Способ определения точечных нуклеотидных замен в днк микобактерий, способ диагностики устойчивости микобактерий к рифампицину, биочип для осуществления этих способов

Способ определения точечных нуклеотидных замен в днк микобактерий, способ диагностики устойчивости микобактерий к рифампицину, биочип для осуществления этих способов

Реферат

 

Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине. Проводят амплификацию фрагмента rроВ гена с получением одноцепочечного флюоресцентно меченного продукта методом ПЦР. Готовят биочип для определения рифампицин-устойчивых микобактерий. Проводят гибридизацию амплифицированного меченного продукта на биочип. Регистрируют результаты гибридизации и интерпретируют их путем сравнения интенсивности флюоресценции сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации. Биочип представляет собой микроматрицу с ячейками, в которых иммобилизован набор олигонуклеотидов. Последовательности последних приведены в описании. Верхний ряд биочипа содержит олигонуклеотиды, комплементарные последовательности ДНК дикого типа. Соответствующий столбец под каждой ячейкой содержит олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям ДНК мутантных типов, ответственных за замену одной аминокислоты. Диагностику устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину проводят путем определения точечных нуклеотидных замен в ДНК возбудителя. Изобретение позволяет проводить анализ непосредственно из клинического образца, определять несколько присутствующих мутаций одновременно, снижать себестоимость анализа и сокращать время его проведения. 3 с. и 8 з. п. ф-лы, 2 табл., 6 ил.

Область техники Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине и рассматривает способ определения чувствительности микобактерий туберкулеза к рифампицину непосредственно в клиническом образце с использованием дифференцирующего биочипа. Изобретение также включает способы создания дифференцирующего олигонуклеотидного биочипа, методику подготовки клинического образца к процедуре гибридизации, регистрации и интерпретации результатов.

Предшествующий уровень техники Для обнаружения точечных мутаций применяются следующие методы: I. Экстенция цепи меченым дидезоксирибонуклеозидтрифосфатом (SNP-single nucleotide polymorphism); Dubiley S. , Kirillov E. and A. Mirzabekov. 1999. Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers. Nucleic Acids Research, Vol.27, No.l8 (el9) Marth GT, Korf I, Yandell MD et al. 1999. A general approach to single-nucleotide polymorphism discovery. Nat Genet., Dec; 23 (4):452-456.

II. Аллель-специфичная ПЦР (Allele specific PCR); De los Monteras L.E.E., J.C.Galan, M.Gutierrez, S.Samper, J.F.G.Marin, C.Martin, L.Doninguez, L. de Rafael, F.Baquero, E.Gomez-Mampaso, and J.Blazquez. 1998. Allele-Specific PCR Method Based on pncA and oxyR Sequences for Distinguishing Mycobacterium bovis from Mycobacterium tuberculosis: Intraspecific M. bovis pncA Sequence Polymorphism. J. Clin. Microbiol. 36:, 239-242.

III. Изучение полиморфизма фрагментов после рестрикции (RFLP-restriction fragment length polymorphism); PCR-RFLP Detection of point Mutations in the Catalase-Peroxidase Gene (katG) of Mycobacterium tuberculosis Associated with Isoniazid Resistance. In: PCR Protocols for Emerging Infectious Diseases (D.H.Persing, Ed.) (1996) ASM Press, Washington, pp. 144-149.

IV. Анализ конформационного полиморфизма одно- и двуцепочечной ДНК (SSCP и DSCP- single- (double)-strand conformation polymorphism); Delgado M.B. and A.Telenti. Detection of Fluoroquinolone Resistance Mutations in Mycobacterium tuberculosis. In: PCR Protocols for Emerging Infectious Diseases (D. H. Persing, Ed. ) (1996) ASM Press, Washington, pp. 138-143.

Pretorius G.S., P.D. van Helden, F.Sirgel, K.D.Eisenach and T.C.Victor. 1995. Mutations in katG Gene Sequences in Isoniazid-Resistant Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis Are Rare. Antimicrob. Agents Chemother., 39, 10, 2276-2281.

