Опосредованный вирусом усиленный перенос днк

Опосредованный вирусом усиленный перенос днк

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается опосредованного вирусом усиленного переноса ДНК и способа повышения эффективности трансдукции кроветворных и других клеток под действием ретровируса. Способ включает инфицирование клеток в присутствии фибронектина или его фрагментов. Фибронектин и его фрагменты значительно усиливают опосредованный ретровирусом перенос генов в клетки, в частности кроветворные клетки, включая коммитированные клетки-предшественники и первичные кроветворные стволовые клетки. Настоящим изобретением предусматриваются также усовершенствованные способы соматической генотерапии на основе усиленного переноса генов, популяции кроветворных клеток и новые конструкции, предназначенные для усиления опосредованного ретровирусом переноса ДНК в клетки, и их использование. Преимущество изобретения заключается в разработке эффективного переноса генетического материала в клетки млекопитающих без опасных последствий и ограничений. 18 с. и 70 з.п. ф-лы, 4 табл., 11 ил.

Это изобретение было сделано при правительственной поддержке, предоставленной Национальным институтом здравоохранения на основании субсидий N PO1 HL-46528 и PO1 HL-45168. В этой связи правительство имеет определенные права на это изобретение.

Область техники, к которой относится изобретение Предметом настоящего изобретения являются способы увеличения эффективности трансдукции клеток вирусами и, в частности, способы усиления опосредованного вирусом переноса генов в клетки с помощью фибронектина и/или фрагментов фибронектина.

Известный уровень техники Прогресс в области понимания молекулярной основы многих болезней человека, а также совершенствования технологии переноса генов сделал возможным разработку процедуры соматической генотерапии для лечения серьезных генетических заболеваний. В настоящее время с помощью генотерапии можно лечить заболевания, вызванные дефектом или недостаточностью фермента или другого белка, требующие точного регулирования уровня этих компонентов, и заболевания костного мозга человека.

Например, одним заболеванием, которое можно лечить с помощью генотерапии, является аденозиндезаминазная (ADA) недостаточность, которая вызывает тяжелую форму комбинированного иммунодефицита. У больных, страдающих аденозиндезаминазной недостаточностью, в клетках костного мозга содержится мало фермента или он вообще отсутствует. Однако аденозиндезаминазную недостаточность можно лечить путем трансплантации совместимого костного мозга. ADA-нормальные клетки характеризуются избирательным действием по сравнению с пораженными клетками и обычно восстанавливают костный мозг больного.

Клетки костного мозга являются хорошей мишенью для соматической генотерапии, так как ткань костного мозга легко использовать для выполнения in vitro анализов и она содержит репопулирующие клетки. Альтернативно было продемонстрировано, что пуповинная кровь содержит большое количество первичных клеток-предшественников. Успешный перенос генов в кроветворные стволовые клетки, долгоживущие репопулирующие клетки, позволяет вылечивать разные заболевания благодаря получению потомства этих клеток.

Перенос генов и долговременная экспрессия генов в репопулирующих стволовых клетках была достигнута в моделях, полученных рядом ученых в результате исследований, проведенных на мышах. Однако при выполнении in vivo экспериментов на более крупных животных, таких как собаки и приматы, успех оказался весьма ограниченным, что связано главным образом с низкой эффективностью заражения первичных кроветворных стволовых клеток. Применение текущей технологии переноса генов далее осложнено при лечении людей несколькими факторами, которые включают низкие количества стволовых клеток, имеющихся в костном мозге взрослого человека, отсутствие приемлемых методов очистки таких клеток и небольшую долю таких первичных клеток в клеточном цикле.

