которого удержание конструкта вне хромосомы и получение множества копий конструкта в клетке. Плазмиды рСЕР4 и pREP4 фирмы Инвитроген (Сан Диего, КА) содержат ориджин репликации вируса Эпштейна-Барра и область кодирования ядерного антигена EBNA-1, что обеспечивает высокопийную эписомальную репликацию без интеграции.

В некоторых рекомендуемых воплощениях изобретения применяемый вектор выбирают из векторов, описанных в Примере 46. В тех аспектах изобретения, которые относятся к генной терапии, рекомендуются конструкты с ориджином репликации, включающим необходимый для активации антиген.

В некоторых рекомендуемых воплощениях изобретения, относящихся к вакцинации, генетический конструкт содержит нуклеотидные последовательности, кодирующие целевой белок, и, кроме того, включает гены для белков, усиливающих иммунную реакцию против таких целевых белков. Примеры подобных генов включают гены, кодирующие цитокины и лимфокины, например альфа-интерферон, гамма-интерферон, происходящий из тромбоцитов фактор роста (ПТФР), GC-SF, GM-CSF, ФНО, эпидермальный фактор роста (ЭФР), ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 и ИЛ-12. В некоторых вариантах рекомендуется, чтобы в применяемых в вакцинирующих препаратах генетических конструктах был включен ген для GM-CSF.

Может быть добавлен дополнительный элемент, служащий мишенью для разрушения клетки, если по какой-либо причине желательно исключить попадания в клетку генетического конструкта. В генетический конструкт может быть включен ген тимидин-киназы герпеса (tk). Индивидууму может быть введено лекарственное средство гангцикловир, ведущее к селективному уничтожению любых продуцирующих tk клеток, с обеспечением тем самым средств для селективного разрушения клеток генетическим конструктом.

Для максимального увеличения продуцирования белка могут быть подобраны регуляторные последовательности, хорошо соответствующие генной экспрессии в клетках, в которые был введен конструктор. Кроме того, могут быть подобраны кодоны, наиболее эффективно транскрибируемые в клетках. Любой специалист способен создать функционирующие в клетках ДНК конструкты.

Для выявления экспрессии генетические конструкты могут быть проанализированы in vltro на уровень экспрессии с применением тканевых культур клеток того же типа, что и клетки, в которые будет вводиться конструкт. К примеру, если генетическая вакцина должна быть введена в мышечные клетки человека, для определения уровня экспрессии в качестве модели in vitro могут быть использованы мышечные клетки, выращенные в культуре, например, клетки твердой мышечной опухоли рабдомиосаркомы.

Применяемые в настоящем изобретении генетические конструкты не вводятся в ретровирусные частицы. Генетические конструкты усвиваются клеткой без участия передаваемой ретровирусной частицей вставки, например такой, которая возникает, когда ретровирусными частицами с введенными в них РНК инфицируют клетку. В применяемом здесь значении термин "без ретровирусных частиц" относится к генетическим конструктам, которые не вводятся в ретровирусные частицы. В применяемом здесь значении выражение "отделенный от инфекционного агента" относится к генетическому материалу, не являющемуся частью вирусного, бактериального или эукариотного вектора (активного, инактивированного, живого или мертвого), способного инфицировать клетку.

В некоторых воплощениях изобретения генетические конструкты представляют собой недостаточно полные способные реплицироваться вирусные геномы, в результате чего при введении в клетку генетический конструкт обладает генетической информацией, недостаточной для обеспечения продукции инфекционных вирусных частиц. В применяемом здесь значении термин "неполный вирусный геном" относится к генетическому конструкту, содержащему недостаточно полный геном, в силу чего при введении такого генетического конструкта в клетку не происходит ввода генетической информации, достаточной для продуцирования инфекционного вируса.

В некоторых вариантах ослабленная вирусная вакцина может быть поставлена в виде генетического конструкта, содержащего достаточно генетического материала, чтобы позволить продуцирование вирусных частиц. Поставка ослабленной вакцины в виде генетического конструкта представляется более легким путем для продуцирования больших количеств безопасного, чистого активного вакцинирующего продукта.

Генетический конструкт может быть введен с применением или без применения "микроснарядов". Преимуществом является то, что генетический конструкт настоящего изобретения может быть доставлен в клетки индивидуума без твердых частиц. Имеется в виду, что выражение "без твердых частиц" в применяемом здесь значении относится к жидкости, которая не содержит каких-либо твердых "микроснарядов", применяемых в качестве средства для перфорации, прокалывания или каким-то иным путем протыкания клеточной мембраны с целью создания входного отверстия для поступления в клетку генетического материала.