V. Гибридизация на микроматрицах (Hybridization on microarray); Gingeras T.R., G.Ghandour, E.Wang, А.Веrnо, P.M.Small, F.Drobniewski, D. Alland, E.Desmond, M.Holodniy, and J.Drenkow. 1998. Simultaneous Genotyping and Species Identification Using Hybridization Pattern Recognition Analysis of Generic Mycobacterium DNA Arrays. Genome Res., 8: 435-448.

Troesch A. , H.Nguyen, C.G.Miyada, S.Desvarenne, T.R.Gingeras, P.M.Kaplan., P.Cross, and C.Mabilat. 1999. Mycobacterium Species Identification and Rifampicin Resistance Testing with High-Density DNA Probe Arrays. J. Clin. Microbiol., 37:,49-55.

VI. Секвенирование (sequencing); Kapur, V., L.-L. Li, S. lordanescu, M. R. Hamrick, A. Wanger, B. N. Kre-iswirth, and J. M. Musser. 1994. Characterization by automated DNA sequencing of mutations in the gene (rpoB) encoding the RNA polymerase b subunit in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains from New York City and Texas. J. Clin. Microbiol. 32:1095-1098.

Rys P. N. and T.A.Felmlee. Detection of Rifampicin Resistance Mutations in Mycobacterium tuberculosis by Dideoxy Fingerprinting. In: PCR Protocols for Emerging Infectious Diseases (D.H.Persing, Ed.) (1996) ASM Press, Washington, pp. 112-121.

VII. Дидезоксифингерпринтинг (ddE-method); Rys P. N. and T.A.Felmlee. Detection of Rifampicin Resistance Mutations in Mycobacterium tuberculosis by Dideoxy Fingerprinting. In: PCR Protocols for Emerging Infectious Diseases (D.H.Persing, Ed.) (1996) ASM Press, Washington, pp. 112-121.

VIII. ПЦР-гетеродуплексный анализ (PCR-heteroduplex analysis); Williams D. L. , C.W.Limbers, L.Spring, S.Jayachandra, and T.P.Gillis. PCR-Heteroduplex Detection of Rifampicin-Resistant Mycobacterium tuberculosis. In: PCR Protocols for Emerging Infectious Diseases (D.H.Persing, Ed.) (1996) ASM Press, Washington, pp. 122-129.

IX. Метод несовершенного дуплекса с РНК (RNA mismatch analysis); Dracopoli, N.C. Ed. "Detection of Mutations by RNase Cleavage". Current Protocols in Human Genetics. 1998. John Wiley & Sons, Inc.

Marth GT, Korf I, Yandell MD et al. 1999. A general approach to single-nucleotide polymorphism discovery. Nat Genet., Dec;23 (4):452-456.

X. Метод структурно-специфичного расщепления (Structure-specific endonuclease cleavage); Brow M.A.D., M.C.Oldenburg, V.Lyamichev, L.M.Heisler, N.Lyamicheva, J.G. Hall, N.J.Eagan, D.M.Olive, L.M.Smith, L.Fors, and J.E.Dahlberg. 1996. Differentiation of Bacterial 16S rRNA Genes and Intergenic Regions and Mycobacterium tuberculosis katG Genes by Structure-Specific Endonuclease Cleavage. J. Clin. Microbiol., 34: 3129-3137.

XI. Метод зондов (Line Probe assay (LiPA)); Cooksey, R. C. , G. P. Morlock, S. Glickman, and J. T. Crawford. 1997. Evaluation of a line probe assay kit for characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from New York City. J. Clin. Microbiol. 35:1281-1283.

De Beenhouwer, H., Z. Lhiang, W. Jannes, L. Nfijs, L. Machtelinckx, R. Rossau, H. Traore, and F. Portaels. 1995. Rapid detection of rifampin resistance in sputum and biopsy specimens from tuberculosis patients by PCR and line probe assay. Tubercle Lung Dis. 76:425-430.

XII. Метод с применением фагов (PhaB assay).

Wilson, S. M. , Z. Al-Suwaidi, R. McNerney, J. Porter, and F. Drobniewski. 1997. Evaluation of a new rapid bacteriophage-based method for the drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. Nat. Med. 3: 465-468.