При выполнении экспериментов как на мышах, так и крупных животных, включающих исследование клеток костного мозга, было установлено, что наиболее успешные процедуры включали сокультивирование клеток-мишеней с линиями ретровирусных клеток-продуцентов. Кроме того, в основе большинства утвержденных Управлением по контролю за продуктами и лекарствами экспериментов по переносу генов у людей лежат рекомбинантные ретровирусные векторы, предназначенные для трансдукции генов. Рекомбинантные ретровирусные векторы весьма желательны для генотерапии, так как они эффективно переносят, точно и стабильно интегрируют экзогенную ДНК в клеточную ДНК. Эти векторы содержат экзогенную ДНК, служащую для переноса генов, и затем модифицируются с целью устранения вирусного патогенеза. Благодаря такой модификации продуцирование вирусов достигается в результате использования ретровирусных упаковочных клеток. Однако для клинической генотерапии более желательна безклеточная трансдукция в связи с вопросами биобезопасности и контроля качества. К сожалению, эффективный перенос генов в такие кроветворные клетки, как стволовые клетки, оказывается невозможным без сокультивирования с вирусопродуцирующими клетками.

Совсем недавно было установлено, что эффективность переноса генов можно увеличить путем оказания воздействия на клетки-мишени со стороны стромальных клеток во время инфицирования. Стромальные клетки являются основным компонентом кроветворного микроокружения. Кроветворное микроокружение состоит из организованной сети макрофагов, стромальных клеток, клеток эндотелия, адипоцитов и сложного экстрацеллюлярного матрикса, составленного из целого ряда определенных адгезионных молекул. Молекулы сложного экстрацеллюлярного матрикса, такие как ламинин, коллаген, тромбоспондин, протеогликаны, гликозаминогликаны и фибронектин, образуют связывающие центры как для кроветворных клеток, так и для факторов роста. До сих пор не ясен механизм, лежащий в основе такого стимулирующего действия стромальных клеток на ретровирусную инфекцию, но уже известно, что физиологическая регуляция пролиферации и дифференциации кроветворных клеток происходит тогда, когда эти клетки непосредственно контактируют с клетками кроветворного микроокружения.

Эффективный перенос генов в долгоживущие репопулирующие кроветворные стволовые клетки и другие клетки остается проблематичным, препятствуя широкому применению в настоящее время методов переноса генов для лечения заболеваний, связанных с кроветворным процессом, и других болезней. Существует насущная необходимость в методах эффективного переноса генетического материала в клетки млекопитающих без опасных последствий и ограничений, присущих используемым ранее методам. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих потребностей.

Краткое изложение сущности изобретения Одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения предусматривается способ увеличения частоты трансдукции кроветворных клеток посредством ретровирусного вектора. Этот способ включает инфицирование жизнеспособных кроветворных клеток рекомбинантным ретровирусным вектором с дефектом репликации в присутствии по существу чистого фибронектина и/или его фрагментов, эффективно увеличивающих частоту клеточной трансдукции ретровирусом. Фибронектин и/или его фрагменты можно получить из натуральных материалов или синтезировать искусственным путем (например, создать генетически с помощью методов рекомбинантного или химического синтеза) либо получить из комбинации натуральных и синтетических материалов. Кроме того, совершенно очевидно, что полипептид или полипептиды фибронектина, используемые в этом изобретении, могут включать мутации, образующие натуральную последовательность аминокислот фибронектина, которая тем не менее представляет функциональные полипептиды, обладающие адгезионными свойствами, необходимыми для достижения повышенной трансдукции в соответствии с этим изобретением.

Другим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения предусматривается способ получения трансдуцированных кроветворных клеток, который включает инфицирование жизнеспособных кроветворных клеток рекомбинантным ретровирусом с дефектом репликации, содержащим экзогенную ДНК, в присутствии иммобилизованного фибронектина, иммобилизованных фрагментов фибронектина или их иммобилизованной смеси в количествах, достаточных для увеличения частоты клеточной трансдукции ретровирусом.

Еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения предусматривается усовершенствованный способ трансплантации клеток. Этот способ включает стадии получения жизнеспособных кроветворных клеток у животного-донора; инфицирование кроветворных клеток вектором рекомбинантного ретровируса с целью получения трансдуцированных жизнеспособных кроветворных клеток, причем инфицирование производится в присутствии фибронектина и/или его фрагмента в иммобилизованной форме, способствующей увеличению частоты трансдукции; и введение трансдуцированных жизнеспособных кроветворных клеток животному-реципиенту в виде клеточного трансплантата. В одном предпочтительном случае инфицированные клетки можно ввести аутологическому донору.

Еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения предусматривается способ получения трансдуцировнных клеток пуповинной крови с целью их трансплантации. Этот способ включает инфицирование кроветворных клеток, взятых из пуповинной крови, рекомбинантным ретровирусным вектором с дефектом репликации в присутствии достаточного количества иммобилизованного фибронектина и/или его фрагментов с целью увеличения частоты трансдукции кроветворных клеток под действием ретровирусного вектора. Настоящее изобретение включает также популяции жизнеспособных трансдуцированных клеток из пуповинной крови, полученных в соответствии с таким способом, и способы трансплантации клеток, которые включают введение животному популяций трансдуцированных клеток в качестве клеточного трансплантата.

В соответствии с особыми аспектами вышеуказанных вариантов осуществления настоящего изобретения используемый фибронектин или его фрагмент должен содержать первую аминокислотную последовательность, которая обеспечивает связывающую ретровирус активность области связывания гепарина П фибронектина, и вторую аминокислотную последовательность, которая обеспечивает связывающую клетки активность области CS-1 фибронектина. Одновременное использование этих двух областей связывания фибронектина обеспечило весьма значительное увеличение трансдукции клеток-мишеней под действием ретровируса.

Еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения предусматривается способ создания генно-инженерной конструкции с целью увеличения частоты трансдукции заранее определенной клетки-мишени под действием ретровирусного вектора. Этот способ включает стадию ковалентного связывания лиганда, который связывает клетку-мишень с полипептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которая обеспечивает связывающую ретровирус активность области связывания гепарина П фибронектина. Настоящее изобретение включает также способы использования этих генно-инженерных конструкций для увеличения частоты трансдукции заранее определенных клеток-мишеней посредством ретровирусного вектора и процедуры трансплантации с использованием трансдуцированных клеток.

Еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения предусматривается способ локализации количества вируса, включающий культивирование среды, содержащей вирус в присутствии необходимого имобилизованного количества фибронектина или фрагментов фибронектина, обеспечивающего связывание вирусом области связывания гепарина П фибронектина с целью локализации количества вируса.

Другими предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения предусматриваются культуры трансдуцированных жизнеспособных кроветворных и других клеток, содержащих чистый и/или иммобилизованный фибронектин или его фрагменты, а также наборы для опосредованного вирусом переноса ДНК в клетки, как это далее рассматривается в описании изобретения.

Целью настоящего изобретения является создание способов эффективного инфицирования ретровирусом клеток млекопитающих.

Другой целью настоящего изобретения является создание способов переноса генов с помощью ретровирусных векторов, которые не требуют сокультивирования.

Еще одной целью настоящего изобретения является создание усовершенствованных способов и культур клеток для аутологической и/или аллогенной трансплантации клеток.

Эти и другие цели, преимущества и отличительные особенности настоящего изобретения станут совершенно очевидными из приводимого ниже описания изобретения.

Описание чертежей Фиг. 1 - схематическое изображение молекулы фибронектина, включающей фрагменты химотрипсина.

Фиг. 2 - изображение эффективности инфицирования коммитированных клеток-предшественников человека в присутствии фрагментов фибронектина с использованием вектора TKNEO, как это далее описывается в примере 1, см. ниже.

Фиг. 3 - сравнение эффективности инфицирования различных коммитированных кроветворных клеток-предшественников человека в присутствии фрагментов фибронектина с использованием вектора TKNEO, как это далее описывается в примере 1, см. ниже.

Фиг. 4 - сравнение наличия аденозиндезаминазы человека у мышей, трансплантированной вместе с клетками костного мозга, которые были трансдуцированы посредством (i) сокультивирования (столбцы 2-4), (ii) инфицирования надостадочной жидкости в присутствии иммобилизованных фрагментов фибронектина (столбцы 5 - 7) и инфицирования надосадочной жидкости на основе бычьего сывороточного альбумина (столбцы 8 - 10), как это далее описывается в примере 7, см. ниже. Контрольные пробы для аденозиндезаминазы человека показаны в столбцах 1 и 12, а для аденозиндезаминазы мышей - в столбце 11.