Настоящее изобретение может быть применено для вакцинации индивидуума против всех патогенов, например вирусов, прокариотных и патогенных эукариотных микроорганизмов, таких как одноклеточные патогенные микроорганизмы и многоклеточные паразиты. Настоящее изобретение особенно пригодно для вакцинации индивидуума против тех патогенов, которые инфицируют клетку и которые не капсулируются, например вирусов и прокариотов, таких как гоноррея, листерез и шигеллез. Кроме того, настоящее изобретение применимо также для вакцинации индивидуума против патогенов из класса простейших, в жизненном цикле которых имеется стадия, когда они являются внутриклеточными патогенами. Имеется в виду, что в применяемом здесь значении термин "внутриклеточный патоген" к вирусу и патогенному микроорганизму, которые по меньшей мере часть своего репродуктивного или жизненного цикла проводят в клетке-хозяине, в которой продуцируют или принуждаются к продуцированию патогенных белков. В Таблице 1 приведен перечень некоторых вирусных семейств и родов, для которых могут быть изготовлены вакцины по настоящему изобретению. В вакцинах могут быть использованы ДНК конструкты, включающие ДНК последовательности, кодирующие пептиды, в состав которых входит по меньшей один эпитоп, идентичный или по существу аналогичный эпитопу, имеющемуся на антигене патогена, например тех антигенов, перечень которых приведен в таблицах. Более того, настоящее изобретение применимо также для вакцинации индивидуума против других патогенов, в том числе прокариотных и эукариотных патогенов из класса простейших, а также многоклеточных паразитов, например тех, перечень которых приведен в Таблице 2.

Для создания генетической вакцины, предназначенной для защиты от патогенной инфекции, в генетический конструкт должен быть включен генетический материал, кодирующий иммуногенные белки, против которых может быть создана защитная иммунная реакция. Будет ли инфекция патогеном внутриклеточной, что особенно приемлемо для настоящего изобретения, или внеклеточной, маловероятно, чтобы все антигены патогена создавали защитную реакцию. Поскольку и ДНК, и РНК сравнительно малы и могут быть получены сравнительно легко, настоящее изобретение обладает дополнительным преимуществом, заключающимся в том, что допускает вакцинацию рядом антигенов патогена. Применяемый в генетической вакцине генетический конструкт может включать генетический материал, кодирующий целый ряд патогенов антигена. К примеру, в один конструкт может быть включено несколько вирусных генов с обеспечением тем самым множества мишений. Кроме того, может быть приготовлен целый ряд инокулятов, которые могут быть поставлены в различные клетки, и совместно включающих в некоторых случаях полный или, что более предпочтительно, неполный, например почти полный, набор генов в вакцине. К примеру, полный набор вирусных генов может быть введен применением двух конструктов, каждый из которых содержит разные половины генома, вводимые в разных участках. Таким образом, может быть создана иммунная реакция против каждого антигена без риска вовлечения инфекционного вируса. Это позволяет вводить более одной мишени антигена, а также позволяет исключить требование идентифицировать защитные антигены.

Простота в обращении и недорогая природа ДНК и РНК позволяют, кроме того, более эффективно отбирать защитные антигены. Гены могут быть отсортированы и подвергнуты системному анализу более легко, чем белки. Отбирают патогенные агенты микроорганизмы, для защиты от которых создается вакцина, и затем идентифицируют иммуногенный белок. Таблицы 1 и 2 включают перечни некоторых патогенных агентов и микроорганизмов, для защиты от инфицирования которыми могут быть созданы генетические вакцины. В некоторых рекомендуемых вариантах способы вакцинации индивидуума от патогена направлены против ВИЧ, HTLV или ВЭБ.

Другим аспектом настоящего изобретения являются способ придания на широкой основе защитной иммунной реакции против гиперпролиферирующих клеток, характерных для гиперпролиферирующих заболеваний, и способ лечения страдающего гиперпролиферативным заболеванием индивидуума. Подразумевается, что в применяемом здесь значении термин "гиперпролиферативное заболевание" относится к тем заболеваниям и нарушениям, которые характеризуются гиперпролиферацией клеток. Примеры гиперпролиферативных заболеваний включают рак всех видов и псориаз.

Обнаружено, что введение генетического конструкта, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую иммуногенный, ассоциированный с "гиперпролиферирующей клеткой" белок, в клетку индивидуума приводит к продуцированию указанных белков в вакцинированных клетках индивидуума. Имеется в виду, что в применяемом здесь значении термин "гиперпролиферативно ассоциируемый белок" относится к белкам, ассоциируемым с гиперпролиферативным заболеванием. Для вакцинации от гиперпролиферативных заболеваний индивидууму вводят генетический конструкт, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую ассоциируемый с гиперпролиферирующим заболеванием белок.

Для того чтобы гиперпролиферативно ассоциируемый белок был эффективной иммуногенной мишенью, это должен быть белок, продуцируемый исключительно или на более высоком, чем в нормальных клетках, уровне в гиперпролиферативных клетках. Целевые антигены включают те белки, их фрагменты и пептиды, которые содержат по меньшей мере один эпитоп, обнаруживаемый в указанных белках. В отдельных случаях гиперпролиферативно ассоциируемый белок является продуктом мутации кодирующего белок гена. Мутировавший ген кодирует белок, почти идентичный нормальному белку за исключением некоторых отличий в аминокислотной последовательности, что приводит к отличному, не обнаруживаемому в нормальном белке эпитопу. Подобные целевые белки включают те белки, которые кодируются онкогенами, например: myb, myc, fyn, а также транслокационным геном bcr/ab1, ras, src, Р53, neu, trk и ECRF. Помимо онкогенных продуктов в качестве целевых антигенов целевые белки для противоракового лечения и защитных режимов включают переменные области антите