Биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, включающий производные гиалуроновой кислоты (варианты) и способ предотвращения послеоперационных спаек ткани

Биоматериал для предотвращения послеоперационных спаек, включающий производные гиалуроновой кислоты (варианты) и способ предотвращения послеоперационных спаек ткани

Реферат

 

Изобретение может быть использовано в хирургии. Биоматериал представляет собой бензиловый эфир гиалуроновой кислоты, в котором от 75 до 100% карбоксильных групп гиалуроновой кислоты этерифицированы бензильным радикалом. До 25% карбоксильных групп могут быть этерифицированы алкильным радикалом С₁₀-С₂₀-алифатического спирта при условии, что по меньшей мере 80% карбоксильных групп этерифицированы. Биоматериал выполнен в форме мембраны, сетки, тканого или нетканого полотна или геля. Другой вариант биоматериала содержит по меньшей мере одно производное гиалуроновой кислоты, представляющее собой аутоперекрестно связанное производное гиалуроновой кислоты, в котором от 0,5 до 20% карбоксильных групп гиалуроновой кислоты перекрестно связаны с гидроксильной группой той же или другой молекулы гиалуроновой кислоты. Способ предотвращения послеоперационных спаек ткани состоит в наложении на ткань, вовлеченную в хирургическую операцию, биоматериала. Изобретение позволяет создать барьер для образования спайки до тех пор, пока не произойдет заживление, чтобы устранить такие проблемы, как инфекция, кальцификация имплантатов, образование рубца и т.д. 3 с. и 9 з.п. ф-лы, 9 табл., 10 ил.

Данное изобретение касается новых биопрепаратов, неотъемлемой составной частью которых являются этерифицированные производные гиалуроновой кислоты или перекрестно связанные производные гиалуроновой кислоты, для использования в области хирургии, в особенности, для использования при предотвращении послеоперационных спаек.

Уровень техники Образование послеоперационных спаек является частым осложнением в абдоминальной хирургии или хирургии таза, которое может приводить к выраженной болезненности. Многие факторы могут влиять на развитие спаек: механическая травма, химические вещества, высыхание слизистой в комбинации с кровью, ишемией, инфекцией и чужеродным веществом - известно, что все они увеличивают образование спаек. Другими причинами являются воспалительные заболевания внутри брюшной полости и врожденные аномалии. Патофизиологический механизм все еще остается неясным, но доказан общий центральный путь, в котором важную роль играет перитонеальный фибринолиз.

Хирургическая травма ткани вызывает освобождение серозно-геморрагического эксудата, который формирует фибриновый мостик, который существует несколько дней, в течение которых происходит размножение клеток. Если в течение этого периода эксудат не абсорбируется или не лизируется, возникают неразмножающиеся фибробласты, и последующее отложение коллагена приводит к образованию постоянного рубца, соединяющего две прилегающие поверхности, называемого спайкой. Наконец, образование спайки представляется результатом воспалительной реакции.

В этом последнем случае, исследование было сфокусировано, главным образом, на поиске биоабсорбируемых веществ с коротким временем существования in vivo, действующих в качестве барьера для образования спайки до тех пор, пока не произойдет заживление, для того, чтобы устранить проблемы, создаваемые не абсорбируемыми материалами (инфекция, кальцификация имплантатов, образование рубца и т.д.).

Одним из особенно перспективных полимеров является Гиалуроновая Кислота (ГК), компонент внеклеточного матрикса, обнаруженный повсеместно в теле человека. Показано, что растворы гиалуроновой кислоты снижают образование послеоперационных спаек после абдоминальных (Urman, В. et al., Effect of Hyaluronic Acid on Postoperative Intraperitoneal Adhesions Formation in the Rat Model, Fertil. Steril. 1991, 56:563; Shushan A. et al., Hyaluronic Acid for Preventing Experimental Postoperative-intraperitoneal Adhesions, J. Reprod. Med. 1994; 39:398) и ортопедических операций (Hadberg, L, Gerdin, В. , Sodium Hyaluronate as an adjunctive in adhesion prevention after flexor tendon surgery in rabbits, J. Hand. Surg. 1992; 17A:935).