Методы экстенции цепи и аллель-специфичная ПЦР (I, II) требуют постановки независимых реакций по числу изучаемых мутаций (т.е. более 30 пробирок в случае гена rpoB) и, соответственно, большого количества изучаемого образца; Методы изучения полиморфизма (III, IV), ПЦР-гетеродуплексный анализ (VIII) и метод несовершенного дуплекса с РНК (IX) трудоемки, занимают большое количество времени, дают косвенное заключение о типе мутации и требуют типовых стандартов (на каждую мутацию); кроме того, для метода несовершенного дуплекса предъявляются повышенные требования к отсутствию РНК-азы и он трудоемкий и неприемлем для детекции дуплекса G-U [12, 18]; Гибридизация на микроматрицах (V) требует сложного компьютерного обсчета полученных результатов и дорогостоящих расходных материалов (собственно микроматрица); Прямое секвенирование (VI) требует выделения чистой культуры, отличается высокой себестоимостью и требует секвенирующее устройство; Методы структурно-специфического расщепления (X) и дидезоксифингерпринтинг (VII) требуют предварительной стандартизации (подбора условий), что увеличивает трудоемкость, а также наличия типовых стандартов. Кроме того, дидезоксифингерпринтинг выполняется с радиоактивной меткой.

Метод зондов (XI) отличается высокой себестоимостью и работает на ограниченное количество мутаций [18].

Метод с применением фагов (XII) занимает большое количество времени, т. к. связан с репликацией фагов и последующей регистрацией лизирования на культуре M.smegmatis, и трудоемок.

Данные недостатки устраняются в настоящем изобретении.

Преимущества метода гибридизации на биочипах Метод гибридизации на биочипах выгодно отличается от вышеперечисленных методик возможностью проведения анализа непосредственно из клинического образца (в случае легочной формы туберкулеза), возможностью определения нескольких присутствующих мутаций одновременно, низкой себестоимостью, малым временем получения результата и не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Кроме того, данные, полученные с помощью метода гибридизации, могут быть использованы для целей эпидемиологического генотипирования.

Сущность изобретения Разработан способ ускоренного определения нуклеотидных замен в ДНК микобактерий туберкулеза, приводящих к устойчивости возбудителя к рифампицину. Способ основан на амплификации фрагмента rpoB гена методом двустадийной ПЦР с получением одноцепочечного флюоресцентно меченного продукта и гибридизации амплифицированного меченного продукта на биочипе с последующей регистрацией и интерпретацией результатов гибридизации. Способ предусматривает использование на стадии ассиметричной ПЦР специфической некомплементарной между собой пары праймеров, один из которых является флюоресцентно меченным. Применение указанной пары праймеров позволяет амплифицировать одноцепочечный флюоресцентно меченный фрагмент небольшого размера, который способен проникать в поры геля и вступать в гибридизационное взаимодействие. Размер амплифицированного одноцепочечного флюоресцентно меченного фрагмента при использовании предложенной пары праймеров составляет около 127 п.о. Амплификацию фрагмента гена rpoB проводят, используя непосредственно материал клинического образца, который может включать мокроту, экссудат, смыв или бронхо-альвеолярный лаваж. Стадию гибридизации проводят с использованием биочипа, содержащего набор дифференцирующих олигонуклеотидов, который с высокой специфичностью позволяет детектировать точечные мутации в участке rpoB гена. Порядок расположения олигонуклеотидов обеспечивает возможность визуально оценить наличие мутации и ее точную локализацию. Разработанные условия гибридизации и отмывки обеспечивают высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами и позволяют осуществлять процедуру в условиях ординарной диагностической лаборатории. Регистрацию результатов гибридизации можно проводить как визуально, так и с помощью фотографирующего устройства. Интерпретацию зарегистрированных результатов выполняют путем сравнения интенсивности флюоресценции сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации. Способ может быть применен для эпидемиологического генотипирования.

На основе способа определения нуклеотидных замен в ДНК предложен способ диагностики устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину.