Фиг. 5 - изображение связывания ретровируса с фрагментами фибронектина, как это далее описывается в примере 8, см. ниже.

Фиг. 6 - изображение того, что связывание ретровируса с фрагментами фибронектина зависит от дозы, как это далее описывается в примере 8, см. ниже.

Фиг. 7 - схематическое изображение, иллюстрирующее разные фрагменты рекомбинантного фибронектина, используемого в примерах 9 - 11, см. ниже.

Фиг. 8 - изображение связывания ретровируса с разными фрагментами фибронектина, включая несколько рекомбинантных фрагментов, как это описывается в примере 9, см. ниже.

Фиг. 9 - изображение того, как гепарин блокирует связывание ретровируса с фрагментами фибронектина, как это описывается в примере 9, см. ниже.

Фиг. 10 - изображение эффективности инфицирования ретровирусом кроветворных клеток мышей в присутствии разных фрагментов фибронектина, как это далее описывается в примере 10, см. ниже.

Фиг. 11 - сравнение наличия аденазиндезаминазы человека у мышей, которым были трансплантированы клетки костного мозга, трансдуцированные посредством (i) сокультивирования, (ii) инфицирования надосадочной жидкости с использованием разных фрагментов фибронектина и (iii) инфицирования надосадочной жидкости с использованием бычьего сывороточного альбумина, как это описывается в примере 11, см. ниже.

Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения Для получения более четкого представления о принципах настоящего изобретения ниже приводится описание некоторых вариантов его осуществления. Тем не менее, следует помнить, что они никоим образом не ограничивают объем изобретения, причем предполагается, что специалистам в этой области должны быть очевидны изменения, модификации и способы применения принципов по настоящему изобретению, приведенные здесь в качестве иллюстрации.

Как указывалось выше, настоящим изобретением предусматриваются способы увеличения частоты трансдукции жизнеспособных клеток под действием таких вирусов, как ретровирусы. Настоящим изобретением предусматриваются также способы эффективного переноса генов в жизнеспособные клетки с использованием рекомбинантных ретровирусных векторов, способы получения трансдуцированных клеток, а также способы и материалы для получения аутологичных и других клеточных трансплантатов.

Одной отличительной особенностью настоящего изобретения является открытие того, что фибронектин и его фрагменты, содержащие область адгезии клеток CS-1 фибронектина, значительно усиливают опосредованный ретровирусом перенос генов в такие клетки, как кроветворные клетки, например коммитировнные клетки-предшественники и стволовые кроветворные клетки или инициирующие клетки долгоживущей культуры, имеющие рецептор фибронектина и, таким образом, обладающие способностью связывания с фибронектином или его фрагментами. Весьма благоприятным является тот фактор, что увеличение эффективности не требует сокультивирования с продуцирующими вирус клетками. Другие отличительные особенности настоящего изобретения основываются на открытии связывающей вирусы области фибронектина, расположенной в области связывания гепарина П. Эту связывающую вирусы область можно использовать для локализации вирусных частиц во многих применениях, включающих, например, широкий диапазон генно-инженерных конструкций, предназначенных для доставки вируса к клетке-мишени.

Рекомбинантные вирусные векторы в соответствии с определенными предпочтительными аспектами настоящего изобретения содержат экзогенную ДНК и не являются патогенными, то есть у них имеется дефект репликации. Эти векторы эффективно переносят, точно и стабильно интегрируют экзогенную ДНК в ДНК клеток-хозяев, таких как клетки животных, в частности клетки млекопитающих. Например, в соответствии с настоящим изобретением нуклеотидную последовательность, включающую ряд оснований из кодирующей последовательности представляющего интерес гена, можно включить в рекомбинантный ретровирусный вектор с целью переноса гена под контролем соответствующего промотора. Таким промотором обычно является экзогенный промотор. В этой связи экзогенная ДНК может содержать ДНК, полученную натуральным или искусственным путем, и может состоять из частей, полученных из гетерологичных источников, причем эти части могут представлять собой натуральные или химические синтезированные молекулы и могут быть соединены посредством лигирования или других известных способов. Как указывалось выше, введенная нуклеотидная последовательность должна находиться под контролем промотора и считываться в прямом направлении. Говоря другими словами, последовательность промотора обычно находится в обратном направлении (то есть в 5' направлении) от кодирующей последовательности. Хорошо известно, что здесь могут присутствовать или отсутствовать другие регулирующие элементы (например, последовательности энхансеров), которые взаимодействуют с промотором и инициирующим кодоном транскрипции с целью получения транскрипции экзогенной кодирующей последовательности. Фраза "под контролем" подразумевает наличие таких элементов, которые необходимы для получения транскрипции введенного гена. Кроме того, рекомбинантная ДНК предпочтительно включает терминирующую последовательность, находящуюся в прямом направлении от введенной кодирующей последовательности.