Фирма Fidia Advanced Biopolymers разработала химические производные гиалуроновой кислоты, т.е. внутренние сложные эфиры (ряд АСР) и сложные эфиры с неактивными спиртами (ряд HYAFF) (Rastrelli, A. et al., Hyaluronic Acid Esters, A New Class of Semisynthetic Biopolymers: Chemical and Physico-chemical Properties, Clinical Implant Materials, Advanced in Biomaterials, G. Heinrike, V. Sollz and AJC Lee (Eds), Elsevier, Amsterdam 1990; 9:199-205), которые обнаруживают физико-химические свойства, отличающиеся от свойств ГК (т. е. более высокое время жизни и возможность производства для получения соответствующих средств), но имеющие свойства переносимости и биосовместимости, типичные для исходного биологического полимера. Более того, эти производные охарактеризованы с химической и токсикологической точки зрения.

Целью данного изобретения было разработать серии ACP гелей, чтобы попытаться оценить их эффект при предотвращении спаек.

Появление спаек, или фиброзных масс, которые образуются между прилежащими друг к другу тканями, подвергшимися травме или ишемии вследствие хирургической операции, все еще остается одним из наиболее тяжелых осложнений при многих хирургических процедурах. Для того, чтобы избежать этого осложнения, было предложено большое количество методов, но проблема осталась в основном неразрешенной.

Одним из предложенных методов было использование суспензий декстрана (diZerega G. S. , "Contemporary adhesion prevention" ("Современные методы предотвращения спаек") Fertility and Sterility, Vol. 61, N 2, February' 94), инъецируемых в перитонеальное пространство после хирургической операции. Клинические результаты использования таких растворов декстрана очень противоречивы. Более того, использование растворов декстрана часто сопровождалось осложнениями, включая отеки, боли в животе и одышку.

Также предлагалось использование преград в виде определенных структур (например, сеток, мембран) (diZerega G.S., "Contemporary adhesion prevention" ("Современные методы предотвращения спаек") Fertility and Sterility, Vol. 61, N 2, February' 94) или вязких гелей (Genzyme, Патенты США N 4,937,270 - N 5,017,229), помещаемых между поврежденными органами. Однако, эти преграды в основном оказались неэффективными, поскольку они вызывали ишемические или воспалительные реакции, обусловленные присутствием инородных тел. Единственными материалами, в настоящее время одобренными для клинического использования, являются преграды на основе окисленной регенерированной целлюлозы ( Interceed ) и преграды на основе растянутого политетрафторэтилена (е-ПТФЭ) ( Goretex - патенты США N 4, 478, 665 и N 4, 482, 516) или полиэтилена, или полипропилена.

В дополнение к тому факту, что клинические исследования эффективности таких барьеров дали очень противоречивые результаты, следует также отметить, что оба вышеуказанных материала связаны с важными противопоказаниями. Использование барьерных мембран из e- PTFE, или полиэтилена, или полипропилена включает имплантацию синтетического материала, который является чужеродным для организма человека и не способен к биодеградации, и который может потребовать повторной хирургической операции для удаления или репозиции барьерной мембраны из-за нежелательных реакций воспалительного типа.

В преклинических и клинических моделях сетки на основе окисленной регенерированной целлюлозы были признаны эффективными для предотвращения образования спаек, но только в том случае, если их наложению предшествовал полный гемостаз.

Поэтому было предложено использование вязких растворов гиалуроновой кислоты (ГК) с большим молекулярным весом как вспомогательного средства для предотвращения спаек (Grainger D. A. et al., "The use of hyaluronic acid polymers to reduce postoperative adhesions", J. of Gynecol. Surg., Vol. 7, N 2. 1991; Hurman В. et al., "Effect of hyaluronic acid on postoperative intraperitoneal adhesion formation in the rat model", Fertility and Sterility, Vol. 56, N 3, September 1991; Shushan A. et al., "Hyaluronic acid for preventing experimental postoperative intraperitoneal adhesions", J. of Reproductive Med., Vol. 39, N 5, May 1994; Mitchell J.D. et al., "Reduction in experimental pericardial adhesions using a hyaluronic acid bioabsorbable membranes", Eur. J. Cardio-thorac. Surg.,8, 149-152, 1994). Гиалуроновая кислота сама по себе, однако, характеризуется очень быстрым временем абсорбции, которое несопоставимо с временем сохранения, необходимым для предотвращения спаек. Более того, природная гиалуроновая кислота не может быть подвергнута технологическому процессу и как таковая не может быть трансформирована в форму биоматериала. Чтобы продлить время ее деградации и позволить ее переработку в различные физические формы для использования в различных областях хирургии, были разработаны эфиры гиалуроновой кислоты и перекрестно связанные производные гиалуроновой кислоты. Получение эфиров гиалуроновой кислоты, где все или часть карбоксильных групп этерифицированы, получение перекрестно связанных производных гиалуроновой кислоты, где часть карбоксильных групп подвергается перекрестному связыванию, и способы их использования в фармацевтическом, косметическом и хирургическом секторах и в виде биодеградируемых пластмасс описаны в патентах США N 4,851,521 и N 4,965,353, европейских патентах ЕР 0216453 и ЕР 0341745.