Для осуществления двух указанных способов разработан специальный дифференцирующий биочип, позволяющий определять нуклеотидные замены в ДНК микобактерий туберкулеза, приводящие к устойчивости возбудителя к рифампицину. Биочип представляет собой микроматрицу с ячейками, в которых в соответствии с табл. 1 и 2 иммобилизован набор олигонуклеотидов, позволяющий с высокой специфичностью детектировать точечные мутации в участке rpoB гена. Олигонуклеотиды иммобилизованы таким образом, что верхний ряд биочипа включает олигонуклеотиды, комплементарные последовательности ДНК дикого типа, а соответствующий столбец под каждой ячейкой включает олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям ДНК мутантных типов, ответственных за замену одной аминокислоты. Схема иммобилизации олигонуклеотидов позволяет визуально оценить наличие и локализацию мутации.

Перечень фигур Фиг. 1. Расположение олигонуклеотидов на дифференцирующем биочипе. Цифра, заключенная в квадрат гелевой ячейки, соответствует номеру олигонуклеотида в табл. 2.

Фиг. 2. Схема расположения олигонуклеотидов, детектирующих аминокислотные замены, на биочипе. В верхнем ряду расположены аминокислоты, соответствующие " дикому" (не имеющему мутаций) типу ДНК.

Фиг. 3. Схема расположения олигонуклеотидов, детектирующих точечные нуклеотидные замены, на биочипе, приводящие к замене аминокислотного остатка. Порядковый номер соответствует первому нуклеотиду из триплета. Del-делеция 6 нуклеотидов в позициях 1294-1299.

Фиг. 4. Гибридизационная картина образца ДНК, выделенного из чувствительного к рифампицину штамма микобактерий туберкулеза, зарегистрированная на флюоресцентном микроскопе.

Фиг. 5. Гибридизационная картина образца ДНК, выделенного из резистентого к рифампицину штамма микобактерий туберкулеза, зарегистрированная на флюоресцентном микроскопе.

Фиг. 6. Гибридизационная картина образца ДНК, выделенного из резистентого к рифампицину штамма микобактерий туберкулеза, зарегистрированная на флюоресцентном микроскопе.

Раскрытие сущности изобретения Задача настоящего изобретения - создание ускоренного метода обнаружения точечных нуклеотидных замен в ДНК микобактерий туберкулеза, приводящих к возникновению резистентности возбудителя к рифампицину на биочипах.

В заявленном методе предложено использование: получения одноцепочечного флюоресцентно меченного фрагмента rpoB гена, мутации в котором приводят к возникновению устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину, непосредственно из клинического образца (мокроты - в случае легочной формы туберкулеза); гибридизации полученного фрагмента на олигонуклеотидный биочип; регистрации на фотографирующем устройстве.

Принципиальная схема обнаружения рифампицин-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза на биочипе Клинический образец (в случае легочной формы - мокрота) разжижают с помощью щелочи и N-ацетил-L-цистеин, подвергают кипячению с детергентом для обеспечения доступа к ДНК и деконтаминации (обеззараживания) образца. Специфический фрагмент гена rpoB накапливают с помощью ПЦР, затем получают одноцепочечный и меченый (пригодный для гибридизации) продукт асимметритричной ПЦР, используя флюоресцентно меченный праймер.

Полученный продукт гибридизуют на дифференцирующий биочип, содержащий олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям гена как имеющим мутации, так и не имеющим таковых (дикий тип).

Изучаемые фрагменты ДНК образуют совершенные гибридизационные дуплексы с соответствующими олигонуклеотидами. Со всеми остальными олигонуклеотидами изучаемые фрагменты ДНК дают несовершенный дуплекс. Дифференциацию совершенных и несовершенных дуплексов проводят, сравнивая интенсивности флюоресценции этих дуплексов. Интенсивность сигнала совершенного дуплекса выше, чем у несовершенного. (Сравнивая вышеуказанные значения интенсивностей сигналов, определяют какой дуплекс сформировался: совершенный или несовершенный). Используя схему расположения олигонуклеотидов на биочипе, определяют мутации, присущие изучаемой последовательности ДНК, и делают заключение об устойчивости (или чувствительности) изучаемого объекта к рифампицину.