Можно использовать ретровирусные векторы, которые включают экзогенную ДНК, представляющую селектирующий маркер или обладающую другим селективным преимуществом. Например, векторы могут содержать один или несколько экзогенных генов, которые являются резистентными к разным селективным агентам, включающим такие антибиотики, как неомицин. Репрезентативные векторы, которые можно использовать в этом изобретении, включают, например, вектор N/ZipTKNEO (TKNEO) (титр: 110⁵ G418^r колониеобразующих единиц/мл на клетки N1H 3N3), вектор ZipPGK-hADA и вектор ZipPGK-mADA, которые ранее описывались Морицем и др. (1993) в журнале J. Exp. Med. 178:529. В векторе TKNEO неофосфотрансферазные последовательности выражены в виде смысловой ориентации (по отношению к 5' длинному концевому повтору - LTR) через промотор тимидинкиназы вируса герпеса простого. Этот вектор содержит ген селекируемого маркера, который обеспечивает резистентность к неомицину, что облегчает идентификацию трансдуцированных клеток. В векторе ZipPGK- hADA кДНК аденозиндезаминазы человека ("hADA") выражается в смысловой ориентации по отношению к 5' длинному концевому повтору через промотор фосфоглицераткиназы человека (PGK). Он содержит только одну экспрессируемую генетическую последовательность и не имеет селектируемого маркера доминанты. Вектор ZipPG-K-mADA (PGK-mADA) идентичен вектору ZipPGK-hADA за исключением того, что кДНК аденозиндезаминазы человека заменена ДНК аденозиндезаминазы мышей (mADA). Эти и другие вирусные векторы и способы их получения хорошо известны и их применение в настоящем изобретении не может вызвать затруднений у специалистов в этой области.

Вирусные векторы, используемые в этом изобретении, обладают способностью связываться с аминокислотной последовательностью области связывания гепарина П фибронектина, в том числе и фибронектина человека. Поскольку настоящее изобретение не ограничено теоретическими выкладками, то можно предположить, что совместная локализация вируса и клетки-мишени посредством привязывания вируса и клетки к соответствующим функциональным областям способствует увеличению трансдукции клетки вирусом. В этом отношении способность вируса связываться с аминокислотной последовательностью области связывания гепарина П и, следовательно, обеспечивать эффективное достижение целей настоящего изобретения можно легко подтвердить с помощью стандартных процедур, аналогичных тем, которые описываются в приводимых ниже примерах 8 и 9. То есть эти анализы позволяют определить степень связывания вирусных частиц с иммобилизованными полипептидами, содержащими область связывания гепарина П с тем, чтобы противостоять вымыванию из иммобилизованной полипептидной матрицы. Коротко говоря, содержащую вирус надосадочную жидкость можно инкубировать в лунке с иммобилизованным полипептидом, включающим область связывания гепарина П фибронектина. Эту лунку затем интенсивно промывают буфером, представляющим собой физиологический раствор, после чего в этой лунке инкубируют клетки-мишени для вируса с целью определения в ней уровня инфицирующей активности. Определяют снижение инфицирующей активности или титра по сравнению с исходной содержащей вирус надосадочной жидкостью и сравнивают полученный показатель с аналогичной контрольной серией (полученной, например, при использовании лунки, покрытой бычьим сывороточным альбумином). Значительно более высокий титр в лунке, содержащей область гепарина П, по сравнению с контрольной лункой означает, что данный вирус пригоден для использования в соответствии с целями настоящего изобретения. Для облегчения процедуры скрининга вирусный вектор может содержать ген селектируемого маркера, как это описывалось выше.