Сущность изобретения Задача, решаемая настоящим изобретением, заключается в получении биоматериалов для использования с целью предотвращения послеоперационных спаек. Биоматериалы согласно изобретению включают бензиловые эфиры гиалуроновой кислоты и/или внутренне перекрестно связанные производные гиалуроновой кислоты и могут быть в форме гелей, мембран, сеток тканого или нетканого полотна. Предлагается также новый способ предотвращения хирургических спаек ткани путем наложения на ткань, вовлеченную в хирургическую операцию биоматериала согласно изобретению.

Перечень фигур чертежей Фиг. 1-10 являются графиками результатов исследования спаек в модельных экспериментах на животных - крысах.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Настоящее изобретение, таким образом, описывает получение средств для медико-санитарной помощи и хирургии на основе бензилового эфира гиалуроновой кислоты или перекрестно связанных производных гиалуроновой кислоты, используемых по отдельности или в смесях друг с другом, характеризующиеся высокой биосовместимостью и возможностью трансформации в физические формы, которые делают их пригодными для различных способов использования в хирургии, включая лапароскопическую хирургию. Материалы также являются полностью биодеградируемыми и не требуют удаления с места аппликации, тем самым устраняя необходимость повторной хирургической операции. Будучи приготовлены в форме гелей, перекрестно связанные производные обеспечивают материалы со значительно большей вязкостью, чем немодифицированный полимер, и с очень вариабельным временем деградации. Более того, как материалы на основе бензиловых эфиров, так и материалы на основе перекрестно связанных производных, являющиеся предметом данного изобретения, могут быть в форме мембран, сеток, тканого или нетканого полотна (приготовленных в соответствии с процедурами, per se описанными в патентных документах США N 4,851,521; N 4,956,353; WO 93/11804; WO 93/11803; WO 94/17837 и EP 0341745) и характеризуются следующими техническими характеристиками: - мембраны варьируют по толщине между 10 мкм и 1,5 мм, предпочтительно между 20-50 мкм; - ткани или сетки варьируют по толщине между 200 мкм и 1,5 мм; - нетканые материалы по существу характеризуются базисной плотностью, варьирующей между 20 г/м² и 500 г/м², и толщиной между 0,2 мм и 5 мм, предпочтительно менее 1 мм.

Эти материалы могут быть использованы по отдельности или вместе друг с другом, или с другими материалами, состоящими из синтетических полимеров (например, гели на основе перекрестно связанной гиалуроновой кислоты + полипропилен, или мембраны, неотъемлемой составной частью которых являются этерифицированные производные ГК + полипропилен, или мембраны, включающие этерифицированные производные ГК, покрытые гелем из аутоперекрестно связанной ГК).

Таким образом, данное изобретение также включает использование композитных материалов в форме гелей (для перекрестно связанных производных), мембран, тканых или нетканых материалов, неотъемлемой составной частью которых являются бензиловые сложные эфиры или перекрестно связанные производные гиалуроновой кислоты вместе с не подвергающимися биодеградации материалами в форме сеток, или мембран, или нетканых материалов, таких, как e-ПТФЭ, полиэтилен, полипропилен, полиэфир (Дакрон). Данное изобретение, следовательно, включает новый класс медико- санитарных и хирургических средств, которые могут быть использованы в области хирургии для предотвращения образования послеоперационных спаек.

Материалы Как отмечено выше, данное изобретение характеризуется материалами, включающими производные гиалуроновой кислоты, особенно производными в виде бензиловых сложных эфиров и производными с внутренними перекрестными связями.

Термин "гиалуроновая кислота" (также обозначаемая далее, как "ГК") используется в литературе для обозначения кислых полисахаридов с различным молекулярным весом, состоящих из остатков D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина, которые в естественных условиях присутствуют на клеточных поверхностях, среди основных внеклеточных веществ соединительных тканей позвоночных, в синовиальной жидкости суставов, в стекловидном теле глаза, в ткани пупочного канатика человека и в петушиных гребнях.

