Полинуклеотидные композиции

Полинуклеотидные композиции

Реферат

 

Изобретение представляет композиции для стабилизации полинуклеиновых кислот и увеличения способности полинуклеиновых кислот проникать через мембраны клеток и действовать внутри клетки. Описывается новая полинуклеотидная композиция, содержащая: (а) ковалентно модифицированные полинуклеотид или молекулу нуклеиновой кислоты и (b) сополимер полимерных сегментов, где указанные сегменты включают (i) по меньшей мере один полиэфирный сегмент, который представляет собой: (а) гомополимер этиленокси мономера -ОСН₂СН₂ - или (b) сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -ОСН(СН₃)СН_2-, причем каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит примерно от 5 до 400 мономерных звеньев и (ii) по меньшей мере один поликатионный сегмент, который представляет собой катионный гомополимер, сополимер или блок-сополимер, который является продуктом реакции по меньшей мере трех аминосодержащих мономеров или их четвертичных солей, причем указанные аминосодержащие мономеры содержат: (а) одинаковые или различные звенья формулы -NH-R⁰-, в которых R⁰ представляет алкилен с прямой цепью, содержащий от 2 до 6 атомов углерода; (b) катионную аминокислоту; (с) (-OPO(NH-R⁹-NH₂)O-R⁸-), в которой R⁹ представляет собой алифатическую группу с прямой цепью, содержащую от 1 до 12 атомов углерода и R⁸ представляет собой -(CH₂)_n-CH(R¹³)-, где n представляет собой целое число от 0 до 5, a R¹³ представляет собой водород, циклоалкил, содержащий 3-8 атомов углерода или алкил, содержащий 1-6 атомов углерода; или (d) 4-винилпиридин. 4 с. и 11 з.п. ф-лы, 14 табл.

Данная заявка является частичным продолжением заявки на патент США N 08/342209, поданной 18 ноября 1994 г. , озаглавленной "Полинуклеотидные композиции" и приведенной здесь в качестве ссылки.

Настоящее изобретение относится к композициям полимеров полинуклеиновой кислоты, таких как полимеры РНК и ДНК, и поликатионов, которые являются ассоциированными либо ковалентно, либо нековалентно с блок-сополимерами алкилэфиров. В предпочтительном варианте полинуклеиновые кислоты образуют комплекс с поликатионом. Полинуклеиновая кислота стабилизируется комплексом и в комплексе имеет повышенную способность проникать через клеточные мембраны. Соответственно, комплексы хорошо подходят для использования в качестве переносчиков для введения нуклеиновой кислоты в клетки.

Использование "антисмысловой" полинуклеиновой кислоты для лечения генетических нарушений, мутаций клеток (включая вызывающие рак или увеличивающие мутацию) и вирусных инфекций получило широкое распространение. Предполагается, что механизм этого лечения действует в одном аспекте путем связывания "смысловых" нитей мРНК, кодируя протеин, который, как считается, обуславливает болезненное состояние, которое предназначается для лечения, в результате останавливая или ингибируя трансляцию мРНК в нежелательный протеин. В другом аспекте геномная ДНК предназначается для связывания антисмыслового полинуклеотида (образующего тройную спираль), например, с ингибированием транскрипции. Смотри Helene, Anti-Cancer Drug Design, 6:569 (1991). Если последовательность мРНК, предназначенной для соединения, является известной, может быть сконструирована антисмысловая молекула, которая связывает смысловую нить по правилам спаривания с основой Уотсона-Крика, образуя двойную структуру, аналогичную двойной спирали ДНК. Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA. Erikson and Ixzant eds., Raven Press, New York, 1991; Helene, Anti-Cancer Drug Design, 6:569 (1991); Crooke Anti-Cancer Drug Design, 6:609 (1991). Серьезным препятствием для полного использования этой технологии является проблема эффективного введения в клетки достаточного числа антисмысловых молекул для эффективного затруднения трансляции целевых мРНК или функции ДНК.