Осуществление способа изобретения Обработка клинического образца Клинический образец (мокрота, экссудат, смыв, бронхо-альвеолярный лаваж) смешивали в соотношении 1:1 по объему со свежеприготовленным 0,5% раствором N-ацетил-L-цистеина (NALC) в 2% NaOH. Образец тщательно перемешивали на вортексе и выдерживали при комнатной температуре в течение 40 мин. К образцу добавляли фосфатный буфер pH 6,8 в соотношении 1:5 по объему и центрифугировали в течение 30 мин при 3000 об/мин. При использовании спинномозговой жидкости ее центрифугировали в центрифуге Эппендорф течение 10 мин при 10000 об/мин. При анализе крови выделяли лимфоцитарную фракцию по общепринятой методике с использованием фиколла. Дальнейшая обработка образцов проводилась одинаково.

Осадок клеток суспендировали в 1,5 мл ТЕ буфера, pH 8,0, и осаждали при 3000 об/мин в течение 30 мин. Отмывку повторяли еще раз.

К полученному осадку добавляли 30-70 мкл ТЕ буфера, pH 8,0, содержавшего 1% (об/об) Тритон Х-100, и выдерживали в сухом термостате при 95^oC в течение 15 мин.

Образец центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин в центрифуге Эппендорф, и надосадочную жидкость (3 мкл) использовали для проведения ПЦР.

Амплификация фрагмента rpoB гена и получение одноцепочечного меченого продукта методом ПЦР.

В 50 мкл ПЦР-смеси вносят 3 мкл образца, полученного в п.5.

Состав ПЦР-смеси IX ПЦР-буфер: 50мМ KCl, 10мМ Tris-HCl (pH 9.0 at 25^oС), 0.1% Triton X-100 (Promega); 1.5 мМ MgCl₂(Promega) 200 мкМ каждого dNTP (Sigma) 5 пмоль каждого праймера (rpo105 и rpo273) 1.5 ед. термостабильной Taq DNA Polymerase (Promega) Праймеры: Праймеры rpo105 (5'-cgt gga ggc gat cac ace gca gac gtt g) и rpo273 (5'-gac etc cag ccc ggc acg etc acg t), фланкируют фрагмент гена rpoB размером 193 п.о. (позиции 1224 - 1416, Ac. N L27989), они синтезированы с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры и очищены методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

1. Амплификацию проводят на программируемом термостате MiniCycler (MJ Research, USA) со следующим режимом: 95^oC - 30 с, 68^oC - 40 с, 72^oC - 20 с; 33 циклов (в первом цикле время денатурации увеличивали до 5 мин, в последнем время элонгации - до 5 мин).

2. 1 мкл (~ 100 нг) амплифицированного препарата двуцепочечной ДНК переносят в 100 мкл ПЦР-смеси для получения одноцепочечного меченого фрагмента гена rpoB.

Состав ПЦР-смеси IX ПЦР-буфер: 50мМ KCl, 10мМ Tris-HCI (pH 9.0 at 25^oC), 0.1% Triton X-100 (Promega); 1.5 мМ MgCl₂ (Promega) 200 мкМ каждого dNTP (Sigma) 10 пмоль праймера 1272f 1 пмоль праймера 1378r 1.5 ед. термостабильной Taq DNA Polymerase (Promega) Праймеры: Праймер 1272f (5'- cgc cgc gat caa gga gtt ct) содержал на 5'-конце C₆ aminomodifier (Glen Research Corp., VA), к аминогруппе которого был присоединен Texas Red -sulfonyl chloride (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) по протоколу, рекомендуемому фирмой-изготовителем.

Праймер 1378r (5'- tca cgt gac aga ccg ccg gg) синтезирован с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. Оба праймера очищены методом обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Праймеры фланкируют фрагмент гена rpoB размером 127 п.о. (позиции 1272 - 1398 Ac. N L27989) 3. Амплификацию проводят как описано п.6, за исключением: вместо 30 циклов проводят 36; температура отжига вместо 68 - 65^oC. 12 мкл полученного продукта (смеси двуцепочечной, одноцепочечной ДНК и праймеров) используется для гибридизации на биочипе Гибридизация амплифицированного меченого продукта на биочипе 4. 12 мкл образца, полученного в асимметричной ПЦР (~ 1.2 мкг оцДНК), используют для гибридизации на биочипе в буфере следующего состава: 1М GuSCN; 50mM HEPES, pH 7.5; 5mM EDTA, pH 7.0. Гибридизацию выполняют в коммерчески производимой гибридизационной камере, объемом 30 мкл (Sigma) в течение ночи (16-18 часов) при 37^oC. Отмывку проводят трижды в буфере: 6.7х SSPE; 10% Tween 20 при 37^oC.