Гиалуроновая кислота играет важную роль в биологическом организме, во-первых, как механическая опора клеток многих тканей, таких как кожа, связки, мышцы и хрящи, и поэтому является главным компонентом внеклеточного матрикса. Но гиалуроновая кислота выполняет также другие функции в биологических процессах, такие, как гидратация тканей, смазывание, миграция клеток, функционирование и дифференциация клеток (см., например, A. Balazs et al., Cosmetics & Toiletries, N 5/84, pp. 8-17). Гиалуроновая кислота может также быть экстрагирована из вышеуказанных природных тканей, таких как петушиные гребни, или также из некоторых бактерий. В настоящее время гиалуроновая кислота может быть получена также микробиологическими методами. Молекулярный вес цельной гиалуроновой кислоты, полученной путем экстракции, находится в диапазоне 8-13 миллионов. Однако, молекулярная цепь полисахарида очень легко может быть разрушена под влиянием различных физических и химических факторов, таких как механические воздействия, или под влиянием радиации, гидролиза, окисления или ферментативных агентов. По этой причине при обычных процедурах очистки исходных экстрактов часто получают деградированные фракции с более низким молекулярным весом (см. Balazs et al., цитировано выше). Гиалуроновая кислота, ее молекулярные фракции и соответствующие соли были использованы в качестве медикаментов, и их использование также предполагается в косметических препаратах (см., например, вышеуказанную статью Balazs et al. и патент Франции N 2478468).

Хотя термин "гиалуроновая кислота" обычно используется в неподходящем смысле, означая, как видно из вышеизложенного, целую серию полисахаридов с различными остатками D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина с различными молекулярными весами или даже их деградированные фракции, и хотя множественное число "гиалуроновые кислоты" представляется более подходящим, далее описание будет продолжаться с использованием единственного числа для ссылок на гиалуроновую кислоту в ее различных формах, включая ее молекулярные фракции, и аббревиатура "ГК" также будет часто использоваться для обозначения этого широкого термина.

1. Производные в виде бензиловых эфиров Первый предпочтительный материал, являющийся предметом изобретения, основан на бензиловом сложном эфире гиалуроновой кислоты, в частности, 80-100% эфирах, где от 80% до 100% карбоксильных групп ГК этерифицированы. Такие бензиловые эфиры, где 80-99% карбоксильных групп ГК этерифицированы бензильной группой, обозначаются как "частичные эфиры", поскольку только часть карбоксильных групп этерифицирована, а оставшиеся карбоксильные группы являются либо свободными, либо образуют соли со щелочными или щелочноземельными металлами, такими, как натрий, кальций или калий.

Наиболее предпочтительными для биоматериалов, являющихся предметом изобретения, являются так называемые "полные" бензиловые сложные эфиры, где все карбоксильные группы ГК этерифицированы. В этих полных эфирах все карбоксильные группы ГК могут быть этерифицированы бензильной группой (также обозначаются как HYAFF 11), или часть (от 75% до 99%) может быть этерифицирована бензильной группой, а все остальные карбоксильные группы этерифицированы липидной цепью/алкильной группой от C_10-20 алифатических спиртов - образования, которые могут быть обозначены как "смешанные" эфиры. Из этих алифатических спиртов наиболее предпочтительны пальмитиновый спирт (С₁₆-гексадецил) и стеариновый спирт (C₁₈-октадецил). Эти смешанные эфиры также могут быть в форме частичных эфиров, т.е. производных, где часть (от 75% до 99%) карбоксильных групп этерифицирована бензильными группами, а некоторые, но не все оставшиеся карбоксильные группы этерифицированы С₁₀-C₂₀ алифатическим спиртом. Из них наиболее предпочтительными являются те, которые, по меньшей мере, на 75% этерифицированы бензильными группами и, по меньшей мере, на 5% этерифицированы C₁₀-C₂₀ алифатическими спиртами.

Бензиловые эфиры гиалуроновой кислоты, в соответствии с изобретением, могут быть получены способами, известными per se для этерификации карбоксильных кислот, например, при обработке свободной гиалуроновой кислоты спиртом (бензилом и/или C₁₀-C₂₀ спиртами) в присутствии катализирующих веществ, таких, как сильные неорганические кислоты или ионные обменники кислотного типа, или этерифицирующим агентом, способным вводить желаемый спиртовой остаток в присутствии неорганических или органических оснований.

Бензиловые сложные эфиры гиалуроновой кислоты могут, однако, быть получены более эффективно в соответствии с особым методом, описанным в документе ЕР 0216453. Этот метод состоит в обработке четвертичной аммониевой соли гиалуроновой кислоты этерифицирующим агентом, предпочтительно в апротонном органическом растворителе.