Фрагменты фибронектина, предназначенные для использования в этом изобретении, могут иметь естественное или искусственное происхождение и могут быть получены из природных материалов с достаточно высокой степенью чистоты, например, так как это описывалось ранее Руослахти и др. (1981) в журнале J. Biol. Chem. 256: 7277; Пател и Лодиш (1986) в журнале J. Cell Biol. 102:449; и Бернарди и др. (1987) в журнале J. Cell Biol. 105:489. В связи с этим ссылка в этом изобретении на чистый фибронектин или его фрагменты означает, что они не содержат других белков, вместе с которыми обычно встречается фибронектин. Чистый фибронектин или его фрагменты, предназначенные для применения в этом изобретении, можно также получить рекомбинантным путем, например, так как это описывается в патенте США N 5198423, выданном 30 марта 1993 г. Тагучи и др. с передачей прав на патент Такара Шузо Компани, Лтд., Киото, Япония. В частности, рекомбинантные фрагменты, идентифицируемые в приводимых ниже примерах, как Н-271, Н-296, CH-271, CH-296 и C-CS1, а также способы их получения, детально описываются в противопоставленном патенте. Фрагмент C247, используемый в приводимых ниже примерах, был получен в соответствии с описанием, приведенным в патенте США N 5102988. Эти фрагменты или фрагменты, из которых они могут быть получены стандартными способами, получают путем культивирования клеток E.coli, зарегистрированных научно-исследовательским институтом ферментации агентства промышленной науки и технологии, Япония, под названиями PERM P-10721 (Н-296), FERM ВР-2799 (C-277, связанный с Н-271 с помощью метионина), FERM ВР-2800 (C-277, связанный с Н-296 с помощью метионина) и FERM ВР-2264 (Н-271) и описанных также в патенте США N 5198423. Кроме того, полезная информация об используемых в этом изобретении фрагментах фибронектина или исходных материалах для получения таких фрагментов содержится в работе Кимизука и др., опубликованной в журнале J. Biochem., 110, 284-291 (1991), в которой более подробно описываются вышеуказанные рекомбинантные фрагменты; в журнале EMBO J. 1755-1759 (1985), где описывается структура гена фибронектина человека; и в журнале Biocnemistry, 25, 4936-4941 (1986), где рассматривается область связывания гепарина П фибронектина человека. Было установлено, что фрагменты фибронектина, содержащие как область адгезии клеток CS-1, так и область связывания гепарина П, например, в виде 30 или 35 кд фрагмента (фибронектин 30/35) и в виде разных рекомбинантных фрагментов, рассматриваемых в приводимых ниже примерах, значительно увеличивают эффективность переноса генов в кроветворные клетки, и в настоящем изобретении предпочтение отдается именно им. Необходимо понять, что полипептид или полипептиды, относящиеся к фибронектину и используемые в этом изобретении, образуют аминокислотную последовательность, обеспечивая связывающую клетки активность области адгезии клеток CS-1 фибронектина, а также аминокислотную последовательность области связывания гепарина П фибронектина, которая обеспечивает связывание вируса. Вполне понятно, что необходимая активность связывания клеток и вирусов может быть обеспечена как нативными аминокислотными последовательностями этих функциональных областей фибронектина, так и аминокислотными последовательностями, которые отличаются от нативных последовательностей, но обладают аналогичной активностью связывания клеток и вирусов. Подобные аминокислотные последовательности характеризуются значительной гомологией в отношении соответствующих нативных последовательностей и могут включать такие последовательности, в которых аминокислоты были удалены, замещены и/или модифицированы, обеспечивая при этом получение аминокислотной последовательности с требуемыми характеристиками связывания клеток или вирусов.