Одним способом, который используется для решения этой проблемы, является ковалентная модификация 5'-конца или 3'-конца антисмысловой молекулы полинуклеиновой кислоты гидрофобными заместителями. Эти модифицированные нуклеиновые кислоты обычно приобретают доступ к внутренней части клетки с большей эффективностью. Смотри, например, Kabanov et al. , FEBS Lett., 259:327 (1990); Boutorin et al. FEBS Lett., 23:1382-1390, 1989; Shea et al., Nucleic Acids Res. , 18:3777-3783, 1990. К тому же, фосфатная основа антисмысловых молекул модифицируется с удалением отрицательного заряда (смотри, например, Agris et al., Biochemistry, 25:6268 (1986); Cazenave and Helene in Antisense Nucleic Acids and Proteins: Fundamentals and Applications, Mol and Van der Krol, eds. , p. 47 et seq., Marcel Dekker, New York, 1991); или модифицируются пуриновые или пиримидиновые основы (смотри, например, Antisense Nucleic Acids and Proteins: Fundamentals and Applications, Mol and Van der Krol, eds., p. 47 et seq., Marcel Dekker, New York, 1991; Milligan et al., in Gene Therapy For Neoplastic Diseases, Huber and Laso, eds., p. 228 et seq., New York Academy of Sciences, New York, 1994). Другие попытки преодолеть барьер клеточной проницаемости включают введение антисмысловой последовательности полинуклеиновой кислоты в экспрессирующий вектор, который может быть введен в клетку в низком числе копий, но который, будучи в клетке, может направить клеточный механизм на синтез более значительных количеств антисмысловых полинуклеиновых молекул. Смотри, например, Farhood et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. , 716:23 (1994). Эта стратегия включает использование рекомбинатных вирусов, которые имеют участок экспрессии, в который вводится антисмысловая последовательность. Смотри, например, Boris-Lawrie and Temin, Ann. N.Y. Acad. Sci., 716:59 (1994).

Другие авторы пытались увеличить мембранную проницаемость путем нейтрализации отрицательных зарядов на антисмысловых молекулах или других молекулах нуклеиновых кислот поликатионами. Смотри, например, Kabanov et al., Soviet Scientific Reviews, Vol. 11, Part 2, 1992; Kabanov et al., Bioconjugate Chemistry 4: 448 (1993); Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Behr et al., Proc. Natl. Acad Sci U.S.A. 86:6982-6986, 1989.

Конечно, антисмысловые молекулы полинуклеиновых кислот не являются единственным типом молекул полинуклеиновых кислот, которые могут успешно сделать более проницаемыми клеточные мембраны. Для того, чтобы получить рекомбинантные протеиновые экспрессирующие системы, направляющая экспрессию нуклеиновая кислота должна быть перенесена через мембрану в эукариотную или прокариотную клетку, которая даст требуемый протеин. Для генной терапии медицинские работники пытаются вводить в один или более типов клеток организма ДНК-вектор, способный к направленному синтезу недостающего протеина, или использовать клетку или организм при экспрессии в больших количествах. Методы введения ДНК, заставляющие клетку давать новый протеин, рибозиму или большее количество протеина или рибозимы, называются методами "трансфекции". Смотри, в основном, Neoplastic Diseases, Huber and Lazo, eds., New York Academy of Sciences, New York, 1994; Feigner, adv. Drug Deliv. Rev., 5:163 (1990); McLachlin, et al., Progr. Nucl. Acids Res. Mol. Biol., 38:91 (1990); Karlsson, S. Blood, 78:2481 (1991); Einerhand and Valerio, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 177:217-235 (1992); Makdisi et al., Prog.Liver Dis., 10:1 (1992); Litzinger and Huang, Biochim. Biophys. Acta, 1113:201 (1992); Morsy et al., J.A.M.A., 270:2338 (1993); Dorudi et al., British J. Surgery, 80:566 (1993).

Ряд рассмотренных методов увеличения проницаемости клетки по отношению к антисмысловой полинуклеиновой кислоте является общепринятыми методами введения целого ряда полинуклеиновых кислот в клетки. Другие основные методы включают осаждение фосфатом кальция полинуклеиновой кислоты и инкубацию целевых клеток (Gracham and Van der Eb, Virology, 52:456,1983), соинкубацию полинуклеиновой кислоты, DEAE-декстрана и клеток (Sompayrac and Danna, Proc. Natl. Acad. Sci. , 12: 7575, 1981), электропорообразование клеток в присутствии полинуклеиновой кислоты (Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 7161, 1984), введение нуклеиновой кислоты в вирусные оболочки с созданием переносчиков трансфекации (Gitman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 7309-7313, 1985) и инкубацию клеток полинуклеиновой кислотой, введенной в липосомы (Wang and Huang, Proc. Natl. Acad. Sci., 84:7851-7855, 1987).

Другой проблемой в доставке полинуклеиновой кислоты в клетку является чрезвычайная чувствительность полинуклеиновых кислот, особенно рибонуклеиновых кислот, к нуклеазной активности. Эта проблема особенно подходит к попыткам использовать рибонуклеиновые кислоты в качестве антисмысловых олигонуклеотидов. Следовательно, требуются способы защиты полинуклеиновой кислоты от нуклеазной активности.