Для получения бензиловых эфиров можно использовать гиалуроновые кислоты любого происхождения, как например, кислоты, экстрагированные из вышеуказанных природных исходных материалов, например из петушиных гребней. Получение таких кислот описано в литературе: предпочтительно используются очищенные гиалуроновые кислоты. В соответствии с изобретением, преимущественно используемыми являются гиалуроновые кислоты, содержащие молекулярные фракции интегральных кислот, полученные непосредственно путем экстракции органических материалов с молекулярными весами, варьирующими в широком диапазоне, например, от примерно 90%-80% (М = 11,7- 10,4 миллионов Дальтон) до 0,2% (М = 30000 Дальтон) молекулярного веса интегральной кислоты, имеющей молекулярный вес 13 миллионов Дальтон, предпочтительно, между 5% и 0,2%. Такие фракции могут быть получены при помощи различных процедур, описанных в литературе, таких, как гидролиз, окисление, энзиматические или физические процедуры, такие, как механические или радиационные процедуры. Поэтому в ходе одних и тех же процедур экстракции часто образуются первичные экстракты (например, смотри процитированную выше статью Balazs et al. в "Cosmetics & Toiletries"). Разделение и очистка полученных молекулярных фракций производится при помощи известных методик, например, путем молекулярной фильтрации.

Одной из фракций очищенной ГК, пригодной для использования в соответствии с изобретением, является, например, та, которая известна как "невоспалительный- NIF-NaГK" - гиалуронат натрия, описанный Balazs в брошюре "Healon" - A guide to its use in Ophthalmic Surgery, D. Miller & R.Stegmann, eds. John Wiley & Sons, N.Y., 81983: p. 5.

Особенно важными в качестве исходных материалов для бензиловых эфиров являются две очищенных фракции, которые можно получить из гиалуроновой кислоты (например, гиалуроновой кислоты, экстрагированной из петушиных гребней), известные как "Гиаластин" ("Hyalastine") и "Гиалектин" ("Hyalectin"). Фракция Гиаластин имеет средний молекулярный вес примерно от 50000 до 100000 Дальтон, тогда как фракция Гиалектин имеет средний Дальтон примерно между 500000 и 730000. Также была выделена объединенная фракция этих двух фракций и охарактеризована как имеющая средний молекулярный вес примерно от 250000 до 350000 Дальтон. Эта объединенная фракция может быть получена в количестве 80% от всей гиалуроновой кислоты, которую можно извлечь из определенного исходного материала, тогда как фракция Гиалектин может быть получена в количестве 30%, а фракция Гиаластина в количестве 50% исходной ГК. Получение этих фракций описано в документе ЕР 0138572.

Следующие примеры описывают получение бензиловых эфиров ГК.

Пример 1 - Получение бензилового эфира гиалуроновой кислоты (ГК) 12,4 г тетрабутиламмониевой соли ГК с молекулярным весом 170000 Дальтон, что соответствует 20 мэкв мономера, растворяют в 620 мл диметилсульфоксида при 25^oC, добавляют 4,5 г (25 мэкв) бензилбромида и 0,2 г иодида тетрабутиламмония, раствор в течение 12 часов выдерживают при 30^oC.

Результирующую смесь медленно вливают в 3500 мл этилацетата при постоянном перемешивании. Образуется преципитат, который фильтруют и промывают четыре раза 500 миллилитрами этилацетата и в конце высушивают под вакуумом в течение двадцати четырех часов при 30^oC.

Получают 9 г продукта бензилового эфира, соответствующего заголовку данного примера. Количественное определение сложноэфирных групп выполняют в соответствии с методом, описанным на страницах 169-172 работы Siggia S. and Hann J.G. "Quantitative organic analysis via functional groups", 4th edition, John Wiley and Sons.

Пример 2 - Получение бензилового эфира гиалуроновой кислоты (ГК) 3 г калиевой соли ГК с молекулярным весом 162000 Дальтон суспендируют в 200 мл диметилсульфоксида; добавляют 120 мг иодида тетрабутиламмония и 2,4 г бензил бромида.

Суспензию выдерживают при перемешивании в течение 48 часов при 30^oC. Результирующую смесь медленно вливают в 1000 мл этилацетата при постоянном перемешивании. Образуется преципитат, который фильтруют и промывают четыре раза 150 миллилитрами этилацетата и в конце высушивают под вакуумом в течение двадцати четырех часов при 30^oC.

Получают 3,1 г продукта бензилового эфира, соответствующего заголовку данного примера. Количественное определение сложноэфирных групп выполняют в соответствии с методом, описанным на страницах 169-172 работы Siggia S. and Hann J.G. "Quantitative organic analysis via functional groups", 4th edition, John Wiley and Sons.