Регистрация и интерпретация результатов гибридизации 5. Фиксирование гибридизационной картины проводят с помощью фотографирующего устройства. Для исследовательской (не практической) работы измерение флюоресцентного сигнала и фиксирование гибридизационной картины проводят на автоматическом комплексе, состоящем из флюоресцентного микроскопа, 512х512 CCD-камеры (3х3 мм² поле зрения), термоконтроллера и компьютера. Для сканирования и последующей обработки изображений применяют программу WinView (Princetone Instruments, USA), обработку интенсивности флюоресцентного сигнала проводят при помощи программ, использующих LabVIEW интерфейс (National Instruments, Austin, Texas).

6. Интерпретацию результатов проводят следующим образом. Внутри каждого столбца гелевых ячеек визуально (или с использованием программного обеспечения) сравнивают интенсивности флюоресцентных сигналов. Если интенсивность сигнала верхней ячейки больше, чем в ячейках, расположенных ниже ее, то по данному столбцу (аминокислотному остатку) изучаемый образец относят к дикому типу, т.е. не имеющему мутации. Если одна из нижерасположенных ячеек (внутри одного столбца) имеет большую интенсивность, чем самая верхняя ячейка столбца, то изучаемый образец нуклеиновой кислоты имеет точечную мутацию. (Тип и расположение мутации устанавливают путем сравнения со схемой расположения олигонуклеотидов на биочипе). В случае, если по каждому столбцу (аминокислотному остатку) изучаемый образец определен как не имеющий мутаций, изучаемый образец относят к дикому типу, и выдается заключение, что в изученном клиническом образце микобактерий туберкулеза, не чувствительных к рифампицину, не обнаружено. В том случае, если хотя бы по одному столбцу изучаемый образец определен как имеющий точечную нуклеотидную мутацию, изучаемый образец относят к "мутантному типу", и выдается заключение, что в изученном клиническом образце обнаружены микобактерии туберкулеза, чувствительные (резистентные) к рифампицину.

Олигонуклеотидный биочип для выявления рифампицин-устойчивых штаммов микобактерии туберкулеза.

Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе были синтезированы на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA synthesizer (Applied Biosystem) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. 3'- конец олигонуклеоидов содержал CPG спейсер (Glen Research, VA).

Биочип был изготовлен, как описано раннее [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4913-4918] . Микроматрица, содержащая ячейки размером 100х100х20 мкм, приготовлена путем фотополимеризации 5%-го полиакриламидного геля, как описано ранее [там же].

Гель активировали 2% трифторуксусной кислотой при комнатной температуре в течение 10 мин, отмывали водой и высушивали. Далее гель последовательно обрабатывали в Repel-Silane (2% раствор (вес/объем) диметилдихролсилана в 1,1,1-трихлорэтане, LKB- Produkter AB, Bromma, Sweden) - 30 с; дихлорметаном - 10 с; этанолом (95 об.%) - 10 с; промывали водой - 3 мин и высушивали.

1мМ раствор олигонуклеотидов наносился иглой робота дважды в количестве 1 нл (конечная концентрация 2 мкМ). Для стабилизации ковалентных связей между 3'-концевыми аминогруппами олигонуклеотидов и альдегидными группами геля матрицу помещали в 0.1 М раствор пиридин-боранового комплекса (Aldrich Chemical Co. , Inc., Milwaukee, WI) в хлороформе, наслаивали верхнюю водную фазу и выдерживали 12-16 часов при комнатной температуре. Далее биочип дважды промывали этанолом (95 об.%) и водой. Непрореагировавшие альдегидные группировки восстанавливали свежеприготовленным раствором 0.1 M NaBH₄ (Aldrich) в течение 20 минут при комнатной температуре. Биочип промывали водой, высушивали и хранили при комнатной температуре.