Краткое описание изобретения Изобретение описывается ниже относительно фрагментарных констант, выведенных Хэншем и Лео. Смотри Hansch and Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, Wiley, New York, pp. 320-325. Эти константы были выведены для использования в оценке вклада части молекулы в тенденцию молекулы к разделению между фазами, образованными октанол-водными смесями. Эти константы обычно называются фрагментарными константами разделения Хэнша-Лео (далее "фрагментарные константы Хэнша-Лео").

Изобретение в первом варианте относится к полинуклеотидной композиции, содержащей: (a) ковалентно модифицированные полинуклеотид или молекулу нуклеиновой кислоты; и (b) сополимер полимерных сегментов, где указанные сегменты включают (i) по меньшей мере один полиэфирный сегмент, который представляет собой: (a) гомополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂- или (b) сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -OCH(CH₃)CH₂-, причем каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит от примерно 5 до примерно 400 мономерных звеньев и (ii) по меньшей мере один поликатионный сегмент, который представляет собой катионный гомополимер, сополимер или блок-сополимер, который является продуктом реакции по меньшей мере трех аминосодержащих мономеров или их четвертичных солей, причем указанные аминосодержащие мономеры содержат: (a) одинаковые или различные звенья формулы -NH-R⁰-, в которых R⁰ представляет алкилен с прямой цепью, содержащий от 2 до 6 атомов углерода; (b) катионную аминокислоту; (c) (-OPO(NH-R⁹-NH₂)O-R⁸- ), в которой R⁹ представляет собой алифатическую группу с прямой цепью, содержащую от 1 до 12 атомов углерода, и R⁸ представляет собой -(CH₂)_n-CH(R¹³)-, где n представляет собой целое число от 0 до 5, а R¹³ представляет собой водород, циклоалкил, содержащий 3-8 атомов углерода, или алкил, содержащий 1-6 атомов углерода; или (d) 4-винилпиридин.

В предпочтительном варианте сополимер полимерных сегментов имеет формулу: A-R, A-R-A' или R-A-R', где каждый из A и A' представляет собой гомополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂- или сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -OCH(CH₃)CH₂-, а каждый из R и R' представляет собой поликатионный сегмент, как определено выше.

В другом предпочтительном варианте R и R' при физиологическом значении pH включают по меньшей мере шесть катионных групп. Еще в одном предпочтительном варианте R и R' при физиологическом значении pH содержат множество катионных групп, разделенных расстоянием от примерно 3 A до примерно 12 A.

В другом предпочтительном варианте в полинуклеотидной композиции каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит от примерно 5 до примерно 80 мономерных звеньев, а указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер, сополимер или блок-сополимер, который содержит от примерно 2 до примерно 180 одинаковых или различных звеньев формулы -NH-R⁰-, в которых R⁰ такой, как определено выше.

В более предпочтительном варианте указанный полиэфирный сегмент представляет собой гомополимер -OCH₂CH₂- и указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер -NHCH₂CH₂CH₂- или является сополимером -NHCH₂CH₂CH₂- и NHCH₂CH₂CH₂CH₂- В еще более предпочтительном варианте указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер - NHCH₂CH₂CH₂- Настоящее изобретение также относится к сополимеру связанных полимерных сегментов, где указанные сегменты содержат: (i) по меньшей мере один полиэфирный сегмент, который представляет собой: (а) гомополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂- или (b) сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -OCH(CH₃)CH₂-, причем каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит от примерно 5 до примерно 400 мономерных звеньев и (ii) по меньшей мере один поликатионный сегмент, который представляет собой гомополимер, сополимер или блок-сополимер, включающий по меньшей мере три аминосодержащих мономера или их четвертичные соли, которые представляют собой одинаковые или различные звенья формулы -NH-R⁰-, в которых R⁰ представляет алифатическую группу с прямой цепью, содержащую от 2 до 6 атомов углерода, которые могут быть замещены. В предпочтительном варианте сополимер имеет формулу: A-R, A-R-A' или R-A-R', где каждый из A и A' представляет собой гомополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂- или сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -OCH(CH₃)CH₂-, а каждый из R и R' представляет собой поликатионный сегмент, как определено выше. В предпочтительном варианте в сополимере каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит от примерно 5 до примерно 80 мономерных звеньев, а указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер, сополимер или блок-сополимер, который содержит от примерно 2 до примерно 180 мономерных звеньев.