Пример 3 - Получение производного гиалуроновой кислоты с 75% карбоксильных функциональных групп, этерифицированных бензиловым спиртом, и оставшимися 25%, этерифицированными октадециловым спиртом (стеариловым спиртом, CH₃-(CH₂)₁₆-CH₂-OH) 6,21 г тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты с молекулярным весом 180000 Дальтон (10 мэкв) растворяют в 248 г диметилсульфоксида (ДМСО) при комнатной температуре.

К этому раствору добавляют 0,89 мл бензилбромида (7,5 мэкв), и раствор оставляют стоять при 30^oC в течение 12 часов. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,83 г октадецилбромида (2,5 мэкв). Раствор выдерживают при 30^oC в течение 24 часов. Затем добавляют 2,5% раствор (вес/вес) NaCl в воде, и результирующую смесь приливают к 750 мл ацетона, в это время перемешивая. Образуется преципитат, который фильтруют и промывают три раза в 100 мл ацетона в воде в соотношении 5:1, три раза 100 миллилитрами ацетона, и затем высушивают в высоком вакууме в течение 24 часов при 30^oC. В результате получают 5,1 грамма желаемого продукта. Количественное определение содержания бензилового спирта и гексадецилового спирта выполняют при помощи газовой хроматографии с последующим щелочным гидролизом. Общее содержание сложноэфирных групп количественно определяют в соответствии с методом омыления, описанным на страницах 169-172 "Quantitative organic analysis via functional groups", 4th edition (John Wiley and Sons).

Пример 4 - Получение производного гиалуроновой кислоты с 75% карбоксильных функциональных групп, этерифицированных бензиловым спиртом, и оставшимися 25%, этерифицированными гексадециловым спиртом (цетиловым пальмитиловым спиртом, CH₃-(CH₂)₁₆-CH₂-ОН) 6,21 г тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты с молекулярным весом 180000 Дальтон (10 мэкв) растворяют в 248 мл диметилсульфоксида (ДМСО) при комнатной температуре.

К этому раствору добавляют 0,89 мл бензилбромида (7,5 мэкв), и раствор оставляют стоять при 30^oC в течение 12 часов. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,76 г гексадецилбромида (2,5 мэкв). Раствор нагревают до 30^oC в течение 24 часов. Затем добавляют 2,5% раствор (вес/вес) NaCl в воде, и результирующую смесь приливают к 750 мл ацетона, в это время перемешивая. Образуется преципитат, который фильтруют и промывают три раза в 100 мл ацетона в воде в соотношении 5:1, три раза 100 мл ацетона, и затем высушивают в высоком вакууме в течение 24 часов при 30^oC. В результате получают пять граммов желаемого продукта. Количественное определение содержания бензилового спирта и гексадецилового спирта выполняют при помощи газовой хроматографии с последующим щелочным гидролизом. Общее содержание эфирных групп количественно определяют в соответствии с методом омыления, описанным на страницах 169-172 "Quantitative organic analysis via functional groups" 4th edition (John Wiley and Sons).

2. Производные гиалуроновой кислоты с внутренними перекрестными связями Производные гиалуроновой кислоты с перекрестными связями, использованные в материалах по настоящему изобретению, описаны в документе ЕР 0341745. Эти производные с перекрестными связями являются меж- и/или внутримолекулярными сложными эфирами гиалуроновой кислоты, где часть карбоксильных групп этерифицирована гидроксильными группами той же молекулы и/или других молекул гиалуроновой кислоты с формированием таким образом лактонов или внутримолекулярных сложноэфирных связей. Эти "внутренние" эфиры, в которых нет внедрения ОН групп других спиртов, также могут быть обозначены как "аутоперекрестно связанная гиалуроновая кислота", так как образование моно- или полимолекулярной перекрестной связи является следствием вышеуказанной внутренней этерификации. Прилагательное "перекрестно связанный" обозначает перекрестные соединения между карбоксилами и гидроксилами молекул гиалуроновой кислоты.