Структура биочипа Биочип содержит 31 иммобилизованный олигонуклеотид, список которых представлен в табл. 1 и 2. Верхний ряд биочипа включает олигонуклеотиды, комплементарные последовательности ДНК дикого типа (из рифампицин-чувствительных микобактерий туберкулеза). Под каждой ячейкой, комплементарной ДНК дикого типа, расположены ячейки, иммобилизованные олигонуклеотидами, комплементарными последовательностям ДНК мутантных типов (из рифампицин устойчивых микобактерий туберкулеза). Каждый столбец ячеек содержит набор олигонуклеотидов, ответственных за замену одной аминокислоты (номер которой приведен над верхним рядом ячеек на фиг. 2). Схема расположения олигонуклеотидов на биочипе приведена на фиг. 1. Биочип способен регистрировать 7 аминокислотных замен (см. фиг. 2) или 22 соответствующие им нуклеотидные замены (см. фиг. 3); одну делецию, содержащую 2 аминокислоты (что соответствует 6 нуклеотидам).

Примеры Пример 1 Определение в клиническом образце микобактерий туберкулеза, чувствительных к рифампицину (ДНК дикого типа), методом гибридизации на биочипе На фиг. 4 представлена картина гибридизации образца ДНК, выделенного из чувствительного к рифампицину штамма микобактерий туберкулеза, регистрируемая на флюоресцентном микроскопе.

Внутри каждого столбца ячеек верхняя ячейка имеет большую интенсивность флюоресцентного сигнала, чем расположенные ниже ячейки. Следовательно, ДНК изучаемого объекта образуют совершенные гибридизационные дуплексы с олигонуклеотидами, комплементарными последовательности ДНК дикого типа (чувствительного к рифампицину штамма микобактерий туберкулеза). Из этого следует, что в изученном клиническом образце микобактерий, устойчивых к рифампицину, не обнаружено.

Пример 2 Определение в клиническом образце микобактерий туберкулеза, резистентных к рифампицину (ДНК, имеющая мутацию), методом гибридизации на биочипе На фиг. 5 представлена картина гибридизации образца ДНК, выделенного из резистентного к рифампицину штамма микобактерий туберкулеза, регистрируемая на флюоресцентном микроскопе.

Внутри каждого столбца ячеек верхняя ячейка имеет большую интенсивность флюоресцентного сигнала, чем расположенные ниже ячейки. Исключение составляет образование совершенного дуплекса в ячейке, обозначенной стрелкой. Интенсивность сигнала в данной ячейке превосходит интенсивность, регистрируемую в верхней ячейке данного столбца. Следовательно, ДНК изучаемого объекта имеет точечную нуклеотидную замену А>Т в позиции N 1322, что приводит к замене аминокислоты Asp на Val в позиции N 516 и ведет к возникновению резистентности изучаемого штамма к рифампицину. Выдается заключение, что в изученном клиническом образце обнаружены микобактерии туберкулеза, резистентные к рифампицину. Резистентность обусловлена заменой аминокислоты Asp на Val в позиции N 516.

Пример 3 Определение в клиническом образце микобактерий туберкулеза, резистентных к рифампицину (ДНК, имеющая мутацию), методом гибридизации на биочипе На фиг. 6 представлена картина гибридизации образца ДНК, выделенного из резистентного к рифампицину штамма микобактерий туберкулеза, регистрируемая на флюоресцентном микроскопе.

Внутри каждого столбца ячеек верхняя ячейка имеет большую интенсивность флюоресцентного сигнала, чем расположенные ниже ячейки. Исключение составляет образование совершенного дуплекса в ячейке, обозначенной стрелкой. Интенсивность сигнала в данной ячейке превосходит интенсивность, регистрируемую в верхней ячейке данного столбца. Следовательно, ДНК изучаемого объекта имеет две точечные нуклеотидные замены C > T в позиции N 1351 и A > G в позиции N 1352, что приводит к замене аминокислоты His на Cys в позиции N 526 и ведет к возникновению резистентности изучаемого штамма к рифампицину. Выдается заключение, что в изученном клиническом образце обнаружены микобактерии туберкулеза, резистентные к рифампицину. Резистентность обусловлена заменой аминокислоты His на Cys в позиции N 526.