В другом предпочтительном варианте в сополимере указанный полиэфирный сегмент представляет собой гомополимер -OCH₂CH₂- и указанный поликатионный сегмент представляет собой гомополимер -NHCH₂CH₂CH₂- или является сополимером -NHCH₂CH₂CH₂- и NHCH₂CH₂CH₂CH₂-. В еще более предпочтительном варианте поликатионный сегмент представляет собой гомополимер -NHCH₂CH₂CH₂-. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидной композиции, содержащей: (а) полинуклеотид, молекулу нуклеиновой кислоты или их производное и (b) до примерно 15% (масса/объем) полиэфирного блок-сополимера, содержащего полимерные сегменты, где указанные сегменты содержат по меньшей мере один полиэфирный сегмент, который представляет собой: (i) гомополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂- или (ii) сополимер или блок-сополимер указанного этиленокси мономера и мономера -OCH(CH₃)CH₂-, причем каждый из указанных полиэфирных сегментов содержит от примерно 5 до примерно 400 мономерных звеньев; и где указанный блок-сополимер присутствует в количествах, недостаточных для образования геля.

В предпочтительном варианте заявленная полинуклеотидная композиция дополнительно включает полимер, содержащий катионные повторяющиеся единицы.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидной композиции, содержащей: полинуклеотид или полинуклеотидное производное, ковалентно связанные с полиэфирным блок-сополимером, содержащим полимерные сегменты, где указанные сегменты содержат: (а) по меньшей мере один сополимерный сегмент, который представляет собой сополимер или блок-сополимер этиленокси мономера -OCH₂CH₂-; и (b) по меньшей мере один сополимерный сегмент, который представляет собой сополимер или блок-сополимер пропиленокси мономера -OCH(CH₃)CH₂- или -OCH₂CH(CH₃)- и каждый из указанных сополимерных сегментов, содержащих от примерно 5 до примерно 400 мономерных звеньев.

Подробное описание изобретения.

Одновременно поданной с основной данной заявкой была заявка, озаглавленная "Связанные полимером биологические агенты", серийный номер 08/342079, зарегистрированная 18 ноября 1994 г на имя Александра Викторовича Кабанова и Валерия Юльевича Алахова в качестве авторов. Одновременно поданной с этой заявкой является Выписка N 313257-101A, которая является частичным продолжением заявки на патент N 08/342089. Полное раскрытие заявки N 08/342079 и ее частичного продолжения - Выписки N 313257-101A приводится здесь в качестве ссылки.

Степень полимеризации гидрофильных блоков (A-типа) или гидрофобных блоков (B-типа) общих формул (I)-(XIII) предпочтительно составляет от примерно 5 до примерно 400. Более предпочтительно степень полимеризации составляет примерно 5-200, еще более предпочтительно примерно 5-80. Степень полимеризации поликатионных блоков R-типа составляет от примерно 2 до примерно 300. Более предпочтительно степень полимеризации составляет примерно 5-180, еще более предпочтительно примерно 5-60. Степень полимеризации поликатионного полимера составляет, предпочтительно от примерно 10 до примерно 10000. Более предпочтительно степень полимеризации составляет примерно 10-1000, еще более предпочтительно примерно 10-100.

Повторяющиеся единицы, которые составляют блоки, для блоков A-типа, B-типа и R-типа обычно имеют молекулярную массу примерно 30-500, предпочтительно примерно 30-100, еще более предпочтительно примерно 30-60. Обычно в каждом из блоков A-типа или B-типа по крайней мере около 80% связей между повторяющимися единицами является простыми эфирными связями, предпочтительно по крайней мере около 90% является простыми эфирными связями, более предпочтительно по крайней мере около 95% является простыми эфирными связями. Эфирные связи для целей данной заявки охватывают гликозидные связи (например, связи сахаров). Однако в одном аспекте простые эфирные связи являются предпочтительными.

Предпочтительно, все повторяющиеся единицы, которые составляют блоки A-типа, имеют фрагментарную константу Хэнша-Лео менее примерно -0,4, более предпочтительно менее -0,5, еще более предпочтительно менее примерно -0,7. Предпочтительно все повторяющиеся единицы, которые составляют блоки B-типа, имеют фрагментарную константу Хэнша-Лео менее примерно -0,30, или более, более предпочтительно около -0,20 или более.

Полинуклеотидный компонент pN общих формул (IX-XIII) предпочтительно содержит от примерно 5 до примерно 1000000 оснований, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 100000 оснований, еще более предпочтительно от примерно 10 до примерно 10000 оснований.