Аутоперекрестно связанными продуктами, в частности, являются неполные внутренние сложные эфиры, в которых процент "поперечных связей" варьирует предпочтительно между 0,5 и 20%, чаще всего составляя 4,5/5,0% от числа карбоксильных групп в гиалуроновой кислоте. В процессе получения карбоксильные группы молекулы гиалуроновой кислоты активируются при добавлении веществ, способных индуцировать такую активацию. Нестабильные промежуточные продукты, полученные в реакции активации, спонтанно отделяются или после добавления катализаторов, и/или вследствие возрастания температуры, образуя вышеуказанные внутренние сложноэфирные связи с гидроксилами той же самой или другой молекулы гиалуроновой кислоты. В соответствии с желаемым уровнем внутренней этерификации либо все, либо аликвотная часть карбоксильных функциональных групп активируются (аликвотную часть получают путем использования избытка активирующих веществ или путем соответствующих методов дозирования).

Карбоксильные группы, конвертируемые во внутренние сложноэфирные группы, могут быть активированы, начиная с гиалуроновой кислоты, содержащей свободные карбоксильные группы, или, предпочтительно, с ГК, содержащей карбоксильные группы в виде солей, например, солей металлов, предпочтительно, щелочных и щелочноземельных металлов, и кроме того, с четвертичных аммониевых солей, такими, как описанные ниже. Тем не менее, соли на органической основе, такие, как амины, могут также быть использованы как исходные вещества.

Методы активации свободных или образовавших соли карбоксильных групп известны per se, в частности, в области синтеза пептидов, и специалисты в данной отрасли науки могут легко определить, какой метод является наиболее подходящим, и особенно, можно или нет использовать исходные вещества в их свободной форме или в виде солей. Методы активации per se, известные для процедур синтеза пептидов и пригодные для процедур получения по настоящему изобретению, описаны, например, в Bodanszky, М., In search of new methods in peptide synthesis, Int. J. Peptide Protein Res. 25, 1985, 449-474; и Gross, E. et al, The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, Inc., 1979, Vol. 1, Chapter 2. В соответствии с такими процедурами, карбоксильный компонент активируется, и это значит, что карбоксильный компонент превращается в реактивную форму. Такая активация обычно включает реакцию между кислотой и активирующим агентом, в соответствии со схемой: где X - часть, оттягивающая на себя электроны. Большинство активированных производных карбоксильных кислот поэтому являются смешанными ангидридами, включающими в широком смысле также азиды кислоты и хлорангидриды, которые могут быть признаны смешанными ангидридами азотоводородной кислоты и HCl, в качестве активирующих агентов. Кроме того, активация карбоксильного компонента может быть выполнена путем образования промежуточных "активированных эфиров". Эти "активированные эфиры" могут быть различных типов, но особенно полезными "активированными эфирами" являются те, которые получены при использовании дициклогексилкарбодиимида, p-нитрофениловых эфиров, трихлорфениловых эфиров, пентахлорфениловых эфиров и O-ацильных производных гидроксиламинов, в частности, эфиров N- гидроксисукцинимида.

Все эти различные типы процедур активации пригодны для получения перекрестно связанной ГК в соответствии с настоящим изобретением, поскольку все эти процедуры могут быть охарактеризованы как включающие в качестве важного компонента реакцию карбоксильной группы с активирующим агентом, которая обязательно приводит к образованию заместительной группы, которая легко реагирует с гидроксильной группой, так что легко образует внутреннюю сложноэфирную связь, характерную для продуктов по настоящему изобретению, число карбоксильных функциональных групп, которые могут быть превращены во внутренние сложные эфиры, в пропорции к числу активированных карбоксильных функциональных групп, и их число зависят от качества используемого активирующего агента.

Предпочтительные процедуры для получения перекрестно связанной ГК поэтому характеризуются обработкой ГК, имеющей свободные или образовавшие соли карбоксильные группы, агентом, который активирует карбоксильную функциональную группу, возможно, в присутствии вспомогательного агента, способствующего образованию промежуточных активированных производных, и/или четвертичных органических или неорганических оснований, при воздействии на смесь нагреванием или излучением (в частности, УФ излучением), и, если желательно, путем образования солей из свободных карбоксильных групп или путем освобождения карбоксигрупп, образовавших соли. Из веществ, способных активировать карбоксильную группу, могут быть использованы обычные, описанные в литературе, например, те, которые обычно используются в синтезе пептидов, за исключением, однако, тех, которые могут проявлять эффект нарушения или разрушения молекулярной структуры исходной ГК, таких, как те, которые используются для образования галогенидов карбоксильных групп. Предпочтительными веществами, которые приводят к образованию активированных эфиров, являются такие вещества, как карбодиимиды, дициклогексилкарбодиимид, бензилизопропилкарбодиимид, бензил-этил-карбодиимид, этоксиацетилен; реагент Вудварда (N-этил-5-фенилизоксазолиум-3- сульфонат), или галогеновые производные алифатических, циклоалифатических или ароматических углеводородов, или гетероциклического соединения с галогеном, приобретающим подвижность в присутствии одной или более активирующих групп, такие, как хлорацетонитрил и особенно соли 2-хлор-N-алкилпиридина, такие, как хлорид 2-хлор-N-метил-пиридина или другие производные алкилов с неразвитыми алкильными группами, такие, как производные алкилов с количеством атомов углерода до 6. Конечно, вместо хлорных производных могут быть использованы другие галогеновые производные, такие, как бромидные производные.