Разработанные биотехнологии достигли такого уровня, при котором может быть легко произведена делеция, замещение, добавление или другая модификация аминокислот в функциональных областях. Полученные аминокислотные последовательности затем могут быть подвергнуты тестированию стандартными методами с целью определения требуемой активности связывания клеток или вирусов. Например, активность связывания вирусов мутанта или модифицированных форм области связывания гепарина П фибронектина можно тестировать так, как описывается ниже, в частности, в примерах 8 и 9, путем культивирования вирусов, промывки и анализов вирусных титров, что позволяет определить степень инфицирования по сравнению с контрольной пробой. С учетом приведенных здесь материалов анализы связывания будут представлять для специалистов в этой области обычную экспериментальную работу.

Связывание клеток с модифицированными или мутантными формами области адгезии клеток CS-1 фибронектина или с другими связывающими клетки полипептидами можно анализировать с помощью известных способов. Например, такие процедуры включают методы, описанные в журнале Nature 352: 438-441 (1991). Коротко говоря, пластиковые чашки покрывали связывающим клетки полипептидом и предназначенную для анализа популяцию клеток помещали в среду на время от 30 минут до 2 часов. После инкубации клетки, не связанные с белком, выделяли, считали и анализировали в отношении жизнеспособности. Клетки, связанные с полипептидом, также выделяли с помощью трипсина или буфера для диссоциации клеток (например, Gibco), считали и тестировали в отношении жизнеспособности. В некоторых случаях, например в случае колониеобразующих кроветворных клеток, такие клетки культивировали еще в течение 12-14 дней, после чего оценивали колониеобразующие характеристики клеток. Затем высчитывали процент адгезивных клеток и сравнивали этот результат с контрольной пробой, полученной при использовании бычьего сывороточного альбумина. Значительное связывание клеток-мишеней с анализированным полипептидом свидетельствует о том, что данная комбинация полипептида и клеток пригодна для достижения целей настоящего изобретения, и этот полипептид может быть присоединен к связывающему ретровирус фрагменту фибронектина с образованием конструкции по настоящему изобретению, предназначенной для увеличения инфицирования клеток-мишеней вирусным вектором.

В соответствии с наиболее характерными аспектами настоящего изобретения связывающий вирус полипептид, используемый для усиления трансдукции под действием ретровирусных векторов, должен включать (i) первую аминокислотную последовательность, которая соответствует Ala¹⁶⁹⁰ - Thr¹⁹⁶⁰ области связывания гепарина П фибронектина человека, которая представлена формулой (идентификационный номер последовательности 1 см. в конце описания).

или в достаточной мере подобную аминокислотную последовательность, обладающую способностью связывать ретровирус; и (ii) вторую аминокислотную последовательность, которая соответствует одной части области связывания IIICS фибронектина человека (область связывания клеток CS-1), которая представлена формулой (идентификационный номер последовательности 2, см. в конце описания): или в достаточной мере подобную аминокислотную последовательность, обладающую способностью связывать кроветворные клетки, в частности первичные клетки-предшественники и/или долгоживующие репопулирующие (стволовые) клетки.

Как отмечалось выше, совершенно очевидно, что в объем настоящего изобретения входят модификации и/или мутации этих нативных последовательностей, если полученная аминокислотная последовательность в достаточной степени подобна нативной последовательности и обладает способностью связывать вирус (в случае области связывания гепарина П), а также способностью связывать клетки-мишени (в случае области CS-1).

Одним аспектом настоящего изобретения предусматривается метод соматической генотерапии, который включает in vitro клеточную терапию и последующую трансплантацию клеток-мишеней хозяину, который также известен как "прививка" хозяину трансдуцированных клеток-мишеней. Кроветворные или другие клетки могут быть взяты у человека или другого млекопитающего с помощью стандартных методов. Например, кроветворные клетки можно получить из костного мозга, крови периферической кровеносной системы человека-донора или пуповинной крови. Полученные кроветворные клетки могут необязательно быть подвергнуты обработке с помощью стандартных методов, чтобы обогатить их стволовыми клетками и/или первичными клетками-предшественниками. Кроветворные клетки затем можно инкубировать соответствующим образом, например, на планшетах с культурами тканей. Необязательно, на этом этапе несвязанные (adherent - negative) мононуклеарные клетки с низкой плотностью можно предварительно стимулировать до инфицирования ретровирусами. Предварительное стимулирование, известное в этой области и применяемое в этом изобретении, представляет собой процесс воздействия на клетки симулирующими рост факторами до инфицирования ретровирусами. Было доказано, что подобное предварительное стимулирование улучшает трансдукцию кроветворных клеток ретровирусами.