Поликатионные полимеры и блоки R-типа имеют несколько положительно ионизирующихся групп и чистый положительный заряд при физиологическом pH. Полиэфир/поликатионные полимеры общих формул (V)-(VIII) также могут служить в качестве поликатионных полимеров. Предпочтительно поликатионные полимеры и блоки R-типа имеют не менее примерно 3 положительных заряда при физиологическом pH, более предпочтительно не менее примерно 6, еще более предпочтительно не менее примерно 12. Также предпочтительными являются полимеры или блоки, которые при физиологическом pH могут иметь положительные заряды с интервалом между зарядами от примерно до примерно Интервалы, устанавливаемые аминопропиленовыми повторяющимися единицами или смесями аминопропиленовых и аминобутиленовых повторяющихся единиц, являются наиболее предпочтительными. Следовательно, например, поликатионные сегменты, которые используют повторяющуюся единицу (NHCH₂CH₂CH₂) или смесь повторяющихся единиц (NHCH₂CH₂CH₂) и (NHCH₂CH₂CH₂CH₂), являются предпочтительными.

Полиэфир/поликатионные полимеры общих формул (V)-(VIII), содержащие повторяющуюся единицу -NH-R₀-, также являются предпочтительными. R₀ - предпочтительно этилен, пропилен, бутилен или пентилен, который может быть модифицирован. В предпочтительном варианте по крайней мере в одной из повторяющихся единиц R₀ включает ДНК-интеркалирующую группу, такую как этидиумбромидная группа. Такие интеркалирующие группы могут увеличивать сродство полимера для нуклеиновой кислоты. Предпочтительные замещения на R₀ включают алкил с 1-6 углеродами; гидрокси; гидроксиалкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; алкокси, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкилкарбонильную группу, имеющую 2-7 углеродных атомов; алкоксикарбонил, в котором алкокси имеет 1-6 углеродных атомов; алкоксикарбонилалкил, в котором алкокси и алкил каждый независимо имеет 1-6 углеродных атомов; алкилкарбоксиалкил, в котором каждая алкильная группа имеет 1-6 углеродных атомов; аминоалкил, в котором алкильная группа имеет 1-6 углеродных атомов; алкиламино или диалкиламино, где каждая алкильная группа независимо имеет 1-6 углеродных атомов; моно- или диалкиламиноалкил, в котором каждый алкил независимо имеет 1-6 углеродных атомов; хлоро; хлоралкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; фторо; фторалкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; циано или цианоалкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; или карбоксильную группу. Более предпочтительно R₀ является пропиленом или бутиленом.

Полимеры согласно первому варианту изобретения являются, например, блок-сополимерами, имеющими общие формулы (XIV)-(XVII): или или или в которых x, y, z, i и j имеют значения от примерно 5 до примерно 400, предпочтительно от примерно 5 до примерно 200, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 80, и в которых в каждой паре R₁ и R₂ один является водородом, а другой - метильной группой.

Формулы (XIV) - (XVI) являются сверхупрощенными в том, что на практике ориентация изопропиленовых радикалов в блоке B является беспорядочной. Эта беспорядочная ориентация указывается в формуле (XVII), которая является более сложной. Такие полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые соединения описаны в работах by Santon. Am. Perfumer Cosmet. 72/4/:54-58 (1958); Schmolka. Loc. cit 82/7/:25-30 (1967); Non-ionic Surfactants. Schick. ed. (Dekker, NY, N 4, 1967) p. p. 300-371. Целый ряд таких соединений является коммерчески доступным под такими родовыми названиями, как "полоксамеры", "плуроники" и "синпероники". Плуроникевые полимеры общей формулы B-A-B часто называются "реверсивными" плурониками, "плуроником R'' или "мероксаполом". "Полиоксаминный" полимер общей формулы XVII поставляется фирмой БиЭйЭсЭф (Уайяндот, Мичиган) под торговой маркой Тетроник. Порядок полиоксиэтиленовых и полиоксипропиленовых блоков, представленных в общей формуле (XVII), может быть реверсивным, создавая Тетроник R, также поставляемый фирмой БиЭйЭсЭф. Смотри Schmolka, J. Am. Oil. Soc., 59:110 (1979). Полиоксипропилен-полиоксиэтиленовые блок-сополимеры могут также быть разработаны с гидрофильными блоками, содержащими статистическую смесь этиленоксидных и пропиленоксидных повторяющихся единиц. Для сохранения гидрофильного характера блока этиленоксид является численно преобладающим. Аналогично гидрофобный блок может быть смесью этиленоксидных и пропиленоксидных повторяющихся единиц. Такие блок-сополимеры поставляются фирмой БиЭйЭсЭф под торговой маркой "Плюрадот".