Эта реакция активации может быть выполнена в органических растворителях, особенно, апротонных растворителях, таких как диалкилсульфоксиды, диалкилкарбоксиламиды, такие, в частности, как диалкилсульфоксиды низших алкилов, в частности, диметилсульфоксид, сульфоксиды полиметилена, такие как сульфоксид тетраметилена, диалкилы или сульфоны полиметилена, такие, как сульфон тетраметилена, сульфолан и диалкиламиды низших алифатических кислот, в которых алкильные группы имеют максимально шесть атомов углерода, такие, как диметил- или диэтилформамид, или диметил- или диэтилацетамид. Однако могут быть использованы также другие растворители, и они не всегда должны быть апротонными, такие как спирты, простые эфиры, кетоны, сложные эфиры, такие, как низшие алифатические диалкилоксикарбиды, такие как диметоксиэтан и особенно алифатические или гетероциклические спирты и кетоны с низкой точкой кипения, такие как низшие N-алкил-пирролидоны, такие, как N-метилпирролидон или N-этил-пирролидон, гексафторизопропанол и трифторэтанол. Если галогеновые производные используются в качестве карбоксил-активирующих веществ, особенно в форме солей, таких, как вышеуказанный хлорид 2-хлор-N- метилпиридиния, лучше использовать соли металлов или соли органического основания исходного полисахарида, особенно, одну из солей четвертичного аммония, описанных ниже, такую, как соль тетрабутиламмония. Эти соли имеют особое преимущество, являясь очень хорошо растворимыми в вышеуказанных органических растворителях, в которых можно лучше всего влиять на реакцию образования перекрестных связей, гарантируя таким образом прекрасный выход. Можно порекомендовать добавить к смеси вещество, способное вытеснять кислоту, такое, как органические основания, карбонаты, бикарбонаты или ацетаты щелочных или щелочноземельных металлов, или органические основания и, особенно, четвертичные основания, такие, как пиридин и его гомологи, такие, как коллидин, или алифатические аминные основания, такие, как триэтиламин или N-метил-пиперазин.

Использование солей четвертичного аммония представляет собой процедуру, имеющую особые преимущества. Такие аммониевые соли хорошо известны и их получают тем же способом, что и другие известные соли. Они являются производными алкилов, имеющих предпочтительно число атомов углерода от 1 до 6. Предпочтительно использовать соли тетрабутиламмония. Одна из вариаций процедуры, в которой используются соли четвертичного аммония, состоит в реагировании соли щелочного металла, например, натриевой или калиевой соли, в присутствии катализирующего количества соли четвертичного аммония, такой, как иодид тетрабутиламмония.

Вещества, катализирующие активацию карбоксильных групп, которые следует добавлять к активирующим агентам, сообщаются в литературе, и они также предпочтительно являются основаниями, такими, как указанные ранее. Так например, когда карбоксильные группы активируются изотиазоловыми солями, предпочтительно добавить к реакционной смеси некоторое количество триэтиламина.

Реакция образования активированных промежуточных веществ, особенно таких, как сложные эфиры, проводится при температуре, рекомендованной в литературе, но эту температуру, однако, можно варьировать в зависимости от необходимых условий, что может легко определить специалист в данной области науки. Образование внутренних сложноэфирных связей может происходить в достаточно широком диапазоне температур, например, между 0^oC и 150^oC, предпочтительно при комнатной температуре или несколько более высокой, например, между 20^oC и 75^oC. Повышение температуры благоприятствует образованию внутренних сложноэфирных связей, как и воздействие излучения подходящей длины волны, например такого, как ультрафиолетовое излучение.

Субстрат гиалуроновй кислоты может быть любой природы и может быть различных типов, обсуждавшихся выше. Предпочтительными исходными материалами являются ГК, которые имеют средний молекулярный вес от 150000 до 730000, предпочтительно от 150000 до 450000 Дальтон.

Кроме того, количество внутренних перекрестных связей варьирует, но предпочтительные материалы, соответствующие изобретению, и