Приведенные выше примеры являются предпочтительными, предназначены лишь для подтверждения возможности осуществления изобретения и не должны стать основанием для ограничения объема притязаний Заявителя. Специалист в данной области техники без труда найдет возможности иных воплощений изобретения, которые безусловно подпадают под притязания Заявителя, отраженные в формуле изобретения, приводимой ниже.

Представленное изобретение позволяет в короткие сроки определять устойчивые к рифампицину формы микобактерий туберкулеза, в том числе непосредственно используя материал клинического образца. Метод выгодно отличается от существующих в настоящее время аналогов простотой выполнения и низкой себестоимостью. Применение биочипа, содержащего набор дифференцирующих олигонуклеотидов, позволяет также выполнять типирование (маркирование) микобакерий туберкулеза на генотипическом уровне.

Формула изобретения

1. Способ ускоренного определения нуклеотидных замен в ДНК микобактерий туберкулеза, приводящих к устойчивости возбудителя к рифампицину, включающий: (а) - амплификацию фрагмента rpoB гена и получение одноцепочечного флюоресцентно меченного продукта методом ПЦР; (б) - приготовление биочипа для определения рифампицин - устойчивых микобактерий; (в) - гибридизацию амплифицированного меченного продукта на биочипе; (г) - регистрацию и (д) - интерпретацию результатов гибридизации путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (а) используют специфическую некомплементарную между собой пару праймеров, один из которых флюоресцентно меченный, причем применение указанной пары праймеров позволяет амплифицировать одноцепочечный флюоресцентно меченный фрагмент небольшого размера, который способен проникать в поры геля и вступать в гибридизационное взаимодействие.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что размер амплифицированного одноцепочечного флюоресцентно меченного фрагмента составляет около 127 п.о.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что амплификацию фрагмента гена rpoB проводят, используя непосредственно материал клинического образца.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что клинический образец включает мокроту, экссудат, смыв или бронхо-альвеолярный лаваж.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (б) используют биочип, содержащий набор олигонуклеотидов, применение которого позволяет детектировать точечные мутации в участке rpoB гена с высокой специфичностью, а порядок размещения олигонуклеотидов обеспечивает возможность визуально оценить наличие мутации и ее точную локализацию.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии (в) использованы условия гибридизации и отмывка, обеспечивающие высокую степень дифференциации между совершенными и несовершенными гибридизационными дуплексами, позволяющие осуществлять процедуру в условиях ординарной диагностической лаборатории.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что регистрацию результатов на стадии (г) проводят визуально.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что регистрацию результатов на стадии (г) проводят с помощью фотографирующего устройства.

10. Способ диагностики устойчивости микобактерий туберкулеза к рифампицину путем определения нуклеотидных замен в ДНК возбудителя, приводящих к возникновению устойчивости, по п.1.

11. Биочип для определения нуклеотидных замен в ДНК микобактерий туберкулеза, приводящих к устойчивости возбудителя к рифампицину, по п.1, представляющий собой микроматрицу с ячейками, в которых иммобилизован набор олигонуклеотидов с последовательностями, указанных в табл. 1 и 2, для детектирования точечных мутаций в участке rpoB гена, причем верхний ряд биочипа содержит олигонуклеотиды, комплементарные последовательности ДНК дикого типа, а соответствующий столбец под каждой ячейкой содержит олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям ДНК мутантных типов, ответственных за замену одной аминокислоты.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 27.04.2006        БИ: 12/2006

QB4A Регистрация лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью "БИОЧИП-ИМБ"

Договор № РД0060273 зарегистрирован 10.02.2010

Извещение опубликовано: 20.03.2010        БИ: 08/2010

* ИЛ - исключительная лицензия        НИЛ - неисключительная лицензия

QZ4A - Регистрация изменений (дополнений) лицензионного договора на использование изобретения

Лицензиар(ы): Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Вид лицензии*: НИЛ

Лицензиат(ы): Общество с ограниченной ответственностью "БИОЧИП-ИМБ"

Характер внесенных изменений (дополнений):Срок действия продлен до 31.12.2010

Дата и номер государственной регистрации договора, в который внесены изменения: 10.02.2010 № РД0060273

Извещение опубликовано: 20.05.2010        БИ: 14/2010

* ИЛ - исключительная лицензия НИЛ - неисключительная лицензия