Диаминосвязанный плуроник общей формулы (XVII) также может быть членом семейства диаминосвязанных полиоксиэтилен-полиоксипропиленовых полимеров общей формулы (XVIIa): в которой пунктирные линии представляют симметричные копии полиэфира, отходящие от второго азота, R^* - алкилен с 2-6 углеродами, циклоалкилен с 5-8 углеродами или фенилен; для R₁ и R₂ - либо (а) оба являются водородом, либо (в) один является водородом, а другой - метил; для R₃ и R₄ - либо (а) оба являются водородом, либо (в) один - водород, а другой - метил; если оба R₃ и R₄ являются водородом, тогда один из R₅ и R₆ - водород, а другой - метил, а если один из R₃ и R₄ является метилом, тогда оба R₅ и R₆ являются водородом.

В свете рассмотренного специалисты разберутся, что, даже когда осуществление изобретения включает, например, полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые соединения, вышеприведенные общие формулы являются также включенными. Важной характеристикой является то, что средняя фрагментарная константа Хэнша-Лео мономеров в блоке A-типа составляет -0,4 или менее. Таким образом, не требуется, чтобы единицы, составляющие первый блок, состояли исключительно из этиленоксида. Аналогично, не требуется, чтобы весь блок B-типа состоял исключительно из пропиленоксидных единиц. Вместо этого блоки могут включать мономеры, отличные от мономеров, определенных в общих формулах (XIV) - (XVII), пока сохраняются параметры первого варианта. Таким образом, в простейшем из примеров по крайней мере один из мономеров в блоке A может быть замещен группой боковой цепи, как описано ранее.

В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидному комплексу, содержащему блок-сополимер по крайней мере одной из общих формул (I) - (XIII), в котором блоки A-типа и B -типа по существу выполнены из повторяющихся единиц общей формулы -O-R₅, где R₅ является: (1) -(CH₂)_n-CH(R₆)-, где n - целое число от 0 до примерно 5, а R₆ - водород; циклоалкил, имеющий 3-8 углеродных атомов; алкил, имеющий 1-6 углеродных атомов; фенил; алкилфенил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; гидрокси; гидроксиалкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; алкокси, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкилкарбонильная группа, имеющая 2-7 углеродных атомов; алкилоксикарбонил, в котором алкокси имеет 1-6 углеродных атомов; алкоксикарбонилалкил, в котором алкокси и алкил каждый независимо имеет 1-6 углеродных атомов; алкилкарбонилалкил, в котором каждая алкильная группа имеет 1-6 углеродных атомов; аминоалкил, в котором алкильная группа имеет 1-6 углеродных атомов; алкиламин или диалкиламино, где каждый алкил независимо имеет 1-6 углеродных атомов; моно- или диалкиламиноалкил, в котором каждый алкил независимо имеет 1-6 углеродных атомов; хлоро; хлоралкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; фторо; фторалкил, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов; циано или алкилциано, в котором алкил имеет 1-6 углеродных атомов, или карбоксил; (2) карбоциклической группой, имеющей 3-8 углеродных атомов в кольце, где группа может быть, например, циклоалкильной или ароматическими группами, и которая может включать алкил, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкокси, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкиламино, имеющий 1-6 углеродных атомов; диалкиламино, в котором каждый алкил независимо имеет 1-6 углеродных атомов; амино; сульфонил; гидрокси; карбокси; фтор или хлорзамещения; или (3) гетероциклической группой, имеющей 3-8 атомов в кольце, которая может включать гетероциклоалкильные или гетероароматические группы, которые могут включать от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из кислорода, азота, серы и их смесей, и которые могут включать алкил, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкокси, имеющий 1-6 углеродных атомов; алкиламино, имеющий 1-6 углеродных атомов; диалкиламино, в котором каждый алкил независимо имеет 1-6 углеродных атомов; амино; сульфонил; гидрокси; карбокси; фторо- или хлорзамещения.

Предпочтительно, n - целое число от 1 до 3. Карбоциклические или гетероциклические группы, содержащие R₅, предпочтительно имеют 4-7 атомов в кольце, более предпочтительно 5-6. Гетероциклы, предпочтительно включают 1-2 гетероатома, более предпочтительно гетероциклы имеют один гетероатом. Предпочтительно гетероциклом является углевод или углеводный аналог. Специалисты поймут, что мономеры, требующиеся для получения этих полимеров, могут быть синтезированы. В некоторых случаях полимеризация мономеров требует использования защитных групп, как будет понятно специалистам. Обычно блоками A-типа и B-типа являются блоки, содержащие по крайней мере примерно 80% повторяющихся единиц -OR₅-, более предпочтительно не менее примерно 90%, еще более предпочтительно не менее примерно 95%.