Вслед за предварительным стимулированием клетки можно собирать и инкубировать с фибронектином или его фрагментами, как описывается в этом изобретении, в результате чего увеличивается частота трансдукции клеток под действием ретровирусов. Клетки предпочтительно инкубируют с очищенным и/или нерастворимым, например иммобилизованным, фибронектином или его фрагментами. После этого клетки инфицируют рекомбинантным вирусом, например ретровирусом, содержащим ген, служащим для устранения недостаточности или дефекта фермента или другого белка в клетках, в присутствии фибронектина или его фрагмента в количестве, достаточном для увеличения чистоты трансдукции клеток под действием вируса. Полученные трансдуцированные кроветворные клетки можно затем ввести, например, внутривенно животному-реципиенту, предпочтительно аутологическому донору, но имеющему также аллогенные трансплантаты, что особенно верно при использовании в качестве трансплантата клеток пуповинной крови, как это описывается ниже.

Способы по настоящему изобретению можно использовать в области маркирования генов или генотерапии для лечения разных заболеваний, в том числе заболеваний костного мозга, включающих, например, разные формы рака и лейкоз, заболеваний, связанных с недостаточностью или дефектами белка, и для модификации кроветворных клеток с целью снижения их резистентности к другим терапевтическим методам, таким как химиотерапия. Типичными заболеваниями, для лечения которых можно использовать это изобретение, являются аденозиндезаминазная недостаточность, например вызванный ею тяжелый комбинированный иммунодефицит, острый миелолейкоз у детей, нейробластома, острый миелолейкоз у взрослых и острый лимфобластный лейкоз.

В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения клетки, используемые для клеточной трансплантации, получают из пуповинной крови человека. Таким образом, пуповинную кровь можно собирать и обогащать жизнеспособными примитивными клетками-предшественниками и/или стволовыми клетками, например, путем получения популяции несвязанных мононуклеарных клеток с низкой плостностью. Такую популяцию затем при желании предварительно стимулируют и инкубируют в присутствии ретровирусного вектора и иммобилизованного и/или очищенного фибронектина или его фрагментов с целью увеличения эффективности трансдукции клеток под действием вектора. В этой связи было установлено, что трансдукция примитивных кроветворных и/или стволовых клеток, полученных из пуповинной крови, значительно увеличивается в присутствии фибронектина или его фрагментов, даже если фибронектин не образует часть комплексной внеклеточной матрицы в пуповинной крови и даже если примитивные клетки-предшественники и стволовые клетки из пуповинной крови имеют характеристики, отличные от показателей костного мозга. В частности, стволовые клетки пуповинной крови характеризовались как CD34⁺, HLA-DR⁺, а стволовые клетки из костного мозга характеризовались как CD34⁺, HLA-DR-. Сделанное авторами изобретения открытие того, что примитивные клетки-предшественники, полученные из пуповинной крови, эффективно трансдуцируются в присутствии фибронектина или его фрагментов, позволяет использовать удобный и значительно обогащенный стволовыми клетками источник кроветворных клеток. Кроме того, данные, свидетельствующие об успешной трансплантации многочисленным больным аллогенных трансплантатов пуповинной крови, обогащенной примитивными клетками-предшественниками и стволовыми клетками, делает пуповинную кровь предпочтительным источником получения кроветворных клеток. См. Кохли-Кумер и др., Brit. Haematol. 85:419-422 (1993); Броксмейер и др., Blood Cell 17:313-329 (1991); Глюкман и др., Br. J. Haematol. 45:557 (1980); Хидельберг; Sptinger - Verlag, стр. 60-68 (1968); Вагнер и др., Blood, 79: 1874-1881 (1992) и Вагнер и др., Blood, 82-86а (реферат).

Собранные трансдуцированные кроветворные или другие клетки можно при желании подвергнуть тестированию с целью определения эффек