В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидному комплексу, содержащему блок-сополимер, одной из общих формул (I) - (XIII), в котором блоки A-типа и B-типа в основном состоят из повторяющихся единиц общей формулы -O-R₇-, где R₇ - C_1-6-алкильная группа.

Оценка Хэнша-Лео коэффициента октанол-водного разделения (P) для органической молекулы рассчитывается по следующей формуле: lgP = a_nf_n+b_mF_m, где значения f_n являются фрагментарными константами для различных групп молекул, значения a_n являются числом любого типа группы в молекуле, значения F_m являются коэффициентами некоторых молекулярных характеристик, таких как простые связи или двойные связи, а значения b_m являются числом любых таких молекулярных характеристик. Например, фрагментарная константа Хэнша-Лео для этиленоксидной повторяющейся единицы (-CH₂CH₂O-) будет равняться: 2f_C + 4f_H + f_O (4-1)F_в = 2(0,20) + 4(0,23) + (-1,82) + 3(-0,12) = -0,86.

Фрагментарная константа Хэнша-Лео для пропиленоксидной повторяющейся единицы (-CH₂CHCH₃)O-) будет равняться: 2f_C + + 3f_H + f_O + (4-1)F_в = 2(0,2) + 0,89 + 3(0,23) + (-1,82) + 3(-0,12) = -0,2.

Специалистам будет понятно, что приближение Хэнша-Лео для оценки констант разделения, в котором применяются приближенные фрагментарные константы Хэнша-Лео, не дает точные эмпирические константы разделения. Смотри Hansch and Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, Wiley, New York, 1979, James, Solubility and Related Properlies, Marsel Dekker, New York, 1986, p.p. 320-325. Однако приближение является достаточно точным для определения характеристик гидрофобности полимерного подающего переносчика.

Широкий ряд молекул полинуклеиновых кислот может быть полинуклеиновокислотным компонентом композиции. Они включают молекулы синтетических ДНК и РНК и молекулы нуклеиновой кислоты, которые ковалентно модифицируются (с введением групп, включающих липофильные группы, фотоиндуцируемые сшивающие группы, алкилирующие группы, металлорганические группы, интеркалирующие группы и группы, которые модифицируют фосфатную основу). Такими молекулами нуклеиновой кислоты могут быть, среди других, антисмысловые молекулы нуклеиновой кислоты, генкодирующая ДНК (обычно включающая соответствующую промоторную последовательность), олигонуклеотидные -аномеры рибозим, этилфосфотрисложноэфирные аналоги, алкилфосфоматы, фосфоротионатные и фосфородитионатные олигонуклеотиды и т.п. В действительности нуклеиновокислотным компонентом может быть любая нуклеиновая кислота, которая может быть успешно перенесена в клетку с большей эффективностью или стабилизирована от процессов разрушения, или может быть улучшено ее биораспределение после введения животному.

Примеры используемых полимеров, соответствующих общим формулам (V) - (VIII), включают двухблочный сополимер полиоксиэтилен-поли-L-лизина следующей общей формулы (XVIII): в которой i - целое число от примерно 5 до примерно 100, a j - целое число от примерно 4 до примерно 100.

Вторым примером является двухблочный сополимер полиоксиэтилен-поли(L-аланин-L-лизин)'a общей формулы (XIX): в которой i - целое число от примерно 5 до примерно 100, a j - целое число от примерно 4 до примерно 100.

Третьим примером является двухблочный сополимер полиоксиэтилен- поли(пропиленимин/бутиленимин)'a следующей общей формулы (XX): в которой i - целое число от примерно 5 до примерно 200, а j - целое число от примерно 1 до примерно 10.

Четвертым примером является полиоксиэтилен-поли(N-этил-4- винилпиридинбромид) или ("pOE-pEVP-Br'') общей формулы (XXI): в которой i - целое число от примерно 5 до примерно 100, а j - целое число от примерно 10 до примерно 500.

Еще одним примером является полимер общей формулы (XXII): CH₃O-(CH₂CH₂O)_iCO[NH(CH₂)₃) NH(CH₂)₄]_j-(NH(CH₂)₃)₂-NHCO-O- -(CH₂CH₂O)_k-CH₃ (XXII), в которой i - целое число от примерно 10 до примерно 200, j - целое число от примерно 1 до примерно 8 и k - целое число от примерно 10 до примерно 200.

Еще одним примером является полимер общей формулы (XXIII): H-G_j-(NH(CH₂)₃)₂-NH-CO-O- (CH₂CH₂O)_iCO-G_m-(NH(CH₂)₃)₂- NH₂ (XXIII) в которой "G" содержит -(NH(CH₂)₃)₃-CH₂-, i и j - такие, как определено для формулы (XVIII), а m - целое число от примерно 1 до примерно 8.

Используемые в изобретении блок-сополимеры обычно в некоторых условиях образуют мицеллы диаметром от примерно 10 нм до примерно 100 нм. Мицеллы являются надмолекулярными комплексами некоторых амфифильных молекул, которые образуются в водных растворах благодаря микрофазному отделению неполярных частей от амфифилий. Мицеллы образуются, когда концентрация амфифилии достигает для данной температуры критической мицеллярной концентрации (КМК), которая является характеристикой амфифилии. Такие мицеллы обычно включают от примерно 10 до примерно 300 блок-сополимеров. При различии размеров гидрофильной и гидрофобной частей блок-сополимеров тенденция сополимеров к образованию мицелл при физиологических условиях может быть различной. Мицеллы имеют поступательную и вращательную свободу в растворе, и растворы, содержащие мицеллы, имеют низкую вязкость, подобную воде. Мицеллообразование обычно имеет место при концентрациях сополимера от примерно 0,001 до 5% (м/о). Обычно концентрация поликатионных полимеров и полинуклеиновой кислоты является меньше концентрации сополимеров в полинуклеотидных композициях, предпочтительно не менее чем в 10 раз меньше, более предпочтительно по крайней мере примерно в 50 раз.

При высоких концентрациях некоторые блок-сополимеры, используемые в изобретении, образуют гели. Эти гели являются вязкими системами, в которых поступательная и вращательная свобода молекул сополимера значительно ограничена непрерывной сетью взаимодействий между молекулами сополимера. В гелях может иметь место или отсутствовать микросегрегация повторяющихся единиц блока В. Для того, чтобы избежать образования гелей, концентрация полимеров (как для блок-сополимеров, так и для полиэфир/поликатионных полимеров), предпочтительно составляет менее примерно 15% (м/о), более предпочтительно менее примерно 10%, еще более предпочтительно менее примерно 5%. В первом варианте изобретения более предпочтительно избегать гелей.

Когда полинуклеотидная композиция включает катионные компоненты, катионы ассоциируются с фосфатными группами полинуклеотида, нейтрализуя заряд на фосфатных группах и делая полинуклеотидный компонент более гидрофобным. Нейтрализация предпочтительно питается катионами на полимерных сегментах R-типа или на поликатионных полимерах. Однако фосфатный заряд может быть также нейтрализован химической модификацией или ассоциацией с гидрофобными катионами, такими как N-[1-2,3- диолеилокси-N,N'-3-метиламмонийхлорид]. Считается, что в водном растворе полинуклеотиды с нейтрализованным зарядом осаждаются с образованием надмолекулярных мицеллоподобных частиц, которые могут быть названы "полинуклеотидными комплексами". Гидрофобное ядро комплекса содержит полинуклеотиды с нейтрализованным зарядом и сополимерные блоки B-типа. Гидрофильная оболочка содержит сополимерные блоки A-типа. Размер комплекса обычно варьируется от примерно 10 нм до примерно 100 нм в диаметре. В некоторых контекстах целесообразно выделить комплекс из необъединенных компонентов. Это может быть сделано, например, гельфильтрующей хроматографией.

Соотношение компонентов полинуклеотидной композиции является важным фактором в оптимизации проницаемости через мембрану полинуклеотидов в композиции. Это соотношение может быть идентифицировано как отношение [], которое является отношением положительно заряженных групп к отрицательно заряженным группам в композиции при физиологическом pH. Если < 1, комплекс содержит ненейтрализованный фосфат из полинуклеотида. Считается, что части полинуклеотидов, смежные с ненейтрализованными зарядами, являются частью оболочки полинуклеотидного комплекса. Соответственно, если > 1, поликатионный полимер или сегмент R-типа имеет у ненейтрализованные заряды, и ненейтрализованные части складываются так, что они образуют часть оболочки комплекса. Обычно варьируется от примерно 0 (где нет катионных групп) до примерно 100, предпочтительно находится в пределах от примерно 0,01 до примерно 50, более предпочтительно от примерно 0,1 до примерно 20, может варьироваться для увеличения эффективности переноса через мембрану и, когда композиция содержит полинуклеотидные комплексы, для увеличения стабильности комплекса. Варьирование может также влиять на биораспределение комплекса после введения животному. Оптимальное зависит среди прочего от (1) контекста, в каком используе